申請(qǐng)人申報(bào)使用遺傳修飾微生物生產(chǎn)新食品原料、食品添加劑新品種和食品相關(guān)產(chǎn)品新品種（以下簡(jiǎn)稱“三新食品”），產(chǎn)品中不含有新引入基因片段和遺傳修飾微生物時(shí)，應(yīng)按本文件提交相關(guān)資料。1.產(chǎn)品信息1.1產(chǎn)品的組成、目標(biāo)產(chǎn)物含量等檢測(cè)數(shù)據(jù)1.2產(chǎn)品中外源基因殘留檢測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)詳細(xì)描述生產(chǎn)過(guò)程中去除外源基因的處理工藝步驟和參數(shù)，并提供產(chǎn)品中無(wú)外源引入基因殘留的檢測(cè)報(bào)告。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法對(duì)生產(chǎn)菌株的特定脫氧核糖核酸（DNA）片段（包括目的基因、報(bào)告基因、標(biāo)記基因等）進(jìn)行檢測(cè)。PCR方法涉及的樣品采集、DNA提取、PCR擴(kuò)增和質(zhì)量控制要求見(jiàn)附件1。1.3產(chǎn)品中遺傳修飾微生物殘留檢測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)詳細(xì)描述生產(chǎn)過(guò)程中滅活和去除遺傳修飾微生物的工藝步驟和參數(shù)，并提供產(chǎn)品中無(wú)遺傳修飾微生物活細(xì)胞殘留的檢測(cè)報(bào)告。采用微生物培養(yǎng)法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行遺傳修飾微生物活細(xì)胞檢測(cè)。具體的樣品采集、樣品前處理、培養(yǎng)和觀察、菌落計(jì)數(shù)、質(zhì)量控制和鑒定確認(rèn)要求見(jiàn)附件2。1.4環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)控制措施及效果應(yīng)提供無(wú)環(huán)境釋放風(fēng)險(xiǎn)承諾書(shū)及其支持資料，包括但不限于生產(chǎn)過(guò)程中確保遺傳修飾微生物及其外源基因不會(huì)進(jìn)入環(huán)境和發(fā)生基因轉(zhuǎn)移的防控措施，及其效果評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)和報(bào)告（如生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢氣、廢水、廢渣中無(wú)可繁殖、可轉(zhuǎn)移的遺傳修飾微生物殘留的至少3批次檢測(cè)數(shù)據(jù)）。1.5產(chǎn)品分類說(shuō)明依據(jù)以上數(shù)據(jù)及報(bào)告，對(duì)產(chǎn)品做出分類。Ⅰ類為純化產(chǎn)品，Ⅱ類為復(fù)合產(chǎn)品。2.遺傳修飾微生物相關(guān)信息2.1基本信息名稱（包括中文名、拉丁名、別名等）、菌株號(hào)、來(lái)源及用途。2.2分類學(xué)及鑒定資料提供基于表型、基因型和最新測(cè)序技術(shù)鑒定到種或亞種水平的鑒定報(bào)告。2.3生物學(xué)特性資料包括但不限于遺傳修飾微生物的表型及顯微鏡下特征、理化特性等。2.4生長(zhǎng)環(huán)境條件資料提供遺傳修飾微生物生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件（包括但不限于培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和濕度、需氧情況、光照等），以及遺傳修飾微生物保藏及復(fù)壯方法等相關(guān)資料。2.5其他國(guó)家法規(guī)資料提供其他國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)或認(rèn)可的該遺傳修飾微生物生產(chǎn)產(chǎn)品的相關(guān)法規(guī)資料。2.6食品加工用遺傳修飾微生物的安全性評(píng)價(jià)2.6.1遺傳修飾微生物在自然界的存活能力，遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到其他生物體的能力和可能后果；2.6.2遺傳修飾微生物的安全性（1）基于全基因組測(cè)序進(jìn)行的毒力基因、耐藥基因、毒素產(chǎn)生相關(guān)基因等分析；（2）遺傳修飾微生物的致病性、耐藥性和產(chǎn)毒能力試驗(yàn)報(bào)告；（3）遺傳修飾微生物新引入基因表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)提供與已知毒性蛋白或毒素的同源性生物信息學(xué)比對(duì)資料，以及與已知致敏原的同源性生物信息學(xué)比對(duì)資料；（4）遺傳修飾微生物新引入基因表達(dá)產(chǎn)物為非蛋白質(zhì)類的產(chǎn)品，還應(yīng)提供至少3批次樣品蛋白殘留數(shù)據(jù)；（5）結(jié)合全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析潛在的脫靶位點(diǎn)與脫靶情況，如有脫靶情況發(fā)生，應(yīng)分析可能造成的非預(yù)期效應(yīng)；（6）其他安全性資料。2.6.3確定遺傳修飾微生物的安全等級(jí)。3.受體微生物的安全性評(píng)價(jià)3.1背景資料3.1.1名稱（包括中文名、拉丁名、別名等）、菌株號(hào)、來(lái)源；3.1.2分類學(xué)資料；3.1.3明確是天然野生菌種還是人工培養(yǎng)菌種，如為人工培養(yǎng)菌種，應(yīng)提供原始菌株的信息；3.1.4安全性背景資料：包括但不限于在國(guó)內(nèi)外的應(yīng)用情況，長(zhǎng)期安全應(yīng)用記錄，對(duì)人類健康或生態(tài)環(huán)境是否產(chǎn)生過(guò)不良影響，是否有演變?yōu)橛泻ι锏目赡苄浴?.2生物學(xué)特性3.2.1生長(zhǎng)周期和世代時(shí)間；3.2.2繁殖方式和繁殖能力；3.2.3適宜生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求；3.2.4在環(huán)境中定殖、存活和傳播的方式、能力及其影響因素；3.2.5對(duì)人體健康和動(dòng)物的潛在風(fēng)險(xiǎn)（包括毒性、致病性、耐藥性等）；3.2.6其他生物學(xué)特性。3.3適應(yīng)的生態(tài)環(huán)境3.3.1在國(guó)內(nèi)的地理分布和自然生長(zhǎng)環(huán)境，其自然分布是否會(huì)因某些條件的變化而改變；3.3.2生長(zhǎng)所需的生態(tài)環(huán)境條件，包括溫度、濕度、酸堿度、光照、空氣等；3.3.3是否具有生態(tài)特異性，如在環(huán)境中的適應(yīng)性等；3.3.4與生態(tài)系統(tǒng)中其他微生物的生態(tài)關(guān)系，是否受人類和動(dòng)物病原體（如病毒）的侵染。包括生態(tài)環(huán)境的改變對(duì)這種（些）關(guān)系的影響以及是否會(huì)因此而產(chǎn)生或增加對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境的不良影響；3.3.5對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響及其潛在風(fēng)險(xiǎn)。3.4遺傳變異3.4.1遺傳穩(wěn)定性；3.4.2質(zhì)粒狀況，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及其潛在風(fēng)險(xiǎn)；3.4.3轉(zhuǎn)座子狀況及其潛在風(fēng)險(xiǎn)；3.4.4是否有發(fā)生遺傳變異而對(duì)人類健康或生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不良影響的可能性；3.4.5在自然條件下與其他微生物（特別是病原體）進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換的可能性。3.5其他資料3.6安全等級(jí)4.基因操作的安全性評(píng)價(jià)4.1食品加工用遺傳修飾微生物中引入或修飾性狀和特性的描述4.2實(shí)際插入或刪除序列的資料4.2.1插入序列的大小和結(jié)構(gòu)，確定其特性的分析方法；4.2.2刪除區(qū)域的大小和功能；4.2.3目的基因的安全性；詳細(xì)描述目的基因的供體來(lái)源、核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列、功能和安全性。（1）結(jié)構(gòu)：完整的DNA或反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸（cDNA）序列和推導(dǎo)的氨基酸序列；（2）供體微生物的來(lái)源；（3）供體微生物的生物學(xué)特性及生物學(xué)功能等；（4）安全性：從供體微生物特性、安全使用歷史、基因結(jié)構(gòu)、毒性、致病性、耐藥性、功能等方面綜合描述目的基因的安全性。4.2.4插入序列的拷貝數(shù)。4.3載體信息載體的名稱和來(lái)源，載體特性和安全性，是否可向自然界中不含有該類基因的微生物轉(zhuǎn)移。構(gòu)建載體圖譜，詳細(xì)注明表達(dá)載體所有元件的名稱、位置和酶切位點(diǎn)。4.4載體中插入?yún)^(qū)域各片段的資料4.4.1啟動(dòng)子和終止子的供體生物的名稱、大小、DNA序列、功能、安全應(yīng)用記錄；4.4.2標(biāo)記基因和報(bào)告基因的供體生物的名稱、大小、DNA序列、功能、安全應(yīng)用記錄；4.4.3其他表達(dá)調(diào)控序列的名稱及其來(lái)源（如人工合成或供體生物名稱）、大小、DNA序列、功能、安全應(yīng)用記錄。4.5基因操作方法4.6遺傳穩(wěn)定性4.6.1目的基因整合的穩(wěn)定性：采用PCR等方法擴(kuò)增外源基因片段，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，分析外源基因片段的插入情況或微生物基因缺失情況，提供不少于轉(zhuǎn)接傳代5代的試驗(yàn)數(shù)據(jù)；4.6.2目的基因表達(dá)的穩(wěn)定性：采用蛋白質(zhì)印記（Western–Blot）、質(zhì)譜、色譜等方法，分析表達(dá)產(chǎn)物中外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性，提供不少于轉(zhuǎn)接傳代5代的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。4.7目的基因的檢測(cè)和鑒定技術(shù)4.8確定基因操作的安全類型

采用PCR方法對(duì)生產(chǎn)菌株特定DNA片段（如目的基因、報(bào)告基因、標(biāo)記基因等）進(jìn)行檢測(cè)。PCR方法涉及的樣品采集、DNA提取、PCR擴(kuò)增和質(zhì)量控制要求如下：1.樣品采集每個(gè)遺傳修飾微生物產(chǎn)品應(yīng)至少包括3個(gè)批次，每個(gè)批次至少取3個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。樣品應(yīng)從工業(yè)化生產(chǎn)線采集，記錄采樣點(diǎn)所處的具體生產(chǎn)環(huán)節(jié)。若尚無(wú)工業(yè)化產(chǎn)品，可采用中試產(chǎn)品，但應(yīng)明確中試生產(chǎn)工藝（發(fā)酵及后處理工藝）具有工業(yè)化生產(chǎn)工藝的代表性。2.DNA提取從至少1g（mL）樣品中提取DNA。若上游發(fā)酵中間產(chǎn)品濃度高于終產(chǎn)品濃度，可使用上游發(fā)酵中間產(chǎn)品提取DNA。應(yīng)采用適合于生產(chǎn)菌株各類細(xì)胞形式（如菌體細(xì)胞、芽胞）的DNA提取方法，確保能從產(chǎn)品中提取到可能殘留的DNA。3.PCR擴(kuò)增針對(duì)生產(chǎn)菌株的特定DNA片段設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增產(chǎn)物不應(yīng)超過(guò)1Kb。應(yīng)詳細(xì)描述生產(chǎn)菌株的特定DNA片段、特異性引物、聚合酶以及擴(kuò)增條件等信息。若生產(chǎn)菌株含有作為報(bào)告基因/標(biāo)記基因的耐藥基因，可設(shè)計(jì)多對(duì)引物以確保擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)覆蓋耐藥基因的完整DNA片段。4.質(zhì)量控制PCR檢測(cè)時(shí)應(yīng)當(dāng)包括以下對(duì)照和靈敏度測(cè)試：（1）將直接從生產(chǎn)菌株中提取的總DNA作為PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性對(duì)照；（2）不含目的基因的微生物DNA作為陰性對(duì)照；（3）試驗(yàn)過(guò)程中為排除PCR抑制劑、核酸酶等的存在，將直接從生產(chǎn)菌株提取的總DNA添加至從樣品中提取的DNA作為PCR擴(kuò)增的質(zhì)控對(duì)照；（4）將直接從生產(chǎn)菌株提取的總DNA梯度稀釋后，分別添加至樣品中，提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，計(jì)算檢測(cè)限；（5）檢測(cè)閾值應(yīng)不高于10ngDNA/g（mL）樣品。

采用微生物培養(yǎng)法檢測(cè)產(chǎn)品中是否存在遺傳修飾微生物活細(xì)胞。具體的樣品采集、樣品前處理、培養(yǎng)和觀察、菌落計(jì)數(shù)、質(zhì)量控制和鑒定確認(rèn)要求如下：1.樣品采集每個(gè)遺傳修飾微生物產(chǎn)品應(yīng)至少包括3個(gè)批次，每個(gè)批次至少取3個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。樣品應(yīng)從工業(yè)化生產(chǎn)線采集，記錄采樣點(diǎn)所處的具體生產(chǎn)環(huán)節(jié)。若尚無(wú)工業(yè)化產(chǎn)品，可采用中試產(chǎn)品，但應(yīng)明確中試生產(chǎn)工藝（發(fā)酵及后處理工藝）具有工業(yè)化生產(chǎn)工藝的代表性。2.樣品前處理每個(gè)樣品至少取25g（mL）進(jìn)行前處理后制備檢液。固體樣品：取25g，加入225mL滅菌生理鹽水，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1∶10稀釋的檢液。水溶性液體樣品：取25mL（g），加入225mL滅菌生理鹽水，混勻后制成1∶10稀釋的檢液。取1mL上述檢液于適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行生產(chǎn)菌株活細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)，需設(shè)定10個(gè)平行樣，用于計(jì)算1g（mL）樣品中待測(cè)微生物的含量。3.培養(yǎng)和觀察將上述平皿置于適宜的條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察生產(chǎn)菌株存活和生長(zhǎng)情況。4.菌落計(jì)數(shù)計(jì)算10個(gè)平行樣平皿中待測(cè)微生物的菌落總數(shù)，并表示為1g（mL