PAGE1PAGE《卷煙主流煙氣中主要雜環(huán)胺類化合物（AαC,MeAαC,Trp-p-1和Trp-p-2）的測(cè)定液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)報(bào)告中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院2011.8

PAGE1PAGE一、前言概述雜環(huán)胺類化合物是卷煙煙氣中非常重要的兩類有害成分，主要是在卷煙抽吸過(guò)程中由含氮化合物和含氧化合物燃燒、裂解而產(chǎn)生的，在主流煙氣中的釋放量較低，基本在納克級(jí)的水平，但生物活性非常強(qiáng)，這些物質(zhì)具有致癌或致突變作用，對(duì)人體健康具有較強(qiáng)的危害性。HOFFMANN在2001年公布的69種有害成分清單中，就包括8種雜環(huán)胺類化合物。近年來(lái)，社會(huì)各界對(duì)吸煙與健康的問(wèn)題日益關(guān)注，隨著我國(guó)政府簽署了煙草框架公約（FCTC），對(duì)煙草中有害成分信息披露的要求也越來(lái)越高。因此為了更好地評(píng)價(jià)卷煙煙氣的危害性，目前很有必要對(duì)以上雜環(huán)胺類化合物進(jìn)行比較詳細(xì)的研究，特別是在分析方法上，需要發(fā)展準(zhǔn)確有效的分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量的描述，這樣才能科學(xué)評(píng)價(jià)其對(duì)卷煙危害性的影響，研究這些有害成分的形成機(jī)理，為開發(fā)煙氣有害成分降低技術(shù)提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。雜環(huán)胺是由蛋白質(zhì)、氨基酸熱解產(chǎn)生的一類化合物，多種煎炸食品[1-6]、咖啡飲料[7]、卷煙煙氣[8-13]、江河水[14]以及尿樣[6,15,16]中都可以檢測(cè)到這類化合物的存在。雜環(huán)胺具有強(qiáng)烈的致癌性和致突變性，可引起哺乳動(dòng)物的基因突變、染色體畸變及姐妹染色體變換等，其中一些雜環(huán)胺類化合物的致突變活性很強(qiáng)，一些還被證明可以引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多種組織的腫瘤。這類化合物在環(huán)境和日常食品中普遍存在，它們?cè)斐傻慕】滴：σ殉蔀槭称钒踩I(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。1939年，瑞典科學(xué)家Widmark用烤馬肉提取物反復(fù)涂抹于小鼠背部皮膚，發(fā)現(xiàn)可以誘發(fā)小鼠乳腺腫瘤[17]，但這一重要結(jié)果在當(dāng)時(shí)并未引起人們的重視。多年后，Sugimura[18]發(fā)現(xiàn)魚和肉類食品經(jīng)烹調(diào)后可形成具致突變性的物質(zhì)，同年Nagao發(fā)現(xiàn)烤魚及肉的煙氣中具有致癌物質(zhì)[19,20]，激發(fā)了人們對(duì)氨基酸、蛋白質(zhì)熱解產(chǎn)物的研究興趣，從而導(dǎo)致了新的致癌、致突變物的發(fā)現(xiàn)，并將這一類物質(zhì)歸為雜環(huán)胺類物質(zhì)。目前大量研究已證明，大部分雜環(huán)胺類物質(zhì)具有致癌、致突變性，它可以導(dǎo)致小白鼠的肝癌、大小腸癌、口腔癌、胰腺癌以及乳腺癌等等。雜環(huán)胺進(jìn)入人體后，主要是在P450細(xì)胞色素氧化酶的作用下，發(fā)生N-氧化和O-乙酰化反應(yīng)生成DNA加合物后產(chǎn)生致突變和致癌作用[21-27]。迄今為止，已從烹調(diào)的食品分離鑒定的具有有的致突變和/或致癌雜環(huán)胺物質(zhì)已超過(guò)20種。對(duì)于煙氣中的雜環(huán)胺的研究起始于1962PoindexterandCarpenter報(bào)道了卷煙煙氣中含有哈爾滿與降哈爾滿（β-咔啉）[8]。上個(gè)世紀(jì)八十年代初，Yoshida與Matsumoto[28]對(duì)煙氣中雜環(huán)胺的分析檢測(cè)，檢測(cè)的雜環(huán)胺有AaC與MeAaC，他們分別用HPLC-熒光檢測(cè)器定量分析了烤牛肉與卷煙主流煙氣中AaC與MeAaC，發(fā)現(xiàn)對(duì)于這兩種雜環(huán)胺，9g烤牛肉的雜環(huán)胺含量與23支卷煙主流煙氣中的含量相類似。1998年DHoffmann與IHoffmann發(fā)表了一份無(wú)濾嘴香煙主流煙氣中具生物活性的物質(zhì)的名單，其中包括Trp-P-1、Trp-p-2等八種雜環(huán)胺類化合物[29]。表1和圖1為煙氣中可能存在的八種雜環(huán)胺類化合物名稱、致癌等級(jí)以及結(jié)構(gòu)圖。表1卷煙煙氣中的主要雜環(huán)胺類化合物化合物名稱縮寫CAS號(hào)致癌性2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚AαC26148-68-52B2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚MeAαC68006-83-72B2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉IQ76180-96-62A2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并4,5-b]吡啶PHIP105650-23-52B2-氨基-6-甲基-二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d]咪唑Glu-P-167730-11-42B2-氨基二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d]并咪唑Glu-P-267730-10-32B3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚Trp-P-162450-06-02B3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚Trp-P-272254-58-12B圖1卷煙煙氣中的主要雜環(huán)胺類化合物的結(jié)構(gòu)圖卷煙主流煙氣中雜環(huán)胺的前處理方法由于煙氣樣品的復(fù)雜性、樣品中雜環(huán)胺含量較低（大多為ng級(jí)別）并且存在大量的基質(zhì)影響，導(dǎo)致了實(shí)際的樣品分析中提取過(guò)雜環(huán)胺以后，要進(jìn)一步進(jìn)行分離純化來(lái)排除樣品中其它物質(zhì)的干擾。雜環(huán)胺屬于有機(jī)堿，通常都是用有機(jī)溶劑或酸性水溶液來(lái)提取，再用CH2Cl2[10,30-31]、乙酸乙酯[30,32,33]等進(jìn)行液液萃取除去酸性或中性雜質(zhì)，此外，除有機(jī)溶劑或酸性水溶液外，卷煙煙氣還常用玻璃纖維進(jìn)行捕集[28,34,35],再用有機(jī)溶劑進(jìn)行洗滌。KataokaH等[11]采用液液萃取法提取了卷煙主側(cè)流煙氣中的雜環(huán)胺，作者先用人造纖維富集煙氣中的雜環(huán)胺，再用甲醇/氨（50：1）洗滌，調(diào)節(jié)洗滌液的pH值后，用CH2Cl2重新萃取，最后作者在卷煙主側(cè)流煙氣中檢測(cè)到了AaC、Trp-P-1、IQ和PHIP。SasakiTA等[10]采用液液萃取法提取了卷煙主流煙氣中的雜環(huán)胺，作者先用0.1M的鹽酸萃取劍橋?yàn)V片，調(diào)節(jié)pH值后，再用CH2Cl2萃取，檢測(cè)到IQ和PHIP。YukariTotsuka等人[13]用有機(jī)溶劑萃取卷煙煙氣濾片后，再用藍(lán)棉提取雜環(huán)胺，以甲醇/氨洗脫，定量分析了哈爾滿與降哈爾滿。液液萃取方法是常用的分離方法，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、方便，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，因該方法需要大量不混溶的溶劑，有些是有毒、易揮發(fā)、易燃的，在樣品預(yù)處理方面存在局限性，所以需要尋找更好的樣品預(yù)處理方法。近年來(lái)，固相萃取法得到了日益廣泛的應(yīng)用。因?yàn)樗哂袠悠诽幚硌杆伲僮骱?jiǎn)單、方便，避免乳化現(xiàn)象，易于自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)。1996年，GrossGA等[36,37]提出了固相萃取的方式來(lái)分離純化復(fù)雜樣品中的雜環(huán)胺。該方法既可以提高萃取率，又可以節(jié)省時(shí)間和費(fèi)用，減少樣品的用量，同時(shí)提取復(fù)雜樣品中的多種雜環(huán)胺。經(jīng)過(guò)近年來(lái)不斷修改，幾乎成為雜環(huán)胺分析測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)前處理方法，用來(lái)測(cè)定的樣品也覆蓋了許多含有雜環(huán)胺類化合物的樣品，卷煙主流煙氣中雜環(huán)胺的分析測(cè)定方法鑒定復(fù)雜樣品中雜環(huán)胺的方法很多，液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用、氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用，毛細(xì)管區(qū)域電泳儀和酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定等方法都已經(jīng)被用來(lái)定性定量分析復(fù)雜樣品中的雜環(huán)胺。3.1氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用法氣相色譜由于其簡(jiǎn)單、靈敏度高以及耗費(fèi)低的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用在雜環(huán)胺的分析測(cè)定中，但是由于大多數(shù)的雜環(huán)胺是低揮發(fā)性，并且具有一定的極性，在氣相分析時(shí)對(duì)氣相色譜柱和進(jìn)樣口有很強(qiáng)的吸附性，色譜峰會(huì)趨向于出現(xiàn)寬峰或拖尾峰，因此雜環(huán)胺在進(jìn)行氣相色譜分析之前要先進(jìn)行衍生化。雜環(huán)胺的衍生化不僅可以減少雜環(huán)胺的極性，而且可以提高雜環(huán)胺的揮發(fā)性、靈敏度、選擇性以及分離度。三氟甲基苯甲酰[38]、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛等很多衍生化試劑都可以用來(lái)衍生化雜環(huán)胺[37,39-45]。因?yàn)檠苌镏泻蠳原子，氮磷檢測(cè)器常用來(lái)檢測(cè)雜環(huán)胺的衍生物。Kataoka[46]等建立了一種簡(jiǎn)單快速的衍生方法，作者采用DMF-DMA衍生、GC-NPD測(cè)定了10種具有致突變性的雜環(huán)胺。該研究組[11]還采用鹽酸/抗壞血酸對(duì)捕集卷煙主、側(cè)流煙氣后，用藍(lán)棉處理，再用DMF-DMA對(duì)雜環(huán)胺衍生，以GC/NPD分析，檢測(cè)到卷煙煙氣中雜環(huán)胺AaC、Trp-p-1、IQ、PHIP和MeIQ。氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合了氣相色譜簡(jiǎn)單耗費(fèi)低的優(yōu)點(diǎn)以及質(zhì)譜高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)。其中，和EI相比，負(fù)化學(xué)電離(NCI)對(duì)于含氮的化合物的選擇性更好、靈敏度更高，比較適合復(fù)雜樣品中痕量雜環(huán)胺的鑒定[47-49]，和氣相色譜方法相同，雜環(huán)胺類化合物在色譜分析之前通常要先進(jìn)行衍生化過(guò)程。但Christopher[47]等未對(duì)雜環(huán)胺化合物進(jìn)行衍生，直接進(jìn)GC/MS分析。作者用濾片捕集主流煙氣粒相物，用HCl超聲萃取后過(guò)MCX固相萃取柱凈化樣品，洗脫液蒸干后用乙腈溶解后進(jìn)GC/MS分析。采用外標(biāo)法對(duì)哈爾滿、降哈爾滿、AaC和MeAaC定量分析。哈爾滿與降哈爾滿的檢測(cè)限分別是33.1和84.7ng/支，AaC和MeAaC的檢測(cè)限為3.1和1.4ng/支。兩個(gè)加標(biāo)水平30and750ng/支的回收率都在79.9和102%之間。SasakiTA等[10]用濾片捕集主流煙氣粒相物，用HCl萃取后調(diào)節(jié)pH值，再用CH2Cl2重新萃取，之后用七氟丁酐(HFBA)和N,N-二甲基甲酰胺對(duì)雜環(huán)胺進(jìn)行兩步衍生，用NCI-GC-MS（選擇離子監(jiān)測(cè)）分析。用此種方法檢測(cè)了煙氣中PHIP和IQ，濃度水平0.5ng/支，方法的檢測(cè)限為0.1～0.5ng/支。3.2液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用法HPLC是一種普遍有效的分析雜環(huán)胺的方法，每一種雜環(huán)胺都有特征的紫外光譜和較高的消光系數(shù)，并且它們都是電化學(xué)可氧化的，因此這些化合物可以通過(guò)紫外、電化學(xué)和熒光法來(lái)檢測(cè)。在高效液相方法中，紫外吸收檢測(cè)是最普遍的方法，大多數(shù)的雜環(huán)胺在260-275nm內(nèi)都可以被檢測(cè)。但是樣品的復(fù)雜性使得該方法的選擇性不高。Gross等[50]采用窄孔色譜柱Vydac201HS52(25cm×2.1mmI.D)檢測(cè)了肉類制品中的12種雜環(huán)胺和哈爾滿，使用該柱子的靈敏度比常規(guī)柱子（直徑4.6mm）要高三倍，該方法已經(jīng)被很多研究者采納。熒光檢測(cè)器常與紫外檢測(cè)器同時(shí)應(yīng)用，IQ類型的雜環(huán)胺類化合物無(wú)熒光吸收，需用紫外檢測(cè)器來(lái)確認(rèn)。熒光檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器相比，靈敏度更高，選擇性好，并且色譜圖更“干凈”[4]。Shige等[34]用玻璃纖維捕集主流煙氣粒相物。纖維用和甲醇和氨水超聲萃取，蒸干后用20mlCH2Cl2溶解，過(guò)反相柱BondElutSIcolumn，最后用HPLC-UV分析，檢測(cè)到卷煙中的PHIP平均值含量為16.4ng/支。液質(zhì)聯(lián)用方法集中了高效液相分離程度高以及質(zhì)譜選擇性和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，該方法可以減少?gòu)?fù)雜樣品中其他物質(zhì)的干擾，而且可以解決分離過(guò)程中的費(fèi)時(shí)費(fèi)力問(wèn)題，比較適合雜環(huán)胺類化合物的定性定量分析。由于基質(zhì)的復(fù)雜性及目標(biāo)化合物含量低的特點(diǎn)，要取得可靠的結(jié)果，分離及檢測(cè)方法必須具有一定的選擇性和靈敏度。當(dāng)前采用液質(zhì)聯(lián)用分析雜環(huán)胺時(shí)廣泛采用的接口技術(shù)有熱噴霧(TSP)、電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)等。LC-TSP-MS在80年代中期曾是成功的接口，該技術(shù)中進(jìn)行的離子化是軟離子化，碎裂程度較小，通過(guò)檢測(cè)雜環(huán)胺類化合物的[M+H]+峰可以檢測(cè)到復(fù)雜樣品中的雜環(huán)胺類化合物，Edmonds[51-52]首次采用該方法測(cè)定了經(jīng)過(guò)烹調(diào)后的肉和魚中的雜環(huán)胺類物質(zhì)，但是LC-TSP-MS所提供的結(jié)構(gòu)信息有限，并且它不適合熱不穩(wěn)定化合物。隨著技術(shù)的發(fā)展，又出現(xiàn)了采用LC-ESI–MS、LC-APCI–MS技術(shù)檢測(cè)樣品中雜環(huán)胺類物質(zhì)的方法，ESI和APCI都是噴霧型的軟電離技術(shù)，它們的高電離效率已成為目前最理想的LC/MS接口技術(shù)。3.3毛細(xì)管區(qū)域電泳(CZE)毛細(xì)管區(qū)域電泳是一種新的高分辨率分析技術(shù)，它兼有高壓電泳的高速、高分辨率及高效液相色譜法的高效率等優(yōu)點(diǎn)，與高效液相方法相比，毛細(xì)管區(qū)域電泳可以達(dá)到較高的分離效率，并且需要的有機(jī)溶劑少，樣品用量小，雜環(huán)胺的毛細(xì)管區(qū)域電泳法近幾年來(lái)才被發(fā)展起來(lái)。1995年Wu等[53]首次采用該方法成功的分離了Trp-P-1、Trp-p-2、AaC、MeAaC、IQ、MeIQ等30種雜環(huán)胺，該方法的檢測(cè)限為0.05-1.3ng/μl。3.4酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度高和分析成本低的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被應(yīng)用在測(cè)定具有致癌性的雜環(huán)胺類物質(zhì)中。1988年Vanderlaan等[54]就采用該方法分析了復(fù)雜樣品中的IQ、MeIQ和PHIP等。3.5小結(jié)盡管卷煙煙氣中雜環(huán)胺類化合物已經(jīng)有了一些研究報(bào)道，但由于雜環(huán)胺在卷煙煙氣中的釋放量很低，煙氣復(fù)雜基質(zhì)對(duì)其分離和分析有著非常嚴(yán)重的干擾，因此給它的分離檢測(cè)帶來(lái)了困難。氣相色譜分析通常需要進(jìn)行衍生化，穩(wěn)定性較差，并且由于煙氣基質(zhì)的干擾經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的分析結(jié)果。HPLC-UV是同時(shí)測(cè)定多種雜環(huán)胺最有效的辦法，但是它的靈敏度不高。HPLC-ED和HPLC-FLD雖然選擇性和靈敏度比較好，但是只能選擇性的檢測(cè)幾種雜環(huán)胺。CZE技術(shù)采用光電二極管陣列檢測(cè)器可以達(dá)到比較高的分離效率，但是它的靈敏度不高。ELISA法需要先產(chǎn)生抗體才能分析雜環(huán)胺類化合物。由于以上分析方法的原因，目前卷煙煙氣雜環(huán)胺的研究經(jīng)常有一些相互矛盾的報(bào)道，不同研究人員在卷煙煙氣中檢出的雜環(huán)胺種類和釋放量有比較大的差異。Moldoveanu等采用液液萃取法提取了卷煙主流煙氣中的雜環(huán)胺，衍生后采用氣相色譜-質(zhì)譜-化學(xué)源負(fù)離子模式檢測(cè)，檢測(cè)到IQ和PHIP[10]。Kataoka等將蘭棉吸附和液液萃取相結(jié)合的方法處理卷煙主側(cè)流煙氣中的雜環(huán)胺，衍生后采用氣相色譜-氮磷檢測(cè)器，檢測(cè)到AaC、Trp-p-1、IQ和PHIP[11]。Moldoveanu等人采用固相萃取方法對(duì)卷煙主流煙氣進(jìn)行處理，并采用氣相色譜-質(zhì)譜分析了非極性的雜環(huán)胺化合物：哈爾滿，降哈爾滿，AaC和MeAaC[47]。上述方法都存在前處理復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度較低或并不具普適性等缺點(diǎn)，因此改進(jìn)現(xiàn)有前處理方法并建立一種對(duì)所有雜化胺類化合物都適用且較為簡(jiǎn)單的、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高的分析方法，具有重要意義。卷煙主流煙氣中主要雜環(huán)胺類的分析1儀器與試劑API4000質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Agilent1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；CeruleanSM450直線式吸煙機(jī)（Cerulean，Ltd.）；Borgwalt-KCRM20H20孔道轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)（BorgwaldtKC，Inc.）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-210（瑞士步琪有限公司）；Milli-Q50超純水儀（美國(guó)MILLIPORE公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；pH計(jì)(上海雷磁儀器公司)；CP2245電子天平（感量0.0001g，德國(guó)Sartorius公司）。2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole(AαC,CAS:26148-68-5);2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole(MeAαC,CAS:68006-83-7),3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole(Trp-p-1,CAS:62450-06-0),3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole(Trp-p-2,CAS:72254-58-1)和2-amino-3,4,7,8-tetramethylimidazo[4,5-f]quinoxaline(4,7,8-TriMeIQx,CAS:95896-78-9)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。除特別要求以外，均應(yīng)使用液相色譜純級(jí)試劑，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水，甲醇、乙腈、甲酸、甲酸胺、氨水（分析純）、鹽酸（分析純）；Oasis?MCX固相萃取柱（150mg，6mL,Waters公司）；0.45μm有機(jī)相針式過(guò)濾器（上海安譜）。2卷煙主流煙氣中主要雜環(huán)胺類化合物的收集和前處理將卷煙樣品放置于（22±1）℃，相對(duì)濕度為（60±2）%的環(huán)境中平衡48h，然后選其平均重量在±0.02g范圍和平均吸阻在±49Pa/支范圍內(nèi)的煙支作為測(cè)試煙支。按照每60秒抽吸一口，每口抽吸容量35ml，抽吸持續(xù)時(shí)間2s。對(duì)于直線式吸煙機(jī)，用直徑44mm的劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，每張濾片收集5支卷煙的總粒相物，取收集10支卷煙的總粒相物的2張濾片置于100mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50mL甲醇/5%鹽酸（v/v=20/80）溶液；對(duì)于轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)，用直徑92mm的劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，每張濾片收集20支卷煙的總粒相物，取收集20支卷煙的總粒相物的1張濾片置于250mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入100mL甲醇/5%鹽酸（v/v=20/80）溶液。超聲萃取30分鐘后，用移液管準(zhǔn)確移取25mL萃取液，上樣到已用10mL甲醇和10mL甲醇/5%鹽酸（v/v=20/80）溶液活化后的MCX固相萃取柱（150mg，6mL）上，令萃取液靠重力自然留下，保持流速在1-1.5mL/min左右。然后依次用10ml水、10ml甲醇、10ml甲醇/氨水/水溶液（v/v/v=25/5/70）洗滌，最后用10ml5％氨水甲醇溶液(v/v)進(jìn)行洗脫，洗脫液加入50μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻過(guò)濾后進(jìn)LC-MS/MS分析。3液相色譜和質(zhì)譜條件3.1液相色譜條件：HPLC-MS/MS分析所用分析柱為AgilentSBC18（100mm×4.6mmi.d.,1.8μm），柱溫：30℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸乙腈溶液，流動(dòng)相B為甲酸/2mM甲酸銨緩沖溶液（pH=4.5），梯度洗脫條件如表2所示，進(jìn)樣體積10μL。表2梯度洗脫條件時(shí)間（min）流速(μL/min)A(%)B(%)02009010520040601020040601520090103.2串聯(lián)質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；電噴霧電壓：5500V；氣簾氣壓力: 0.124Mpa；輔助氣1壓力:0.379Mpa；輔助氣2壓力:0.345Mpa；離子源溫度: 600.00℃各化合物的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、駐留時(shí)間以及碰撞能量（CE）參見表3表3質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)表化合物定量離子對(duì)(m/z)定性離子對(duì)(m/z)駐留時(shí)間（ms）CE（V）Trp-p-2198.1/181.0198.2/154.05035Trp-p-1212.1/195.1212.1/168.15038AαC184.0/167.1184.0/140.05032MeAαC198.1/181.0198.1/129.050354,7,8-TriMeIQx242.1/227.2242.1/145.25042圖2為主流煙氣中主要雜環(huán)胺在標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中的MRM色譜圖Trp-p-2、2-Trp-p-1、3-AαC、4-MeAαC圖2主流煙氣中主要雜環(huán)胺在標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中的MRM色譜圖4.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備母液取適量AαC、MeAαC、Trp-p-1和Trp-p-2標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇分別配制成100μg/mL儲(chǔ)備母液。于-18℃冰箱中避光保存，有效期為6個(gè)月。4.2一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別吸取AαC、MeAαC、Trp-p-1和Trp-p-2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備母液10mL，2mL、1mL和1mL至100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于-18℃冰箱中避光保存，有效期為6個(gè)月。4.3二級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液吸取一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10mL至50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于-18℃冰箱中避光保存，有效期為3個(gè)月。4.4內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液取4,7,8-TriMeIQx標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成100μg/mL儲(chǔ)備液。于-18℃冰箱中避光保存，有效期為6個(gè)月。4.5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液移取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液1mL至100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于-18℃冰箱中避光保存，有效期為3個(gè)月。4.6標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，95%甲醇水溶液定容。即配制成如表4所示的6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。表4標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列(ng/mL)化合物1#2#3#4#5#6#AαC125102050MeAαC0.20.412410Trp-p-10.10.20.5125Trp-p-20.10.20.5125內(nèi)標(biāo)5555555.主流煙氣中主要雜環(huán)胺的定性和定量測(cè)定待測(cè)目標(biāo)物選擇1個(gè)母離子，2個(gè)或2個(gè)以上子離子，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)；且樣品譜圖中各組分特征離子的相對(duì)豐度與濃度臨近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的特征離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，當(dāng)相對(duì)豐度>50%時(shí)，允許偏差±20%，當(dāng)相對(duì)豐度在20-50%時(shí)，允許偏差±25%，當(dāng)相對(duì)豐度在10-20%時(shí)，允許偏差±30%，當(dāng)相對(duì)豐度<10%時(shí)，允許偏差±50%。配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分析進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)不小于0.99，內(nèi)標(biāo)法定量。主流煙氣中雜環(huán)胺類化合物的釋放量由式（1）計(jì)算得出，結(jié)果以納克每支表示：??????????????????????????????????????（1）式中：m每支卷煙主流煙氣雜環(huán)胺類化合物的釋放量，單位為納克每支(ng/cig)。A溶液中雜環(huán)胺類化合物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）。L溶液的體積，單位為毫升（mL）n煙支數(shù)量，單位為支。三、討論1超聲萃取溶劑選擇雜環(huán)胺的堿性較弱，所以采用強(qiáng)酸水溶液和甲醇的混溶液進(jìn)行提取，本實(shí)驗(yàn)中以5%的鹽酸溶液混合不同比例的甲醇，按體積比將甲醇的比例分別設(shè)為0、10、20和50。如圖3所示，但5%的鹽酸與甲醇的比例超過(guò)80/20時(shí)，萃取結(jié)果基本不變。同時(shí)由于甲醇比例越高，萃取出的干擾成分就越多，因此確定萃取的溶液為甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=20/80)。1-5%鹽酸溶液、2-甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=10/90)、3-甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=20/80)、4-甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=50/50)圖3萃取溶劑中甲醇比例的影響2不同萃取方式的影響本實(shí)驗(yàn)中比較了兩種提取方式對(duì)煙氣中雜環(huán)胺類化合物測(cè)定的影響。一種超聲萃取，一般來(lái)說(shuō)，超生萃取的優(yōu)勢(shì)是耗時(shí)較短，萃取效率較高，缺點(diǎn)是超聲時(shí)間如果較長(zhǎng)，溫度會(huì)上升，有機(jī)溶劑的揮發(fā)的可能性增大，另外萃取的干擾成分也較多。另一種是震蕩萃取，震蕩萃取時(shí)發(fā)熱較少，但要較長(zhǎng)時(shí)間的萃取，才能萃取完全。圖4顯示了超聲萃取30分鐘和震蕩萃取60分鐘的比較結(jié)果，由圖中可見對(duì)于煙氣中雜環(huán)胺類化合物，超聲萃取的效率高于震蕩萃取。故采用超聲萃取方式來(lái)提取目標(biāo)物。圖4不同萃取方式的影響3不同超聲萃取時(shí)間的影響本實(shí)驗(yàn)中選擇了超聲15min，30min，45min和60min四個(gè)條件來(lái)確定超聲萃取的時(shí)間。由圖5可見，在超聲30min后，目標(biāo)物的含量基本不變，為節(jié)約時(shí)間和防止引入更多的干擾成分，我們選擇30min為萃取時(shí)間。圖5不同超聲萃取時(shí)間的影響4固相萃取過(guò)程中待測(cè)目標(biāo)物的保留情況本實(shí)驗(yàn)所采用的WatersOasisMCX固相萃取小柱屬混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，對(duì)堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度，基質(zhì)為聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，具有雙重保留模式：離子交換和反相，適合與復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的除雜和純化。為考察固相萃取過(guò)程中目標(biāo)物的保留情況，分別收集固相萃取各個(gè)步驟的溶液，進(jìn)液質(zhì)分析，考察保留情況。圖6顯示了整個(gè)固相萃取過(guò)程，實(shí)驗(yàn)中分別收集上樣、淋洗和洗脫等步驟的流出液。如圖所示，待測(cè)的4種雜環(huán)胺在上樣和凈化過(guò)程中幾乎都保留在固相萃取小柱上，只有極微量（<0.02%）的流失，在固相萃取過(guò)程中目標(biāo)物與雜質(zhì)達(dá)到較好的分離；同時(shí)由于內(nèi)標(biāo)在固相萃取過(guò)程中發(fā)生了部分流失，所以選擇將目標(biāo)物洗脫后再加內(nèi)標(biāo)，由圖7可見，目標(biāo)物在萃取過(guò)程中幾乎全部轉(zhuǎn)移到洗脫后的溶液中，從而保證了定量的準(zhǔn)確性。圖6固相萃取凈化過(guò)程1-上樣、2-水淋洗3-甲醇淋洗、4-氨水甲醇淋洗液淋洗5-5%氨水甲醇溶液洗脫圖7固相萃取過(guò)程中待測(cè)目標(biāo)物的分布5待測(cè)目標(biāo)物洗脫體積的確定增大洗脫體積能夠保證把目標(biāo)物盡可能全部洗脫出來(lái)，但目標(biāo)物的濃度也會(huì)隨著體積增大而降低，而減小洗脫體積可能產(chǎn)生洗脫不完全的風(fēng)險(xiǎn)，因而選擇適宜的洗脫體積時(shí)需二者兼顧。實(shí)驗(yàn)中分別收集0-5mL、5-10mL、10-15mL、15-20mL和20-25mL洗脫液進(jìn)行測(cè)定。如圖8所示，當(dāng)采用10mL洗脫液洗脫時(shí)，已有99.5%以上的待測(cè)目標(biāo)物被洗脫，因此選擇10mL洗脫液進(jìn)行洗脫。1-5mL、2-10mL、3-15mL、4-20mL、5-25mL圖8洗脫液洗脫體積的影響6流動(dòng)相pH值的影響本實(shí)驗(yàn)中液相色譜分析采用的是水-乙腈體系，水相為甲酸/甲酸銨緩沖溶液。為研究緩沖溶液pH對(duì)色譜峰響應(yīng)的影響，分別配制了pH值為3.5、4、4.5、5的緩沖溶液。如圖9所示，當(dāng)緩沖溶液pH值為4.5時(shí)，色譜峰的整體響應(yīng)最高。AeraAera圖9流動(dòng)相pH值的影響7前處理后樣品的穩(wěn)定性為考察樣品的穩(wěn)定性，將前處理后的樣品密閉于2mL色譜小瓶中，4℃冷藏保存，分別在前處理當(dāng)天和第3、5、7天進(jìn)樣。如圖10所示，4種雜環(huán)胺在三日內(nèi)穩(wěn)定性良好。圖10前處理后樣品的穩(wěn)定性8不同類型吸煙機(jī)的影響目前行業(yè)內(nèi)常用的吸煙機(jī)有轉(zhuǎn)盤式和直線式兩種，實(shí)驗(yàn)比較了兩種類型吸煙機(jī)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。對(duì)于直線式吸煙機(jī)，抽吸10支卷煙，兩張44mm劍橋?yàn)V片捕集，50mL5%鹽酸/甲醇溶液(80/20)萃取，上樣25mL；對(duì)于轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)，抽吸20支卷煙，一張92mm劍橋?yàn)V片捕集，100mL5%鹽酸/甲醇溶液(80/20)萃取，上樣25mL。如圖11所示，轉(zhuǎn)盤式和直線式吸煙機(jī)測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差小于5%，無(wú)顯著差異。圖11不同類型吸煙機(jī)的影響9標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和檢測(cè)限如表5所示，本實(shí)驗(yàn)中Trp-p-2、Trp-P-1、AaC、MeAaC等四種雜環(huán)胺線性良好，通過(guò)計(jì)算10次最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到檢出限分別為0.09、0.08、0.56、0.12ng/cig。表5四種雜環(huán)胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和定量檢出限化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線R2檢出限（ng/cig）定量限（ng/cig）Trp-p-2Y=0.307x+0.007210.99980.090.29Trp-p-1Y=0.373x+0.1820.99960.080.27AαCY=0.404x+0.1370.99980.561.85MeAαCY=0.348x+0.04050.99880.120.3910精密度和回收率由表6可見Trp-p-2、Trp-P-1、AaC、MeAaC等四種雜環(huán)胺的日內(nèi)精密度結(jié)果分別為7.45%、6.37%、7.93%和7.10%，日間精密度結(jié)果分別為8.88%、7.33%、7.73%和9.31%。回收率分別在85.1~107.7%、83.2~95.6%、89.6~110.7%和81.0~100.4%之間。表6四種雜環(huán)胺的精密度和回收率化合物日內(nèi)精密度/%（n=6）日間精密度/%（n=5）添加濃度/(ng/mL)回收率范圍/%Trp-p-27.458.880.492.9~107.71.085.1~97.92.096.2~101.8Trp-p-16.377.330.487.7~95.61.083.2~92.02.087.5~96.5AαC7.937.734.089.6~110.710.0100.7~109.920.0101.2~110.3MeAαC7.109.310.887.6~100.42.085.9~92.34.081.0~94.211雜環(huán)胺比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果本項(xiàng)目開展了比對(duì)實(shí)驗(yàn)，選擇了參比（烤煙型）卷煙、參比（混合型）卷煙、白沙、紅塔山、中南海5個(gè)牌號(hào)的卷煙進(jìn)行分析。鄭州煙草研究院、云南紅塔集團(tuán)、河南中煙工業(yè)公司、廣東中煙工業(yè)公司、湖北中煙工業(yè)公司和國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心等6家實(shí)驗(yàn)室參與了比對(duì)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)牌號(hào)卷煙各家實(shí)驗(yàn)室均測(cè)定5次，表中列出了6家實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果。由表7結(jié)果可見，6家實(shí)驗(yàn)室的RSD除一個(gè)為12.12%外，均小于10%，說(shuō)明各家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果較為接近，再現(xiàn)性好。表7雜環(huán)胺比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果ng/cig化合物鄭州院紅塔河南廣東湖北質(zhì)檢平均值RSD參比（烤煙型)Trp-p-20.710.800.750.750.800.770.764.48%Trp-p-11.040.891.041.001.030.981.005.77%AαC10.108.989.7010.499.799.899.825.11%MeAαC1.281.141.261.171.261.181.214.91%參比（混合型）Trp-p-20.790.840.811.010.840.930.879.71%Trp-p-11.221.341.231.151.251.221.245.09%AαC15.4714.8115.6117.5115.7215.0615.706.07%MeAαC1.321.561.381.341.381.341.396.49%白沙Trp-p-20.920.920.910.950.920.870.922.95%Trp-p-11.250.981.261.441.261.191.2312.12%AαC12.3612.1012.0512.1412.4612.3512.241.38%MeAαC1.431.221.451.251.421.401.367.46%紅塔山Trp-p-20.90.910.951.000.920.890.934.58%Trp-p-11.461.421.401.481.471.391.442.61%AαC14.9914.5514.9814.4115.1715.0814.862.08%MeAαC1.661.601.631.411.561.551.575.51%中南海Trp-p-21.291.231.291.031.281.151.218.58%Trp-p-11.611.491.631.571.621.551.583.45%AαC17.9617.4317.8019.2717.8516.8417.864.51%MeAαC1.731.651.751.451.721.621.656.78%12卷煙樣品的測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果的比較本項(xiàng)目測(cè)定了20個(gè)牌號(hào)的國(guó)內(nèi)外卷煙，測(cè)定結(jié)果見表8。由表中結(jié)果可見Trp-p-2的含量為0.39~3.25ng/cig、Trp-p-1的含量為0.61~2.44ng/cig、AαC的含量為9.01~41.40ng/cig、MeAαC的含量為0.70~3.53ng/cig。文獻(xiàn)[55-56]中報(bào)道了卷煙主流煙氣中雜環(huán)胺的含量范圍：Trp-p-2的含量為0.82~1.1ng/cig、Trp-p-1的含量為0.29~0.48ng/cig、AαC的含量為25~260ng/cig、MeAαC的含量為2~37ng/cig，兩者結(jié)果進(jìn)行比較，本實(shí)驗(yàn)樣品Trp-p-2和Trp-p-1的含量范圍與文獻(xiàn)比較接近，AαC和MeAαC的含量因所測(cè)試樣品的差異而處于含量范圍的低端。表8卷煙主流煙氣中四種雜環(huán)胺的測(cè)定結(jié)果（ng/cig）編號(hào)卷煙類型Trp-p-2Trp-p-1AαCMeAαC1#國(guó)外混合型2.582.2732.603.362#國(guó)外混合型1.991.9423.602.543#國(guó)外混合型1.951.9623.792.394#國(guó)外混合型2.101.9125.642.325#國(guó)外混合型3.252.4441.403.536#國(guó)外混合型1.501.4220.802.077#國(guó)外混合型0.390.619.010.788#國(guó)內(nèi)混合型1.471.4718.871.739#國(guó)內(nèi)混合型1.621.7818.901.9710#國(guó)內(nèi)混合型1.561.4617.721.6511#國(guó)內(nèi)烤煙型1.231.1612.641.4112#國(guó)內(nèi)烤煙型1.250.9814.311.5413#國(guó)內(nèi)烤煙型1.161.049.011.0714#國(guó)內(nèi)烤煙型1.681.2214.571.3715#國(guó)內(nèi)烤煙型1.421.3414.321.4216#國(guó)內(nèi)烤煙型1.331.1510.751.2117#國(guó)內(nèi)烤煙型1.161.3511.061.2218#國(guó)內(nèi)烤煙型1.831.7331.402.6319#國(guó)內(nèi)烤煙型1.971.7433.303.3720#國(guó)內(nèi)烤煙型0.660.759.330.70

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