PAGE1PAGE《卷煙主流煙氣中主要雜環胺類化合物（AαC,MeAαC,Trp-p-1和Trp-p-2）的測定液相色譜－串聯質譜法》標準項目實驗報告中國煙草總公司鄭州煙草研究院2011.8

PAGE1PAGE一、前言概述雜環胺類化合物是卷煙煙氣中非常重要的兩類有害成分，主要是在卷煙抽吸過程中由含氮化合物和含氧化合物燃燒、裂解而產生的，在主流煙氣中的釋放量較低，基本在納克級的水平，但生物活性非常強，這些物質具有致癌或致突變作用，對人體健康具有較強的危害性。HOFFMANN在2001年公布的69種有害成分清單中，就包括8種雜環胺類化合物。近年來，社會各界對吸煙與健康的問題日益關注，隨著我國政府簽署了煙草框架公約（FCTC），對煙草中有害成分信息披露的要求也越來越高。因此為了更好地評價卷煙煙氣的危害性，目前很有必要對以上雜環胺類化合物進行比較詳細的研究，特別是在分析方法上，需要發展準確有效的分析技術對其進行定量的描述，這樣才能科學評價其對卷煙危害性的影響，研究這些有害成分的形成機理，為開發煙氣有害成分降低技術提供可靠的數據支撐。雜環胺是由蛋白質、氨基酸熱解產生的一類化合物，多種煎炸食品[1-6]、咖啡飲料[7]、卷煙煙氣[8-13]、江河水[14]以及尿樣[6,15,16]中都可以檢測到這類化合物的存在。雜環胺具有強烈的致癌性和致突變性，可引起哺乳動物的基因突變、染色體畸變及姐妹染色體變換等，其中一些雜環胺類化合物的致突變活性很強，一些還被證明可以引起實驗動物多種組織的腫瘤。這類化合物在環境和日常食品中普遍存在，它們造成的健康危害已成為食品安全領域關注的熱點問題之一。1939年，瑞典科學家Widmark用烤馬肉提取物反復涂抹于小鼠背部皮膚，發現可以誘發小鼠乳腺腫瘤[17]，但這一重要結果在當時并未引起人們的重視。多年后，Sugimura[18]發現魚和肉類食品經烹調后可形成具致突變性的物質，同年Nagao發現烤魚及肉的煙氣中具有致癌物質[19,20]，激發了人們對氨基酸、蛋白質熱解產物的研究興趣，從而導致了新的致癌、致突變物的發現，并將這一類物質歸為雜環胺類物質。目前大量研究已證明，大部分雜環胺類物質具有致癌、致突變性，它可以導致小白鼠的肝癌、大小腸癌、口腔癌、胰腺癌以及乳腺癌等等。雜環胺進入人體后，主要是在P450細胞色素氧化酶的作用下，發生N-氧化和O-乙酰化反應生成DNA加合物后產生致突變和致癌作用[21-27]。迄今為止，已從烹調的食品分離鑒定的具有有的致突變和/或致癌雜環胺物質已超過20種。對于煙氣中的雜環胺的研究起始于1962PoindexterandCarpenter報道了卷煙煙氣中含有哈爾滿與降哈爾滿（β-咔啉）[8]。上個世紀八十年代初，Yoshida與Matsumoto[28]對煙氣中雜環胺的分析檢測，檢測的雜環胺有AaC與MeAaC，他們分別用HPLC-熒光檢測器定量分析了烤牛肉與卷煙主流煙氣中AaC與MeAaC，發現對于這兩種雜環胺，9g烤牛肉的雜環胺含量與23支卷煙主流煙氣中的含量相類似。1998年DHoffmann與IHoffmann發表了一份無濾嘴香煙主流煙氣中具生物活性的物質的名單，其中包括Trp-P-1、Trp-p-2等八種雜環胺類化合物[29]。表1和圖1為煙氣中可能存在的八種雜環胺類化合物名稱、致癌等級以及結構圖。表1卷煙煙氣中的主要雜環胺類化合物化合物名稱縮寫CAS號致癌性2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚AαC26148-68-52B2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚MeAαC68006-83-72B2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉IQ76180-96-62A2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并4,5-b]吡啶PHIP105650-23-52B2-氨基-6-甲基-二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d]咪唑Glu-P-167730-11-42B2-氨基二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d]并咪唑Glu-P-267730-10-32B3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚Trp-P-162450-06-02B3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚Trp-P-272254-58-12B圖1卷煙煙氣中的主要雜環胺類化合物的結構圖卷煙主流煙氣中雜環胺的前處理方法由于煙氣樣品的復雜性、樣品中雜環胺含量較低（大多為ng級別）并且存在大量的基質影響，導致了實際的樣品分析中提取過雜環胺以后，要進一步進行分離純化來排除樣品中其它物質的干擾。雜環胺屬于有機堿，通常都是用有機溶劑或酸性水溶液來提取，再用CH2Cl2[10,30-31]、乙酸乙酯[30,32,33]等進行液液萃取除去酸性或中性雜質，此外，除有機溶劑或酸性水溶液外，卷煙煙氣還常用玻璃纖維進行捕集[28,34,35],再用有機溶劑進行洗滌。KataokaH等[11]采用液液萃取法提取了卷煙主側流煙氣中的雜環胺，作者先用人造纖維富集煙氣中的雜環胺，再用甲醇/氨（50：1）洗滌，調節洗滌液的pH值后，用CH2Cl2重新萃取，最后作者在卷煙主側流煙氣中檢測到了AaC、Trp-P-1、IQ和PHIP。SasakiTA等[10]采用液液萃取法提取了卷煙主流煙氣中的雜環胺，作者先用0.1M的鹽酸萃取劍橋濾片，調節pH值后，再用CH2Cl2萃取，檢測到IQ和PHIP。YukariTotsuka等人[13]用有機溶劑萃取卷煙煙氣濾片后，再用藍棉提取雜環胺，以甲醇/氨洗脫，定量分析了哈爾滿與降哈爾滿。液液萃取方法是常用的分離方法，其優點是操作簡單、方便，但費時、費力，因該方法需要大量不混溶的溶劑，有些是有毒、易揮發、易燃的，在樣品預處理方面存在局限性，所以需要尋找更好的樣品預處理方法。近年來，固相萃取法得到了日益廣泛的應用。因為它具有樣品處理迅速，操作簡單、方便，避免乳化現象，易于自動化操作等優點。1996年，GrossGA等[36,37]提出了固相萃取的方式來分離純化復雜樣品中的雜環胺。該方法既可以提高萃取率，又可以節省時間和費用，減少樣品的用量，同時提取復雜樣品中的多種雜環胺。經過近年來不斷修改，幾乎成為雜環胺分析測定的標準前處理方法，用來測定的樣品也覆蓋了許多含有雜環胺類化合物的樣品，卷煙主流煙氣中雜環胺的分析測定方法鑒定復雜樣品中雜環胺的方法很多，液相色譜、液質聯用、氣相色譜、氣質聯用，毛細管區域電泳儀和酶聯免疫吸附劑測定等方法都已經被用來定性定量分析復雜樣品中的雜環胺。3.1氣相色譜和氣質聯用法氣相色譜由于其簡單、靈敏度高以及耗費低的優點已經被廣泛的應用在雜環胺的分析測定中，但是由于大多數的雜環胺是低揮發性，并且具有一定的極性，在氣相分析時對氣相色譜柱和進樣口有很強的吸附性，色譜峰會趨向于出現寬峰或拖尾峰，因此雜環胺在進行氣相色譜分析之前要先進行衍生化。雜環胺的衍生化不僅可以減少雜環胺的極性，而且可以提高雜環胺的揮發性、靈敏度、選擇性以及分離度。三氟甲基苯甲酰[38]、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛等很多衍生化試劑都可以用來衍生化雜環胺[37,39-45]。因為衍生物中含有N原子，氮磷檢測器常用來檢測雜環胺的衍生物。Kataoka[46]等建立了一種簡單快速的衍生方法，作者采用DMF-DMA衍生、GC-NPD測定了10種具有致突變性的雜環胺。該研究組[11]還采用鹽酸/抗壞血酸對捕集卷煙主、側流煙氣后，用藍棉處理，再用DMF-DMA對雜環胺衍生，以GC/NPD分析，檢測到卷煙煙氣中雜環胺AaC、Trp-p-1、IQ、PHIP和MeIQ。氣質聯用結合了氣相色譜簡單耗費低的優點以及質譜高靈敏度和高選擇性的優點。其中，和EI相比，負化學電離(NCI)對于含氮的化合物的選擇性更好、靈敏度更高，比較適合復雜樣品中痕量雜環胺的鑒定[47-49]，和氣相色譜方法相同，雜環胺類化合物在色譜分析之前通常要先進行衍生化過程。但Christopher[47]等未對雜環胺化合物進行衍生，直接進GC/MS分析。作者用濾片捕集主流煙氣粒相物，用HCl超聲萃取后過MCX固相萃取柱凈化樣品，洗脫液蒸干后用乙腈溶解后進GC/MS分析。采用外標法對哈爾滿、降哈爾滿、AaC和MeAaC定量分析。哈爾滿與降哈爾滿的檢測限分別是33.1和84.7ng/支，AaC和MeAaC的檢測限為3.1和1.4ng/支。兩個加標水平30and750ng/支的回收率都在79.9和102%之間。SasakiTA等[10]用濾片捕集主流煙氣粒相物，用HCl萃取后調節pH值，再用CH2Cl2重新萃取，之后用七氟丁酐(HFBA)和N,N-二甲基甲酰胺對雜環胺進行兩步衍生，用NCI-GC-MS（選擇離子監測）分析。用此種方法檢測了煙氣中PHIP和IQ，濃度水平0.5ng/支，方法的檢測限為0.1～0.5ng/支。3.2液相色譜和液質聯用法HPLC是一種普遍有效的分析雜環胺的方法，每一種雜環胺都有特征的紫外光譜和較高的消光系數，并且它們都是電化學可氧化的，因此這些化合物可以通過紫外、電化學和熒光法來檢測。在高效液相方法中，紫外吸收檢測是最普遍的方法，大多數的雜環胺在260-275nm內都可以被檢測。但是樣品的復雜性使得該方法的選擇性不高。Gross等[50]采用窄孔色譜柱Vydac201HS52(25cm×2.1mmI.D)檢測了肉類制品中的12種雜環胺和哈爾滿，使用該柱子的靈敏度比常規柱子（直徑4.6mm）要高三倍，該方法已經被很多研究者采納。熒光檢測器常與紫外檢測器同時應用，IQ類型的雜環胺類化合物無熒光吸收，需用紫外檢測器來確認。熒光檢測器與紫外檢測器相比，靈敏度更高，選擇性好，并且色譜圖更“干凈”[4]。Shige等[34]用玻璃纖維捕集主流煙氣粒相物。纖維用和甲醇和氨水超聲萃取，蒸干后用20mlCH2Cl2溶解，過反相柱BondElutSIcolumn，最后用HPLC-UV分析，檢測到卷煙中的PHIP平均值含量為16.4ng/支。液質聯用方法集中了高效液相分離程度高以及質譜選擇性和靈敏度高的優點，該方法可以減少復雜樣品中其他物質的干擾，而且可以解決分離過程中的費時費力問題，比較適合雜環胺類化合物的定性定量分析。由于基質的復雜性及目標化合物含量低的特點，要取得可靠的結果，分離及檢測方法必須具有一定的選擇性和靈敏度。當前采用液質聯用分析雜環胺時廣泛采用的接口技術有熱噴霧(TSP)、電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學電離(APCI)等。LC-TSP-MS在80年代中期曾是成功的接口，該技術中進行的離子化是軟離子化，碎裂程度較小，通過檢測雜環胺類化合物的[M+H]+峰可以檢測到復雜樣品中的雜環胺類化合物，Edmonds[51-52]首次采用該方法測定了經過烹調后的肉和魚中的雜環胺類物質，但是LC-TSP-MS所提供的結構信息有限，并且它不適合熱不穩定化合物。隨著技術的發展，又出現了采用LC-ESI–MS、LC-APCI–MS技術檢測樣品中雜環胺類物質的方法，ESI和APCI都是噴霧型的軟電離技術，它們的高電離效率已成為目前最理想的LC/MS接口技術。3.3毛細管區域電泳(CZE)毛細管區域電泳是一種新的高分辨率分析技術，它兼有高壓電泳的高速、高分辨率及高效液相色譜法的高效率等優點，與高效液相方法相比，毛細管區域電泳可以達到較高的分離效率，并且需要的有機溶劑少，樣品用量小，雜環胺的毛細管區域電泳法近幾年來才被發展起來。1995年Wu等[53]首次采用該方法成功的分離了Trp-P-1、Trp-p-2、AaC、MeAaC、IQ、MeIQ等30種雜環胺，該方法的檢測限為0.05-1.3ng/μl。3.4酶聯接免疫吸附劑測定法(ELISA)ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用結合起來的一種敏感性很高的技術，該技術具有操作簡便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度高和分析成本低的優點，現已被應用在測定具有致癌性的雜環胺類物質中。1988年Vanderlaan等[54]就采用該方法分析了復雜樣品中的IQ、MeIQ和PHIP等。3.5小結盡管卷煙煙氣中雜環胺類化合物已經有了一些研究報道，但由于雜環胺在卷煙煙氣中的釋放量很低，煙氣復雜基質對其分離和分析有著非常嚴重的干擾，因此給它的分離檢測帶來了困難。氣相色譜分析通常需要進行衍生化，穩定性較差，并且由于煙氣基質的干擾經常會產生錯誤的分析結果。HPLC-UV是同時測定多種雜環胺最有效的辦法，但是它的靈敏度不高。HPLC-ED和HPLC-FLD雖然選擇性和靈敏度比較好，但是只能選擇性的檢測幾種雜環胺。CZE技術采用光電二極管陣列檢測器可以達到比較高的分離效率，但是它的靈敏度不高。ELISA法需要先產生抗體才能分析雜環胺類化合物。由于以上分析方法的原因，目前卷煙煙氣雜環胺的研究經常有一些相互矛盾的報道，不同研究人員在卷煙煙氣中檢出的雜環胺種類和釋放量有比較大的差異。Moldoveanu等采用液液萃取法提取了卷煙主流煙氣中的雜環胺，衍生后采用氣相色譜-質譜-化學源負離子模式檢測，檢測到IQ和PHIP[10]。Kataoka等將蘭棉吸附和液液萃取相結合的方法處理卷煙主側流煙氣中的雜環胺，衍生后采用氣相色譜-氮磷檢測器，檢測到AaC、Trp-p-1、IQ和PHIP[11]。Moldoveanu等人采用固相萃取方法對卷煙主流煙氣進行處理，并采用氣相色譜-質譜分析了非極性的雜環胺化合物：哈爾滿，降哈爾滿，AaC和MeAaC[47]。上述方法都存在前處理復雜、檢測靈敏度較低或并不具普適性等缺點，因此改進現有前處理方法并建立一種對所有雜化胺類化合物都適用且較為簡單的、選擇性好、檢測靈敏度高的分析方法，具有重要意義。卷煙主流煙氣中主要雜環胺類的分析1儀器與試劑API4000質譜儀（美國應用生物系統公司）；Agilent1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；CeruleanSM450直線式吸煙機（Cerulean，Ltd.）；Borgwalt-KCRM20H20孔道轉盤式吸煙機（BorgwaldtKC，Inc.）；旋轉蒸發儀R-210（瑞士步琪有限公司）；Milli-Q50超純水儀（美國MILLIPORE公司）；KQ-700DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；pH計(上海雷磁儀器公司)；CP2245電子天平（感量0.0001g，德國Sartorius公司）。2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole(AαC,CAS:26148-68-5);2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole(MeAαC,CAS:68006-83-7),3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole(Trp-p-1,CAS:62450-06-0),3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole(Trp-p-2,CAS:72254-58-1)和2-amino-3,4,7,8-tetramethylimidazo[4,5-f]quinoxaline(4,7,8-TriMeIQx,CAS:95896-78-9)標準品購自Sigma公司。除特別要求以外，均應使用液相色譜純級試劑，水為GB/T6682規定的一級水，甲醇、乙腈、甲酸、甲酸胺、氨水（分析純）、鹽酸（分析純）；Oasis?MCX固相萃取柱（150mg，6mL,Waters公司）；0.45μm有機相針式過濾器（上海安譜）。2卷煙主流煙氣中主要雜環胺類化合物的收集和前處理將卷煙樣品放置于（22±1）℃，相對濕度為（60±2）%的環境中平衡48h，然后選其平均重量在±0.02g范圍和平均吸阻在±49Pa/支范圍內的煙支作為測試煙支。按照每60秒抽吸一口，每口抽吸容量35ml，抽吸持續時間2s。對于直線式吸煙機，用直徑44mm的劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，每張濾片收集5支卷煙的總粒相物，取收集10支卷煙的總粒相物的2張濾片置于100mL錐形瓶中，準確加入50mL甲醇/5%鹽酸（v/v=20/80）溶液；對于轉盤式吸煙機，用直徑92mm的劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，每張濾片收集20支卷煙的總粒相物，取收集20支卷煙的總粒相物的1張濾片置于250mL錐形瓶中，準確加入100mL甲醇/5%鹽酸（v/v=20/80）溶液。超聲萃取30分鐘后，用移液管準確移取25mL萃取液，上樣到已用10mL甲醇和10mL甲醇/5%鹽酸（v/v=20/80）溶液活化后的MCX固相萃取柱（150mg，6mL）上，令萃取液靠重力自然留下，保持流速在1-1.5mL/min左右。然后依次用10ml水、10ml甲醇、10ml甲醇/氨水/水溶液（v/v/v=25/5/70）洗滌，最后用10ml5％氨水甲醇溶液(v/v)進行洗脫，洗脫液加入50μL內標標準溶液，混勻過濾后進LC-MS/MS分析。3液相色譜和質譜條件3.1液相色譜條件：HPLC-MS/MS分析所用分析柱為AgilentSBC18（100mm×4.6mmi.d.,1.8μm），柱溫：30℃；流動相A為0.1%甲酸乙腈溶液，流動相B為甲酸/2mM甲酸銨緩沖溶液（pH=4.5），梯度洗脫條件如表2所示，進樣體積10μL。表2梯度洗脫條件時間（min）流速(μL/min)A(%)B(%)02009010520040601020040601520090103.2串聯質譜條件：離子源：電噴霧電離源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;檢測方式：多反應監測MRM；電噴霧電壓：5500V；氣簾氣壓力: 0.124Mpa；輔助氣1壓力:0.379Mpa；輔助氣2壓力:0.345Mpa；離子源溫度: 600.00℃各化合物的定量離子對、定性離子對、駐留時間以及碰撞能量（CE）參見表3表3質譜檢測參數表化合物定量離子對(m/z)定性離子對(m/z)駐留時間（ms）CE（V）Trp-p-2198.1/181.0198.2/154.05035Trp-p-1212.1/195.1212.1/168.15038AαC184.0/167.1184.0/140.05032MeAαC198.1/181.0198.1/129.050354,7,8-TriMeIQx242.1/227.2242.1/145.25042圖2為主流煙氣中主要雜環胺在標準溶液和樣品中的MRM色譜圖Trp-p-2、2-Trp-p-1、3-AαC、4-MeAαC圖2主流煙氣中主要雜環胺在標準溶液和樣品中的MRM色譜圖4.標準溶液的配制4.1標準儲備母液取適量AαC、MeAαC、Trp-p-1和Trp-p-2標準品用甲醇分別配制成100μg/mL儲備母液。于-18℃冰箱中避光保存，有效期為6個月。4.2一級混合標準儲備液分別吸取AαC、MeAαC、Trp-p-1和Trp-p-2標準儲備母液10mL，2mL、1mL和1mL至100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于-18℃冰箱中避光保存，有效期為6個月。4.3二級混合標準儲備液吸取一級混合標準儲備液10mL至50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于-18℃冰箱中避光保存，有效期為3個月。4.4內標儲備溶液取4,7,8-TriMeIQx標準品用甲醇配制成100μg/mL儲備液。于-18℃冰箱中避光保存，有效期為6個月。4.5內標標準溶液移取內標儲備溶液1mL至100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于-18℃冰箱中避光保存，有效期為3個月。4.6標準工作溶液分別移取適量標準儲備溶液和內標標準溶液于容量瓶中，95%甲醇水溶液定容。即配制成如表4所示的6級標準工作溶液。表4標準工作溶液系列(ng/mL)化合物1#2#3#4#5#6#AαC125102050MeAαC0.20.412410Trp-p-10.10.20.5125Trp-p-20.10.20.5125內標5555555.主流煙氣中主要雜環胺的定性和定量測定待測目標物選擇1個母離子，2個或2個以上子離子，在相同實驗條件下，樣品中待測物質的相對保留時間與標準工作溶液中對應的保留時間偏差在±2.5%之內；且樣品譜圖中各組分特征離子的相對豐度與濃度臨近的標準工作溶液中對應的特征離子的相對豐度進行比較，當相對豐度>50%時，允許偏差±20%，當相對豐度在20-50%時，允許偏差±25%，當相對豐度在10-20%時，允許偏差±30%，當相對豐度<10%時，允許偏差±50%。配制標準工作溶液分析進樣，繪制標準工作曲線，相關系數R2應不小于0.99，內標法定量。主流煙氣中雜環胺類化合物的釋放量由式（1）計算得出，結果以納克每支表示：??????????????????????????????????????（1）式中：m每支卷煙主流煙氣雜環胺類化合物的釋放量，單位為納克每支(ng/cig)。A溶液中雜環胺類化合物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）。L溶液的體積，單位為毫升（mL）n煙支數量，單位為支。三、討論1超聲萃取溶劑選擇雜環胺的堿性較弱，所以采用強酸水溶液和甲醇的混溶液進行提取，本實驗中以5%的鹽酸溶液混合不同比例的甲醇，按體積比將甲醇的比例分別設為0、10、20和50。如圖3所示，但5%的鹽酸與甲醇的比例超過80/20時，萃取結果基本不變。同時由于甲醇比例越高，萃取出的干擾成分就越多，因此確定萃取的溶液為甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=20/80)。1-5%鹽酸溶液、2-甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=10/90)、3-甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=20/80)、4-甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=50/50)圖3萃取溶劑中甲醇比例的影響2不同萃取方式的影響本實驗中比較了兩種提取方式對煙氣中雜環胺類化合物測定的影響。一種超聲萃取，一般來說，超生萃取的優勢是耗時較短，萃取效率較高，缺點是超聲時間如果較長，溫度會上升，有機溶劑的揮發的可能性增大，另外萃取的干擾成分也較多。另一種是震蕩萃取，震蕩萃取時發熱較少，但要較長時間的萃取，才能萃取完全。圖4顯示了超聲萃取30分鐘和震蕩萃取60分鐘的比較結果，由圖中可見對于煙氣中雜環胺類化合物，超聲萃取的效率高于震蕩萃取。故采用超聲萃取方式來提取目標物。圖4不同萃取方式的影響3不同超聲萃取時間的影響本實驗中選擇了超聲15min，30min，45min和60min四個條件來確定超聲萃取的時間。由圖5可見，在超聲30min后，目標物的含量基本不變，為節約時間和防止引入更多的干擾成分，我們選擇30min為萃取時間。圖5不同超聲萃取時間的影響4固相萃取過程中待測目標物的保留情況本實驗所采用的WatersOasisMCX固相萃取小柱屬混合型陽離子交換固相萃取柱，對堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度，基質為聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，具有雙重保留模式：離子交換和反相，適合與復雜基質中目標物的除雜和純化。為考察固相萃取過程中目標物的保留情況，分別收集固相萃取各個步驟的溶液，進液質分析，考察保留情況。圖6顯示了整個固相萃取過程，實驗中分別收集上樣、淋洗和洗脫等步驟的流出液。如圖所示，待測的4種雜環胺在上樣和凈化過程中幾乎都保留在固相萃取小柱上，只有極微量（<0.02%）的流失，在固相萃取過程中目標物與雜質達到較好的分離；同時由于內標在固相萃取過程中發生了部分流失，所以選擇將目標物洗脫后再加內標，由圖7可見，目標物在萃取過程中幾乎全部轉移到洗脫后的溶液中，從而保證了定量的準確性。圖6固相萃取凈化過程1-上樣、2-水淋洗3-甲醇淋洗、4-氨水甲醇淋洗液淋洗5-5%氨水甲醇溶液洗脫圖7固相萃取過程中待測目標物的分布5待測目標物洗脫體積的確定增大洗脫體積能夠保證把目標物盡可能全部洗脫出來，但目標物的濃度也會隨著體積增大而降低，而減小洗脫體積可能產生洗脫不完全的風險，因而選擇適宜的洗脫體積時需二者兼顧。實驗中分別收集0-5mL、5-10mL、10-15mL、15-20mL和20-25mL洗脫液進行測定。如圖8所示，當采用10mL洗脫液洗脫時，已有99.5%以上的待測目標物被洗脫，因此選擇10mL洗脫液進行洗脫。1-5mL、2-10mL、3-15mL、4-20mL、5-25mL圖8洗脫液洗脫體積的影響6流動相pH值的影響本實驗中液相色譜分析采用的是水-乙腈體系，水相為甲酸/甲酸銨緩沖溶液。為研究緩沖溶液pH對色譜峰響應的影響，分別配制了pH值為3.5、4、4.5、5的緩沖溶液。如圖9所示，當緩沖溶液pH值為4.5時，色譜峰的整體響應最高。AeraAera圖9流動相pH值的影響7前處理后樣品的穩定性為考察樣品的穩定性，將前處理后的樣品密閉于2mL色譜小瓶中，4℃冷藏保存，分別在前處理當天和第3、5、7天進樣。如圖10所示，4種雜環胺在三日內穩定性良好。圖10前處理后樣品的穩定性8不同類型吸煙機的影響目前行業內常用的吸煙機有轉盤式和直線式兩種，實驗比較了兩種類型吸煙機對測定結果的影響。對于直線式吸煙機，抽吸10支卷煙，兩張44mm劍橋濾片捕集，50mL5%鹽酸/甲醇溶液(80/20)萃取，上樣25mL；對于轉盤式吸煙機，抽吸20支卷煙，一張92mm劍橋濾片捕集，100mL5%鹽酸/甲醇溶液(80/20)萃取，上樣25mL。如圖11所示，轉盤式和直線式吸煙機測定結果相對偏差小于5%，無顯著差異。圖11不同類型吸煙機的影響9標準曲線方程和檢測限如表5所示，本實驗中Trp-p-2、Trp-P-1、AaC、MeAaC等四種雜環胺線性良好，通過計算10次最低濃度標準溶液測定結果的標準偏差，得到檢出限分別為0.09、0.08、0.56、0.12ng/cig。表5四種雜環胺的標準曲線方程和定量檢出限化合物標準曲線R2檢出限（ng/cig）定量限（ng/cig）Trp-p-2Y=0.307x+0.007210.99980.090.29Trp-p-1Y=0.373x+0.1820.99960.080.27AαCY=0.404x+0.1370.99980.561.85MeAαCY=0.348x+0.04050.99880.120.3910精密度和回收率由表6可見Trp-p-2、Trp-P-1、AaC、MeAaC等四種雜環胺的日內精密度結果分別為7.45%、6.37%、7.93%和7.10%，日間精密度結果分別為8.88%、7.33%、7.73%和9.31%。回收率分別在85.1~107.7%、83.2~95.6%、89.6~110.7%和81.0~100.4%之間。表6四種雜環胺的精密度和回收率化合物日內精密度/%（n=6）日間精密度/%（n=5）添加濃度/(ng/mL)回收率范圍/%Trp-p-27.458.880.492.9~107.71.085.1~97.92.096.2~101.8Trp-p-16.377.330.487.7~95.61.083.2~92.02.087.5~96.5AαC7.937.734.089.6~110.710.0100.7~109.920.0101.2~110.3MeAαC7.109.310.887.6~100.42.085.9~92.34.081.0~94.211雜環胺比對實驗結果本項目開展了比對實驗，選擇了參比（烤煙型）卷煙、參比（混合型）卷煙、白沙、紅塔山、中南海5個牌號的卷煙進行分析。鄭州煙草研究院、云南紅塔集團、河南中煙工業公司、廣東中煙工業公司、湖北中煙工業公司和國家煙草質量監督檢驗中心等6家實驗室參與了比對實驗。每個牌號卷煙各家實驗室均測定5次，表中列出了6家實驗室的測定結果。由表7結果可見，6家實驗室的RSD除一個為12.12%外，均小于10%，說明各家實驗室結果較為接近，再現性好。表7雜環胺比對實驗結果ng/cig化合物鄭州院紅塔河南廣東湖北質檢平均值RSD參比（烤煙型)Trp-p-20.710.800.750.750.800.770.764.48%Trp-p-11.040.891.041.001.030.981.005.77%AαC10.108.989.7010.499.799.899.825.11%MeAαC1.281.141.261.171.261.181.214.91%參比（混合型）Trp-p-20.790.840.811.010.840.930.879.71%Trp-p-11.221.341.231.151.251.221.245.09%AαC15.4714.8115.6117.5115.7215.0615.706.07%MeAαC1.321.561.381.341.381.341.396.49%白沙Trp-p-20.920.920.910.950.920.870.922.95%Trp-p-11.250.981.261.441.261.191.2312.12%AαC12.3612.1012.0512.1412.4612.3512.241.38%MeAαC1.431.221.451.251.421.401.367.46%紅塔山Trp-p-20.90.910.951.000.920.890.934.58%Trp-p-11.461.421.401.481.471.391.442.61%AαC14.9914.5514.9814.4115.1715.0814.862.08%MeAαC1.661.601.631.411.561.551.575.51%中南海Trp-p-21.291.231.291.031.281.151.218.58%Trp-p-11.611.491.631.571.621.551.583.45%AαC17.9617.4317.8019.2717.8516.8417.864.51%MeAαC1.731.651.751.451.721.621.656.78%12卷煙樣品的測定結果與文獻報道結果的比較本項目測定了20個牌號的國內外卷煙，測定結果見表8。由表中結果可見Trp-p-2的含量為0.39~3.25ng/cig、Trp-p-1的含量為0.61~2.44ng/cig、AαC的含量為9.01~41.40ng/cig、MeAαC的含量為0.70~3.53ng/cig。文獻[55-56]中報道了卷煙主流煙氣中雜環胺的含量范圍：Trp-p-2的含量為0.82~1.1ng/cig、Trp-p-1的含量為0.29~0.48ng/cig、AαC的含量為25~260ng/cig、MeAαC的含量為2~37ng/cig，兩者結果進行比較，本實驗樣品Trp-p-2和Trp-p-1的含量范圍與文獻比較接近，AαC和MeAαC的含量因所測試樣品的差異而處于含量范圍的低端。表8卷煙主流煙氣中四種雜環胺的測定結果（ng/cig）編號卷煙類型Trp-p-2Trp-p-1AαCMeAαC1#國外混合型2.582.2732.603.362#國外混合型1.991.9423.602.543#國外混合型1.951.9623.792.394#國外混合型2.101.9125.642.325#國外混合型3.252.4441.403.536#國外混合型1.501.4220.802.077#國外混合型0.390.619.010.788#國內混合型1.471.4718.871.739#國內混合型1.621.7818.901.9710#國內混合型1.561.4617.721.6511#國內烤煙型1.231.1612.641.4112#國內烤煙型1.250.9814.311.5413#國內烤煙型1.161.049.011.0714#國內烤煙型1.681.2214.571.3715#國內烤煙型1.421.3414.321.4216#國內烤煙型1.331.1510.751.2117#國內烤煙型1.161.3511.061.2218#國內烤煙型1.831.7331.402.6319#國內烤煙型1.971.7433.303.3720#國內烤煙型0.660.759.330.70

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