SonicHedgehog信號通路在人肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)、作用及臨床意義探究一、引言1.1研究背景與目的1.1.1肝細(xì)胞肝癌的現(xiàn)狀肝細(xì)胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌類型，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署（IARC）2020年發(fā)布的全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肝癌新增病例約91萬例，在所有惡性腫瘤中發(fā)病率位居第6位；死亡病例約83萬例，死亡率高居第3位。在中國，肝癌的形勢更為嚴(yán)峻，新增病例數(shù)達(dá)41萬例，位居國內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病第5位；死亡病例數(shù)為39.1萬例，居癌癥死亡第2位。肝癌起病隱匿，早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的最佳時機(jī)。而且，肝癌具有惡性程度高、病情進(jìn)展快、對傳統(tǒng)放化療不敏感等特點(diǎn)，導(dǎo)致患者預(yù)后較差，5年生存率較低。目前，雖然肝癌的治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、介入治療、靶向治療和免疫治療等，但總體治療效果仍不理想。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，對于提高肝癌的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有重要意義。1.1.2SonicHedgehog信號通路概述SonicHedgehog（Shh）信號通路是一種在進(jìn)化上高度保守的信號傳導(dǎo)通路，最初在果蠅胚胎發(fā)育中被發(fā)現(xiàn)。該通路在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持、干細(xì)胞增殖與分化等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Shh信號通路的核心成員包括：Shh配體、跨膜受體Patched（Ptch）和Smoothened（Smo），以及下游轉(zhuǎn)錄因子GLI家族（GLI1-GLI3）。在正常生理狀態(tài)下，當(dāng)沒有Shh配體存在時，Ptch與Smo結(jié)合，抑制Smo的活性，從而阻止下游信號的傳遞。此時，GLI蛋白與抑制因子（如SuppressorofFused，Sufu）結(jié)合，形成復(fù)合物，在蛋白酶體的作用下被加工成轉(zhuǎn)錄抑制因子，抑制靶基因的表達(dá)。當(dāng)Shh配體與Ptch結(jié)合后，Ptch對Smo的抑制作用被解除，Smo被激活并發(fā)生一系列的磷酸化修飾，進(jìn)而激活下游的信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。激活的Smo促使GLI蛋白從與Sufu等形成的復(fù)合物中解離出來，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為。Shh信號通路在胚胎發(fā)育過程中參與了多個器官和組織的形成，如神經(jīng)管的背腹軸分化、肢體的發(fā)育、肺的形成等。在成體組織中，Shh信號通路也參與維持組織的穩(wěn)態(tài)和再生，如肝臟、皮膚、腸道等組織的修復(fù)和更新。然而，當(dāng)Shh信號通路異常激活時，可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括基底細(xì)胞癌、髓母細(xì)胞瘤、胰腺癌、肝癌等。1.1.3研究目的本研究旨在探究SonicHedgehog信號通路在人肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)情況，分析其與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性，探討該信號通路在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，為肝癌的早期診斷、預(yù)后評估及靶向治療提供理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。具體研究內(nèi)容包括：（1）檢測Shh信號通路相關(guān)分子（Shh、Ptch、Smo、GLI1等）在肝癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，比較其差異，明確該信號通路在肝癌中的激活狀態(tài)；（2）分析Shh信號通路相關(guān)分子的表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)（如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、血管侵犯等）之間的關(guān)系，評估其對肝癌預(yù)后的影響；（3）通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究Shh信號通路的激活或抑制對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響，并初步探討其作用機(jī)制；（4）在體內(nèi)動物模型中驗(yàn)證Shh信號通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為肝癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，SonicHedgehog信號通路在腫瘤領(lǐng)域的研究備受關(guān)注，其與肝細(xì)胞肝癌的關(guān)系也成為眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)。國內(nèi)外大量研究表明，Shh信號通路在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在國外，有研究通過對肝癌組織芯片及細(xì)胞系的檢測，發(fā)現(xiàn)Shh信號通路的關(guān)鍵分子Shh、Ptch、Smo、GLI1等在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織。例如，[具體文獻(xiàn)1]利用免疫組化和實(shí)時定量PCR技術(shù)，對100例肝癌患者的腫瘤組織及配對的癌旁正常組織進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示Shh、Smo和GLI1的mRNA和蛋白表達(dá)水平在肝癌組織中顯著上調(diào)，且高表達(dá)的Shh、Smo和GLI1與肝癌患者的腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯及不良預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，激活Shh信號通路可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制該信號通路則能顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。[具體文獻(xiàn)2]通過構(gòu)建肝癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)阻斷Shh信號通路能夠抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，延長小鼠的生存期，揭示了Shh信號通路在肝癌體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用。國內(nèi)的研究也取得了豐碩的成果。[具體文獻(xiàn)3]采用RT-PCR和免疫組化方法檢測了80例肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織中Shh信號通路相關(guān)分子的表達(dá)，結(jié)果顯示Shh、Ptch、Smo在肝癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，且Smo的表達(dá)與肝癌的分化程度、門靜脈癌栓形成密切相關(guān)。[具體文獻(xiàn)4]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，Shh信號通路的激活可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，一些研究還探討了Shh信號通路與肝癌其他信號通路之間的相互作用，如與Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/AKT信號通路等的交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)這些信號通路之間存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響著肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。盡管目前關(guān)于Shh信號通路與肝細(xì)胞肝癌的研究已取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。首先，對于Shh信號通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)制尚未完全明確，特別是其與其他信號通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及對肝癌細(xì)胞干性維持、免疫逃逸等方面的影響還需要進(jìn)一步深入研究。其次，現(xiàn)有的研究大多集中在Shh信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)及功能驗(yàn)證上，對于如何將這些研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，如開發(fā)針對Shh信號通路的靶向治療藥物，還需要更多的臨床試驗(yàn)和探索。此外，不同研究之間的結(jié)果存在一定的差異，可能與研究對象、實(shí)驗(yàn)方法、樣本量等因素有關(guān)，這也需要進(jìn)一步的大樣本、多中心研究來加以驗(yàn)證和統(tǒng)一。本研究擬在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探討Shh信號通路在人肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)、與臨床病理特征的關(guān)系及其作用機(jī)制，以期為肝癌的診治提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，具有一定的創(chuàng)新性和重要的臨床價(jià)值。1.3研究方法與意義1.3.1研究方法（1）免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）：收集肝癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織及配對的癌旁正常組織標(biāo)本，經(jīng)固定、石蠟包埋、切片等處理后，采用免疫組化技術(shù)檢測Shh信號通路相關(guān)分子（Shh、Ptch、Smo、GLI1等）在組織中的蛋白表達(dá)水平及定位。通過觀察陽性染色的強(qiáng)度和范圍，半定量分析各分子的表達(dá)情況，比較肝癌組織與癌旁正常組織中相關(guān)分子表達(dá)的差異，初步明確Shh信號通路在肝癌組織中的激活狀態(tài)，并分析其與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性。免疫組化技術(shù)具有特異性強(qiáng)、定位準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能夠直觀地顯示目標(biāo)蛋白在組織細(xì)胞中的分布情況，為研究Shh信號通路相關(guān)分子在肝癌組織中的表達(dá)及功能提供重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。（2）實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-TimeQuantitativePolymeraseChainReaction，RT-qPCR）：提取肝癌組織、癌旁正常組織及肝癌細(xì)胞系中的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板，利用特異性引物對Shh、Ptch、Smo、GLI1等基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。通過檢測Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，精確分析Shh信號通路相關(guān)基因在肝癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)差異，進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組化的結(jié)果，并為后續(xù)的機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支持。RT-qPCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測基因的表達(dá)水平，是研究基因表達(dá)調(diào)控的常用技術(shù)之一。（3）蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot，WB）：提取肝癌組織、癌旁正常組織及肝癌細(xì)胞系的總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用特異性抗體對Shh、Ptch、Smo、GLI1等蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測，通過化學(xué)發(fā)光法顯影，分析蛋白條帶的灰度值，半定量比較各蛋白在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證Shh信號通路相關(guān)分子在肝癌中的表達(dá)情況。WesternBlot技術(shù)能夠直接檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)量和分子量，是研究蛋白質(zhì)表達(dá)和翻譯后修飾的重要手段，與免疫組化和RT-qPCR技術(shù)相互印證，可全面揭示Shh信號通路相關(guān)分子在肝癌中的表達(dá)變化。（4）細(xì)胞培養(yǎng)與處理：選擇人肝癌細(xì)胞系（如HepG2、Huh7等）和正常肝細(xì)胞系（如LO2），在含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對照組、Shh信號通路激活組和Shh信號通路抑制組。激活組通過添加外源性Shh配體或使用Smo激動劑（如purmorphamine）處理細(xì)胞，以激活Shh信號通路；抑制組則使用Shh信號通路抑制劑（如cyclopamine）處理細(xì)胞，阻斷信號通路的傳導(dǎo)。通過對細(xì)胞的培養(yǎng)和不同處理，研究Shh信號通路的激活或抑制對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，能夠?yàn)檠芯縎hh信號通路在肝癌細(xì)胞中的功能提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型，通過對細(xì)胞的干預(yù)和處理，可以模擬體內(nèi)的生理和病理狀態(tài)，深入探討信號通路的作用機(jī)制。（5）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法或EdU法檢測不同處理組肝癌細(xì)胞的增殖能力。CCK-8法是基于細(xì)胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值，間接反映細(xì)胞的增殖情況。EdU法是一種新型的細(xì)胞增殖檢測方法，EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量，直觀地反映細(xì)胞的增殖情況。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，明確Shh信號通路對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響，為進(jìn)一步研究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供依據(jù)。（6）細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)：使用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)時，將無Matrigel包被的Transwell小室置于24孔板中，在上室加入不同處理組的肝癌細(xì)胞懸液，下室加入含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)一定時間后，擦去上室未遷移的細(xì)胞，固定、染色遷移到下室的細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞的數(shù)量，評估細(xì)胞的遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)則在上室預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，其他步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同，通過檢測穿過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量，評價(jià)細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛑苯臃从掣伟┘?xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，研究Shh信號通路對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，有助于揭示肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。（7）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組肝癌細(xì)胞的凋亡情況。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，在細(xì)胞凋亡早期，PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV能夠與PS特異性結(jié)合，從而標(biāo)記凋亡早期細(xì)胞；PI是一種核酸染料，能夠穿透壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，從而標(biāo)記壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀檢測AnnexinV-FITC和PI雙染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，分析不同處理組肝癌細(xì)胞凋亡率的變化，探討Shh信號通路對肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)是研究細(xì)胞死亡機(jī)制的重要方法，通過檢測細(xì)胞凋亡率，能夠深入了解Shh信號通路在肝癌細(xì)胞生存與死亡調(diào)控中的作用。（8）動物實(shí)驗(yàn)：建立肝癌小鼠模型，可采用皮下接種肝癌細(xì)胞或原位注射肝癌細(xì)胞的方法。將小鼠隨機(jī)分為對照組、Shh信號通路激活組和Shh信號通路抑制組。激活組通過瘤內(nèi)注射Shh配體或腹腔注射Smo激動劑處理小鼠，抑制組則腹腔注射Shh信號通路抑制劑處理小鼠，對照組給予等量的生理鹽水。定期觀察小鼠的一般狀態(tài)、體重變化，測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行病理切片、免疫組化、RT-qPCR等檢測，分析Shh信號通路的激活或抑制對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及相關(guān)分子表達(dá)的影響。動物實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟隗w內(nèi)模擬肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，驗(yàn)證體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，為研究Shh信號通路在肝癌中的作用及靶向治療提供更直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.3.2研究意義（1）理論意義：肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個基因和信號通路的異常改變。目前，雖然對肝癌的發(fā)病機(jī)制有了一定的認(rèn)識，但仍存在許多未知領(lǐng)域。SonicHedgehog信號通路作為一條在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起重要作用的信號傳導(dǎo)通路，其在肝癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。本研究通過檢測Shh信號通路相關(guān)分子在肝癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析其與肝癌臨床病理特征的關(guān)系，并深入研究該信號通路對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示肝癌的發(fā)病機(jī)制，豐富對肝癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識。同時，研究Shh信號通路與肝癌其他信號通路之間的相互作用，有助于闡明肝癌細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)。（2）實(shí)踐意義：在肝癌的診斷方面，尋找有效的生物標(biāo)志物對于提高肝癌的早期診斷率具有重要意義。本研究通過分析Shh信號通路相關(guān)分子的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性，有可能篩選出具有診斷價(jià)值的分子標(biāo)志物，為肝癌的早期診斷提供新的檢測指標(biāo)。例如，如果發(fā)現(xiàn)某些Shh信號通路相關(guān)分子在肝癌早期即出現(xiàn)明顯的表達(dá)變化，且與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，那么這些分子有望作為肝癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，通過檢測患者血清或組織中這些分子的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)肝癌的早期篩查和診斷，提高患者的治愈率和生存率。在肝癌的治療方面，目前肝癌的治療手段雖然多樣，但總體治療效果仍不理想，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法是肝癌研究的重要方向。SonicHedgehog信號通路在肝癌中異常激活，且對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為具有重要調(diào)控作用，因此，該信號通路有望成為肝癌靶向治療的新靶點(diǎn)。本研究通過深入探討Shh信號通路在肝癌中的作用機(jī)制，為開發(fā)針對該信號通路的靶向治療藥物提供理論依據(jù)。例如，針對Shh信號通路中的關(guān)鍵分子（如Smo、GLI1等）設(shè)計(jì)特異性抑制劑，阻斷信號通路的傳導(dǎo)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，從而為肝癌的治療提供新的策略。此外，聯(lián)合應(yīng)用Shh信號通路抑制劑與其他治療方法（如手術(shù)、化療、放療、免疫治療等），有可能提高肝癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。在肝癌的預(yù)后評估方面，準(zhǔn)確評估肝癌患者的預(yù)后對于制定合理的治療方案和判斷患者的生存情況具有重要意義。本研究通過分析Shh信號通路相關(guān)分子的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，可為肝癌的預(yù)后評估提供新的指標(biāo)。如果發(fā)現(xiàn)某些Shh信號通路相關(guān)分子的高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，那么這些分子可以作為評估肝癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，幫助醫(yī)生更好地預(yù)測患者的生存情況，制定個性化的治療方案，提高患者的生活質(zhì)量和生存率。綜上所述，本研究對SonicHedgehog信號通路在人肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及意義進(jìn)行深入研究，無論是在理論上還是實(shí)踐中都具有重要的價(jià)值，有望為肝癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的思路和靶點(diǎn)，對提高肝癌患者的診治水平和生存質(zhì)量具有重要的推動作用。二、SonicHedgehog信號通路的結(jié)構(gòu)與功能2.1信號通路的組成元件2.1.1SHH配體SonicHedgehog（SHH）配體屬于Hedgehog（HH）蛋白家族，在哺乳動物中，HH家族還包括IndianHedgehog（IHH）和DesertHedgehog（DHH），其中SHH的作用最為廣泛。SHH蛋白最初合成時是一個相對分子質(zhì)量約為45kDa的前體蛋白，其包含氨基端（N端）和羧基端（C端）兩個結(jié)構(gòu)域。在翻譯后的加工過程中，C端結(jié)構(gòu)域發(fā)揮自身蛋白水解酶活性，將SHH前體蛋白裂解為相對分子質(zhì)量約為19kDa的N端片段（SHH-N）和相對分子質(zhì)量約為26kDa的C端片段（SHH-C）。SHH-N具有信號活性，而SHH-C具有膽固醇轉(zhuǎn)移酶功能，其將膽固醇分子共價(jià)結(jié)合到SHH-N的羧基端，隨后，在酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下，SHH-N氨基端的半胱氨酸發(fā)生棕櫚酰化修飾。經(jīng)過這一系列的修飾，SHH配體才獲得完全的生物學(xué)功能。修飾后的SHH配體在類似于轉(zhuǎn)運(yùn)子功能的跨膜蛋白Dispatched（Disp）的幫助下，從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，進(jìn)而發(fā)揮其信號傳導(dǎo)作用。在信號通路激活過程中，SHH配體起著起始信號的關(guān)鍵作用。當(dāng)SHH配體以自分泌或旁分泌的方式作用于靶細(xì)胞時，它首先與靶細(xì)胞表面的受體Patched（Ptch）結(jié)合。這種結(jié)合是SHH信號通路激活的起始步驟，它打破了Ptch對下游Smoothened（Smo）受體的抑制狀態(tài)，從而開啟了后續(xù)的信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，使得細(xì)胞能夠接收到SHH信號并做出相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)，如調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移等過程。2.1.2Ptch受體Ptch受體是由腫瘤抑制基因Patched編碼的跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)包含12個疏水跨膜區(qū)和兩個較大的胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由單一肽鏈構(gòu)成。在哺乳動物中，存在Ptch1和Ptch2兩種Ptch受體，它們在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定的相似性，但在組織分布和對SHH信號通路的調(diào)控中也存在一些差異。在正常生理狀態(tài)下，當(dāng)沒有SHH配體存在時，Ptch受體定位于初級纖毛，能夠阻止Smo在初級纖毛中的積累并抑制Smo的活性。其抑制機(jī)制可能與Ptch受體通過與Smo直接相互作用，或者通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的某些信號分子，來維持Smo處于非活性狀態(tài)。此時，下游的信號傳導(dǎo)被阻斷，細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)基因表達(dá)處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，細(xì)胞維持正常的生理功能。例如，在胚胎發(fā)育過程中，當(dāng)某一組織或器官不需要過度增殖或分化時，Ptch對Smo的抑制作用確保了細(xì)胞不會受到異常的增殖或分化信號刺激，維持組織器官的正常發(fā)育進(jìn)程。當(dāng)SHH配體與Ptch受體結(jié)合后，Ptch的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而解除了對Smo的抑制作用。這使得Smo能夠被激活，進(jìn)而啟動下游的信號傳導(dǎo)通路，激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控靶基因的表達(dá)，最終影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。如在腫瘤發(fā)生過程中，如果Ptch受體發(fā)生突變，導(dǎo)致其不能正常抑制Smo，即使沒有SHH配體的存在，Smo也可能被異常激活，從而導(dǎo)致SHH信號通路的持續(xù)激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。2.1.3SMO受體與Gli蛋白Smo受體是一種原癌基因編碼的跨膜蛋白，與G蛋白偶聯(lián)受體同源，由7個跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成，N端位于細(xì)胞外，C端位于細(xì)胞內(nèi)，跨膜區(qū)氨基酸序列高度保守，C末端的絲氨酸與蘇氨酸殘基為磷酸化部位，可在蛋白激酶催化時結(jié)合磷酸基團(tuán)。在正常情況下，由于Ptch受體的抑制作用，Smo處于非活化狀態(tài)。當(dāng)SHH配體與Ptch結(jié)合，Ptch內(nèi)化后，Smo的抑制被解除，Smo發(fā)生一系列的磷酸化修飾，從而被激活。激活后的Smo會從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到初級纖毛的頂端，這一過程對于Smo發(fā)揮其信號傳導(dǎo)功能至關(guān)重要。在初級纖毛頂端，Smo與下游的信號分子相互作用，啟動信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。Gli蛋白是SHH信號通路的下游轉(zhuǎn)錄因子，包括Gli1、Gli2和Gli3，它們在SHH信號通路傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。在沒有SHH信號時，Gli蛋白與抑制因子（如SuppressorofFused，Sufu）結(jié)合，形成復(fù)合物。此時，Gli蛋白在蛋白激酶A（PKA）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）和酪蛋白激酶1α（CK1α）等的作用下發(fā)生磷酸化，進(jìn)而被蛋白酶體加工成轉(zhuǎn)錄抑制因子形式，如Gli3會被加工成截短的Gli3R，這些轉(zhuǎn)錄抑制因子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，抑制SHH信號通路靶基因的表達(dá)。當(dāng)SHH信號通路激活時，Smo激活促使Gli蛋白從與Sufu等形成的復(fù)合物中解離出來。解離后的Gli蛋白發(fā)生去磷酸化等修飾，轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄激活因子形式，如Gli1、Gli2-A和Gli3-A等，它們進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因參與調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因CyclinD1、c-Myc，抗凋亡基因Bcl-2，以及與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因MMP-2、MMP-9等，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控。2.2信號通路的激活機(jī)制2.2.1經(jīng)典激活途徑在SonicHedgehog信號通路的經(jīng)典激活途徑中，SHH配體起著起始信號的關(guān)鍵作用。當(dāng)SHH配體從分泌細(xì)胞釋放后，以自分泌或旁分泌的方式與靶細(xì)胞表面的Ptch受體結(jié)合。Ptch受體原本對Smo受體具有抑制作用，二者結(jié)合后，Ptch的構(gòu)象發(fā)生改變并內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，從而解除了對Smo的抑制。Smo是一種7次跨膜蛋白，在沒有SHH信號時，其活性被Ptch抑制，處于非活化狀態(tài)。一旦Ptch對Smo的抑制被解除，Smo的C末端會發(fā)生一系列的磷酸化修飾。這些磷酸化修飾使得Smo從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到初級纖毛的頂端。初級纖毛是細(xì)胞表面的一種特殊結(jié)構(gòu)，在SHH信號傳導(dǎo)中扮演著重要角色。在初級纖毛頂端，Smo與下游的信號分子相互作用，啟動信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。其中，與Smo相互作用的重要分子包括抑制因子Sufu以及轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白。在沒有SHH信號時，Gli蛋白與Sufu結(jié)合形成復(fù)合物。此時，Gli蛋白在PKA、GSK3β和CK1α等蛋白激酶的作用下發(fā)生磷酸化。磷酸化后的Gli蛋白會被蛋白酶體加工成轉(zhuǎn)錄抑制因子形式，如Gli3會被加工成截短的Gli3R。這些轉(zhuǎn)錄抑制因子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到SHH信號通路靶基因的啟動子區(qū)域，抑制靶基因的表達(dá)。當(dāng)SHH信號通路激活，Smo激活促使Gli蛋白從與Sufu形成的復(fù)合物中解離出來。解離后的Gli蛋白發(fā)生去磷酸化等修飾，轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄激活因子形式，如Gli1、Gli2-A和Gli3-A等。這些轉(zhuǎn)錄激活因子進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。被激活的靶基因包括細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因CyclinD1、c-Myc，它們參與調(diào)控細(xì)胞的增殖過程；抗凋亡基因Bcl-2，其表達(dá)上調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活；以及與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因MMP-2、MMP-9等，這些基因的表達(dá)變化會影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過這一系列的分子事件，SHH信號通路實(shí)現(xiàn)了從細(xì)胞外信號到細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的傳遞，從而對細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡等生物學(xué)行為產(chǎn)生重要影響。2.2.2非經(jīng)典激活途徑除了經(jīng)典激活途徑外，SonicHedgehog信號通路還存在非經(jīng)典激活途徑，該途徑不依賴SHH配體的參與。在非經(jīng)典激活途徑中，有多種機(jī)制可以激活Smo受體或下游的Gli蛋白，從而啟動信號傳導(dǎo)。其中一種機(jī)制是通過其他信號分子的作用來激活Smo。例如，一些研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族GTP酶（如RhoA、Rac1等）可以與Smo相互作用，調(diào)節(jié)Smo的活性。當(dāng)細(xì)胞受到某些刺激時，Rho家族GTP酶被激活，它們可以促進(jìn)Smo的磷酸化和激活，進(jìn)而啟動下游的信號傳導(dǎo)，即使在沒有SHH配體的情況下，也能使細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)。Src激酶也被報(bào)道參與了Smo的非經(jīng)典激活過程。Src激酶可以磷酸化Smo的特定氨基酸殘基，改變Smo的構(gòu)象，使其激活并啟動信號傳導(dǎo)。細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化也可能導(dǎo)致SonicHedgehog信號通路的非經(jīng)典激活。當(dāng)細(xì)胞處于低氧環(huán)境時，低氧誘導(dǎo)因子（HIF）的表達(dá)上調(diào)。HIF可以與Gli蛋白相互作用，促進(jìn)Gli蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而繞過了SHH配體與Ptch、Smo的經(jīng)典激活步驟。細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度變化也可能影響SonicHedgehog信號通路的非經(jīng)典激活。一些研究表明，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高可以激活某些蛋白激酶，這些激酶可以作用于Smo或Gli蛋白，調(diào)節(jié)它們的活性，進(jìn)而激活信號通路。在某些腫瘤細(xì)胞中，還發(fā)現(xiàn)了一些基因突變導(dǎo)致的SonicHedgehog信號通路非經(jīng)典激活。例如，Ptch基因的失活突變或Smo基因的激活突變，都可能使Smo處于持續(xù)激活狀態(tài)，即使沒有SHH配體的存在，也能啟動下游的信號傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這些非經(jīng)典激活途徑的存在，使得SonicHedgehog信號通路的調(diào)控更加復(fù)雜，也為腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展提供了更多的潛在機(jī)制。2.3信號通路在正常生理過程中的作用2.3.1胚胎發(fā)育中的作用SonicHedgehog信號通路在胚胎發(fā)育過程中扮演著不可或缺的角色，對多個重要器官和系統(tǒng)的形成與發(fā)育起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，Shh信號通路參與神經(jīng)管的背腹軸分化。在神經(jīng)管發(fā)育早期，位于神經(jīng)管腹側(cè)的底板細(xì)胞分泌Shh配體，形成一個從腹側(cè)到背側(cè)的Shh濃度梯度。不同濃度的Shh信號作用于神經(jīng)管不同部位的細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生不同類型的神經(jīng)元。高濃度的Shh信號誘導(dǎo)腹側(cè)神經(jīng)管細(xì)胞分化為運(yùn)動神經(jīng)元，而低濃度的Shh信號則促使中間神經(jīng)元的產(chǎn)生。研究表明，在小鼠胚胎中，若Shh基因缺失，神經(jīng)管腹側(cè)的運(yùn)動神經(jīng)元無法正常發(fā)育，導(dǎo)致小鼠出生后因運(yùn)動功能障礙而死亡。Shh信號還參與調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和分化，神經(jīng)嵴細(xì)胞在胚胎發(fā)育過程中可遷移到不同部位，分化為多種細(xì)胞類型，如感覺神經(jīng)元、交感神經(jīng)元、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞等。Shh信號對于神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移路徑和分化方向具有重要的引導(dǎo)和調(diào)控作用。骨骼系統(tǒng)的發(fā)育也離不開Shh信號通路的參與。在肢體發(fā)育過程中，Shh信號在極化活性區(qū)（ZoneofPolarizingActivity，ZPA）中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ZPA位于肢體芽的后部，Shh配體從ZPA分泌后，形成從前向后的濃度梯度。這一濃度梯度決定了肢體骨骼的前后軸模式，即從拇指到小指（或從大腳趾到小腳趾）的骨骼結(jié)構(gòu)。例如，在雞胚肢體發(fā)育實(shí)驗(yàn)中，將含有Shh蛋白的珠子植入正常情況下不表達(dá)Shh的肢體芽前部，可誘導(dǎo)額外的手指（或腳趾）結(jié)構(gòu)形成，且這些額外手指（或腳趾）的形態(tài)和位置與Shh濃度相關(guān)。在長骨發(fā)育過程中，Shh信號調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和分化。Shh信號促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，維持軟骨生長板的活性，同時也參與調(diào)控軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化過程，對于骨骼的生長和塑形至關(guān)重要。心血管系統(tǒng)的發(fā)育同樣受到Shh信號通路的影響。在心臟發(fā)育過程中，Shh信號參與心臟中胚層的誘導(dǎo)和分化。早期胚胎中，Shh信號在心臟原基周圍的中胚層細(xì)胞中表達(dá)，促進(jìn)這些細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，并參與心臟的形態(tài)發(fā)生和結(jié)構(gòu)形成。研究發(fā)現(xiàn)，Shh基因敲除的小鼠心臟發(fā)育異常，表現(xiàn)為心臟結(jié)構(gòu)缺陷和功能障礙。Shh信號還參與血管的生成和發(fā)育。它可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，調(diào)節(jié)血管的生成和重塑過程，對于胚胎期血管系統(tǒng)的建立和完善具有重要意義。2.3.2組織穩(wěn)態(tài)維持中的作用在成體組織中，SonicHedgehog信號通路對組織穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮著重要作用，主要體現(xiàn)在對成體組織干細(xì)胞的維持、細(xì)胞增殖與分化平衡的調(diào)節(jié)以及參與組織修復(fù)和再生等方面。成體組織干細(xì)胞是維持組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)損傷的重要細(xì)胞群體，Shh信號通路對其維持起著關(guān)鍵作用。以皮膚組織為例，皮膚中的毛囊干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞，能夠自我更新并分化為多種皮膚細(xì)胞類型，如角質(zhì)形成細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞等。研究表明，Shh信號通路在毛囊干細(xì)胞的維持和激活中發(fā)揮重要作用。在毛囊干細(xì)胞微環(huán)境中，Shh配體由周圍的細(xì)胞分泌，與毛囊干細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活Shh信號通路，維持毛囊干細(xì)胞的干性和自我更新能力。當(dāng)毛囊受到損傷或處于生長周期的特定階段時，Shh信號通路被進(jìn)一步激活，促使毛囊干細(xì)胞增殖和分化，參與毛囊的修復(fù)和再生。在腸道組織中，腸道干細(xì)胞負(fù)責(zé)腸道上皮的更新和修復(fù)。Shh信號通路通過調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞的增殖和分化，維持腸道上皮的穩(wěn)態(tài)。Shh信號可促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖，同時抑制其過度分化，確保腸道上皮細(xì)胞的持續(xù)更新和正常功能。Shh信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化平衡方面也發(fā)揮著重要作用。在正常組織中，細(xì)胞的增殖與分化處于動態(tài)平衡狀態(tài)，以維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。Shh信號通路通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期和細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的水平，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化。在肝臟組織中，Shh信號通路參與肝細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控。在肝臟受到損傷時，Shh信號通路被激活，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，以修復(fù)受損組織。當(dāng)肝臟修復(fù)完成后，Shh信號通路的活性逐漸降低，肝細(xì)胞的增殖也隨之受到抑制，細(xì)胞逐漸恢復(fù)到正常的分化狀態(tài)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Shh信號對于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化平衡同樣至關(guān)重要。適當(dāng)?shù)腟hh信號強(qiáng)度可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，而當(dāng)Shh信號強(qiáng)度改變時，神經(jīng)干細(xì)胞則會向不同類型的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，從而維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能。在組織修復(fù)和再生過程中，Shh信號通路也發(fā)揮著積極的參與作用。當(dāng)組織受到損傷時，Shh信號通路被激活，通過多種機(jī)制促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中，Shh信號通路可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，增加膠原蛋白的合成，加速傷口愈合。Shh信號還可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，吸引免疫細(xì)胞到損傷部位，清除病原體和壞死組織，為組織修復(fù)創(chuàng)造良好的環(huán)境。在心肌梗死發(fā)生后，激活Shh信號通路可促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖和分化，增加心肌細(xì)胞的數(shù)量，改善心臟功能。Shh信號還可促進(jìn)血管新生，為受損心肌組織提供充足的血液供應(yīng)，有助于心肌組織的修復(fù)和再生。三、SonicHedgehog信號通路在人肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)檢測3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料組織樣本：收集[具體醫(yī)院名稱]20XX年至20XX年期間行手術(shù)切除的肝細(xì)胞肝癌組織標(biāo)本[X]例，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療。同時收集距離腫瘤邊緣至少2cm的癌旁正常肝組織標(biāo)本作為對照。標(biāo)本在手術(shù)切除后立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ袠?biāo)本均經(jīng)病理確診為肝細(xì)胞肝癌，患者的臨床病理資料完整，包括性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤分化程度、TNM分期、血管侵犯情況等。細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7和正常肝細(xì)胞系LO2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Gibco公司，美國）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%融合時，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。主要實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗人Shh多克隆抗體、兔抗人Ptch多克隆抗體、兔抗人Smo多克隆抗體、兔抗人GLI1多克隆抗體（均購自Abcam公司，英國）；鼠抗人β-actin單克隆抗體（Sigma-Aldrich公司，美國）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（JacksonImmunoResearchLaboratories公司，美國）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；SYBRGreenRealtimePCRMasterMix（TaKaRa公司，日本）；RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；PVDF膜（Millipore公司，美國）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國）；Shh信號通路激動劑purmorphamine和抑制劑cyclopamine（均購自Sigma-Aldrich公司，美國）。主要實(shí)驗(yàn)儀器：石蠟切片機(jī)（Leica公司，德國）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司，美國）；實(shí)時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；垂直電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，美國）；CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法免疫組織化學(xué)法：石蠟切片制備：將組織標(biāo)本從-80℃冰箱取出，放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后依次經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制成4μm厚的石蠟切片，貼片后60℃烤片2h，備用。免疫組化染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H?O?室溫孵育10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗后，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。自然冷卻后，PBS沖洗3次，每次5min。用5%山羊血清室溫封閉30min，傾去血清，不洗，分別滴加適量稀釋的兔抗人Shh、Ptch、Smo、GLI1多克隆抗體（抗體稀釋度根據(jù)說明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:200稀釋），37℃孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，適時終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：采用半定量積分法對免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析。在400倍光鏡下隨機(jī)選取5個視野，觀察細(xì)胞中陽性染色的強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例。陽性染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞所占比例評分：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分。將陽性染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞所占比例評分相乘，得到免疫組化綜合評分：0分為陰性（-），1-2分為弱陽性（+），3-4分為中度陽性（++），5-6分為強(qiáng)陽性（+++）。RT-PCR技術(shù)：總RNA提取：取適量的肝癌組織、癌旁正常組織及培養(yǎng)的細(xì)胞，按照Trizol試劑說明書進(jìn)行總RNA提取。用微量核酸蛋白測定儀（ThermoFisherScientific公司，美國）測定RNA的濃度和純度，A???/A???比值在1.8-2.0之間表明RNA純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將提取的RNA保存于-80℃冰箱備用。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers、總RNA和RNaseFreedH?O，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA保存于-20℃冰箱備用。實(shí)時熒光定量PCR：以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenRealtimePCRMasterMix、0.8μL上游引物（10μmol/L）、0.8μL下游引物（10μmol/L）、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。引物序列根據(jù)GenBank中Shh、Ptch、Smo、GLI1和β-actin基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：Shh：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；Ptch：上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'；Smo：上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'；GLI1：上游引物5'-[具體序列7]-3'，下游引物5'-[具體序列8]-3'；β-actin：上游引物5'-[具體序列9]-3'，下游引物5'-[具體序列10]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。Westernblot：蛋白提取：取適量的肝癌組織、癌旁正常組織及培養(yǎng)的細(xì)胞，加入預(yù)冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，然后4℃、12000r/min離心15min，取上清液即為總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。將蛋白樣品加入適量的5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min使蛋白變性，然后保存于-20℃冰箱備用。SDS-PAGE凝膠電泳：根據(jù)目的蛋白的分子量大小，配制不同濃度的SDS-PAGE凝膠。一般情況下，對于分子量較小的蛋白（＜50kDa），采用12%-15%的分離膠；對于分子量較大的蛋白（＞50kDa），采用8%-10%的分離膠。將蛋白樣品上樣到凝膠孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30min；分離膠120V，電泳至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部，約需1-2h。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。將PVDF膜在甲醇中浸泡15s，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5min，使其充分濕潤。按照凝膠、PVDF膜、濾紙的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，注意避免氣泡產(chǎn)生。采用半干轉(zhuǎn)膜法，在恒定電流下轉(zhuǎn)膜，根據(jù)蛋白分子量大小確定轉(zhuǎn)膜時間和電流強(qiáng)度，一般情況下，對于分子量較小的蛋白，轉(zhuǎn)膜時間為30-60min，電流強(qiáng)度為0.2-0.3A；對于分子量較大的蛋白，轉(zhuǎn)膜時間為60-120min，電流強(qiáng)度為0.3-0.5A。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：封閉結(jié)束后，傾去封閉液，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次5min。將PVDF膜放入適量稀釋的兔抗人Shh、Ptch、Smo、GLI1多克隆抗體或鼠抗人β-actin單克隆抗體中（抗體稀釋度根據(jù)說明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），4℃孵育過夜。二抗孵育：次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋）中，室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min。化學(xué)發(fā)光檢測：將ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液等體積混合，滴加在PVDF膜上，室溫孵育1-2min，然后將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。注意事項(xiàng)：在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，抗原修復(fù)的條件（如溫度、時間、緩沖液種類等）對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，需根據(jù)不同的抗原進(jìn)行優(yōu)化。抗體的選擇和稀釋度也至關(guān)重要，應(yīng)選擇特異性高、親和力強(qiáng)的抗體，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳稀釋度。在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，RNA提取過程中要注意防止RNA酶污染，所有操作應(yīng)在冰上進(jìn)行，使用的耗材和試劑均需經(jīng)過DEPC處理。引物設(shè)計(jì)要遵循相關(guān)原則，避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，蛋白提取過程要充分裂解細(xì)胞，確保蛋白的完整性和提取效率。轉(zhuǎn)膜過程中要注意膜與凝膠的緊密貼合，避免氣泡產(chǎn)生，影響轉(zhuǎn)膜效果。化學(xué)發(fā)光檢測時，要根據(jù)蛋白條帶的強(qiáng)弱調(diào)整曝光時間，以獲得清晰的圖像。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1肝癌組織與正常肝組織中信號通路相關(guān)分子的表達(dá)差異免疫組化結(jié)果顯示，Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)存在明顯差異。在肝癌組織中，Shh蛋白主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈現(xiàn)出不同程度的陽性染色，陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）；而在正常肝組織中，Shh蛋白僅在少數(shù)肝細(xì)胞中呈弱陽性表達(dá)或幾乎不表達(dá)，陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1A。Ptch蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，而在正常肝組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，肝癌組織中Ptch蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織（P<0.05），見圖1B。Smo蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率高達(dá)[X]%，在癌細(xì)胞中呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽性染色，而在正常肝組織中僅有[X]%的陽性表達(dá)率，且染色強(qiáng)度較弱，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1C。GLI1蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，主要定位于細(xì)胞核，在正常肝組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，肝癌組織中GLI1蛋白的表達(dá)明顯高于正常肝組織（P<0.05），見圖1D。蛋白肝癌組織陽性表達(dá)率（%）正常肝組織陽性表達(dá)率（%）P值Shh[X][X]<0.05Ptch[X][X]<0.05Smo[X][X]<0.05GLI1[X][X]<0.05<此處插入圖1：免疫組化檢測Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)（×400）>RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組化的發(fā)現(xiàn)。Shh、Ptch、Smo和GLI1基因在肝癌組織中的mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常肝組織。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，肝癌組織中ShhmRNA的相對表達(dá)量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；PtchmRNA在肝癌組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，兩者差異顯著（P<0.05）；SmomRNA在肝癌組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；GLI1mRNA在肝癌組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，肝癌組織中GLI1mRNA的表達(dá)明顯高于正常肝組織（P<0.05），見圖2。<此處插入圖2：RT-qPCR檢測Shh、Ptch、Smo和GLI1基因在肝癌組織和正常肝組織中的mRNA表達(dá)水平，*P<0.05，與正常肝組織比較>Westernblot結(jié)果與免疫組化和RT-qPCR結(jié)果一致。在蛋白水平上，Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)量均顯著高于正常肝組織。以β-actin為內(nèi)參，通過分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，肝癌組織中Shh蛋白的相對表達(dá)量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Ptch蛋白在肝癌組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，兩者差異顯著（P<0.05）；Smo蛋白在肝癌組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；GLI1蛋白在肝癌組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，肝癌組織中GLI1蛋白的表達(dá)明顯高于正常肝組織（P<0.05），見圖3。<此處插入圖3：Westernblot檢測Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)，*P<0.05，與正常肝組織比較>綜上所述，免疫組化、RT-qPCR和Westernblot三種檢測方法均表明，Shh信號通路相關(guān)分子Shh、Ptch、Smo和GLI1在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織，提示Shh信號通路在肝癌組織中處于異常激活狀態(tài)。3.2.2不同臨床病理特征肝癌組織中信號通路分子的表達(dá)分析將肝癌組織按照不同的臨床病理特征進(jìn)行分組，分析Shh信號通路相關(guān)分子的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白的表達(dá)與腫瘤大小、病理分級、肝門靜脈侵犯等臨床病理特征密切相關(guān)。在腫瘤大小方面，腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中，Shh蛋白的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），顯著高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織（[X]%，[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Ptch蛋白在腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織（[X]%），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Smo蛋白在腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，明顯高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織（[X]%），差異顯著（P<0.05）；GLI1蛋白在腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。臨床病理特征nShh陽性表達(dá)率（%）Ptch陽性表達(dá)率（%）Smo陽性表達(dá)率（%）GLI1陽性表達(dá)率（%）腫瘤大小（cm）≥5[X][X][X][X][X]<5[X][X][X][X][X]P值-<0.05<0.05<0.05<0.05在病理分級方面，低分化（Ⅲ-Ⅳ級）肝癌組織中，Shh蛋白的陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于中高分化（Ⅰ-Ⅱ級）肝癌組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Ptch蛋白在低分化肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，高于中高分化肝癌組織（[X]%），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Smo蛋白在低分化肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，明顯高于中高分化肝癌組織（[X]%），差異顯著（P<0.05）；GLI1蛋白在低分化肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，高于中高分化肝癌組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。臨床病理特征nShh陽性表達(dá)率（%）Ptch陽性表達(dá)率（%）Smo陽性表達(dá)率（%）GLI1陽性表達(dá)率（%）病理分級Ⅰ-Ⅱ[X][X][X][X][X]Ⅲ-Ⅳ[X][X][X][X][X]P值-<0.05<0.05<0.05<0.05在肝門靜脈侵犯方面，有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中，Shh蛋白的陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于無肝門靜脈侵犯的肝癌組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Ptch蛋白在有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，高于無肝門靜脈侵犯的肝癌組織（[X]%），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Smo蛋白在有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，明顯高于無肝門靜脈侵犯的肝癌組織（[X]%），差異顯著（P<0.05）；GLI1蛋白在有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%，高于無肝門靜脈侵犯的肝癌組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。臨床病理特征nShh陽性表達(dá)率（%）Ptch陽性表達(dá)率（%）Smo陽性表達(dá)率（%）GLI1陽性表達(dá)率（%）肝門靜脈侵犯有[X][X][X][X][X]無[X][X][X][X][X]P值-<0.05<0.05<0.05<0.05而Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤數(shù)目等臨床病理特征無明顯相關(guān)性（P>0.05）。綜上所述，Shh信號通路相關(guān)分子的表達(dá)與肝癌的腫瘤大小、病理分級、肝門靜脈侵犯等臨床病理特征密切相關(guān)，提示Shh信號通路的激活可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。3.3結(jié)果討論3.3.1信號通路在肝癌組織中高表達(dá)的原因探討SonicHedgehog信號通路在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這一現(xiàn)象背后可能存在多種潛在原因，主要涉及基因調(diào)控和細(xì)胞微環(huán)境等方面。從基因調(diào)控角度來看，首先，基因突變是導(dǎo)致信號通路異常激活和高表達(dá)的重要因素之一。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，SonicHedgehog信號通路相關(guān)基因如Shh、Ptch、Smo、Gli1等可能發(fā)生突變。Ptch基因的失活突變會使其失去對Smo的抑制作用，即使在沒有Shh配體的情況下，Smo也能持續(xù)激活，進(jìn)而啟動下游信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致信號通路過度活化，相關(guān)分子表達(dá)上調(diào)。Smo基因的激活突變也可能使其處于持續(xù)激活狀態(tài)，促進(jìn)信號通路的傳導(dǎo)，使Shh、Gli1等分子表達(dá)增加。有研究報(bào)道，在部分肝癌患者中檢測到Ptch基因的點(diǎn)突變或缺失突變，這些突變與肝癌組織中SonicHedgehog信號通路的高表達(dá)及腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。基因甲基化異常也在信號通路的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用。基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)會影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)SonicHedgehog信號通路相關(guān)基因的啟動子區(qū)域發(fā)生低甲基化時，轉(zhuǎn)錄因子更容易與之結(jié)合，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致相關(guān)分子的表達(dá)增加。相反，高甲基化則會抑制基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，Shh基因啟動子區(qū)域的甲基化水平低于正常肝組織，這可能是導(dǎo)致Shh在肝癌組織中高表達(dá)的原因之一。一些轉(zhuǎn)錄因子也參與調(diào)控SonicHedgehog信號通路相關(guān)基因的表達(dá)。如NF-κB、STAT3等轉(zhuǎn)錄因子可以與Shh、Gli1等基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，在肝癌細(xì)胞中，這些轉(zhuǎn)錄因子的異常激活可導(dǎo)致SonicHedgehog信號通路相關(guān)分子的高表達(dá)。細(xì)胞微環(huán)境對SonicHedgehog信號通路的表達(dá)也有重要影響。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、生長因子等信號分子可以調(diào)節(jié)信號通路的活性。在肝癌微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞會分泌多種細(xì)胞因子，如TGF-β、EGF、HGF等。TGF-β可以通過激活下游的Smad信號通路，上調(diào)Shh的表達(dá)，進(jìn)而激活SonicHedgehog信號通路。EGF可以通過與EGFR結(jié)合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，促進(jìn)Gli1的表達(dá)，增強(qiáng)信號通路的活性。低氧環(huán)境是腫瘤微環(huán)境的一個重要特征，肝癌組織中由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖和血管生成異常，常處于低氧狀態(tài)。低氧可以誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子（HIF）的表達(dá)，HIF可以與Gli蛋白相互作用，促進(jìn)Gli蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致SonicHedgehog信號通路的激活和相關(guān)分子的高表達(dá)。細(xì)胞間的相互作用也會影響SonicHedgehog信號通路的表達(dá)。肝癌細(xì)胞與周圍的基質(zhì)細(xì)胞之間存在著復(fù)雜的相互作用，通過細(xì)胞表面的受體和配體相互結(jié)合，傳遞信號，調(diào)節(jié)SonicHedgehog信號通路的活性，促進(jìn)相關(guān)分子的表達(dá)。3.3.2信號通路分子表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性的意義SonicHedgehog信號通路分子表達(dá)與肝癌臨床病理特征密切相關(guān)，這對于肝癌的診斷、分期和預(yù)后評估具有重要的潛在價(jià)值。在診斷方面，信號通路相關(guān)分子有望成為肝癌早期診斷的生物標(biāo)志物。由于Shh、Ptch、Smo、Gli1等分子在肝癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，檢測這些分子在血清或組織中的表達(dá)水平，有可能實(shí)現(xiàn)肝癌的早期篩查和診斷。通過檢測血清中Shh蛋白的含量，可作為肝癌早期診斷的輔助指標(biāo)，提高肝癌的早期診斷率。研究表明，在肝癌患者的血清中，Shh蛋白水平明顯高于健康人群，且在肝癌早期即可出現(xiàn)升高。聯(lián)合檢測多個信號通路分子，如Shh、Gli1和Smo，可能提高診斷的準(zhǔn)確性和特異性。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)或免疫組化技術(shù)，同時檢測這些分子在組織中的表達(dá)情況，能夠更全面地反映肝癌的生物學(xué)特性，有助于早期診斷和鑒別診斷。對于肝癌的分期，信號通路分子表達(dá)與腫瘤大小、病理分級、肝門靜脈侵犯等臨床病理特征的相關(guān)性，為準(zhǔn)確判斷腫瘤的分期提供了重要依據(jù)。腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中，Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達(dá)顯著高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織，這表明信號通路的激活程度與腫瘤的生長和發(fā)展密切相關(guān)。在判斷腫瘤分期時，結(jié)合這些分子的表達(dá)情況，能夠更準(zhǔn)確地評估腫瘤的大小和進(jìn)展程度。低分化肝癌組織中信號通路分子的高表達(dá)，提示腫瘤的惡性程度較高，進(jìn)展較快，有助于確定腫瘤的病理分級。肝門靜脈侵犯是肝癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中信號通路分子表達(dá)明顯升高，這為判斷肝癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)提供了參考依據(jù)。通過檢測這些分子的表達(dá)，可輔助醫(yī)生更準(zhǔn)確地進(jìn)行肝癌的TNM分期，為制定合理的治療方案提供重要信息。在預(yù)后評估方面，SonicHedgehog信號通路分子表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)的信號通路分子通常預(yù)示著患者的預(yù)后較差。研究表明，Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白高表達(dá)的肝癌患者，其術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，生存率較低。這是因?yàn)樾盘柾返募せ畲龠M(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，增加了腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。通過檢測這些分子的表達(dá)水平，醫(yī)生可以預(yù)測患者的預(yù)后情況，對于預(yù)后較差的患者，可采取更積極的治療措施，如術(shù)后輔助化療、靶向治療或免疫治療等，以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生存率。信號通路分子的表達(dá)還可以作為評估肝癌患者對治療反應(yīng)的指標(biāo)。在接受治療后，信號通路分子表達(dá)水平的變化可反映治療的效果。如果治療有效，信號通路分子的表達(dá)可能會降低，提示腫瘤細(xì)胞的活性受到抑制；反之，如果表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化或升高，可能意味著治療效果不佳，需要調(diào)整治療方案。四、SonicHedgehog信號通路對人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響4.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTT法和EdU摻入法檢測干擾或激活SonicHedgehog信號通路后肝癌細(xì)胞增殖能力的變化。將人肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7分為對照組、Shh信號通路激活組和Shh信號通路抑制組。激活組通過添加外源性Shh配體（100ng/mL）或使用Smo激動劑purmorphamine（10μmol/L）處理細(xì)胞，抑制組則使用Shh信號通路抑制劑cyclopamine（10μmol/L）處理細(xì)胞，對照組給予等量的生理鹽水。MTT法檢測結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24h后，激活組細(xì)胞的吸光度值（A值）顯著高于對照組，表明激活Shh信號通路可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖；而抑制組細(xì)胞的A值明顯低于對照組，說明抑制Shh信號通路能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖。隨著培養(yǎng)時間延長至48h和72h，這種差異更加顯著。在72h時，激活組HepG2細(xì)胞的A值為[X]±[X]，顯著高于對照組的[X]±[X]（P<0.05）；抑制組HepG2細(xì)胞的A值為[X]±[X]，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，激活組A值為[X]±[X]，對照組為[X]±[X]，抑制組為[X]±[X]，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。<此處插入圖4：MTT法檢測不同處理組肝癌細(xì)胞的增殖能力，*P<0.05，與對照組比較>EdU摻入法進(jìn)一步驗(yàn)證了MTT法的結(jié)果。在熒光顯微鏡下觀察，激活組中EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯多于對照組，而抑制組中EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著少于對照組。通過計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)激活組HepG2細(xì)胞中EdU陽性細(xì)胞比例為[X]%，顯著高于對照組的[X]%（P<0.05）；抑制組HepG2細(xì)胞中EdU陽性細(xì)胞比例為[X]%，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細(xì)胞中，激活組EdU陽性細(xì)胞比例為[X]%，對照組為[X]%，抑制組為[X]%，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。<此處插入圖5：EdU摻入法檢測不同處理組肝癌細(xì)胞的增殖能力（×200），*P<0.05，與對照組比較>為了探究其機(jī)制，通過Westernblot檢測了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活Shh信號通路后，肝癌細(xì)胞中CyclinD1和c-Myc蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而p21蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。抑制Shh信號通路則導(dǎo)致CyclinD1和c-Myc蛋白表達(dá)降低，p21蛋白表達(dá)升高。CyclinD1和c-Myc是促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白，p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，可抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。這表明Shh信號通路可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。4.1.2細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)研究SonicHedgehog信號通路對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，激活組肝癌細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯多于對照組，而抑制組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著少于對照組。在HepG2細(xì)胞中，激活組遷移細(xì)胞數(shù)為[X]±[X]個，顯著高于對照組的[X]±[X]個（P<0.05）；抑制組遷移細(xì)胞數(shù)為[X]±[X]個，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細(xì)胞中，激活組遷移細(xì)胞數(shù)為[X]±[X]個，對照組為[X]±[X]個，抑制組為[X]±[X]個，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。<此處插入圖6：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測不同處理組肝癌細(xì)胞的遷移能力（×200），*P<0.05，與對照組比較>Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激活組穿過Matrigel基質(zhì)膠的肝癌細(xì)胞數(shù)量顯著多于對照組，抑制組穿過的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組。在HepG2細(xì)胞中，激活組侵襲細(xì)胞數(shù)為[X]±[X]個，顯著高于對照組的[X]±[X]個（P<0.05）；抑制組侵襲細(xì)胞數(shù)為[X]±[X]個，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細(xì)胞中，激活組侵襲細(xì)胞數(shù)為[X]±[X]個，對照組為[X]±[X]個，抑制組為[X]±[X]個，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。<此處插入圖7：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測不同處理組肝癌細(xì)胞的侵襲能力（×200），*P<0.05，與對照組比較>劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Transwell實(shí)驗(yàn)一致。在劃痕后0h，各組細(xì)胞劃痕寬度無明顯差異。隨著時間推移，激活組細(xì)胞的劃痕愈合速度明顯快于對照組，而抑制組細(xì)胞的劃痕愈合速度顯著慢于對照組。在劃痕后48h，激活組HepG2細(xì)胞的劃痕愈合率為[X]%，顯著高于對照組的[X]%（P<0.05）；抑制組HepG2細(xì)胞的劃痕愈合率為[X]%，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細(xì)胞中，激活組劃痕愈合率為[X]%，對照組為[X]%，抑制組為[X]%，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。<此處插入圖8：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同處理組肝癌細(xì)胞的遷移能力，*P<0.05，與對照組比較>進(jìn)一步探討相關(guān)分子機(jī)制，通過Westernblot檢測了與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活Shh信號通路后，肝癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而E-cadherin的表達(dá)水平明顯下調(diào)。抑制Shh信號通路則導(dǎo)致MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲；E-cadherin是一種上皮細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)降低可導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，有利于細(xì)胞的遷移和侵襲。這表明Shh信號通路可能通過調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。4.1.3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測SonicHedgehog信號通路對肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及相關(guān)信號分子的變化。將肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7分為對照組、Shh信號通路激活組和Shh信號通路抑制組，分別進(jìn)行相應(yīng)處理。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，激活組肝癌細(xì)胞的凋亡率顯著低于對照組，而抑制組細(xì)胞的凋亡率明顯高于對照組。在HepG2細(xì)胞中，激活組凋亡率為[X]%，顯著低于對照組的[X]%（P<0.05）；抑制組凋亡率為[X]%，明顯高于對照組（P<0.05）。在Huh7細(xì)胞中，激活組凋亡率為[X]%，對照組為[X]%，抑制組為[X]%，激活組與對照組、抑制組與對照