SonicHedgehog信號通路在人肝細胞肝癌中的表達、作用及臨床意義探究一、引言1.1研究背景與目的1.1.1肝細胞肝癌的現狀肝細胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌類型，嚴重威脅人類健康。據世界衛生組織國際癌癥研究署（IARC）2020年發布的全球癌癥負擔數據顯示，2020年全球肝癌新增病例約91萬例，在所有惡性腫瘤中發病率位居第6位；死亡病例約83萬例，死亡率高居第3位。在中國，肝癌的形勢更為嚴峻，新增病例數達41萬例，位居國內惡性腫瘤發病第5位；死亡病例數為39.1萬例，居癌癥死亡第2位。肝癌起病隱匿，早期癥狀不典型，多數患者確診時已處于中晚期，失去了手術根治的最佳時機。而且，肝癌具有惡性程度高、病情進展快、對傳統放化療不敏感等特點，導致患者預后較差，5年生存率較低。目前，雖然肝癌的治療手段包括手術切除、肝移植、介入治療、靶向治療和免疫治療等，但總體治療效果仍不理想。因此，深入研究肝癌的發病機制，尋找新的治療靶點和生物標志物，對于提高肝癌的早期診斷率、改善患者預后具有重要意義。1.1.2SonicHedgehog信號通路概述SonicHedgehog（Shh）信號通路是一種在進化上高度保守的信號傳導通路，最初在果蠅胚胎發育中被發現。該通路在胚胎發育、組織穩態維持、干細胞增殖與分化等生理過程中發揮著關鍵作用。Shh信號通路的核心成員包括：Shh配體、跨膜受體Patched（Ptch）和Smoothened（Smo），以及下游轉錄因子GLI家族（GLI1-GLI3）。在正常生理狀態下，當沒有Shh配體存在時，Ptch與Smo結合，抑制Smo的活性，從而阻止下游信號的傳遞。此時，GLI蛋白與抑制因子（如SuppressorofFused，Sufu）結合，形成復合物，在蛋白酶體的作用下被加工成轉錄抑制因子，抑制靶基因的表達。當Shh配體與Ptch結合后，Ptch對Smo的抑制作用被解除，Smo被激活并發生一系列的磷酸化修飾，進而激活下游的信號傳導級聯反應。激活的Smo促使GLI蛋白從與Sufu等形成的復合物中解離出來，進入細胞核內，激活靶基因的轉錄，調控細胞的增殖、分化、遷移等生物學行為。Shh信號通路在胚胎發育過程中參與了多個器官和組織的形成，如神經管的背腹軸分化、肢體的發育、肺的形成等。在成體組織中，Shh信號通路也參與維持組織的穩態和再生，如肝臟、皮膚、腸道等組織的修復和更新。然而，當Shh信號通路異常激活時，可導致多種腫瘤的發生和發展，包括基底細胞癌、髓母細胞瘤、胰腺癌、肝癌等。1.1.3研究目的本研究旨在探究SonicHedgehog信號通路在人肝細胞肝癌中的表達情況，分析其與肝癌臨床病理特征的相關性，探討該信號通路在肝癌發生、發展中的作用機制，為肝癌的早期診斷、預后評估及靶向治療提供理論依據和潛在的治療靶點。具體研究內容包括：（1）檢測Shh信號通路相關分子（Shh、Ptch、Smo、GLI1等）在肝癌組織及癌旁正常組織中的表達水平，比較其差異，明確該信號通路在肝癌中的激活狀態；（2）分析Shh信號通路相關分子的表達與肝癌患者臨床病理參數（如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、血管侵犯等）之間的關系，評估其對肝癌預后的影響；（3）通過體外細胞實驗，研究Shh信號通路的激活或抑制對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學行為的影響，并初步探討其作用機制；（4）在體內動物模型中驗證Shh信號通路在肝癌發生發展中的作用，為肝癌的靶向治療提供實驗依據。1.2國內外研究現狀近年來，SonicHedgehog信號通路在腫瘤領域的研究備受關注，其與肝細胞肝癌的關系也成為眾多學者研究的焦點。國內外大量研究表明，Shh信號通路在肝癌的發生、發展過程中發揮著重要作用。在國外，有研究通過對肝癌組織芯片及細胞系的檢測，發現Shh信號通路的關鍵分子Shh、Ptch、Smo、GLI1等在肝癌組織中的表達水平明顯高于正常肝組織。例如，[具體文獻1]利用免疫組化和實時定量PCR技術，對100例肝癌患者的腫瘤組織及配對的癌旁正常組織進行檢測，結果顯示Shh、Smo和GLI1的mRNA和蛋白表達水平在肝癌組織中顯著上調，且高表達的Shh、Smo和GLI1與肝癌患者的腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯及不良預后密切相關。進一步的功能實驗表明，激活Shh信號通路可促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制該信號通路則能顯著抑制肝癌細胞的生長和轉移。[具體文獻2]通過構建肝癌小鼠模型，發現阻斷Shh信號通路能夠抑制腫瘤的生長和轉移，延長小鼠的生存期，揭示了Shh信號通路在肝癌體內生長和轉移過程中的關鍵作用。國內的研究也取得了豐碩的成果。[具體文獻3]采用RT-PCR和免疫組化方法檢測了80例肝癌組織及相應癌旁組織中Shh信號通路相關分子的表達，結果顯示Shh、Ptch、Smo在肝癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織，且Smo的表達與肝癌的分化程度、門靜脈癌栓形成密切相關。[具體文獻4]研究發現，在肝癌細胞中，Shh信號通路的激活可通過上調基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，促進細胞外基質的降解，從而增強肝癌細胞的遷移和侵襲能力。此外，一些研究還探討了Shh信號通路與肝癌其他信號通路之間的相互作用，如與Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/AKT信號通路等的交聯，發現這些信號通路之間存在復雜的調控網絡，共同影響著肝癌細胞的生物學行為。盡管目前關于Shh信號通路與肝細胞肝癌的研究已取得了一定的進展，但仍存在一些不足之處。首先，對于Shh信號通路在肝癌發生發展中的具體分子機制尚未完全明確，特別是其與其他信號通路之間的相互作用網絡以及對肝癌細胞干性維持、免疫逃逸等方面的影響還需要進一步深入研究。其次，現有的研究大多集中在Shh信號通路關鍵分子的表達及功能驗證上，對于如何將這些研究成果轉化為臨床應用，如開發針對Shh信號通路的靶向治療藥物，還需要更多的臨床試驗和探索。此外，不同研究之間的結果存在一定的差異，可能與研究對象、實驗方法、樣本量等因素有關，這也需要進一步的大樣本、多中心研究來加以驗證和統一。本研究擬在現有研究的基礎上，進一步深入探討Shh信號通路在人肝細胞肝癌中的表達、與臨床病理特征的關系及其作用機制，以期為肝癌的診治提供新的理論依據和潛在的治療靶點，具有一定的創新性和重要的臨床價值。1.3研究方法與意義1.3.1研究方法（1）免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）：收集肝癌患者手術切除的腫瘤組織及配對的癌旁正常組織標本，經固定、石蠟包埋、切片等處理后，采用免疫組化技術檢測Shh信號通路相關分子（Shh、Ptch、Smo、GLI1等）在組織中的蛋白表達水平及定位。通過觀察陽性染色的強度和范圍，半定量分析各分子的表達情況，比較肝癌組織與癌旁正常組織中相關分子表達的差異，初步明確Shh信號通路在肝癌組織中的激活狀態，并分析其與肝癌臨床病理特征的相關性。免疫組化技術具有特異性強、定位準確等優點，能夠直觀地顯示目標蛋白在組織細胞中的分布情況，為研究Shh信號通路相關分子在肝癌組織中的表達及功能提供重要的形態學依據。（2）實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-TimeQuantitativePolymeraseChainReaction，RT-qPCR）：提取肝癌組織、癌旁正常組織及肝癌細胞系中的總RNA，通過逆轉錄合成cDNA，然后以cDNA為模板，利用特異性引物對Shh、Ptch、Smo、GLI1等基因進行實時熒光定量PCR擴增。通過檢測Ct值，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，精確分析Shh信號通路相關基因在肝癌組織及癌旁正常組織中的表達差異，進一步驗證免疫組化的結果，并為后續的機制研究提供數據支持。RT-qPCR技術具有靈敏度高、特異性強、定量準確等特點，能夠快速、準確地檢測基因的表達水平，是研究基因表達調控的常用技術之一。（3）蛋白質免疫印跡法（WesternBlot，WB）：提取肝癌組織、癌旁正常組織及肝癌細胞系的總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度后，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，再將蛋白轉移至PVDF膜上。用特異性抗體對Shh、Ptch、Smo、GLI1等蛋白進行免疫印跡檢測，通過化學發光法顯影，分析蛋白條帶的灰度值，半定量比較各蛋白在不同組織和細胞中的表達水平，從蛋白質水平進一步驗證Shh信號通路相關分子在肝癌中的表達情況。WesternBlot技術能夠直接檢測蛋白質的表達量和分子量，是研究蛋白質表達和翻譯后修飾的重要手段，與免疫組化和RT-qPCR技術相互印證，可全面揭示Shh信號通路相關分子在肝癌中的表達變化。（4）細胞培養與處理：選擇人肝癌細胞系（如HepG2、Huh7等）和正常肝細胞系（如LO2），在含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM或RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。實驗分為對照組、Shh信號通路激活組和Shh信號通路抑制組。激活組通過添加外源性Shh配體或使用Smo激動劑（如purmorphamine）處理細胞，以激活Shh信號通路；抑制組則使用Shh信號通路抑制劑（如cyclopamine）處理細胞，阻斷信號通路的傳導。通過對細胞的培養和不同處理，研究Shh信號通路的激活或抑制對肝癌細胞生物學行為的影響。細胞培養技術是進行體外細胞實驗的基礎，能夠為研究Shh信號通路在肝癌細胞中的功能提供穩定的細胞模型，通過對細胞的干預和處理，可以模擬體內的生理和病理狀態，深入探討信號通路的作用機制。（5）細胞增殖實驗：采用CCK-8法或EdU法檢測不同處理組肝癌細胞的增殖能力。CCK-8法是基于細胞線粒體中的脫氫酶能夠將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產物，其生成量與活細胞數量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值，間接反映細胞的增殖情況。EdU法是一種新型的細胞增殖檢測方法，EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料標記的疊氮化物發生銅催化的點擊化學反應，在熒光顯微鏡下觀察EdU陽性細胞的數量，直觀地反映細胞的增殖情況。通過細胞增殖實驗，明確Shh信號通路對肝癌細胞增殖能力的影響，為進一步研究其在肝癌發生發展中的作用提供依據。（6）細胞遷移與侵襲實驗：使用Transwell小室進行細胞遷移和侵襲實驗。遷移實驗時，將無Matrigel包被的Transwell小室置于24孔板中，在上室加入不同處理組的肝癌細胞懸液，下室加入含血清的培養基作為趨化因子，培養一定時間后，擦去上室未遷移的細胞，固定、染色遷移到下室的細胞，在顯微鏡下計數，統計遷移細胞的數量，評估細胞的遷移能力。侵襲實驗則在上室預先包被Matrigel基質膠，模擬細胞外基質，其他步驟與遷移實驗相同，通過檢測穿過Matrigel基質膠的細胞數量，評價細胞的侵襲能力。細胞遷移和侵襲實驗能夠直接反映肝癌細胞的轉移潛能，研究Shh信號通路對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，有助于揭示肝癌轉移的分子機制。（7）細胞凋亡實驗：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測不同處理組肝癌細胞的凋亡情況。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，在細胞凋亡早期，PS從細胞膜內側翻轉到細胞膜外側，AnnexinV能夠與PS特異性結合，從而標記凋亡早期細胞；PI是一種核酸染料，能夠穿透壞死細胞的細胞膜，與細胞核中的DNA結合，從而標記壞死細胞和晚期凋亡細胞。通過流式細胞儀檢測AnnexinV-FITC和PI雙染細胞的熒光強度，分析不同處理組肝癌細胞凋亡率的變化，探討Shh信號通路對肝癌細胞凋亡的調控作用。細胞凋亡實驗是研究細胞死亡機制的重要方法，通過檢測細胞凋亡率，能夠深入了解Shh信號通路在肝癌細胞生存與死亡調控中的作用。（8）動物實驗：建立肝癌小鼠模型，可采用皮下接種肝癌細胞或原位注射肝癌細胞的方法。將小鼠隨機分為對照組、Shh信號通路激活組和Shh信號通路抑制組。激活組通過瘤內注射Shh配體或腹腔注射Smo激動劑處理小鼠，抑制組則腹腔注射Shh信號通路抑制劑處理小鼠，對照組給予等量的生理鹽水。定期觀察小鼠的一般狀態、體重變化，測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。實驗結束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，進行病理切片、免疫組化、RT-qPCR等檢測，分析Shh信號通路的激活或抑制對腫瘤生長、轉移及相關分子表達的影響。動物實驗能夠在體內模擬肝癌的發生發展過程，驗證體外細胞實驗的結果，為研究Shh信號通路在肝癌中的作用及靶向治療提供更直接的實驗依據。1.3.2研究意義（1）理論意義：肝細胞肝癌的發病機制復雜，涉及多個基因和信號通路的異常改變。目前，雖然對肝癌的發病機制有了一定的認識，但仍存在許多未知領域。SonicHedgehog信號通路作為一條在胚胎發育和腫瘤發生中起重要作用的信號傳導通路，其在肝癌中的具體作用機制尚未完全明確。本研究通過檢測Shh信號通路相關分子在肝癌組織及細胞中的表達情況，分析其與肝癌臨床病理特征的關系，并深入研究該信號通路對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學行為的影響及其作用機制，有助于進一步揭示肝癌的發病機制，豐富對肝癌發生發展分子機制的認識。同時，研究Shh信號通路與肝癌其他信號通路之間的相互作用，有助于闡明肝癌細胞內復雜的信號調控網絡，為肝癌的基礎研究提供新的理論依據。（2）實踐意義：在肝癌的診斷方面，尋找有效的生物標志物對于提高肝癌的早期診斷率具有重要意義。本研究通過分析Shh信號通路相關分子的表達與肝癌臨床病理特征的相關性，有可能篩選出具有診斷價值的分子標志物，為肝癌的早期診斷提供新的檢測指標。例如，如果發現某些Shh信號通路相關分子在肝癌早期即出現明顯的表達變化，且與肝癌的發生發展密切相關，那么這些分子有望作為肝癌早期診斷的潛在生物標志物，通過檢測患者血清或組織中這些分子的表達水平，實現肝癌的早期篩查和診斷，提高患者的治愈率和生存率。在肝癌的治療方面，目前肝癌的治療手段雖然多樣，但總體治療效果仍不理想，尋找新的治療靶點和治療方法是肝癌研究的重要方向。SonicHedgehog信號通路在肝癌中異常激活，且對肝癌細胞的生物學行為具有重要調控作用，因此，該信號通路有望成為肝癌靶向治療的新靶點。本研究通過深入探討Shh信號通路在肝癌中的作用機制，為開發針對該信號通路的靶向治療藥物提供理論依據。例如，針對Shh信號通路中的關鍵分子（如Smo、GLI1等）設計特異性抑制劑，阻斷信號通路的傳導，抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導肝癌細胞凋亡，從而為肝癌的治療提供新的策略。此外，聯合應用Shh信號通路抑制劑與其他治療方法（如手術、化療、放療、免疫治療等），有可能提高肝癌的治療效果，改善患者的預后。在肝癌的預后評估方面，準確評估肝癌患者的預后對于制定合理的治療方案和判斷患者的生存情況具有重要意義。本研究通過分析Shh信號通路相關分子的表達與肝癌患者預后的關系，可為肝癌的預后評估提供新的指標。如果發現某些Shh信號通路相關分子的高表達與肝癌患者的不良預后密切相關，那么這些分子可以作為評估肝癌患者預后的重要指標，幫助醫生更好地預測患者的生存情況，制定個性化的治療方案，提高患者的生活質量和生存率。綜上所述，本研究對SonicHedgehog信號通路在人肝細胞肝癌中的表達及意義進行深入研究，無論是在理論上還是實踐中都具有重要的價值，有望為肝癌的診斷、治療和預后評估提供新的思路和靶點，對提高肝癌患者的診治水平和生存質量具有重要的推動作用。二、SonicHedgehog信號通路的結構與功能2.1信號通路的組成元件2.1.1SHH配體SonicHedgehog（SHH）配體屬于Hedgehog（HH）蛋白家族，在哺乳動物中，HH家族還包括IndianHedgehog（IHH）和DesertHedgehog（DHH），其中SHH的作用最為廣泛。SHH蛋白最初合成時是一個相對分子質量約為45kDa的前體蛋白，其包含氨基端（N端）和羧基端（C端）兩個結構域。在翻譯后的加工過程中，C端結構域發揮自身蛋白水解酶活性，將SHH前體蛋白裂解為相對分子質量約為19kDa的N端片段（SHH-N）和相對分子質量約為26kDa的C端片段（SHH-C）。SHH-N具有信號活性，而SHH-C具有膽固醇轉移酶功能，其將膽固醇分子共價結合到SHH-N的羧基端，隨后，在酰基轉移酶的作用下，SHH-N氨基端的半胱氨酸發生棕櫚酰化修飾。經過這一系列的修飾，SHH配體才獲得完全的生物學功能。修飾后的SHH配體在類似于轉運子功能的跨膜蛋白Dispatched（Disp）的幫助下，從細胞內釋放到細胞外，進而發揮其信號傳導作用。在信號通路激活過程中，SHH配體起著起始信號的關鍵作用。當SHH配體以自分泌或旁分泌的方式作用于靶細胞時，它首先與靶細胞表面的受體Patched（Ptch）結合。這種結合是SHH信號通路激活的起始步驟，它打破了Ptch對下游Smoothened（Smo）受體的抑制狀態，從而開啟了后續的信號傳導級聯反應，使得細胞能夠接收到SHH信號并做出相應的生物學反應，如調控細胞的增殖、分化、遷移等過程。2.1.2Ptch受體Ptch受體是由腫瘤抑制基因Patched編碼的跨膜蛋白，其結構包含12個疏水跨膜區和兩個較大的胞外環狀結構，由單一肽鏈構成。在哺乳動物中，存在Ptch1和Ptch2兩種Ptch受體，它們在結構和功能上具有一定的相似性，但在組織分布和對SHH信號通路的調控中也存在一些差異。在正常生理狀態下，當沒有SHH配體存在時，Ptch受體定位于初級纖毛，能夠阻止Smo在初級纖毛中的積累并抑制Smo的活性。其抑制機制可能與Ptch受體通過與Smo直接相互作用，或者通過調節細胞內的某些信號分子，來維持Smo處于非活性狀態。此時，下游的信號傳導被阻斷，細胞內的相關基因表達處于相對穩定的狀態，細胞維持正常的生理功能。例如，在胚胎發育過程中，當某一組織或器官不需要過度增殖或分化時，Ptch對Smo的抑制作用確保了細胞不會受到異常的增殖或分化信號刺激，維持組織器官的正常發育進程。當SHH配體與Ptch受體結合后，Ptch的構象發生改變，導致其內化進入細胞內，從而解除了對Smo的抑制作用。這使得Smo能夠被激活，進而啟動下游的信號傳導通路，激活相關的轉錄因子，調控靶基因的表達，最終影響細胞的生物學行為。如在腫瘤發生過程中，如果Ptch受體發生突變，導致其不能正常抑制Smo，即使沒有SHH配體的存在，Smo也可能被異常激活，從而導致SHH信號通路的持續激活，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。2.1.3SMO受體與Gli蛋白Smo受體是一種原癌基因編碼的跨膜蛋白，與G蛋白偶聯受體同源，由7個跨膜區的單一肽鏈構成，N端位于細胞外，C端位于細胞內，跨膜區氨基酸序列高度保守，C末端的絲氨酸與蘇氨酸殘基為磷酸化部位，可在蛋白激酶催化時結合磷酸基團。在正常情況下，由于Ptch受體的抑制作用，Smo處于非活化狀態。當SHH配體與Ptch結合，Ptch內化后，Smo的抑制被解除，Smo發生一系列的磷酸化修飾，從而被激活。激活后的Smo會從細胞膜轉移到初級纖毛的頂端，這一過程對于Smo發揮其信號傳導功能至關重要。在初級纖毛頂端，Smo與下游的信號分子相互作用，啟動信號傳導級聯反應。Gli蛋白是SHH信號通路的下游轉錄因子，包括Gli1、Gli2和Gli3，它們在SHH信號通路傳導中起著關鍵作用。在沒有SHH信號時，Gli蛋白與抑制因子（如SuppressorofFused，Sufu）結合，形成復合物。此時，Gli蛋白在蛋白激酶A（PKA）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）和酪蛋白激酶1α（CK1α）等的作用下發生磷酸化，進而被蛋白酶體加工成轉錄抑制因子形式，如Gli3會被加工成截短的Gli3R，這些轉錄抑制因子進入細胞核內，抑制SHH信號通路靶基因的表達。當SHH信號通路激活時，Smo激活促使Gli蛋白從與Sufu等形成的復合物中解離出來。解離后的Gli蛋白發生去磷酸化等修飾，轉化為轉錄激活因子形式，如Gli1、Gli2-A和Gli3-A等，它們進入細胞核，與靶基因啟動子區域的特定序列結合，激活靶基因的轉錄。這些靶基因參與調控細胞的多種生物學過程，如細胞周期調控相關基因CyclinD1、c-Myc，抗凋亡基因Bcl-2，以及與細胞遷移和侵襲相關的基因MMP-2、MMP-9等，從而實現對細胞增殖、分化、遷移、凋亡等生物學行為的調控。2.2信號通路的激活機制2.2.1經典激活途徑在SonicHedgehog信號通路的經典激活途徑中，SHH配體起著起始信號的關鍵作用。當SHH配體從分泌細胞釋放后，以自分泌或旁分泌的方式與靶細胞表面的Ptch受體結合。Ptch受體原本對Smo受體具有抑制作用，二者結合后，Ptch的構象發生改變并內化進入細胞，從而解除了對Smo的抑制。Smo是一種7次跨膜蛋白，在沒有SHH信號時，其活性被Ptch抑制，處于非活化狀態。一旦Ptch對Smo的抑制被解除，Smo的C末端會發生一系列的磷酸化修飾。這些磷酸化修飾使得Smo從細胞膜轉移到初級纖毛的頂端。初級纖毛是細胞表面的一種特殊結構，在SHH信號傳導中扮演著重要角色。在初級纖毛頂端，Smo與下游的信號分子相互作用，啟動信號傳導級聯反應。其中，與Smo相互作用的重要分子包括抑制因子Sufu以及轉錄因子Gli蛋白。在沒有SHH信號時，Gli蛋白與Sufu結合形成復合物。此時，Gli蛋白在PKA、GSK3β和CK1α等蛋白激酶的作用下發生磷酸化。磷酸化后的Gli蛋白會被蛋白酶體加工成轉錄抑制因子形式，如Gli3會被加工成截短的Gli3R。這些轉錄抑制因子進入細胞核內，結合到SHH信號通路靶基因的啟動子區域，抑制靶基因的表達。當SHH信號通路激活，Smo激活促使Gli蛋白從與Sufu形成的復合物中解離出來。解離后的Gli蛋白發生去磷酸化等修飾，轉化為轉錄激活因子形式，如Gli1、Gli2-A和Gli3-A等。這些轉錄激活因子進入細胞核，與靶基因啟動子區域的特定序列結合，激活靶基因的轉錄。被激活的靶基因包括細胞周期調控相關基因CyclinD1、c-Myc，它們參與調控細胞的增殖過程；抗凋亡基因Bcl-2，其表達上調可抑制細胞凋亡，促進細胞存活；以及與細胞遷移和侵襲相關的基因MMP-2、MMP-9等，這些基因的表達變化會影響細胞的遷移和侵襲能力。通過這一系列的分子事件，SHH信號通路實現了從細胞外信號到細胞核內基因表達調控的傳遞，從而對細胞的增殖、分化、遷移、凋亡等生物學行為產生重要影響。2.2.2非經典激活途徑除了經典激活途徑外，SonicHedgehog信號通路還存在非經典激活途徑，該途徑不依賴SHH配體的參與。在非經典激活途徑中，有多種機制可以激活Smo受體或下游的Gli蛋白，從而啟動信號傳導。其中一種機制是通過其他信號分子的作用來激活Smo。例如，一些研究發現，Rho家族GTP酶（如RhoA、Rac1等）可以與Smo相互作用，調節Smo的活性。當細胞受到某些刺激時，Rho家族GTP酶被激活，它們可以促進Smo的磷酸化和激活，進而啟動下游的信號傳導，即使在沒有SHH配體的情況下，也能使細胞產生相應的生物學反應。Src激酶也被報道參與了Smo的非經典激活過程。Src激酶可以磷酸化Smo的特定氨基酸殘基，改變Smo的構象，使其激活并啟動信號傳導。細胞內環境的變化也可能導致SonicHedgehog信號通路的非經典激活。當細胞處于低氧環境時，低氧誘導因子（HIF）的表達上調。HIF可以與Gli蛋白相互作用，促進Gli蛋白進入細胞核，激活下游靶基因的轉錄，從而繞過了SHH配體與Ptch、Smo的經典激活步驟。細胞內的鈣離子濃度變化也可能影響SonicHedgehog信號通路的非經典激活。一些研究表明，細胞內鈣離子濃度的升高可以激活某些蛋白激酶，這些激酶可以作用于Smo或Gli蛋白，調節它們的活性，進而激活信號通路。在某些腫瘤細胞中，還發現了一些基因突變導致的SonicHedgehog信號通路非經典激活。例如，Ptch基因的失活突變或Smo基因的激活突變，都可能使Smo處于持續激活狀態，即使沒有SHH配體的存在，也能啟動下游的信號傳導，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。這些非經典激活途徑的存在，使得SonicHedgehog信號通路的調控更加復雜，也為腫瘤等疾病的發生發展提供了更多的潛在機制。2.3信號通路在正常生理過程中的作用2.3.1胚胎發育中的作用SonicHedgehog信號通路在胚胎發育過程中扮演著不可或缺的角色，對多個重要器官和系統的形成與發育起著關鍵的調控作用。在胚胎神經系統發育中，Shh信號通路參與神經管的背腹軸分化。在神經管發育早期，位于神經管腹側的底板細胞分泌Shh配體，形成一個從腹側到背側的Shh濃度梯度。不同濃度的Shh信號作用于神經管不同部位的細胞，誘導產生不同類型的神經元。高濃度的Shh信號誘導腹側神經管細胞分化為運動神經元，而低濃度的Shh信號則促使中間神經元的產生。研究表明，在小鼠胚胎中，若Shh基因缺失，神經管腹側的運動神經元無法正常發育，導致小鼠出生后因運動功能障礙而死亡。Shh信號還參與調控神經嵴細胞的遷移和分化，神經嵴細胞在胚胎發育過程中可遷移到不同部位，分化為多種細胞類型，如感覺神經元、交感神經元、腎上腺髓質細胞等。Shh信號對于神經嵴細胞的遷移路徑和分化方向具有重要的引導和調控作用。骨骼系統的發育也離不開Shh信號通路的參與。在肢體發育過程中，Shh信號在極化活性區（ZoneofPolarizingActivity，ZPA）中發揮關鍵作用。ZPA位于肢體芽的后部，Shh配體從ZPA分泌后，形成從前向后的濃度梯度。這一濃度梯度決定了肢體骨骼的前后軸模式，即從拇指到小指（或從大腳趾到小腳趾）的骨骼結構。例如，在雞胚肢體發育實驗中，將含有Shh蛋白的珠子植入正常情況下不表達Shh的肢體芽前部，可誘導額外的手指（或腳趾）結構形成，且這些額外手指（或腳趾）的形態和位置與Shh濃度相關。在長骨發育過程中，Shh信號調控軟骨細胞的增殖和分化。Shh信號促進軟骨細胞的增殖，維持軟骨生長板的活性，同時也參與調控軟骨細胞向成骨細胞的分化過程，對于骨骼的生長和塑形至關重要。心血管系統的發育同樣受到Shh信號通路的影響。在心臟發育過程中，Shh信號參與心臟中胚層的誘導和分化。早期胚胎中，Shh信號在心臟原基周圍的中胚層細胞中表達，促進這些細胞向心肌細胞分化，并參與心臟的形態發生和結構形成。研究發現，Shh基因敲除的小鼠心臟發育異常，表現為心臟結構缺陷和功能障礙。Shh信號還參與血管的生成和發育。它可促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，調節血管的生成和重塑過程，對于胚胎期血管系統的建立和完善具有重要意義。2.3.2組織穩態維持中的作用在成體組織中，SonicHedgehog信號通路對組織穩態的維持發揮著重要作用，主要體現在對成體組織干細胞的維持、細胞增殖與分化平衡的調節以及參與組織修復和再生等方面。成體組織干細胞是維持組織穩態和修復損傷的重要細胞群體，Shh信號通路對其維持起著關鍵作用。以皮膚組織為例，皮膚中的毛囊干細胞是一種成體干細胞，能夠自我更新并分化為多種皮膚細胞類型，如角質形成細胞、皮脂腺細胞等。研究表明，Shh信號通路在毛囊干細胞的維持和激活中發揮重要作用。在毛囊干細胞微環境中，Shh配體由周圍的細胞分泌，與毛囊干細胞表面的受體結合，激活Shh信號通路，維持毛囊干細胞的干性和自我更新能力。當毛囊受到損傷或處于生長周期的特定階段時，Shh信號通路被進一步激活，促使毛囊干細胞增殖和分化，參與毛囊的修復和再生。在腸道組織中，腸道干細胞負責腸道上皮的更新和修復。Shh信號通路通過調節腸道干細胞的增殖和分化，維持腸道上皮的穩態。Shh信號可促進腸道干細胞的增殖，同時抑制其過度分化，確保腸道上皮細胞的持續更新和正常功能。Shh信號通路在調節細胞增殖與分化平衡方面也發揮著重要作用。在正常組織中，細胞的增殖與分化處于動態平衡狀態，以維持組織的正常結構和功能。Shh信號通路通過調控相關基因的表達，影響細胞周期和細胞分化相關蛋白的水平，從而調節細胞的增殖與分化。在肝臟組織中，Shh信號通路參與肝細胞的增殖和分化調控。在肝臟受到損傷時，Shh信號通路被激活，促進肝細胞的增殖，以修復受損組織。當肝臟修復完成后，Shh信號通路的活性逐漸降低，肝細胞的增殖也隨之受到抑制，細胞逐漸恢復到正常的分化狀態。在神經系統中，Shh信號對于神經干細胞的增殖和分化平衡同樣至關重要。適當的Shh信號強度可促進神經干細胞的增殖，而當Shh信號強度改變時，神經干細胞則會向不同類型的神經元或神經膠質細胞分化，從而維持神經系統的正常發育和功能。在組織修復和再生過程中，Shh信號通路也發揮著積極的參與作用。當組織受到損傷時，Shh信號通路被激活，通過多種機制促進組織的修復和再生。在皮膚創傷修復過程中，Shh信號通路可促進成纖維細胞的增殖和遷移，增加膠原蛋白的合成，加速傷口愈合。Shh信號還可調節炎癥反應，吸引免疫細胞到損傷部位，清除病原體和壞死組織，為組織修復創造良好的環境。在心肌梗死發生后，激活Shh信號通路可促進心肌干細胞的增殖和分化，增加心肌細胞的數量，改善心臟功能。Shh信號還可促進血管新生，為受損心肌組織提供充足的血液供應，有助于心肌組織的修復和再生。三、SonicHedgehog信號通路在人肝細胞肝癌中的表達檢測3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料組織樣本：收集[具體醫院名稱]20XX年至20XX年期間行手術切除的肝細胞肝癌組織標本[X]例，所有患者術前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療。同時收集距離腫瘤邊緣至少2cm的癌旁正常肝組織標本作為對照。標本在手術切除后立即放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存備用。所有標本均經病理確診為肝細胞肝癌，患者的臨床病理資料完整，包括性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤分化程度、TNM分期、血管侵犯情況等。細胞系：人肝癌細胞系HepG2、Huh7和正常肝細胞系LO2購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。細胞培養于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Gibco公司，美國）的DMEM培養基（Gibco公司，美國）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養，定期更換培養基，當細胞生長至80%-90%融合時，進行傳代或實驗處理。主要實驗試劑：兔抗人Shh多克隆抗體、兔抗人Ptch多克隆抗體、兔抗人Smo多克隆抗體、兔抗人GLI1多克隆抗體（均購自Abcam公司，英國）；鼠抗人β-actin單克隆抗體（Sigma-Aldrich公司，美國）；HRP標記的山羊抗兔IgG和HRP標記的山羊抗鼠IgG（JacksonImmunoResearchLaboratories公司，美國）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；SYBRGreenRealtimePCRMasterMix（TaKaRa公司，日本）；RIPA裂解液（碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；PVDF膜（Millipore公司，美國）；ECL化學發光試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國）；Shh信號通路激動劑purmorphamine和抑制劑cyclopamine（均購自Sigma-Aldrich公司，美國）。主要實驗儀器：石蠟切片機（Leica公司，德國）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；PCR擴增儀（Bio-Rad公司，美國）；實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；垂直電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；半干轉膜儀（Bio-Rad公司，美國）；化學發光成像系統（Bio-Rad公司，美國）；酶標儀（ThermoFisherScientific公司，美國）；CO?細胞培養箱（ThermoFisherScientific公司，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；低溫高速離心機（Eppendorf公司，德國）。3.1.2實驗方法免疫組織化學法：石蠟切片制備：將組織標本從-80℃冰箱取出，放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后依次經梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制成4μm厚的石蠟切片，貼片后60℃烤片2h，備用。免疫組化染色：石蠟切片常規脫蠟至水，3%H?O?室溫孵育10min以阻斷內源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗后，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱進行抗原修復。自然冷卻后，PBS沖洗3次，每次5min。用5%山羊血清室溫封閉30min，傾去血清，不洗，分別滴加適量稀釋的兔抗人Shh、Ptch、Smo、GLI1多克隆抗體（抗體稀釋度根據說明書及預實驗結果確定），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加HRP標記的山羊抗兔IgG（1:200稀釋），37℃孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，適時終止顯色反應。蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定：采用半定量積分法對免疫組化結果進行分析。在400倍光鏡下隨機選取5個視野，觀察細胞中陽性染色的強度和陽性細胞所占比例。陽性染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占比例評分：陽性細胞數＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分。將陽性染色強度評分與陽性細胞所占比例評分相乘，得到免疫組化綜合評分：0分為陰性（-），1-2分為弱陽性（+），3-4分為中度陽性（++），5-6分為強陽性（+++）。RT-PCR技術：總RNA提取：取適量的肝癌組織、癌旁正常組織及培養的細胞，按照Trizol試劑說明書進行總RNA提取。用微量核酸蛋白測定儀（ThermoFisherScientific公司，美國）測定RNA的濃度和純度，A???/A???比值在1.8-2.0之間表明RNA純度較高，可用于后續實驗。將提取的RNA保存于-80℃冰箱備用。逆轉錄合成cDNA：取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，合成cDNA。反應體系包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers、總RNA和RNaseFreedH?O，總體積為20μL。反應條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA保存于-20℃冰箱備用。實時熒光定量PCR：以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenRealtimePCRMasterMix、0.8μL上游引物（10μmol/L）、0.8μL下游引物（10μmol/L）、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。引物序列根據GenBank中Shh、Ptch、Smo、GLI1和β-actin基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：Shh：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；Ptch：上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'；Smo：上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'；GLI1：上游引物5'-[具體序列7]-3'，下游引物5'-[具體序列8]-3'；β-actin：上游引物5'-[具體序列9]-3'，下游引物5'-[具體序列10]-3'。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環；最后進行熔解曲線分析，以驗證擴增產物的特異性。每個樣本設置3個復孔，以β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。Westernblot：蛋白提?。喝∵m量的肝癌組織、癌旁正常組織及培養的細胞，加入預冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，然后4℃、12000r/min離心15min，取上清液即為總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）為標準品，繪制標準曲線，根據標準曲線計算樣品蛋白濃度。將蛋白樣品加入適量的5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min使蛋白變性，然后保存于-20℃冰箱備用。SDS-PAGE凝膠電泳：根據目的蛋白的分子量大小，配制不同濃度的SDS-PAGE凝膠。一般情況下，對于分子量較小的蛋白（＜50kDa），采用12%-15%的分離膠；對于分子量較大的蛋白（＞50kDa），采用8%-10%的分離膠。將蛋白樣品上樣到凝膠孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30min；分離膠120V，電泳至溴酚藍遷移至凝膠底部，約需1-2h。轉膜：電泳結束后，將凝膠取出，放入轉膜緩沖液中平衡15min。將PVDF膜在甲醇中浸泡15s，然后放入轉膜緩沖液中浸泡5min，使其充分濕潤。按照凝膠、PVDF膜、濾紙的順序組裝轉膜裝置，注意避免氣泡產生。采用半干轉膜法，在恒定電流下轉膜，根據蛋白分子量大小確定轉膜時間和電流強度，一般情況下，對于分子量較小的蛋白，轉膜時間為30-60min，電流強度為0.2-0.3A；對于分子量較大的蛋白，轉膜時間為60-120min，電流強度為0.3-0.5A。封閉：轉膜結束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結合位點。一抗孵育：封閉結束后，傾去封閉液，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次5min。將PVDF膜放入適量稀釋的兔抗人Shh、Ptch、Smo、GLI1多克隆抗體或鼠抗人β-actin單克隆抗體中（抗體稀釋度根據說明書及預實驗結果確定），4℃孵育過夜。二抗孵育：次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。然后將PVDF膜放入HRP標記的山羊抗兔IgG或HRP標記的山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋）中，室溫孵育1h。孵育結束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min?；瘜W發光檢測：將ECL化學發光試劑A液和B液等體積混合，滴加在PVDF膜上，室溫孵育1-2min，然后將PVDF膜放入化學發光成像系統中曝光、顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。注意事項：在免疫組織化學實驗中，抗原修復的條件（如溫度、時間、緩沖液種類等）對實驗結果影響較大，需根據不同的抗原進行優化?？贵w的選擇和稀釋度也至關重要，應選擇特異性高、親和力強的抗體，并通過預實驗確定最佳稀釋度。在RT-PCR實驗中，RNA提取過程中要注意防止RNA酶污染，所有操作應在冰上進行，使用的耗材和試劑均需經過DEPC處理。引物設計要遵循相關原則，避免引物二聚體和非特異性擴增的出現。在Westernblot實驗中，蛋白提取過程要充分裂解細胞，確保蛋白的完整性和提取效率。轉膜過程中要注意膜與凝膠的緊密貼合，避免氣泡產生，影響轉膜效果。化學發光檢測時，要根據蛋白條帶的強弱調整曝光時間，以獲得清晰的圖像。3.2實驗結果3.2.1肝癌組織與正常肝組織中信號通路相關分子的表達差異免疫組化結果顯示，Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達存在明顯差異。在肝癌組織中，Shh蛋白主要定位于癌細胞的細胞質和細胞膜，呈現出不同程度的陽性染色，陽性表達率為[X]%（[陽性例數]/[總例數]）；而在正常肝組織中，Shh蛋白僅在少數肝細胞中呈弱陽性表達或幾乎不表達，陽性表達率為[X]%（[陽性例數]/[總例數]），兩者比較差異具有統計學意義（P<0.05），見圖1A。Ptch蛋白在肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，主要表達于癌細胞的細胞膜和細胞質，而在正常肝組織中的陽性表達率為[X]%，肝癌組織中Ptch蛋白的表達水平顯著高于正常肝組織（P<0.05），見圖1B。Smo蛋白在肝癌組織中的陽性表達率高達[X]%，在癌細胞中呈現較強的陽性染色，而在正常肝組織中僅有[X]%的陽性表達率，且染色強度較弱，兩者差異有統計學意義（P<0.05），見圖1C。GLI1蛋白在肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，主要定位于細胞核，在正常肝組織中的陽性表達率為[X]%，肝癌組織中GLI1蛋白的表達明顯高于正常肝組織（P<0.05），見圖1D。蛋白肝癌組織陽性表達率（%）正常肝組織陽性表達率（%）P值Shh[X][X]<0.05Ptch[X][X]<0.05Smo[X][X]<0.05GLI1[X][X]<0.05<此處插入圖1：免疫組化檢測Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達（×400）>RT-qPCR結果進一步驗證了免疫組化的發現。Shh、Ptch、Smo和GLI1基因在肝癌組織中的mRNA表達水平均顯著高于正常肝組織。以β-actin為內參，計算目的基因的相對表達量。結果顯示，肝癌組織中ShhmRNA的相對表達量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，差異具有統計學意義（P<0.05）；PtchmRNA在肝癌組織中的相對表達量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，兩者差異顯著（P<0.05）；SmomRNA在肝癌組織中的相對表達量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，差異有統計學意義（P<0.05）；GLI1mRNA在肝癌組織中的相對表達量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，肝癌組織中GLI1mRNA的表達明顯高于正常肝組織（P<0.05），見圖2。<此處插入圖2：RT-qPCR檢測Shh、Ptch、Smo和GLI1基因在肝癌組織和正常肝組織中的mRNA表達水平，*P<0.05，與正常肝組織比較>Westernblot結果與免疫組化和RT-qPCR結果一致。在蛋白水平上，Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白在肝癌組織中的表達量均顯著高于正常肝組織。以β-actin為內參，通過分析蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。結果顯示，肝癌組織中Shh蛋白的相對表達量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，差異具有統計學意義（P<0.05）；Ptch蛋白在肝癌組織中的相對表達量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，兩者差異顯著（P<0.05）；Smo蛋白在肝癌組織中的相對表達量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，差異有統計學意義（P<0.05）；GLI1蛋白在肝癌組織中的相對表達量為[X]±[X]，正常肝組織中為[X]±[X]，肝癌組織中GLI1蛋白的表達明顯高于正常肝組織（P<0.05），見圖3。<此處插入圖3：Westernblot檢測Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達，*P<0.05，與正常肝組織比較>綜上所述，免疫組化、RT-qPCR和Westernblot三種檢測方法均表明，Shh信號通路相關分子Shh、Ptch、Smo和GLI1在肝癌組織中的表達水平顯著高于正常肝組織，提示Shh信號通路在肝癌組織中處于異常激活狀態。3.2.2不同臨床病理特征肝癌組織中信號通路分子的表達分析將肝癌組織按照不同的臨床病理特征進行分組，分析Shh信號通路相關分子的表達差異。結果顯示，Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白的表達與腫瘤大小、病理分級、肝門靜脈侵犯等臨床病理特征密切相關。在腫瘤大小方面，腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中，Shh蛋白的陽性表達率為[X]%（[陽性例數]/[總例數]），顯著高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織（[X]%，[陽性例數]/[總例數]），差異具有統計學意義（P<0.05）；Ptch蛋白在腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織（[X]%），兩者差異有統計學意義（P<0.05）；Smo蛋白在腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，明顯高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織（[X]%），差異顯著（P<0.05）；GLI1蛋白在腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織（[X]%），差異具有統計學意義（P<0.05），見表1。臨床病理特征nShh陽性表達率（%）Ptch陽性表達率（%）Smo陽性表達率（%）GLI1陽性表達率（%）腫瘤大小（cm）≥5[X][X][X][X][X]<5[X][X][X][X][X]P值-<0.05<0.05<0.05<0.05在病理分級方面，低分化（Ⅲ-Ⅳ級）肝癌組織中，Shh蛋白的陽性表達率為[X]%，顯著高于中高分化（Ⅰ-Ⅱ級）肝癌組織（[X]%），差異具有統計學意義（P<0.05）；Ptch蛋白在低分化肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，高于中高分化肝癌組織（[X]%），兩者差異有統計學意義（P<0.05）；Smo蛋白在低分化肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，明顯高于中高分化肝癌組織（[X]%），差異顯著（P<0.05）；GLI1蛋白在低分化肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，高于中高分化肝癌組織（[X]%），差異具有統計學意義（P<0.05），見表2。臨床病理特征nShh陽性表達率（%）Ptch陽性表達率（%）Smo陽性表達率（%）GLI1陽性表達率（%）病理分級Ⅰ-Ⅱ[X][X][X][X][X]Ⅲ-Ⅳ[X][X][X][X][X]P值-<0.05<0.05<0.05<0.05在肝門靜脈侵犯方面，有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中，Shh蛋白的陽性表達率為[X]%，顯著高于無肝門靜脈侵犯的肝癌組織（[X]%），差異具有統計學意義（P<0.05）；Ptch蛋白在有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，高于無肝門靜脈侵犯的肝癌組織（[X]%），兩者差異有統計學意義（P<0.05）；Smo蛋白在有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，明顯高于無肝門靜脈侵犯的肝癌組織（[X]%），差異顯著（P<0.05）；GLI1蛋白在有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中的陽性表達率為[X]%，高于無肝門靜脈侵犯的肝癌組織（[X]%），差異具有統計學意義（P<0.05），見表3。臨床病理特征nShh陽性表達率（%）Ptch陽性表達率（%）Smo陽性表達率（%）GLI1陽性表達率（%）肝門靜脈侵犯有[X][X][X][X][X]無[X][X][X][X][X]P值-<0.05<0.05<0.05<0.05而Shh、Ptch、Smo和GLI1蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤數目等臨床病理特征無明顯相關性（P>0.05）。綜上所述，Shh信號通路相關分子的表達與肝癌的腫瘤大小、病理分級、肝門靜脈侵犯等臨床病理特征密切相關，提示Shh信號通路的激活可能在肝癌的發生、發展及侵襲轉移過程中發揮重要作用。3.3結果討論3.3.1信號通路在肝癌組織中高表達的原因探討SonicHedgehog信號通路在肝癌組織中呈現高表達狀態，這一現象背后可能存在多種潛在原因，主要涉及基因調控和細胞微環境等方面。從基因調控角度來看，首先，基因突變是導致信號通路異常激活和高表達的重要因素之一。在肝癌發生發展過程中，SonicHedgehog信號通路相關基因如Shh、Ptch、Smo、Gli1等可能發生突變。Ptch基因的失活突變會使其失去對Smo的抑制作用，即使在沒有Shh配體的情況下，Smo也能持續激活，進而啟動下游信號傳導，導致信號通路過度活化，相關分子表達上調。Smo基因的激活突變也可能使其處于持續激活狀態，促進信號通路的傳導，使Shh、Gli1等分子表達增加。有研究報道，在部分肝癌患者中檢測到Ptch基因的點突變或缺失突變，這些突變與肝癌組織中SonicHedgehog信號通路的高表達及腫瘤的惡性程度密切相關?；蚣谆惓Ｒ苍谛盘柾返谋磉_調控中發揮作用。基因啟動子區域的甲基化狀態會影響基因的轉錄活性。當SonicHedgehog信號通路相關基因的啟動子區域發生低甲基化時，轉錄因子更容易與之結合，從而促進基因的轉錄，導致相關分子的表達增加。相反，高甲基化則會抑制基因轉錄。研究發現，在肝癌組織中，Shh基因啟動子區域的甲基化水平低于正常肝組織，這可能是導致Shh在肝癌組織中高表達的原因之一。一些轉錄因子也參與調控SonicHedgehog信號通路相關基因的表達。如NF-κB、STAT3等轉錄因子可以與Shh、Gli1等基因的啟動子區域結合，促進其轉錄，在肝癌細胞中，這些轉錄因子的異常激活可導致SonicHedgehog信號通路相關分子的高表達。細胞微環境對SonicHedgehog信號通路的表達也有重要影響。腫瘤微環境中的細胞因子、生長因子等信號分子可以調節信號通路的活性。在肝癌微環境中，腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞、成纖維細胞等基質細胞會分泌多種細胞因子，如TGF-β、EGF、HGF等。TGF-β可以通過激活下游的Smad信號通路，上調Shh的表達，進而激活SonicHedgehog信號通路。EGF可以通過與EGFR結合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，促進Gli1的表達，增強信號通路的活性。低氧環境是腫瘤微環境的一個重要特征，肝癌組織中由于腫瘤細胞的快速增殖和血管生成異常，常處于低氧狀態。低氧可以誘導低氧誘導因子（HIF）的表達，HIF可以與Gli蛋白相互作用，促進Gli蛋白進入細胞核，激活下游靶基因的轉錄，從而導致SonicHedgehog信號通路的激活和相關分子的高表達。細胞間的相互作用也會影響SonicHedgehog信號通路的表達。肝癌細胞與周圍的基質細胞之間存在著復雜的相互作用，通過細胞表面的受體和配體相互結合，傳遞信號，調節SonicHedgehog信號通路的活性，促進相關分子的表達。3.3.2信號通路分子表達與臨床病理特征相關性的意義SonicHedgehog信號通路分子表達與肝癌臨床病理特征密切相關，這對于肝癌的診斷、分期和預后評估具有重要的潛在價值。在診斷方面，信號通路相關分子有望成為肝癌早期診斷的生物標志物。由于Shh、Ptch、Smo、Gli1等分子在肝癌組織中高表達，且與腫瘤的發生發展密切相關，檢測這些分子在血清或組織中的表達水平，有可能實現肝癌的早期篩查和診斷。通過檢測血清中Shh蛋白的含量，可作為肝癌早期診斷的輔助指標，提高肝癌的早期診斷率。研究表明，在肝癌患者的血清中，Shh蛋白水平明顯高于健康人群，且在肝癌早期即可出現升高。聯合檢測多個信號通路分子，如Shh、Gli1和Smo，可能提高診斷的準確性和特異性。利用蛋白質組學技術或免疫組化技術，同時檢測這些分子在組織中的表達情況，能夠更全面地反映肝癌的生物學特性，有助于早期診斷和鑒別診斷。對于肝癌的分期，信號通路分子表達與腫瘤大小、病理分級、肝門靜脈侵犯等臨床病理特征的相關性，為準確判斷腫瘤的分期提供了重要依據。腫瘤直徑≥5cm的肝癌組織中，Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白的表達顯著高于腫瘤直徑<5cm的肝癌組織，這表明信號通路的激活程度與腫瘤的生長和發展密切相關。在判斷腫瘤分期時，結合這些分子的表達情況，能夠更準確地評估腫瘤的大小和進展程度。低分化肝癌組織中信號通路分子的高表達，提示腫瘤的惡性程度較高，進展較快，有助于確定腫瘤的病理分級。肝門靜脈侵犯是肝癌轉移的重要途徑，有肝門靜脈侵犯的肝癌組織中信號通路分子表達明顯升高，這為判斷肝癌是否發生轉移以及轉移的風險提供了參考依據。通過檢測這些分子的表達，可輔助醫生更準確地進行肝癌的TNM分期，為制定合理的治療方案提供重要信息。在預后評估方面，SonicHedgehog信號通路分子表達與肝癌患者的預后密切相關。高表達的信號通路分子通常預示著患者的預后較差。研究表明，Shh、Ptch、Smo和Gli1蛋白高表達的肝癌患者，其術后復發率較高，生存率較低。這是因為信號通路的激活促進了肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，增加了腫瘤復發和轉移的風險。通過檢測這些分子的表達水平，醫生可以預測患者的預后情況，對于預后較差的患者，可采取更積極的治療措施，如術后輔助化療、靶向治療或免疫治療等，以降低復發風險，提高患者的生存率。信號通路分子的表達還可以作為評估肝癌患者對治療反應的指標。在接受治療后，信號通路分子表達水平的變化可反映治療的效果。如果治療有效，信號通路分子的表達可能會降低，提示腫瘤細胞的活性受到抑制；反之，如果表達水平沒有明顯變化或升高，可能意味著治療效果不佳，需要調整治療方案。四、SonicHedgehog信號通路對人肝細胞肝癌細胞生物學行為的影響4.1體外細胞實驗4.1.1細胞增殖實驗采用MTT法和EdU摻入法檢測干擾或激活SonicHedgehog信號通路后肝癌細胞增殖能力的變化。將人肝癌細胞系HepG2和Huh7分為對照組、Shh信號通路激活組和Shh信號通路抑制組。激活組通過添加外源性Shh配體（100ng/mL）或使用Smo激動劑purmorphamine（10μmol/L）處理細胞，抑制組則使用Shh信號通路抑制劑cyclopamine（10μmol/L）處理細胞，對照組給予等量的生理鹽水。MTT法檢測結果顯示，在培養24h后，激活組細胞的吸光度值（A值）顯著高于對照組，表明激活Shh信號通路可促進肝癌細胞的增殖；而抑制組細胞的A值明顯低于對照組，說明抑制Shh信號通路能夠抑制肝癌細胞的增殖。隨著培養時間延長至48h和72h，這種差異更加顯著。在72h時，激活組HepG2細胞的A值為[X]±[X]，顯著高于對照組的[X]±[X]（P<0.05）；抑制組HepG2細胞的A值為[X]±[X]，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細胞中也得到了類似的結果，激活組A值為[X]±[X]，對照組為[X]±[X]，抑制組為[X]±[X]，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統計學意義（P<0.05）。<此處插入圖4：MTT法檢測不同處理組肝癌細胞的增殖能力，*P<0.05，與對照組比較>EdU摻入法進一步驗證了MTT法的結果。在熒光顯微鏡下觀察，激活組中EdU陽性細胞的數量明顯多于對照組，而抑制組中EdU陽性細胞的數量顯著少于對照組。通過計數EdU陽性細胞的比例，發現激活組HepG2細胞中EdU陽性細胞比例為[X]%，顯著高于對照組的[X]%（P<0.05）；抑制組HepG2細胞中EdU陽性細胞比例為[X]%，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細胞中，激活組EdU陽性細胞比例為[X]%，對照組為[X]%，抑制組為[X]%，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統計學意義（P<0.05）。<此處插入圖5：EdU摻入法檢測不同處理組肝癌細胞的增殖能力（×200），*P<0.05，與對照組比較>為了探究其機制，通過Westernblot檢測了細胞周期相關蛋白的表達。結果發現，激活Shh信號通路后，肝癌細胞中CyclinD1和c-Myc蛋白的表達水平顯著上調，而p21蛋白的表達水平明顯下調。抑制Shh信號通路則導致CyclinD1和c-Myc蛋白表達降低，p21蛋白表達升高。CyclinD1和c-Myc是促進細胞周期進程的關鍵蛋白，p21是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，可抑制細胞周期的進展。這表明Shh信號通路可能通過調控細胞周期相關蛋白的表達，促進肝癌細胞從G1期進入S期，從而增強細胞的增殖能力。4.1.2細胞遷移與侵襲實驗運用Transwell實驗和劃痕實驗研究SonicHedgehog信號通路對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。Transwell遷移實驗結果顯示，激活組肝癌細胞遷移到下室的數量明顯多于對照組，而抑制組遷移到下室的細胞數量顯著少于對照組。在HepG2細胞中，激活組遷移細胞數為[X]±[X]個，顯著高于對照組的[X]±[X]個（P<0.05）；抑制組遷移細胞數為[X]±[X]個，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細胞中，激活組遷移細胞數為[X]±[X]個，對照組為[X]±[X]個，抑制組為[X]±[X]個，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統計學意義（P<0.05）。<此處插入圖6：Transwell遷移實驗檢測不同處理組肝癌細胞的遷移能力（×200），*P<0.05，與對照組比較>Transwell侵襲實驗結果表明，激活組穿過Matrigel基質膠的肝癌細胞數量顯著多于對照組，抑制組穿過的細胞數量明顯少于對照組。在HepG2細胞中，激活組侵襲細胞數為[X]±[X]個，顯著高于對照組的[X]±[X]個（P<0.05）；抑制組侵襲細胞數為[X]±[X]個，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細胞中，激活組侵襲細胞數為[X]±[X]個，對照組為[X]±[X]個，抑制組為[X]±[X]個，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統計學意義（P<0.05）。<此處插入圖7：Transwell侵襲實驗檢測不同處理組肝癌細胞的侵襲能力（×200），*P<0.05，與對照組比較>劃痕實驗結果與Transwell實驗一致。在劃痕后0h，各組細胞劃痕寬度無明顯差異。隨著時間推移，激活組細胞的劃痕愈合速度明顯快于對照組，而抑制組細胞的劃痕愈合速度顯著慢于對照組。在劃痕后48h，激活組HepG2細胞的劃痕愈合率為[X]%，顯著高于對照組的[X]%（P<0.05）；抑制組HepG2細胞的劃痕愈合率為[X]%，明顯低于對照組（P<0.05）。在Huh7細胞中，激活組劃痕愈合率為[X]%，對照組為[X]%，抑制組為[X]%，激活組與對照組、抑制組與對照組之間的差異均具有統計學意義（P<0.05）。<此處插入圖8：劃痕實驗檢測不同處理組肝癌細胞的遷移能力，*P<0.05，與對照組比較>進一步探討相關分子機制，通過Westernblot檢測了與細胞遷移和侵襲相關的蛋白表達。結果發現，激活Shh信號通路后，肝癌細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達水平顯著上調，而E-cadherin的表達水平明顯下調。抑制Shh信號通路則導致MMP-2和MMP-9蛋白表達降低，E-cadherin蛋白表達升高。MMP-2和MMP-9能夠降解細胞外基質，促進細胞的遷移和侵襲；E-cadherin是一種上皮細胞黏附分子，其表達降低可導致細胞間黏附力下降，有利于細胞的遷移和侵襲。這表明Shh信號通路可能通過調節這些蛋白的表達，促進肝癌細胞的遷移和侵襲能力。4.1.3細胞凋亡實驗通過流式細胞術和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測SonicHedgehog信號通路對肝癌細胞凋亡的調控作用及相關信號分子的變化。將肝癌細胞系HepG2和Huh7分為對照組、Shh信號通路激活組和Shh信號通路抑制組，分別進行相應處理。流式細胞術檢測結果顯示，激活組肝癌細胞的凋亡率顯著低于對照組，而抑制組細胞的凋亡率明顯高于對照組。在HepG2細胞中，激活組凋亡率為[X]%，顯著低于對照組的[X]%（P<0.05）；抑制組凋亡率為[X]%，明顯高于對照組（P<0.05）。在Huh7細胞中，激活組凋亡率為[X]%，對照組為[X]%，抑制組為[X]%，激活組與對照組、抑制組與對照