有機溶劑沉淀法第二節第二章固相析出技術有機溶劑對于許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一，常用丙酮、異丙酮、乙醇、甲醇等。定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，稱為有機溶劑沉淀法。第二節有機溶劑沉淀法基本原理：①降低了介質的介電常數，使溶質分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀；②有機溶劑的親水性比溶質分子的親水性強，會搶奪本來與親水溶質結合的自由水，破壞其表面的水化膜，導致溶質分子間相互作用增強而發生聚集，從而沉淀析出。一、

有機溶劑沉淀的特點和基本原理溶劑介電常數溶劑介電常數水802.5mol/L尿素8420%乙醇702.5mol/L甘氨酸13740%乙醇60丙酮2260%乙醇48甲醇33100%乙醇24丙醇23部分常用溶劑介電常數介電常數:表征介質在外電場作用下極化程度介電常數越大,絕緣性越大優點：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉析；有機溶劑沸點低，容易除去或回收，產品更純凈，分離容易。缺點：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，沉淀操作需在低溫下進行；需用大量的有機溶劑，成本較高，且易燃易爆。第二節有機溶劑沉淀法（一）有機溶劑選擇的基本標準

1.介電常數要小，沉淀作用強2.致變性作用要小，對生物大分子的變性作用小3.毒性要小、揮發性適中4.水溶性要好，與水無限互溶二、

常用的有機溶劑及其選擇（二）常用的有機溶劑

沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。第二節有機溶劑沉淀法二、

常用的有機溶劑及其選擇溶劑用量V=V0（S2－S1）/（100－S2）

V:需加入有機溶劑體積；V0：原溶液體積；S1：原溶液中有機溶劑的體積分數，%；S2：所需要的有機溶劑體積分數，%。第二節有機溶劑沉淀法二、

常用的有機溶劑及其選擇案例：果膠是一種廣泛分布在植物體內的膠體性多糖物質，包括原果膠、水溶性果膠和果膠酸三大類。用酸提取沉淀法時可以選擇乙醇沉淀法或者鹽析法。請選擇較為優化的方法，并說明理由。第二節有機溶劑沉淀法（一）溫度

（低溫）進行有機溶劑沉淀，溫度重要的因素。大多數蛋白質的溶解度隨溫度降低減小，故低溫沉淀較為完全；生物大分子在有機溶劑中對溫度敏感，易變性，且有機溶劑與水混合時產生放熱反應。在用有機溶劑沉淀生物大分子時，操作是在低溫下進行的，同時要保持低溫的恒定。三、影響有機溶劑沉淀的因素第二節有機溶劑沉淀法（一）溫度

（低溫）具體操作，待分離的溶液和有機溶劑分別進行預冷。有機溶劑必須預先冷至較低溫度，一般在0℃以下，操作時要在冰浴中進行，加入有機溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過濃。為減少變性作用，通常低溫沉淀短時間（0.5-2h）后進行過濾或離心分離；真空抽去剩余溶劑或者沉淀溶于緩沖液中，減少目的物與有機溶劑的接觸。三、影響有機溶劑沉淀的因素第二節有機溶劑沉淀法（二）樣品濃度樣品濃度低時增加有機溶劑投入量和損耗，降低了溶質回收率，易產生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果；對于高濃度的生物樣品，節省了有機溶劑，減少了變性的危險，但共沉作用大，分離效果下降。

蛋白質（5-20mg/ml）0.5％～2％，粘多糖（10-20mg/ml）1％～2％三、影響有機溶劑沉淀的因素第二節有機溶劑沉淀法（三）pH盡可能選擇樣品溶解度最低的pH，通常是選在等電點附近，以提高該沉析的分辨能力;要選擇在樣品穩定的pH范圍內，少數生物分子在等電點附近不穩定，影響其活性。盡量避免目的物與雜質帶相反電荷而加劇共沉現象的發生。三、影響有機溶劑沉淀的因素注意：使溶液中大多數蛋白質帶相同電荷，不要讓目的物與主要雜質分子帶相反電荷，以致出現較嚴重的共沉作用。第二節有機溶劑沉淀法（四）離子強度

低鹽：有利于沉淀，還有保護蛋白質，防止變性。高鹽：增大蛋白質溶解度，降低效果，沉淀物中可能夾帶鹽。

一般中性鹽濃度以0.01～0.05mol/L為好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。三、影響有機溶劑沉淀的因素第二節有機溶劑沉淀法三、影響有機溶劑沉淀的因素（五）多價金屬離子的影響某些金屬離子具有助沉作用，蛋白質與Zn2+、Ca2+等形成復合物，使蛋白質在水和有機溶液中的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機溶劑的耗量；0.005～0.02mol/L的Zn2+可使有機溶劑用量減少l/3至1/2；使用時要避免會與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在。實際操作時，經常預先加入有機溶劑除雜蛋白，再加陽離子Zn2+、Ca2+沉淀目的物。第二節有機溶劑沉淀法總結：1、有機溶劑沉淀法經常用于蛋白質、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分離，使用時先選擇合適的有機溶劑，然后注意調整樣品的濃度、溫度、pH和離子強度，來達到最佳效果。2、沉淀所得到的固體樣品，盡可能抽干沉淀，減少其中有機溶劑的含量。第二節有機溶劑沉淀法三、

影響有機溶劑沉淀的因素應用實例胰島素的精制胰島素粗提液調pH4.2加30%丙酮調pH6.0加Zn2+上清液上清液（回收）沉析(胰島素鋅鹽)沉析（雜蛋白）應用實例-乙醇沉淀法提取柑橘皮中的果膠材料新鮮柑橘皮50g正磷酸、0.2mol/L鹽酸、焦磷酸鈉（又稱磷酸四鈉）組織搗碎機、大燒杯（≥500mL）、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、搪瓷桶、酸度計、不銹鋼鍋提取液分離將提取液加入1％的硅藻土作助濾劑，然后送入板框壓濾機，過濾后得無色透明的果膠稀溶液，濾渣棄去。濃縮將過濾收集的濾液置于真空濃縮裝置中，于75℃溫度下濃縮，直至濃縮到果膠濃度為4％左右。沉析將濃縮液置于搪瓷桶中，并冷至室溫，然后乙醇以噴淋方式加至已濃縮好的果膠溶液中，乙醇含量控制在40-50％的范圍內，不斷攪動，果膠聚結成海綿狀析出。分離將果膠/乙醇混合物經1~2h靜置后，送入板框壓濾機過濾。收集濾餅(果膠)，然后用80％乙醇溶液洗滌濾餅1~2次，再用95％的乙醇洗滌1~2次，洗完后壓干。干燥將以上濾好的果膠置于真空干燥器中于55℃左右干燥，即得果膠純品。應用實例-銀耳多糖的提取純化銀耳多糖主要成分含有酸性雜多糖、中性雜多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖不含核酸、蛋白質類物質實驗儀器：燒杯、布氏漏斗、抽濾瓶、分液漏斗、量筒、離心機、恒溫水浴鍋、透析袋、濾紙、組織搗碎機、不銹鋼鍋。實驗試劑：（1）1％復合酶制劑(含果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶食品級復合酶)；（2）2％溴化十六烷基三甲銨（CTAB）配制：取2gCTAB溶于100mL蒸餾水中，搖勻備用；（3）α-萘酚配制：α-萘酚5g溶于95％乙醇；（4）5%三氯乙酸-正丁醇溶液；（5）2mol／L的氫氧化鈉溶液；（6）0.5％甲苯胺乙醇溶液；（7）2mol／L氯化鈉溶液；（8）2mol／L鹽酸溶液；（9）活性炭；硅藻土。（10）1％融菌酶制劑；（11）無水乙醇；（12）濃硫酸；（13）乙醚。1.銀耳預處理

20g不銹鋼鍋中

加水1600mL

20℃～25℃浸泡30min

搗碎機中搗碎

銀耳漿液

2mol／L鹽酸溶液調pH至6.3

加入1％復合酶制劑

50℃下酶促反應40min

銀耳漿液

2.酶浸提

80℃滅酶，保溫浸提約1.5h

80℃水浴濃縮

等體積5％三氯乙酸-正丁醇溶液

搖勻

離心（3000r/min）15min

濃縮液

3.多糖的沉淀（有機酸除雜）

下層清液備用

吸去上層正丁醇中層變性蛋白

2mol／L的氫氧化鈉溶液調pH至7

搖勻

抽濾

3.多糖的沉淀（脫色、透析

）

下層清液備用

加1％活性炭