生物藥物檢測技術

藥學系朱宏陽7/1/20251第八章多糖類藥物的分析第一節概述第二節黏多糖第三節細菌多糖第四節真菌多糖7/1/20252學習目標學習用于臨床治療的黏多糖、細菌多糖和真菌多糖的結構、理化性質和質量分析方法等有關知識。掌握多糖類藥物的結構特征，肝素、硫酸軟骨素等黏多糖藥物的鑒別和含量測定方法。熟悉右旋糖酐分子量測定方法和含量測定方法了解真菌多糖的質量標準和含量測定方法熟練掌握比色法測定氨基己糖的含量、凝固時法測定抗凝血活性的技能7/1/20253第一節概述糖：多羥基醛酮化合物。單糖：具有還原性，在酸中穩定，在濃堿中不穩定，發生裂解聚合反應多糖：單糖分子縮合、失水而成，分子結構復雜、龐大的糖類物質。糖苷鍵連接。>10個單糖，稱多糖，<10，寡糖四大生命基本物質之一，高等植物、動物、微生物、地衣和海藻中廣泛存在。生物活性作用：抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫促進7/1/20254多糖：分子量大，帶負電荷，水溶液有黏度，能被酸堿水解成單糖或低聚糖或其他組分多糖。含糖醛酸和氨基糖基多糖：肝素、透明質酸生物活性與化學結構有關。多糖藥物的結構分析：單糖組成、分子量、糖苷鍵連接方法、糖苷鍵連接位置等分析方法：單糖分離和鑒定：紙層析、薄層層析、HPLC、GC-MASS聯用分子量：凝膠色譜法糖苷鍵：紅外光譜、核磁共振、化學反應后產物的分析7/1/20255第二節黏多糖黏多糖：含氮的不均一多糖，構成細胞間結締組織的主要成分，廣泛存在于哺乳動物各種細胞內。化學組成：糖醛酸和酪氨基己糖交替出現，有時含硫鍵。糖胺聚糖、酸性黏多糖由特定的重復雙糖結構構成，在雙糖單位包含一個氨基己糖(N-乙酰化)。糖殘基：D-半乳糖、D-甘露糖、L-巖藻糖；D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、L-艾杜糖醛酸；氨基半乳糖、氨基葡萄糖重要的黏多糖：肝素、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、透明質酸7/1/20256肝素：heparin，從牛肺、豬小腸粘膜提取。化學組成：葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組成的黏多糖硫酸脂強酸性、高度負電荷，延長血凝時間，特異性與毛細血管壁上的脂蛋白脂酶結合。預防手術后血栓形成和治療急性靜脈血栓的首選藥物。降血脂、抗炎、抗過敏及免疫調節等。白色或類白色粉末，有吸濕性，水中易溶解。7/1/20257硫酸軟骨素：從豬的鼻軟骨或鯨魚或鯊魚的軟骨中提取。可防止脂蛋白酯酶激活引起的脂質沉積和抑制血栓的形成，防止冠心病和動脈粥樣硬化，用于偏頭痛和鏈霉素引起的聽覺障礙及肝炎的輔助治療，健康食品。軟骨素化學組成：D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺組成的黏多糖。硫酸軟骨素是軟骨素的硫酸酯，A、B、C三者構型。白色粉末，易濕性，易溶于水。避光密封保存7/1/20258一、鑒別利用各種糖具有其特有的比旋度，來鑒別糖類物質。1、沉淀法黏多糖分子具有半縮醛基結構，有還原性，與堿性酒石酸鉀銅溶液反應加熱即生產氧化亞銅的紅色沉淀。取硫酸軟骨素5%溶液1ml，加堿性酒石酸鉀銅數滴，加熱，即產生紅色沉淀。酒石酸鉀銅+RCHO→RCOOH+酒石酸鉀+氫氧化亞銅氫氧化亞銅→Cu2O↓+H2O7/1/202592、SO42-鑒別反應由于黏多糖分子結構中的硫酸酯被水解成游離的硫酸根離子，而顯硫酸鹽的鑒別反應。取硫酸軟骨素供試溶液10ml，加稀鹽酸0.5ml，加BaCl2試液，產生白色沉淀。3、標準品對照法肝素，瓊脂糖凝膠電泳法，遷移距離之比應為0.9~1.1。4、甲苯胺藍染色法硫酸軟骨素與甲苯胺藍產生異染反應，硫酸軟骨素被染成紫紅色。7/1/202510二、檢查酸堿度、溶液的澄清度與顏色、干燥失重、熾灼殘渣、重金屬、吸收度、黏度、總氮量、氯化物、硫、熱原等。1、吸收度黏多糖易混入來源于動物細胞內的核酸蛋白質等雜質，利用蛋白質和核酸分別在280nm、260nm有紫外吸收的特性檢查其純度。肝素鈉，260nm不超過0.2，280nm不超過0.15。7/1/2025112、黏度通過黏度檢查，可以控制雜質的量。粘度計檢測。3、含氮量通過測定含氮量可控制引入的雜蛋白含量。硫酸軟骨素理論含氮量為3.05%，含氮量應在2.5~3.8%；肝素鈉含氮量應在1.3~2.5%。4、硫黏多糖是含硫酸酯的糖類化合物，通過測定含硫量可以控制雜質量。氧瓶燃燒法。7/1/202512三、含量測定1、硫酸軟骨素硫酸軟骨素的雙糖結構單位中有一分子為氨基己糖，將硫酸軟骨素在酸性條件下水解釋放出氨基己糖，使其在堿性條件下與乙酰丙酮反應，生成色原物質，再與對二甲氨基苯甲醛鹽酸醇溶液反應生成紅色溶液，以鹽酸氨基葡萄糖為對照品，同法進行上述操作，用比色法測定硫酸軟骨素中氨基己糖的含量。再與理論值39.0%比較，即可計算出硫酸軟骨素的百分含量，氨基己糖不得少于24.0%7/1/2025131)對照溶液的配制每毫升含鹽酸氨基葡萄糖0.1mg2)供試溶液的配制3)測定方法525nm處測定吸收度4)結果計算7/1/202514注意事項在乙酰丙酮反應過程中，為防止乙酰丙酮的揮發和保證反應完全，必須密塞。水浴液面必須高于刻度試管內容物的液面，并避免刻度試管底部接觸鍋底，使局部溫度過高。測定必須用無醛乙醇，因加乙酰丙酮后，生成的色原物質也能與乙醇中的醛作用，影響測定結果。硫酸軟骨素用過量酸水解后，水解產物在288nm處有最大吸收，其吸光度與硫酸軟骨素的含量呈線性關系，通過用精致硫酸軟骨素為標準品繪制標準曲線，可求得樣品的含量，此法專屬性強，操作簡便，結果穩定。7/1/2025152、肝素肝素對凝血過程的多個環節都有抑制作用，最終使纖維蛋白原不能轉變為纖維蛋白而產生抗凝血作用。其生物檢定方法系比較肝素標準品與供試品延長新鮮兔血或兔、豬血漿凝結時間的作用，以測定供試品的效價。1)標準品溶液的配制2)標準品稀釋液的配制按高、中、低劑量組用0.9%氯化鈉溶液配成三種濃度的稀釋液3)供試品溶液與稀釋液的配制按供試品的標示量或估計效價照標準品溶液與稀釋液的配制法配成高、中、低三種濃度的稀釋液。7/1/2025164)血漿的制備5)檢定法新鮮兔血：將小試管置于37±0.5℃水浴中，從動物采血時起至小試管放入恒溫水浴時間不得超過3min，注意觀察并記錄各管的凝結時間。血漿：注意觀察并記錄各管凝結時間，將各管凝結時間換成對數，照生物檢定統計法中的量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差檢定法1可信限率(FL%)不得大于10%檢定法2可信限率(FL%)不得大于5%7/1/202517色原底物法：基于肝素與抗凝酶(AT-Ⅳ)的復合物對凝血因子×a(F×a)或凝血酶有抑制作用，殘余的F×a或凝血酶用某些色原底物測出，量與肝素呈負相關，鑒于肝素的抗F×a活性對抗血栓效應的重要性，美國把色原底物測定用于肝素的質量控制。底物S-2222的C端結合了對硝基苯胺(PNA)，水解釋放出的游離PNA在波長405nm處吸光度很高，而本身無色的底物在此基本無吸收。7/1/202518第三節細菌多糖細菌多糖：生長過程中產生的一些多糖類物質。右旋糖酐，葡聚糖，是蔗糖經腸膜狀串珠菌發酵后生成的一種高分子葡萄糖聚合物高分子右旋糖酐、中分子右旋糖酐、小分子右旋糖酐臨床上使用：右旋糖酐20、右旋糖酐40和右旋糖酐70，用作血漿代用品，用于出血性休克、創傷性休克及燒傷休克等右旋糖酐：葡萄糖(1→6)α-糖苷鍵連接而成，同時含有(1→3)α-和(1→4)α-糖苷鍵連接形成的分支結構白色或類白色無定性粉末。水解得到葡萄糖7/1/202519一、鑒別右旋糖酐經堿水解后產生葡萄糖，葡萄糖可使Cu2+還原成紅色氧化亞銅沉淀。取本品0.2g，加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液2ml與硫酸銅試液數滴，加熱后變成紅棕色沉淀。二、檢查右旋糖酐檢查項目多，氯化物、重金屬、干燥失重、熾灼殘渣的檢查參見藥典，氮、分子量與分子量分布7/1/2025201、氮右旋糖酐在發酵生產中混入的微量雜質蛋白采用檢查氮的含量來控制。凱氏定氮法2、分子量與分子量分布發酵得到的產物分子量很大，需經水解才能得到右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70，如果水解不完全，就會引入大分子量的糖酐分子排阻色譜法：多糖測定凝膠柱，以0.71%硫酸鈉溶液為流動相，柱溫35℃，流速每分鐘0.5ml，示差折光檢查器檢測。進樣量20μl，根據保留時間計算平均分子量和分子量分布7/1/202521三、含量測定右旋糖酐的含量測定為旋光光度法。根據右旋糖酐水溶液的旋光度在一定范圍內與濃度成正比來測定含量的。右旋糖酐20氯化鈉注射液的含量測定：精密量取本品10ml，置25ml或50ml量瓶中，加水稀釋到刻度，搖勻，照旋光度測定法測定。

C=0.5128αC：每100ml注射液中含有右旋糖酐的種類，gΑ：旋光度×稀釋倍數7/1/202522第四節真菌多糖真菌多糖：食用菌中所含的最重要得藥效成分。顯著提高免疫力，抗腫瘤的藥理活性。靈芝、冬蟲夏草、灰樹花、木耳、銀耳、香菇、猴頭菇、白靈菇、竹黃、云芝、雞腿蘑、松茸、桑黃等。7/1/2025237/1/202524云芝多糖：從彩絨革蓋菌的菌絲體中提取分離得到。分子量在10萬以上，富含β-1,4、β-1,3、或β-1,4、β-1,6糖苷鍵的葡聚糖，另有甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。多糖鏈上結合著小分子蛋白質(多肽)組成蛋白多糖。胞內：抑制肉瘤S180的作用，免疫激活作用胞外多糖：無抑瘤作用，只有免疫激活作用。實際應用的是胞內、胞外多糖的混合物7/1/202525香菇多糖：從香菇子實體中提取、純化的多糖肽類高分子物質基本結構：每5個β-(1→3)結合的葡萄糖直鏈上有2個β-(1→3)結合側鏈的高分子葡聚糖。多糖：主要是甘露糖和葡聚糖，少量的巖藻糖、半乳糖、木糖及阿拉伯糖等7/1/202526肽鏈則以天門冬氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、甘氨酸和絲氨酸等18種氨基酸組成。具有免疫調節作用的抗腫瘤輔助藥物，能促進T、B淋巴細胞增殖，提高自然殺傷細胞活性。適用于慢性病毒性肝炎、肝中毒、肝硬化、腫瘤及其他免疫功能低下癥。7/1/202527一、鑒別1、葡萄糖的鑒別反應真菌多糖經酸性水解產生葡萄糖，經濃硫酸脫水后，生產糠醛衍生物，再與二分子α-萘酚縮合成醌型化合物而呈紫紅色。2、蛋白質的鑒別反應云芝多糖經強酸水解后，蛋白質與多糖連接的鍵斷裂，蛋白質被水解為小分子多肽、氨基酸，可與茚三酮丙酮試液反應產生藍紫色。7/1/202528二、檢查真菌多糖的有關雜質主要為來自于提取所用的真菌的雜質：低聚糖、核酸、蛋白質等1、單糖香菇多糖產品中有部分單糖，規定單糖的含量以無水葡萄糖計不得超過15%。碘滴定法2、蛋白質對真菌多糖中混入的雜蛋白的量進行控制。磺基水楊酸法一般多糖在200nm或小于200nm波長處有最大吸收峰，用紫外分光光度法于200~400nm處進行掃描，在260nm和280nm處應無最大吸收峰。7/1/202529