ICS67.080.20B61DB42Regulationofqaulityidentificationforediblefungispawn湖北省質量技術監督局發布IDB42/T671-2010本標準由華中農業大學提出。本標準起草單位：華中農業大學植物科技學院，農業部微生物產品質量監督檢驗測試中心（武漢湖北省食用菌工程技術研究中心。本標準主要起草人：邊銀丙、王卓仁、樊曉琳、李維琳、肖揚、徐章逸。DB42/T671-20101食用菌菌種質量鑒定技術規程本標準規定了食用菌菌種質量鑒定技術規程的術語和定義、鑒定技術要求、菌種送樣與留樣、菌種質量要求、菌種質量鑒定方法、菌種質量的判定、菌種標簽、包裝、保藏、運輸和檢驗報告。auricula)、雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)nebrodensis)、杏鮑菇(Pleurotuseryngiivar.eryngii）的母種（一級菌種）、原種（二級菌種）和栽培種（三級菌種）的質量鑒定。2規范性引用文件下列文件對本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T12728-2006食用菌術語GB19169GB19170GB19171GB19172黑木耳菌種香菇菌種雙孢蘑菇菌種平菇菌種NY862杏鮑菇和白靈菇菌種NY/T528-2002食用菌菌種生產技術規程NY/T1097-2006食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶法NY/T1730-2009食用菌菌種真實性鑒定ISSR法NY/T1743-2009食用菌菌種真實性鑒定RAPD法NY5099無公害食品食用菌栽培基質安全技術要求NY/T5333-2006無公害食品食用菌生產技術規范《食用菌菌種管理辦法》（2006年3月27日農業部令第62號）3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1菌種純度culturepurity指某一菌種只含有特定品種的菌絲體。3.2菌種活力culturevigour菌種活力包括菌種萌發、定植能力和吃料能力。2DB42/T671-20103.3待檢菌種testedculture指由受檢單位或委托方提供的需要檢驗機構進行檢驗的菌種，包括母種、原種和栽培種。3.4標準菌種standardculture指由法定菌種保藏機構進行保藏的、菌種來源明確且種性穩定、活力正常的菌種，包括標準母種、標準原種和標準栽培種。4鑒定技術要求4.1鑒定技術人員應符合農業部2006年《食用菌菌種管理辦法》的要求。4.2鑒定單位資質應符合農業部2006年《食用菌菌種管理辦法》的要求。4.3鑒定場地的選擇鑒定場地所處的環境應不影響檢驗結果的有效性或不對其所要求的測量準確度產生不利的影響。檢驗場地的檢驗工作區域、能源、采光、控溫、通風等應該保證有利于正常檢驗工作的進行。4.3.1顯微鏡觀察室室內要求干燥、通風、環境衛生潔凈。顯微鏡所在試驗臺有局部照明，遠離水源。4.3.2微生物培養室室內應干燥、通風，具有紫外燈等消毒條件，與外間安全隔離。4.3.3生化分析室具有檢測食用菌生物學特性和各項理化指標的實驗條件。分析用藥劑放置于藥劑櫥中，藥劑櫥放在人員進出或操作時不易靠近的陰涼地方，避免陽光直射。電烘箱、高速離心機等設備，應遠離藥劑櫥，無菌操作臺遠離空調。保持周圍環境衛生，干燥，注意通風。4.3.4分子生物學實驗室分子實驗室分為核酸檢測區(試劑貯存和準備區，樣品粉碎區，核酸制備區，擴增區，產物分析區)，蛋白質檢測區（蛋白質分離純化區，蛋白質檢測區）和其他區域[設置洗滌消毒室（洗滌、消毒、制備純水和/或雙蒸水、制冰等）、高速/超高速離心機室、低溫/超低溫冰箱室等]3個區。各區的工作服、實驗用具和實驗記錄本應區分標記，不能混用。4.3.5栽培場所和栽培基質栽培場所應符合NY/T5333-2006的要求。栽培基質應符合NY5099的要求。5菌種送樣與留樣菌種送樣時同一待檢菌種應不少于4支(瓶、袋)。檢驗機構應將樣品分為A、B兩份，每份2支(瓶、袋)以上，其中1份送檢，另1份留樣備查。留樣菌種應于4℃~6℃下貯存，貯存時間應符合GB19169、GB19170-2003、GB19171、GB19172、NY862的規定。DB42/T671-201036菌種質量要求6.1菌種種性質量要求6.1.1感官特性黑木耳菌種應符合GB19169規定的質量要求。香菇菌種應符合GB19170規定的質量要求。雙孢蘑菇菌種應符合GB19171規定的質量要求。平菇菌種應符合GB19172規定的質量要求。杏鮑菇和白靈菇菌種應符合NY862規定的質量要求。6.1.2生物學特性表1菌種生物學特性的質量要求質量要求母種菌絲生長速度黑木耳菌種、香菇菌種、雙孢蘑菇菌種、平菇菌種、杏鮑菇和白靈菇菌種應依次符合GB19169、GB19170、GB19171、GB19172、NY862的質量要求原種、栽培種菌絲生長速度黑木耳菌種、香菇菌種、雙孢蘑菇菌種、平菇菌種、杏鮑菇和白靈菇菌種應依次符合GB19169、GB19170、GB19171、GB19172、NY862的質量要求拮抗現象采用PDA瓊脂培養基，將待檢菌種與標準菌種進行對峙培養。待兩個菌落交接后，再繼續培養10d后觀察。如果交接處出現明顯的拮抗線、隔離帶或隆起成柵欄狀，即為拮抗反應，應判定待檢菌種與標準菌種屬于不同的菌株或品種；如果沒有表現出拮抗反應，則應結合其它方法進行判斷菌絲生長溫度范圍白靈菇(5~32)℃、杏鮑菇(5~33)℃的溫度范圍要求，待檢菌種與標準菌種相差不應超過2℃菌絲生長最適溫度應符合黑木耳(26±2)℃、平菇(25±2)℃、香菇(23±2)℃、雙孢蘑菇(24±1)℃、杏鮑菇和白靈菇(25±1)℃的溫度范圍要求，待檢菌種與標準菌種相差不應超過2℃菌絲生長最適pH值應符合香菇pH5.0-6.0、黑木耳pH5.0-6.5、平菇和白靈菇pH5.5-6.5、雙孢蘑菇pH6.5-7.0、杏鮑菇pH6.5-7.5的pH范圍要求，待檢菌種與標準菌種最適pH相差不應超過0.56.1.3雙孢蘑菇酯酶同工酶應符合GB19171的質量要求。6.1.4DNA指紋圖譜按照NY/T1730-2009、NY/T1743-2009規定的方法進行。統計待檢菌種與標準菌種的DNA條帶，計算相似系數。若相似系數低于80%，則判定兩者為不同菌株；若相似系數大于80%，則應結合其它方法進行判斷。6.1.5農藝性狀DB42/T671-20104表2菌種農藝性狀的質量要求質量要求菌種萌發定植能力母種、原種轉接及栽培種播種后應在24h之內萌發定植結菇轉潮能力（雙孢蘑菇）覆土后12d~16d開始出菇，18d~22d采收，每潮間生物學效率待檢菌種與標準菌種的差異值應不超過5%第1潮和第2潮菇的產量待檢菌種與標準菌種之間應不存在顯著性差異色澤待檢菌種與標準菌種應沒有明顯差異菇蓋直徑和厚度、菇柄長度和直徑；耳片大小和厚度待檢菌種與標準菌種之間應不存在顯著性差異6.2菌種純度質量要求黑木耳菌種應符合GB19169規定的質量要求。香菇菌種應符合GB19170規定的質量要求。雙孢蘑菇菌種應符合GB19171規定的質量要求。平菇菌種應符合GB19172規定的質量要求。杏鮑菇和白靈菇菌種應符合NY862規定的質量要求。凡是含有細菌、放線菌、霉菌、螨蟲、線蟲等生物及其代謝物的菌種應判定為不合格菌種。6.3菌種活力質量要求6.3.1菌絲萌發、定植能力菌絲應在24h以內萌發、定植。6.3.2菌絲生長速度黑木耳菌種應符合GB19169規定的質量要求。香菇菌種應符合GB19170規定的質量要求。雙孢蘑菇菌種應符合GB19171規定的質量要求。平菇菌種應符合GB19172規定的質量要求。杏鮑菇和白靈菇菌種應符合NY862規定的質量要求。7菌種質量鑒定方法7.1菌種種性鑒定方法7.1.1感官鑒定黑木耳菌種應按照GB19169規定的感官鑒定方法進行鑒定。香菇菌種應符合GB19170規定的感官鑒定方法進行鑒定。雙孢蘑菇菌種應符合GB19171規定的感官鑒定方法進行鑒定。平菇菌種應符合GB19172規定的感官鑒定方法進行鑒定。DB42/T671-20105杏鮑菇和白靈菇菌種應符合NY862規定的感官鑒定方法進行鑒定。7.1.2菌絲顯微觀察在載玻片上滴一滴無菌水，用解剖針挑取待檢菌株活化的菌絲少許于水滴上，蓋上蓋玻片。先用10倍物鏡觀察，再轉到40倍物鏡下觀察菌絲的形態結構，測量菌絲細胞的寬度，同時與標準菌種比較，觀察兩者在菌絲直徑、分枝密度、分枝特征、鎖狀聯合等方面有無明顯差異。至少觀察待檢菌株的50個不同視野。7.1.3生物學特性鑒定7.1.3.1菌絲生長速度黑木耳菌種應按照GB19169規定的方法進行鑒定。香菇菌種應符合GB19170規定的方法進行鑒定。雙孢蘑菇菌種應符合GB19171規定的方法進行鑒定。平菇菌種應符合GB19172規定的方法進行鑒定。杏鮑菇和白靈菇菌種應符合NY862規定的方法進行鑒定。7.1.3.2拮抗試驗取待檢菌種和標準菌種分別進行轉管活化后，在同一個平板培養基上相距3cm左右進行接種，適溫下培養，待兩個菌落交接時進行觀察。7.1.3.3溫度試驗將待檢菌種與標準菌種進行活化，將直徑約5mm的接種塊接種在PDA平皿中（直徑90mm分別在3℃、5℃、8℃、10℃、15℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃下培養，觀察待檢菌種與標準菌種在相同溫度下的生長速度。7.1.3.4pH值測定取待檢菌種活化的菌絲塊接入于不同酸堿度(pH4~11)的平板培養基上，置于適宜的溫度下培養。當菌落直徑達1cm~2cm時，在菌落邊緣畫線作為生長起始線，繼續培養。當菌絲快長滿平皿時，再畫一條終止線。測量起始線與終止線之間的距離．計算菌絲生長速度，獲得菌絲生長適宜的pH范圍和最適pH值。7.1.3酯酶同工酶鑒定雙孢蘑菇酯酶同工酶測定按照NY/T1097-2006、GB19171規定的方法進行。7.1.4DNA指紋鑒定按照NY/T1730-2009、NY/T1743-2009規定的方法進行。7.1.5農藝性狀鑒定7.1.5.1菌種萌發定植能力將待檢菌種轉接到母種PDA培養基(詳見附錄A.1)和相應的原種、栽培種培養基中(詳見附錄A.2、附錄A.3、附錄A.4、附錄A.5)，置于(24±1)℃培養，肉眼觀察菌絲的萌發定植情況。7.1.5.2子實體形態將待檢菌種與標準菌種轉接到附錄B中相應的培養料或段木中進行出菇試驗。雙孢蘑菇、香菇、黑木耳、平菇、杏鮑菇和白靈菇均按常規方法栽培后進行子實體形態觀察。7.1.5.3產量性狀制作待檢菌種和標準菌種的三級菌種，按照附錄B中的培養料配方制作栽培袋（栽培料）或準備段木進行栽培試驗，試驗采用隨機區組排列，不少于3次重復，袋栽種類每小區不少于30袋，床栽種類每小區不少于3平方米，段木種類每小區不少于30根，設保護區和保護行。統計待檢菌種與標準菌種的單位面積產量或單袋（根）產量，進行差異顯著性檢驗。7.1.5.4生物學效率統計第一潮菇（耳）至該品種的正常栽培季節結束，分別計算待檢菌種和標準菌種的生物學效率，DB42/T671-20106再比較兩者生物學效率的差異。7.2菌種純度鑒定方法7.2.1肉眼觀察在光線適宜的條件下，肉眼觀察裝有菌種的容器中是否混有細菌、霉菌、螨蟲、線蟲等其它生物及其代謝物。7.2.2細菌檢測黑木耳菌種應按照GB19169規定的細菌檢驗方法進行鑒定。香菇菌種應符合GB19170規定的細菌檢驗方法進行鑒定。雙孢蘑菇菌種應符合GB19171規定的細菌檢驗方法進行鑒定。平菇菌種應符合GB19172規定的細菌檢驗方法進行鑒定。杏鮑菇和白靈菇菌種應符合NY862規定的細菌檢驗方法進行鑒定。7.2.3霉菌檢測黑木耳菌種應按照GB19169規定的霉菌檢驗方法進行鑒定。香菇菌種應按照GB19170規定的霉菌檢驗方法進行鑒定。雙孢蘑菇菌種應按照GB19171規定的霉菌檢驗方法進行鑒定。平菇菌種應按照GB19172規定的霉菌檢驗方法進行鑒定。杏鮑菇和白靈菇菌種應按照NY862規定的霉菌檢驗方法進行鑒定。7.2.4螨蟲和線蟲檢測用接種針挑取少許待檢菌種的菌絲于載玻片上水滴中，蓋上蓋玻片，用10倍或40倍物鏡觀察，檢查是否有螨蟲或線蟲存在。至少觀察50個不同的視野。7.3菌種活力鑒定方法7.3.1菌絲萌發、定植能力按無菌操作要求，挑取小塊待檢菌種的菌絲塊，轉接到PDA平板(或斜面)培養基上，置于24℃±2℃的溫度下培養，觀察其萌發出新菌絲的能力。7.3.2菌絲生長速度黑木耳菌種應按照GB19169規定的菌絲生長速度檢驗方法進行鑒定。香菇菌種應按照GB19170規定的菌絲生長速度檢驗方法進行鑒定。雙孢蘑菇菌種應按照GB19171規定的菌絲生長速度檢驗方法進行鑒定。平菇菌種應按照GB19172規定的菌絲生長速度檢驗方法進行鑒定。杏鮑菇和白靈菇菌種應按照NY862規定的菌絲生長速度檢驗方法進行鑒定。8菌種質量的判定菌種質量的判定按菌種種性、菌種純度和菌種活力的質量要求進行。檢驗項目全部符合質量要求時，為合格菌種；其中任何一項不符合質量要求時，均為不合格菌種。9菌種標簽、包裝、保藏、運輸黑木耳菌種應符合GB19169規定的要求。香菇菌種應符合GB19170規定的要求。雙孢蘑菇菌種應符合GB19171規定的要求。DB42/T671-2010平菇菌種應符合GB19172規定的要求。杏鮑菇和白靈菇菌種應符合NY862規定的要求。10檢驗報告檢驗報告內容包括樣品菌種的種類、品種名稱、菌種分級、受檢單位(生產單位)、檢驗類別、檢驗依據、樣品數量、檢測項目、檢驗結論，并附有檢測結果報告書。結果報告書包括樣品編號、樣品菌種的種類、品種名稱、菌種分級、檢測項目、檢測指標、實測數據、單項結論、檢測依據等。檢驗報告一式兩份，分正本和副本，正本