第3章基因工程、第4章生物技術的安全性與倫理問題第1節重組DNA技術的基本工具[必備知識]1．基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。(P67)2．1944年，艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了遺傳物質是DNA，還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉移。(P68“科技探索之路”)3．切割DNA分子的工具是限制性內切核酸酶，簡稱限制酶，這類酶主要是從原核生物中分離純化出來的。它們能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，產生黏性末端或平末端兩種形式的末端。(P71)4．DNA連接酶主要有兩類，一類是E.coliDNA連接酶，另一類是T4DNA連接酶。后者既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端的效率相對較低。(P72)5．質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。(P72)6．載體必須具備的條件：(1)能在受體細胞中保存下來并能自我復制；(2)具有一個或多個限制酶切割位點，以便與外源基因連接；(3)具有標記基因。(P72)7．在基因工程中使用的載體除質粒外，還有噬菌體、動植物病毒等。它們的來源不同，在大小、結構、復制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差別。(P73)8．DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。(P74“探究·實踐”)[重要圖解]1．限制酶切割DNA分子產生兩種不同末端的示意圖(箭頭表示酶的切割位置)(P71)下圖中的圖1和圖2分別表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意圖，從圖示可以看出，EcoRⅠ限制酶識別的堿基序列是GAATTC，切割位點在G和A之間；SmaⅠ限制酶識別的堿基序列是CCCGGG，切割位點在G和C之間。圖1說明，EcoRⅠ發揮作用是在它識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開，所以產生的是黏性末端，圖2說明SmaⅠ發揮作用是在它識別序列的中心軸線處將DNA的兩條鏈分別切開，所以產生的是平末端。（P71“圖3-3”改編）2．大腸桿菌及質粒結構模式圖(P72)[易錯提醒]錯點1：誤認為目的基因的插入位點是“隨機”的精析：目的基因的插入位點不是隨機的，基因表達需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入啟動子與終止子之間的部位，若目的基因插入啟動子內部，啟動子將失去原功能。錯點2：誤認為切取目的基因與切取載體時“只能”使用“同一種酶”精析：(1)在獲取目的基因和切割載體時通常用同種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同時，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。(2)為了防止載體或目的基因的黏性末端自己連接即所謂“環化”，可用不同的限制酶分別處理目的基因和載體，使目的基因兩側及載體上具有兩個不同的黏性末端。第2節基因工程的基本操作程序[必備知識]1．培育轉基因抗蟲棉主要需要四個步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。(P76)2．PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。(P77)3．PCR反應過程可以分為變性、復性和延伸三步。(P78)4．PCR反應過程可以在PCR擴增儀(PCR儀)中自動完成，完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物。(P79)5．構建基因表達載體的目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。(P80)6．基因表達載體要包括以下四個基本的結構：目的基因、啟動子、終止子、標記基因。(P80)7．啟動子位于基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結合的部位。(P80)8．標記基因的作用：鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來(或供重組DNA的鑒定和選擇)。9．花粉管通道法有多種操作方式。例如，可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。除此之外，將目的基因導入植物細胞常用的方法還有農桿菌轉化法。(P80～81)10.轉化是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。(P81“資料卡”)11．農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA(可轉移的DNA)轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。根據農桿菌的這種特點，如果將目的基因插入Ti質粒的T-DNA中，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞。(P81“資料卡”)12．檢查轉基因抗蟲棉是否培育成功，首先是分子水平的檢測，包括通過PCR等技術檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因是否轉錄出了mRNA；從轉基因棉花中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交，檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白等。其次，還需要進行個體生物學水平的鑒定。例如，通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。(P82)13．在獲得轉基因產品的過程中，還可以通過構建基因文庫來獲取目的基因。(P82)14．將目的基因導入動物受精卵最常用的一種方法是利用顯微注射將目的基因注入動物的受精卵中，這個受精卵將發育成為具有新性狀的動物。在基因工程操作中，常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌應用最為廣泛。研究人員一般先用Ca2＋處理大腸桿菌細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，然后再將重組的基因表達載體導入其中。(P82)[重要圖解]1．PCR反應過程示意圖(P78～79)下圖為PCR反應原理示意圖，圖中①表示引物，該物質是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸；②表示熱穩定性聚合酶（Taq酶）；dCTP、dATP、dGTP、dTTP的中文名稱依次是：三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸；③表示變性（雙鏈DNA解聚為單鏈），發生該過程的條件是溫度上升到90℃；④表示復性（兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合，發生該過程的條件是溫度下降到50℃左右；⑤表示延伸（4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈），發生該過程的條件是溫度上升到72℃左右。2．基因表達載體構建模式圖(P80)(1)構建基因表達載體的過程，甲、乙、丙表示相關酶，甲、乙應是同一種限制酶或能產生相同末端的限制酶，甲酶作用形成了一個切口，兩個黏性末端，乙酶作用形成了兩個切口，四個黏性末端；丙酶是DNA連接酶，丙酶作用后若考慮DNA片段的兩兩相連情況，則會出現目的基因與目的基因連接、目的基因與質粒連接、質粒與質粒連接三種情況，因此，需通過篩選才可獲得目的基因與質粒連接的重組質粒。(2)上圖為基因表達載體模式圖，圖中①表示啟動子，它是一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉錄的起始位點，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，其作用是驅動基因轉錄出mRNA，最終表達出人類所需要的蛋白質。有時為了滿足應用需要，會在載體中人工構建誘導型啟動子，當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達。②表示終止子，位于基因的下游，是一段有特殊序列結構的DNA短片段，其作用是能夠使轉錄在所需要的地方停止下來。③表示標記基因，其作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，如抗生素抗性基因就可以作為這種基因。3．農桿菌轉化法示意圖(P81)[易錯提醒]錯點1:混淆啟動子與起始密碼子，終止子與終止密碼子，不明確標記基因的作用精析：啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子。(1)啟動子：一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶識別、結合的部位。(2)終止子：一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的尾端。作用是使轉錄過程停止。(3)起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。(4)標記基因：一般為抗生素抗性基因或熒光基因等，其作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因(目的基因是否導入成功)，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。第3節基因工程的應用第4節蛋白質工程的原理和應用[必備知識]1．科學家將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達的基因的啟動子等調控元件重組在一起，通過顯微注射的方法導入哺乳動物的受精卵中，由這個受精卵發育成的轉基因動物在進入泌乳期后，可以通過分泌乳汁來生產所需要的藥物，這稱為乳腺生物反應器或乳房生物反應器。(P90)2．目前，科學家正嘗試利用基因工程技術對豬的器官進行改造，采用的方法是在器官供體的基因組中導入某種調節因子，以抑制抗原決定基因的表達，或設法除去抗原決定基因，然后再結合克隆技術，培育出不會引起免疫排斥反應的轉基因克隆豬器官。(P91)3．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類一般稱為基因工程菌。(P91“相關信息”)4．蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類生產和生活的需求。(P93)5.基因工程原則上只能生產自然界中已存在的蛋白質，這些天然蛋白質是生物在長期進化過程中形成的，它們的結構和功能符合特定物種生存的需要，卻不一定完全符合人類生產和生活的需要。(P93)[重要圖解]蛋白質工程的基本思路蛋白質工程的基本思路是從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質。(P94)[易錯提醒]錯點1：誤認為基因工程可導致受體細胞或生物產生“新基因”或“新蛋白質”精析：基因工程的實質是“基因重組”，它是將外源基因導入受體細胞，使該基因在受體細胞中表達——由于“外源基因”是自然界已存在的“現成”基因，故基因工程并未產生新基因，因此目的基因表達時也未產生新蛋白質，基因工程只不過是讓受體細胞(或生物)實現了“外源基因的表達”。第4章生物技術的安全性與倫理問題[必備知識]1．對微生物的基因改造是基因工程中研究最早、最廣泛和取得實際應用成果最多的領域，這是因為微生物具有生理結構和遺傳物質簡單、生長繁殖快、對環境因素敏感和容易進行遺傳物質操作等優點。(P101)2．在轉基因研究工作中，科學家會采取很多方法防止基因污染。例如，我國科學家將來自玉米的α-淀粉酶基因與目的基因一起轉入植物中，由于α-淀粉酶基因可以阻斷淀粉儲藏使花粉失去活性，因而可以防止轉基因花粉的傳播。(P102“相關信息”)3．生殖性克隆是指通過克隆技術產生獨立生存的新個體。治療性克隆是指利用克隆技術產生特定的細胞、組織和器官，用它們來修復或替代受損的細胞、組織和器官，從而達到治療疾病的目的。兩者有著本質的區別。(P106)4．有的倫理學家認為，生殖性克隆人是在人為地制造在心理上和社會地位上都不健全的人，嚴重地違反了人類倫理道德，是克隆技術的濫用。(P107)5．我國政府一再重申四不原則：不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人實驗。(P108)6．生物武器包括致病菌類、病毒類和生化毒劑類等，例如，天花病毒、波特淋菌、霍亂弧菌和炭疽桿菌都可以用來制造生物武器。生物武器的致病能力強、攻擊范圍廣。它可以直接或者通過食物、生活必需品和帶菌昆蟲等散布，經由呼吸道、消化道和皮膚等侵入人、畜體內，造成大規模傷亡，也能大量損害植物。(P111)[重要圖解]試管嬰兒與“設計試管嬰兒”試管嬰兒與“設計試管嬰兒”都是有性生殖，都要通過①體外受精，并進行②體外早期胚胎培養和胚胎移植，不同的是“設計試管嬰兒”胚胎移植前需進行遺傳學診斷。(P109“思考·討論”)[易錯提醒]易錯點1：三個不同層次的克隆精析：(1)分子水平：一般指DNA克隆，即DNA復制，如PCR技術。(2)細胞水平：是指由一個單一的共同祖先細胞分裂形成一個細胞群體的過程，如動物細胞培養。(3)個體水平：是指形成基因型完全相同的兩個或更多的個體的過程，如扦插、嫁接等。易錯點2：混淆“生殖性克隆與治療性克隆”、“試管嬰兒技術與設計試管嬰兒”等概念而出錯（1）