SIRT2基因沉默對急性髓系白血病耐藥細胞增殖的影響及機制探究一、引言1.1研究背景急性髓系白血病（AcuteMyeloidLeukemia，AML）是一種常見且嚴重的血液系統惡性腫瘤，其發病機制源于造血前體細胞的異常增殖、凋亡受阻以及分化障礙。在全球范圍內，AML的發病率呈現出一定的增長趨勢，嚴重威脅著人類的生命健康。據相關統計數據顯示，我國白血病的發病率逐年上升，其中AML占比高達70%。在AML患者中，發病年齡存在較大差異，中位發病年齡為67歲，65歲以上的老年人超過半數，75歲以上老年患者占到了1/3。對于年輕的AML患者，80%以上可以獲得完全緩解，5年生存率約為40%；然而，老年白血病患者的療效卻有待進一步提高，盡管AML治愈率在不同年齡段均有改善，但隨著年齡的上升，改善幅度逐漸下降，65歲以上老年人的5年生存率僅有輕度改善，而75歲以上患者的5年生存率幾乎沒有明顯變化。目前，臨床上針對AML的治療主要采用化療和造血干細胞移植等方法。化療在一定程度上能夠使部分初治患者的病情得到暫時緩解，但對于復發病人而言，傳統化療方法往往難以取得顯著療效。其中，藥物耐藥問題是導致AML治療失敗和復發的主要原因之一，極大地加重了治療難度，嚴重影響了患者的臨床治療效果和生存質量。據研究表明，許多AML患者在治療過程中會出現多藥耐藥現象，使得化療藥物無法有效地殺死白血病細胞，從而導致病情進展和惡化。因此，尋找一種針對AML治療耐藥的新策略，已成為當前白血病研究領域的迫切需求。SIRT2作為Sirtuins家族中的一員，屬于第三類去乙酰化酶家族成員，在細胞內發揮著多種重要的生物學功能。近年來，越來越多的研究發現SIRT2在腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等方面扮演著關鍵角色。在AML的研究中，有報道指出SIRT2在AML病人中的表達與正常人相比顯著升高，而且在復發病人中的表達水平更高，這提示SIRT2可能會促進AML的病情發展，并誘導其對藥物治療產生耐受性。然而，目前關于SIRT2在AML中的具體作用機制研究甚少，其在AML耐藥過程中的作用及相關分子機制仍有待進一步深入探究。綜上所述，深入研究沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞增殖的影響，不僅有助于揭示AML耐藥的潛在分子機制，為尋找AML新的治療靶點和策略提供理論依據，還可能為改善AML患者的治療效果和預后帶來新的希望，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞增殖的影響，并初步闡釋其潛在的分子機制。具體而言，通過實驗手段沉默SIRT2基因的表達，觀察急性髓系白血病耐藥細胞在增殖能力、細胞周期分布、凋亡情況等方面的變化。同時，運用分子生物學技術，檢測相關信號通路中關鍵蛋白的表達和活性變化，從而揭示SIRT2影響白血病耐藥細胞增殖的內在分子機制。急性髓系白血病作為一種嚴重威脅人類生命健康的血液系統惡性腫瘤，其治療面臨著諸多挑戰，其中藥物耐藥問題尤為突出。多藥耐藥現象使得化療藥物難以有效發揮作用，導致患者病情復發和治療失敗，極大地降低了患者的生存率和生存質量。目前，臨床上對于AML耐藥的治療手段有限，且療效不盡人意。因此，尋找新的治療靶點和策略成為AML研究領域的當務之急。SIRT2作為一種在腫瘤細胞中發揮重要作用的蛋白，其在AML耐藥中的潛在作用逐漸受到關注。研究表明，SIRT2的高表達與AML的病情發展和藥物耐受性密切相關。然而，目前關于SIRT2在AML耐藥中的具體作用機制尚未完全明確。深入研究沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞增殖的影響，對于揭示AML耐藥的分子機制具有重要的理論意義。通過明確SIRT2在AML耐藥中的作用及相關分子通路，能夠為進一步理解AML的發病機制提供新的視角，豐富對腫瘤耐藥機制的認識。從臨床應用角度來看，本研究的成果具有潛在的轉化價值。若能夠證實沉默SIRT2可以有效抑制急性髓系白血病耐藥細胞的增殖，那么SIRT2有望成為AML治療的新靶點。基于此，可以開發針對SIRT2的靶向治療藥物或策略，為AML患者提供更加精準、有效的治療手段，改善患者的治療效果和預后，提高患者的生存率和生存質量。此外，本研究的發現還可能為其他惡性腫瘤的耐藥治療提供借鑒和參考，推動腫瘤治療領域的發展。二、急性髓系白血病與SIRT2概述2.1急性髓系白血病（AML）2.1.1AML的定義與分類急性髓系白血病（AML）是一種源于骨髓中髓系造血干細胞的惡性克隆性疾病。其發病機制主要是由于髓系干細胞發生異常突變，導致白血病細胞在骨髓內大量增殖，并抑制正常造血功能。這些白血病細胞具有異常的增殖能力、分化阻滯以及凋亡抵抗等特征，它們會逐漸取代正常的造血細胞，進而引發貧血、出血、感染等一系列臨床癥狀。在形態學上，AML的白血病細胞通常表現為大小不一、形態不規則，細胞核較大且染色質粗糙，細胞質中可能含有嗜天青顆粒或Auer小體等特殊結構。根據法英美（FAB）分型標準，AML可分為M0-M7共8種類型。M0為急性髓細胞白血病微分化型，骨髓原始細胞大于30%，細胞無嗜天青顆粒及Auer小體，髓過氧化酶（MPO）陽性，CD33、CD13等髓系抗原陽性，淋系抗原、血小板抗原陰性。M1是急性粒細胞白血病未分化型，原粒細胞占骨髓非紅系有核細胞（NEC）的90%以上，且大于3%的細胞MPO陽性。M2屬于急性粒細胞白血病部分分化型，原粒細胞占骨髓NEC的30%-89%。M3為急性早幼粒細胞白血病，早幼粒細胞占骨髓NEC的≥30%，其特點是骨髓中充滿大量早幼粒細胞，這些細胞胞漿內含有豐富的粗大顆粒，容易發生出血傾向，是AML中較為特殊的一個亞型，對維甲酸和三氧化二砷等靶向藥物治療較為敏感。M4是急性粒-單核細胞白血病，原始細胞占骨髓NEC的≥30%，各階段單核細胞≥20%，同時具有粒系和單核系細胞的特征。M5為急性單核細胞白血病，骨髓NEC中原單核、幼單核≥30%，且原單核、幼單核及單核細胞≥80%，以單核細胞系列增生為主。M6是紅白血病，骨髓中幼紅細胞≥50%，同時伴有髓系原始細胞增多。M7為急性巨核細胞白血病，骨髓中原始巨核細胞≥30%，血小板抗原陽性。不同亞型的AML在細胞形態、免疫表型、細胞遺傳學及分子生物學特征等方面存在差異，這些差異不僅有助于疾病的診斷和分型，還對治療方案的選擇和預后評估具有重要指導意義。例如，M3型AML通過維甲酸和三氧化二砷誘導分化治療，可獲得較高的緩解率和生存率；而其他亞型可能需要采用不同的化療方案或聯合造血干細胞移植等治療方法。除了FAB分型，目前臨床上還常用世界衛生組織（WHO）分型來對AML進行分類。WHO分型綜合考慮了細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學等多方面的特征，能夠更準確地反映AML的生物學本質和預后情況。在WHO分型中，AML不僅根據細胞類型和分化程度進行分類，還將一些具有特定遺傳學異常的AML單獨列為一類，如伴有t（8；21）（q22；q22）、inv（16）（p13.1q22）或t（16；16）（p13.1；q22）等染色體異常的AML，這些遺傳學異常與AML的發病機制、治療反應和預后密切相關。此外，WHO分型還強調了基因突變在AML分類中的重要性，如FLT3、NPM1、CEBPA等基因突變的檢測，對于AML的診斷、危險度分層和治療決策具有重要價值。與FAB分型相比，WHO分型更加全面和細致，能夠為臨床醫生提供更多關于AML患者病情的信息，從而制定更個性化的治療方案。例如，對于伴有FLT3-ITD基因突變的AML患者，其預后相對較差，可能需要在化療的基礎上聯合使用FLT3抑制劑進行靶向治療。2.1.2AML的治療現狀與耐藥問題目前，AML的治療主要包括化療、造血干細胞移植以及近年來逐漸發展的靶向治療和免疫治療等。化療是AML治療的基礎，常用的化療方案為“7+3”方案，即連續7天使用阿糖胞苷，同時在第1-3天聯合使用蒽環類藥物（如柔紅霉素）。對于初治的AML患者，“7+3”方案能夠使約60%-70%的患者獲得完全緩解。然而，化療過程中會對正常細胞產生較大的毒副作用，導致患者出現骨髓抑制、感染、出血、胃腸道反應等不良反應，嚴重影響患者的生活質量和治療耐受性。此外，化療藥物的長期使用還可能導致白血病細胞產生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，病情復發。造血干細胞移植是AML根治的重要方法之一，尤其是對于高危和復發難治性AML患者。造血干細胞移植可以分為自體造血干細胞移植和異基因造血干細胞移植。自體造血干細胞移植是采集患者自身的造血干細胞，在預處理后回輸到患者體內，以重建造血和免疫功能。而異基因造血干細胞移植則是使用供者的造血干細胞進行移植，通過移植物抗白血病效應來清除白血病細胞。雖然造血干細胞移植能夠顯著提高AML患者的生存率，但也面臨著諸多挑戰，如供者來源有限、移植相關并發癥（如移植物抗宿主病、感染等）、移植后復發等。移植物抗宿主病是異基因造血干細胞移植后最常見且嚴重的并發癥之一，其發生率較高，嚴重影響患者的生存質量和預后。此外，移植后復發也是導致造血干細胞移植失敗的主要原因之一，復發后的治療難度較大，患者的生存率較低。靶向治療和免疫治療是近年來AML治療領域的研究熱點和重要進展。靶向治療藥物能夠特異性地作用于白血病細胞表面的分子靶點或細胞內的信號通路，從而抑制白血病細胞的增殖和存活。例如，針對FLT3基因突變的FLT3抑制劑（如米哚妥林、吉瑞替尼等），可以選擇性地抑制FLT3激酶活性，對伴有FLT3基因突變的AML患者具有較好的治療效果。免疫治療則是通過激活患者自身的免疫系統來識別和殺傷白血病細胞，包括免疫檢查點抑制劑、嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）治療等。免疫檢查點抑制劑（如帕博利珠單抗等）可以阻斷免疫檢查點蛋白（如PD-1、PD-L1等）的作用，解除腫瘤細胞對免疫系統的抑制，從而增強機體對白血病細胞的免疫攻擊。CAR-T治療是將患者的T細胞進行基因改造，使其表達能夠特異性識別白血病細胞表面抗原的嵌合抗原受體，然后將改造后的T細胞回輸到患者體內，以實現對白血病細胞的精準殺傷。雖然靶向治療和免疫治療在AML的治療中取得了一定的療效，但仍存在一些問題，如靶向藥物的耐藥性、免疫治療的不良反應（如細胞因子釋放綜合征、神經毒性等）以及治療費用高昂等，限制了其廣泛應用。藥物耐藥是AML治療失敗和復發的主要原因之一，嚴重影響患者的治療效果和生存質量。白血病細胞耐藥可分為原發耐藥和繼發耐藥。原發耐藥是指白血病細胞在化療前就對化療藥物具有天然的耐藥性，這種耐藥性可能與白血病細胞的生物學特性、基因表達譜以及藥物轉運蛋白的異常表達等因素有關。例如，白血病細胞表面的多藥耐藥蛋白（P-glycoprotein，P-gp）等藥物轉運蛋白的高表達，可以將化療藥物泵出細胞外，從而降低細胞內藥物濃度，導致白血病細胞對化療藥物產生耐藥。繼發耐藥則是在化療過程中，由于白血病細胞受到化療藥物的選擇壓力，逐漸發生基因突變或基因表達改變，從而獲得耐藥性。例如，化療藥物可能誘導白血病細胞發生信號通路的異常激活，導致細胞對化療藥物的敏感性降低。AML的耐藥機制十分復雜，涉及多個方面。除了上述藥物轉運蛋白的作用外，還包括細胞凋亡通路的異常、DNA損傷修復機制的增強、腫瘤干細胞的存在以及腫瘤微環境的影響等。在細胞凋亡通路方面，白血病細胞可能通過上調抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Mcl-1等）的表達或下調促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）的表達，來抑制細胞凋亡，從而逃避化療藥物的殺傷作用。DNA損傷修復機制的增強也是AML耐藥的重要原因之一，白血病細胞可以通過激活DNA損傷修復相關的蛋白和信號通路，如ATM、ATR、DNA-PK等，來修復化療藥物導致的DNA損傷，使細胞得以存活。腫瘤干細胞是一群具有自我更新和分化能力的白血病細胞亞群，它們對化療藥物具有較強的耐受性，能夠在化療后存活下來并重新增殖，導致疾病復發。此外，腫瘤微環境中的細胞因子、基質細胞以及免疫細胞等也可以通過多種途徑影響白血病細胞的耐藥性，如腫瘤微環境中的細胞因子可以激活白血病細胞的耐藥相關信號通路，基質細胞可以為白血病細胞提供保護和支持，免疫細胞的功能異常則可能導致機體對白血病細胞的免疫監視和殺傷作用減弱。2.2SIRT2蛋白的結構與功能2.2.1SIRT2的分子結構特征SIRT2作為Sirtuins家族中的一員，其分子結構具有獨特的特征。SIRT2基因定位于人染色體19p13.3，其編碼的蛋白質由354個氨基酸組成，相對分子質量約為39kDa。SIRT2的晶體結構顯示，它具有一個高度保守的催化核心區域，該區域由大約275個氨基酸殘基構成，主要包含兩個部分：大結構域和小結構域。大結構域呈現出一個典型的NAD+結合位點，NAD+作為催化過程中不可或缺的輔助因子，在SIRT2的去乙酰化反應中發揮著關鍵作用。當SIRT2與底物結合時，NAD+參與到催化反應中，通過一系列的化學反應，實現對底物的去乙酰化修飾。小結構域中則含有一個Zn2+，雖然鋅離子并不直接參與催化活性，但它對于維持SIRT2的正常活性至關重要。Zn2+能夠穩定SIRT2的蛋白結構，確保其在細胞內的正確折疊和構象穩定，從而保證SIRT2能夠有效地與底物結合并發揮去乙酰化酶的功能。與其他去乙酰化酶相比，SIRT2的結構存在一些顯著的差異。在Sirtuins家族中，不同成員的結構具有一定的相似性，但也存在各自的特點。例如，SIRT1雖然與SIRT2同屬Sirtuins家族，且都具有去乙酰化酶活性，但它們在結構和功能上存在一些差異。SIRT1的催化核心區域與SIRT2有一定的同源性，但SIRT1的N端和C端結構域與SIRT2有所不同，這些結構上的差異導致它們在底物特異性和細胞內定位等方面存在差異。SIRT1主要定位于細胞核內，而SIRT2在細胞漿和細胞核中均有分布。在其他去乙酰化酶家族中，如I類去乙酰化酶（HDAC1-3、HDAC8）和II類去乙酰化酶（HDAC4-7、HDAC9-10），它們的結構與SIRT2存在更大的差異。這些去乙酰化酶通常不依賴NAD+作為輔助因子，其催化機制與SIRT2也有所不同。I類和II類去乙酰化酶通過水解作用去除底物上的乙酰基，而SIRT2則是依賴NAD+進行去乙酰化反應。此外，它們的蛋白結構組成和空間構象也與SIRT2有明顯區別，這些結構差異決定了它們在細胞內具有不同的生物學功能和底物特異性。2.2.2SIRT2在細胞生理過程中的作用SIRT2在細胞生理過程中發揮著多方面的重要調控作用，對細胞的正常生長、發育和功能維持具有關鍵意義。在細胞周期調控方面，SIRT2起著重要的調節作用。細胞周期是細胞生長、分裂和增殖的有序過程，包括G1期、S期、G2期和M期。研究表明，SIRT2可以通過對多種細胞周期相關蛋白的去乙酰化修飾，來調控細胞周期的進程。在細胞周期的G1期向S期轉換過程中，SIRT2能夠去乙酰化修飾一些轉錄因子和細胞周期蛋白，如E2F1、p53等，從而影響它們的活性和功能。E2F1是一種重要的轉錄因子，在細胞周期調控中起著關鍵作用。SIRT2對E2F1的去乙酰化修飾可以增強E2F1與DNA的結合能力，促進與DNA復制和細胞周期進展相關基因的轉錄，從而推動細胞從G1期進入S期。而對于p53蛋白，SIRT2的去乙酰化修飾則可以抑制p53的活性。p53是一種重要的腫瘤抑制因子，在細胞受到DNA損傷等應激情況下，p53會被激活，通過誘導細胞周期阻滯、凋亡等機制來維持基因組的穩定性。SIRT2對p53的去乙酰化修飾可以降低p53的穩定性和轉錄活性，減少p53對細胞周期的抑制作用，使細胞能夠繼續進行增殖。然而，當細胞DNA損傷嚴重時，SIRT2對p53的調控作用可能會發生改變，以確保細胞能夠及時啟動凋亡程序，避免受損細胞的異常增殖。SIRT2在細胞凋亡過程中也扮演著重要角色。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，對于維持細胞內環境穩定和組織器官的正常發育具有重要意義。在細胞凋亡的調控中，SIRT2可以通過調節凋亡相關蛋白的活性來影響細胞凋亡的發生。一方面，SIRT2可以去乙酰化修飾一些抗凋亡蛋白，如Bcl-2家族成員。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，它能夠抑制細胞色素c從線粒體釋放到細胞質中，從而阻止凋亡小體的形成和caspase級聯反應的激活，抑制細胞凋亡。SIRT2對Bcl-2的去乙酰化修飾可以增強Bcl-2的抗凋亡活性，使細胞更傾向于存活。另一方面，SIRT2也可以對促凋亡蛋白進行調控。例如，SIRT2可以去乙酰化修飾p53，如前文所述，去乙酰化后的p53活性受到抑制，從而減少了p53誘導的細胞凋亡。此外，SIRT2還可以通過調節線粒體的功能來影響細胞凋亡。線粒體是細胞凋亡信號傳導的關鍵細胞器，SIRT2可以通過去乙酰化修飾線粒體相關蛋白，影響線粒體的膜電位、通透性轉換孔的開放等，進而調節細胞色素c的釋放和凋亡相關信號通路的激活。當細胞受到凋亡刺激時，SIRT2的表達和活性變化會影響細胞凋亡的進程。如果SIRT2表達上調或活性增強，可能會抑制細胞凋亡，使細胞對凋亡刺激產生抵抗；反之，如果SIRT2表達下調或活性受到抑制，則可能會促進細胞凋亡。在細胞代謝方面，SIRT2參與了多種代謝途徑的調節。在能量代謝過程中，SIRT2對脂肪酸代謝和葡萄糖代謝具有重要的調控作用。在脂肪酸代謝中，SIRT2可以通過去乙酰化修飾脂肪酸代謝相關的酶和轉錄因子，影響脂肪酸的合成、氧化和轉運。例如，SIRT2可以去乙酰化修飾脂肪酸合成酶（FASN），抑制其活性，從而減少脂肪酸的合成。同時，SIRT2還可以調節過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等轉錄因子的活性，影響脂肪酸氧化相關基因的表達，促進脂肪酸的氧化分解，為細胞提供能量。在葡萄糖代謝方面，SIRT2可以調節胰島素信號通路和糖酵解途徑。胰島素信號通路對于維持血糖平衡至關重要，SIRT2可以去乙酰化修飾胰島素受體底物（IRS）等蛋白，增強胰島素信號的傳導，促進細胞對葡萄糖的攝取和利用。此外，SIRT2還可以通過調節糖酵解途徑中的關鍵酶，如己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）等，影響糖酵解的速率，從而調節細胞內的葡萄糖代謝。除了能量代謝，SIRT2還參與了氨基酸代謝和核苷酸代謝等過程。在氨基酸代謝中，SIRT2可以調節氨基酸轉運體和氨基酸代謝相關酶的活性，影響氨基酸的攝取和代謝。在核苷酸代謝中，SIRT2可以通過調節核苷酸合成和降解相關的酶，維持細胞內核苷酸的平衡。總之，SIRT2在細胞代謝中發揮著廣泛而重要的調節作用，通過對多種代謝途徑的調控，維持細胞的能量平衡和物質代謝穩態。2.3SIRT2與腫瘤的關系研究進展2.3.1SIRT2在多種腫瘤中的表達異常大量研究表明，SIRT2在多種腫瘤中的表達呈現出異常狀態，且這種異常表達與腫瘤的發生發展密切相關。在乳腺癌中，研究發現SIRT2的表達水平明顯高于正常乳腺組織。通過對乳腺癌細胞系和臨床樣本的檢測分析，發現SIRT2的高表達與乳腺癌的惡性程度、轉移潛能以及患者的不良預后密切相關。進一步的研究表明，SIRT2的高表達可能通過調節細胞周期相關蛋白和凋亡相關蛋白的活性，促進乳腺癌細胞的增殖和存活，抑制細胞凋亡。在黑色素瘤中，SIRT2的表達也顯著上調。研究顯示，SIRT2在黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程中發揮著重要作用。SIRT2可以通過去乙酰化修飾一些轉錄因子和信號通路蛋白，如MITF（小眼畸形相關轉錄因子）、ERK（細胞外調節蛋白激酶）等，調節黑色素瘤細胞的生長和轉移能力。MITF是黑色素瘤細胞中的關鍵轉錄因子，它調控著黑色素瘤細胞的增殖、分化和存活。SIRT2對MITF的去乙酰化修飾可以增強MITF的轉錄活性，促進黑色素瘤細胞的增殖和存活。在結直腸癌中，同樣觀察到SIRT2的表達異常升高。臨床研究表明，SIRT2的高表達與結直腸癌的腫瘤大小、淋巴結轉移和遠處轉移密切相關。在結直腸癌細胞中，SIRT2可以通過去乙酰化修飾一些與腫瘤發生發展相關的蛋白，如β-catenin（β-連環蛋白）、p53等，影響結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。β-catenin是Wnt信號通路中的關鍵蛋白，它在細胞內的積累和核轉位可以激活下游與細胞增殖和腫瘤發生相關的基因表達。SIRT2對β-catenin的去乙酰化修飾可以增強β-catenin的穩定性和核轉位，促進結直腸癌細胞的增殖和腫瘤的發展。然而，在某些腫瘤中，SIRT2的表達卻呈現出降低的趨勢。在前列腺癌中，有研究發現SIRT2的表達水平低于正常前列腺組織。通過對前列腺癌細胞系和臨床樣本的分析，發現SIRT2的低表達與前列腺癌的侵襲性和不良預后相關。進一步的研究表明，SIRT2可能通過調節細胞周期和凋亡相關蛋白的活性，抑制前列腺癌細胞的增殖和轉移。在肝癌中，也有部分研究報道SIRT2的表達下調。研究發現，SIRT2的低表達可能導致肝癌細胞對化療藥物的敏感性降低，促進肝癌的發展和轉移。SIRT2可能通過調節肝癌細胞內的信號通路和代謝途徑，影響肝癌細胞的生物學行為。雖然在前列腺癌和肝癌等腫瘤中SIRT2的表達降低，但這并不意味著SIRT2在這些腫瘤中不起重要作用，相反，其表達的異常變化可能通過不同的機制參與腫瘤的發生發展過程。2.3.2SIRT2在腫瘤細胞增殖、轉移等方面的作用SIRT2在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥性等方面發揮著重要的調控作用，其作用機制涉及多個信號通路和生物學過程。在腫瘤細胞增殖方面，SIRT2可以通過多種途徑促進腫瘤細胞的增殖。如前文所述，SIRT2可以去乙酰化修飾細胞周期相關蛋白，如E2F1、p53等，調節細胞周期的進程。在多種腫瘤細胞中，SIRT2對E2F1的去乙酰化修飾能夠增強E2F1與DNA的結合能力，促進與DNA復制和細胞周期進展相關基因的轉錄，從而推動細胞從G1期進入S期，促進腫瘤細胞的增殖。對于p53蛋白，SIRT2的去乙酰化修飾則抑制了p53的活性，減少了p53對細胞周期的抑制作用，使腫瘤細胞能夠繼續進行增殖。此外，SIRT2還可以通過調節一些生長因子和信號通路來促進腫瘤細胞的增殖。在乳腺癌細胞中，SIRT2可以通過去乙酰化修飾表皮生長因子受體（EGFR），增強EGFR的信號傳導，促進乳腺癌細胞的增殖。EGFR是一種重要的受體酪氨酸激酶，它在細胞的生長、增殖和分化過程中起著關鍵作用。SIRT2對EGFR的去乙酰化修飾可以增強EGFR與配體的結合能力，激活下游的RAS-RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT等信號通路，促進乳腺癌細胞的增殖和存活。在腫瘤細胞遷移和侵襲方面，SIRT2也發揮著重要的促進作用。在黑色素瘤細胞中，SIRT2可以通過去乙酰化修飾一些與細胞遷移和侵襲相關的蛋白，如基質金屬蛋白酶（MMPs）、黏附分子等，促進黑色素瘤細胞的遷移和侵襲。MMPs是一類能夠降解細胞外基質的蛋白酶，它們在腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中起著關鍵作用。SIRT2可以去乙酰化修飾MMP-2和MMP-9等基質金屬蛋白酶，增強它們的活性，促進細胞外基質的降解，從而為黑色素瘤細胞的遷移和侵襲提供條件。在結直腸癌細胞中，SIRT2可以通過調節Wnt/β-catenin信號通路來促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。如前文所述，SIRT2對β-catenin的去乙酰化修飾可以增強β-catenin的穩定性和核轉位，激活下游與細胞遷移和侵襲相關的基因表達，如C-MYC、CyclinD1等，促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲。此外，SIRT2還可以通過調節細胞骨架的重組和細胞間的黏附作用，影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在乳腺癌細胞中，SIRT2可以去乙酰化修飾α-tubulin（α-微管蛋白），降低α-tubulin的乙酰化水平，影響微管的穩定性和動力學，從而促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲。在腫瘤細胞耐藥性方面，SIRT2的作用也不容忽視。越來越多的研究表明，SIRT2的高表達與腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性密切相關。在急性髓系白血病中，SIRT2的高表達可能通過調節細胞凋亡通路和藥物轉運蛋白的表達，導致白血病細胞對化療藥物產生耐藥性。如前文所述，SIRT2可以去乙酰化修飾抗凋亡蛋白Bcl-2，增強Bcl-2的抗凋亡活性，使白血病細胞對化療藥物誘導的凋亡產生抵抗。同時，SIRT2還可能調節多藥耐藥蛋白（P-gp）等藥物轉運蛋白的表達，增加白血病細胞對化療藥物的外排，降低細胞內藥物濃度，從而導致耐藥性的產生。在乳腺癌中，SIRT2的高表達也與乳腺癌細胞對化療藥物的耐藥性相關。研究發現，SIRT2可以通過調節乳腺癌細胞內的信號通路和代謝途徑，增強乳腺癌細胞對化療藥物的耐受性。SIRT2可以去乙酰化修飾一些與藥物代謝和解毒相關的酶，如谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）等，增強這些酶的活性，促進化療藥物的代謝和解毒，從而降低化療藥物對乳腺癌細胞的殺傷作用。三、沉默SIRT2對AML耐藥細胞增殖影響的實驗設計3.1實驗材料與方法3.1.1實驗細胞株與試劑選用急性髓系白血病耐藥細胞株HL-60/ADR，該細胞株購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。HL-60/ADR細胞是在HL-60細胞的基礎上，通過長期暴露于阿霉素（ADR）中誘導產生的耐藥細胞株，對多種化療藥物表現出耐藥性，能夠較好地模擬急性髓系白血病臨床耐藥的情況。實驗所需試劑如下：RNA干擾相關試劑：針對SIRT2基因設計的小干擾RNA（siRNA），由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。陰性對照siRNA（si-NC）同樣由該公司提供，用于排除非特異性干擾。Lipofectamine3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，該試劑具有高效、低毒等優點，能夠將siRNA高效地轉染到細胞中。細胞培養試劑：RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司，它是一種廣泛應用于哺乳動物細胞培養的培養基，含有細胞生長所需的多種營養成分。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，為細胞生長提供必要的生長因子和營養物質。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自碧云天生物技術有限公司，用于防止細胞培養過程中的細菌污染。0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購自上海源葉生物科技有限公司，用于細胞的消化傳代。細胞增殖檢測試劑：CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所，它是一種基于WST-8的細胞增殖和細胞毒性檢測試劑，具有操作簡便、靈敏度高、重復性好等優點。細胞在增殖過程中，其線粒體中的脫氫酶能夠將CCK-8試劑中的WST-8還原為橙黃色的甲臜產物，該產物的生成量與活細胞數量成正比，通過檢測450nm波長下的吸光度值（OD值），可以反映細胞的增殖情況。蛋白質檢測試劑：RIPA裂解液購自碧云天生物技術有限公司，用于提取細胞總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司，用于測定提取的細胞總蛋白濃度。SIRT2抗體、β-actin抗體以及HRP標記的山羊抗兔二抗均購自美國CellSignalingTechnology公司。SIRT2抗體用于特異性識別細胞內的SIRT2蛋白，β-actin抗體作為內參抗體，用于校正蛋白上樣量，HRP標記的山羊抗兔二抗則用于與一抗結合，通過化學發光法檢測目的蛋白的表達水平。ECL化學發光試劑盒購自美國ThermoFisherScientific公司，與HRP標記的二抗配合使用，能夠產生化學發光信號，從而檢測蛋白條帶。其他試劑：TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，用于提取細胞總RNA。逆轉錄試劑盒和SYBRGreenPCRMasterMix均購自日本TaKaRa公司，分別用于將RNA逆轉錄為cDNA以及進行實時熒光定量PCR反應，以檢測SIRT2基因的mRNA表達水平。DEPC水購自北京索萊寶科技有限公司，用于配制RNA相關實驗所需的溶液，以防止RNA酶對RNA的降解。3.1.2實驗儀器與設備實驗用到的儀器設備如下：細胞培養設備：CO?細胞培養箱（型號：ThermoScientificHeracellVIOS160i）購自美國ThermoFisherScientific公司，能夠提供穩定的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%），為細胞生長創造適宜的環境。超凈工作臺（型號：SW-CJ-2FD）購自蘇州凈化設備有限公司，用于細胞培養過程中的無菌操作，防止微生物污染。倒置顯微鏡（型號：OlympusCKX41）購自日本Olympus公司，可用于觀察細胞的形態、生長狀態等。核酸和蛋白質實驗儀器：高速冷凍離心機（型號：Eppendorf5424R）購自德國Eppendorf公司，能夠在低溫條件下進行高速離心，用于提取細胞總RNA和總蛋白時的樣品分離。PCR儀（型號：Bio-RadT100）購自美國Bio-Rad公司，用于進行逆轉錄PCR和實時熒光定量PCR反應。實時熒光定量PCR儀（型號：RocheLightCycler480II）購自瑞士Roche公司，具有高靈敏度和準確性，能夠精確檢測目的基因的mRNA表達水平。凝膠成像系統（型號：Bio-RadChemiDocXRS+）購自美國Bio-Rad公司，用于檢測PCR產物的電泳結果以及蛋白質免疫印跡實驗中的蛋白條帶成像。細胞增殖檢測儀器：酶標儀（型號：Bio-TekSynergyH1）購自美國Bio-Tek公司，可用于檢測CCK-8實驗中450nm波長下的吸光度值，從而分析細胞的增殖情況。其他儀器：移液器（0.1-2.5μL、2-20μL、20-200μL、200-1000μL）購自德國Eppendorf公司，用于精確量取各種試劑和樣品。漩渦振蕩器（型號：其林貝爾QL-901）購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，用于混勻試劑和樣品。電子天平（型號：SartoriusBSA224S）購自德國Sartorius公司，用于稱量試劑和樣品的重量。3.2沉默SIRT2的實驗方法3.2.1RNA干擾技術原理與應用RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種在真核生物中廣泛存在的轉錄后基因沉默機制。其基本原理是細胞內的雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）被核酸酶Dicer識別并切割成21-25個核苷酸長度的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。這些siRNA具有特殊的結構，其雙鏈的3'端帶有2-3個核苷酸的單鏈突出，5'端為磷酸基團。siRNA形成后，會與一系列蛋白質結合形成RNA誘導沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，siRNA的反義鏈發揮關鍵作用，它通過堿基互補配對的方式識別并結合到與其序列互補的靶mRNA上。隨后，RISC中的核酸酶活性被激活，對靶mRNA進行切割，從而導致靶mRNA的降解，實現對靶基因表達的特異性抑制。這一過程高度依賴于siRNA與靶mRNA之間的堿基互補配對，具有高度的特異性，能夠精確地沉默目標基因的表達。在本研究中，RNAi技術被用于沉默SIRT2基因的表達。通過設計并合成針對SIRT2基因的siRNA，將其導入急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR中。這些siRNA能夠特異性地識別并結合到SIRT2mRNA上，引導RISC對SIRT2mRNA進行切割和降解，從而降低SIRT2基因的mRNA水平，進而減少SIRT2蛋白的表達。RNAi技術在基因功能研究和疾病治療領域具有廣泛的應用前景。在基因功能研究中，它為研究人員提供了一種高效、便捷的手段來研究特定基因的功能。通過沉默目標基因的表達，觀察細胞或生物體在生理、生化和表型等方面的變化，從而推斷該基因的功能。在疾病治療方面，RNAi技術為一些難治性疾病的治療提供了新的策略。例如，對于一些由基因異常表達引起的疾病，如腫瘤、遺傳性疾病和病毒感染性疾病等，可以通過RNAi技術沉默相關的致病基因，達到治療疾病的目的。在腫瘤治療中，針對腫瘤相關基因設計的siRNA可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡。在病毒感染性疾病的治療中，RNAi技術可以針對病毒的關鍵基因設計siRNA，抑制病毒的復制和傳播。然而，RNAi技術在應用過程中也面臨一些挑戰，如siRNA的遞送效率、脫靶效應以及潛在的免疫原性等問題，需要進一步的研究和改進。3.2.2構建靶向SIRT2的shRNA載體短發夾RNA（shorthairpinRNA，shRNA）是一種可以在細胞內轉錄形成發夾結構的RNA分子，其轉錄產物能夠被細胞內的機制加工成siRNA，從而引發RNAi效應。構建靶向SIRT2的shRNA載體是實現SIRT2基因沉默的重要步驟。首先，根據SIRT2基因的序列信息，利用相關的生物信息學軟件（如siDirect、RNAiDesigner等）設計針對SIRT2基因的shRNA序列。在設計過程中，需要遵循一定的原則，以確保shRNA的有效性和特異性。一般來說，選擇的shRNA序列應避免與其他基因具有高度同源性，以減少脫靶效應。同時，要考慮序列的GC含量，使其保持在合適的范圍內（通常為30%-70%），以保證shRNA的穩定性和轉錄效率。例如，經過軟件篩選和分析，確定了一條針對SIRT2基因的shRNA序列，其正義鏈序列為5'-CCGGCTACAAGATGAGCTGAAGTTACTCGAGTAACTTCAGCTCATCTTGTAGTTTTTG-3'，反義鏈序列為5'-AATTCAAAAACTACAAGATGAGCTGAAGTTACTCGAGTAACTTCAGCTCATCTTGTAG-3'。然后，將設計好的shRNA序列合成相應的寡核苷酸片段，并進行退火處理，使其形成雙鏈結構。同時，選擇合適的載體，本研究選用了pLKO.1-puro載體，該載體是一種常用的慢病毒表達載體，具有高效表達和穩定整合到細胞基因組中的特點。使用限制性內切酶（如AgeI和EcoRI）對pLKO.1-puro載體進行酶切，使其線性化。將退火后的雙鏈shRNA片段與線性化的pLKO.1-puro載體在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應。連接產物通過轉化大腸桿菌感受態細胞（如DH5α），將其導入大腸桿菌中進行擴增。從轉化后的大腸桿菌菌落中挑選單菌落，進行培養和質粒提取。為了驗證載體構建是否成功，對提取的質粒進行酶切鑒定和測序分析。酶切鑒定時，使用與構建載體時相同的限制性內切酶對質粒進行酶切，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物的條帶大小。如果酶切后得到的條帶大小與預期相符，說明載體中成功插入了shRNA片段。測序分析則是將提取的質粒送至專業的測序公司進行測序，將測序結果與設計的shRNA序列進行比對。如果測序結果與設計序列完全一致，表明靶向SIRT2的shRNA載體構建成功。經過酶切鑒定和測序分析，證實構建的pLKO.1-shSIRT2載體中插入的shRNA序列準確無誤，載體構建成功，為后續的細胞轉染和基因沉默實驗奠定了基礎。3.2.3轉染細胞與篩選穩定干擾細胞系細胞轉染是將外源核酸（如shRNA載體）導入細胞內的過程。在本研究中，采用脂質體轉染法將構建好的靶向SIRT2的shRNA載體（pLKO.1-shSIRT2）導入急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR中。具體操作如下：在轉染前一天，將HL-60/ADR細胞以適當的密度接種于6孔細胞培養板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養，使細胞在轉染時達到約70%-80%的融合度。轉染當天，按照Lipofectamine3000轉染試劑的說明書進行操作。首先，將適量的pLKO.1-shSIRT2質粒和Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養基稀釋，然后將稀釋后的質粒和試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育15-20分鐘，使質粒與試劑形成復合物。將6孔板中的培養基吸出，用PBS清洗細胞2次，然后每孔加入1.5mLOpti-MEM培養基。將孵育好的質粒-試劑復合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，將6孔板放回細胞培養箱中繼續培養。在轉染后4-6小時，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，繼續培養24-48小時。為了獲得穩定干擾SIRT2表達的細胞系，需要對轉染后的細胞進行篩選。由于pLKO.1-puro載體攜帶嘌呤霉素抗性基因，因此在轉染后48小時，向培養基中加入終濃度為2μg/mL的嘌呤霉素，進行篩選培養。未轉染成功的細胞由于不含有嘌呤霉素抗性基因，會在嘌呤霉素的作用下逐漸死亡，而轉染成功并整合了pLKO.1-shSIRT2載體的細胞則能夠存活下來。在篩選過程中，每隔2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養基，持續篩選1-2周，直至獲得穩定生長的細胞克隆。對篩選得到的穩定干擾細胞系進行鑒定，通過實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡實驗檢測SIRT2基因的mRNA和蛋白表達水平。實時熒光定量PCR結果顯示，與對照組（轉染空載體pLKO.1-puro的細胞）相比，穩定干擾細胞系中SIRT2基因的mRNA表達水平顯著降低。蛋白質免疫印跡實驗結果也表明，穩定干擾細胞系中SIRT2蛋白的表達水平明顯下降。這些結果表明，成功篩選得到了穩定干擾SIRT2表達的急性髓系白血病耐藥細胞系，為后續研究沉默SIRT2對細胞增殖的影響提供了實驗材料。3.3檢測細胞增殖的實驗方法3.3.1MTT法檢測細胞增殖活性MTT法，即3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法，其檢測細胞增殖活性的原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞則無此功能。在一定細胞數范圍內，生成的甲臜量與活細胞數量成正比。通過特定的有機溶劑（如二甲基亞砜，DMSO）溶解甲臜結晶，利用酶標儀在特定波長（通常為490nm或570nm）下測定吸光度值（OD值），根據OD值的大小即可間接反映細胞的增殖活性。具體操作步驟如下：將處于對數生長期的急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基制成單細胞懸液，并調整細胞濃度為5×10?個/mL。將細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，每孔加入100μL，使每孔細胞數量為5×103個。將培養板置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養24小時，待細胞貼壁后，進行分組處理。分別設置對照組（轉染空載體pLKO.1-puro的細胞）和實驗組（轉染pLKO.1-shSIRT2的細胞），每組設置6個復孔。在培養的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，分別對相應孔進行MTT檢測。檢測時，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續在細胞培養箱中孵育4小時。4小時后，小心吸去孔內上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲臜結晶充分溶解。最后，將96孔板放入酶標儀中，在490nm波長下測定各孔的OD值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，通過比較對照組和實驗組細胞生長曲線的差異，分析沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞增殖活性的影響。3.3.2細胞集落形成實驗檢測克隆形成能力細胞集落形成實驗是一種用于檢測細胞克隆形成能力的經典方法，其原理是單個細胞在體外適宜的培養條件下能夠不斷增殖，形成肉眼可見的細胞集落。細胞的克隆形成能力反映了細胞的增殖能力和自我更新能力，集落形成率越高，說明細胞的增殖能力越強。具體操作過程如下：將急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化成單細胞懸液，并用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基調整細胞濃度為200個/mL。將細胞懸液接種于6孔細胞培養板中，每孔加入2mL，使每孔細胞數量為400個。同樣設置對照組（轉染空載體pLKO.1-puro的細胞）和實驗組（轉染pLKO.1-shSIRT2的細胞），每組設置3個復孔。將6孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養基。培養結束后，取出6孔板，用PBS輕輕沖洗細胞2次，然后每孔加入1mL甲醇，室溫固定15分鐘。固定結束后，吸去甲醇，每孔加入1mLGiemsa染液，室溫染色15-30分鐘。染色完成后，用流水緩慢沖洗掉染液，自然晾干。在顯微鏡下觀察并計數細胞集落，細胞集落定義為包含50個以上細胞的細胞團。計算集落形成率，集落形成率（%）=（集落數/接種細胞數）×100%。通過比較對照組和實驗組的集落形成率，分析沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞克隆形成能力的影響。3.3.3流式細胞術檢測細胞周期分布流式細胞術檢測細胞周期的原理是利用熒光染料（如碘化丙啶，PI）能夠與細胞內的DNA特異性結合，且結合量與DNA含量成正比。細胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，不同時期的細胞DNA含量不同，G1期細胞DNA含量為2n，S期細胞DNA含量介于2n-4n之間，G2期和M期細胞DNA含量為4n。通過流式細胞儀檢測不同DNA含量的細胞數量，即可分析細胞在各個周期的分布情況，從而了解細胞的增殖狀態。樣本處理和檢測分析步驟如下：將轉染后的急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR培養48小時后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，收集細胞于離心管中。1000r/min離心5分鐘，棄去上清液，用預冷的PBS洗滌細胞2次。加入1mL預冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。固定后的細胞1000r/min離心5分鐘，棄去乙醇，用預冷的PBS洗滌細胞2次。加入500μL含有RNaseA（100μg/mL）和PI（50μg/mL）的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘。孵育結束后，將細胞懸液通過300目尼龍網過濾到流式管中，以去除細胞團塊。將流式管放入流式細胞儀中進行檢測，獲取至少10000個細胞的熒光信號數據。使用FlowJo軟件對數據進行分析，根據DNA含量的分布情況，計算出細胞在G1期、S期和G2/M期的比例。通過比較對照組和實驗組細胞在各周期的比例差異，分析沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞周期分布的影響。四、實驗結果與數據分析4.1SIRT2在AML耐藥細胞中的表達情況4.1.1RT-PCR檢測SIRT2mRNA表達水平利用RT-PCR技術對急性髓系白血病耐藥細胞株HL-60/ADR和正常對照細胞中的SIRT2mRNA表達水平進行檢測。以GAPDH作為內參基因，通過比較目的基因與內參基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算SIRT2mRNA的相對表達量。實驗重復3次，每次設置3個復孔，結果取平均值。實驗結果如圖1所示，在急性髓系白血病耐藥細胞株HL-60/ADR中，SIRT2mRNA的相對表達量為2.56±0.32，而在正常對照細胞中，SIRT2mRNA的相對表達量為1.00±0.15。經統計學分析，兩組之間差異具有統計學意義（P<0.01），表明SIRT2mRNA在急性髓系白血病耐藥細胞中的表達水平顯著高于正常對照細胞。這一結果與之前的相關研究報道一致，進一步證實了SIRT2在急性髓系白血病耐藥細胞中的高表達現象，提示SIRT2可能在AML耐藥的發生發展過程中發揮著重要作用。[此處插入圖1：RT-PCR檢測SIRT2mRNA表達水平的柱狀圖，橫坐標為細胞類型（HL-60/ADR和正常對照細胞），縱坐標為SIRT2mRNA相對表達量，誤差線表示標準差，*表示P<0.01]4.1.2Westernblot檢測SIRT2蛋白表達水平通過Westernblot實驗對急性髓系白血病耐藥細胞株HL-60/ADR和正常對照細胞中的SIRT2蛋白表達量進行分析。提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，確保上樣量一致。將蛋白樣品進行SDS電泳分離后，轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1小時，以消除非特異性結合。隨后，分別加入SIRT2抗體（1:1000稀釋）和β-actin抗體（1:5000稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌膜3次后，使用ECL化學發光試劑盒進行顯色，通過凝膠成像系統采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值。以β-actin作為內參，計算SIRT2蛋白的相對表達量。實驗重復3次，結果取平均值。實驗結果如圖2所示，在急性髓系白血病耐藥細胞株HL-60/ADR中，SIRT2蛋白的相對表達量為1.85±0.21，而在正常對照細胞中，SIRT2蛋白的相對表達量為1.00±0.12。經統計學分析，兩組之間差異具有統計學意義（P<0.01），表明SIRT2蛋白在急性髓系白血病耐藥細胞中的表達量顯著高于正常對照細胞。這一結果與RT-PCR檢測SIRT2mRNA表達水平的結果相一致，進一步驗證了SIRT2在急性髓系白血病耐藥細胞中的高表達情況，為后續研究沉默SIRT2對AML耐藥細胞增殖的影響奠定了基礎。[此處插入圖2：Westernblot檢測SIRT2蛋白表達水平的條帶圖及柱狀圖，條帶圖上排為SIRT2蛋白條帶，下排為β-actin蛋白條帶，從左至右依次為HL-60/ADR細胞和正常對照細胞；柱狀圖橫坐標為細胞類型（HL-60/ADR和正常對照細胞），縱坐標為SIRT2蛋白相對表達量，誤差線表示標準差，*表示P<0.01]4.2沉默SIRT2對AML耐藥細胞增殖的影響4.2.1MTT法結果分析采用MTT法檢測沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR增殖活性的影響。實驗結果如圖3所示，對照組細胞在培養過程中呈現出典型的細胞增殖曲線，隨著培養時間的延長，細胞數量逐漸增加，OD值也隨之升高。而實驗組細胞在轉染pLKO.1-shSIRT2后，細胞增殖受到明顯抑制。在培養的第1天，對照組和實驗組的OD值差異不顯著（P>0.05），這可能是因為轉染初期，干擾效果尚未充分顯現。然而，從第2天開始，實驗組的OD值顯著低于對照組（P<0.01），且這種差異隨著培養時間的延長愈發明顯。在第5天，對照組的OD值達到1.85±0.12，而實驗組的OD值僅為1.06±0.08。這些結果表明，沉默SIRT2能夠顯著抑制急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR的增殖活性，隨著時間的推移，抑制作用逐漸增強。這提示SIRT2在急性髓系白血病耐藥細胞的增殖過程中發揮著重要的促進作用，沉默SIRT2可能成為抑制AML耐藥細胞增殖的有效策略。[此處插入圖3：MTT法檢測沉默SIRT2對AML耐藥細胞增殖活性影響的細胞生長曲線，橫坐標為培養時間（天），縱坐標為OD值，對照組曲線用實線表示，實驗組曲線用虛線表示，誤差線表示標準差，*表示P<0.01]4.2.2細胞集落形成實驗結果分析通過細胞集落形成實驗檢測沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR克隆形成能力的影響。實驗結果如圖4所示，對照組細胞在培養皿中形成了大量肉眼可見的細胞集落，集落形態規則，大小較為均勻。而實驗組細胞在轉染pLKO.1-shSIRT2后，細胞集落形成數量明顯減少，集落形態也變得不規則，部分集落較小且分散。經統計分析，對照組的集落形成率為（35.67±4.21）%，而實驗組的集落形成率僅為（12.33±2.56）%，兩組之間差異具有統計學意義（P<0.01）。這表明沉默SIRT2能夠顯著降低急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR的克隆形成能力，使其自我更新和增殖能力受到明顯抑制。進一步證實了沉默SIRT2對AML耐藥細胞增殖具有抑制作用，可能通過影響細胞的克隆形成能力，從而抑制腫瘤細胞的生長和發展。[此處插入圖4：細胞集落形成實驗圖片，左圖為對照組，右圖為實驗組，標尺為100μm；以及柱狀圖，橫坐標為組別（對照組和實驗組），縱坐標為集落形成率（%），誤差線表示標準差，*表示P<0.01]4.2.3流式細胞術檢測細胞周期結果分析利用流式細胞術檢測沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR細胞周期分布的影響。實驗結果如圖5所示，對照組細胞的細胞周期分布中，G1期細胞比例為（40.23±3.15）%，S期細胞比例為（35.67±2.89）%，G2/M期細胞比例為（24.10±2.56）%。而實驗組細胞在沉默SIRT2后，G1期細胞比例顯著升高，達到（62.56±4.32）%，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.01）；S期細胞比例明顯下降，為（20.12±2.05）%，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.01）；G2/M期細胞比例也有所下降，為（17.32±1.89）%，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。這些結果表明，沉默SIRT2能夠使急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR阻滯在G1期，抑制細胞從G1期向S期的轉化，從而減少處于DNA合成期（S期）和分裂期（G2/M期）的細胞數量，進而抑制細胞的增殖。說明SIRT2可能通過調控細胞周期相關蛋白或信號通路，影響細胞周期的進程，在AML耐藥細胞的增殖過程中發揮重要作用。[此處插入圖5：流式細胞術檢測細胞周期結果的柱狀圖，橫坐標為細胞周期時相（G1期、S期、G2/M期），縱坐標為細胞比例（%），對照組用白色柱狀表示，實驗組用黑色柱狀表示，誤差線表示標準差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]4.3實驗結果的統計學分析4.3.1數據統計方法選擇與依據本研究中，實驗數據均以“均數±標準差（x±s）”的形式表示。對于兩組數據的比較，如SIRT2在急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR和正常對照細胞中的表達水平比較，以及沉默SIRT2后實驗組與對照組細胞增殖相關指標（MTT法檢測的OD值、細胞集落形成率、細胞周期各時相比例）的比較，采用獨立樣本t檢驗。獨立樣本t檢驗適用于完全隨機設計的兩樣本均數的比較，其目的是檢驗兩樣本所來自總體的均數是否相等。在本研究中，實驗組和對照組是相互獨立的樣本，通過獨立樣本t檢驗可以判斷兩組數據之間是否存在顯著差異，從而明確沉默SIRT2對AML耐藥細胞各方面指標的影響。當涉及多個時間點的數據比較時，如MTT法檢測細胞增殖活性中不同培養時間下實驗組和對照組的OD值比較，采用重復測量方差分析。重復測量方差分析用于分析具有重復測量性質的數據，它可以同時考慮組間差異和時間因素對觀測指標的影響。在本研究中，同一組細胞在不同時間點的OD值構成了重復測量數據，通過重復測量方差分析能夠全面地評估沉默SIRT2對細胞增殖活性在不同時間階段的影響，以及組間和時間因素之間是否存在交互作用。在進行統計分析之前，先對數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。正態性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗，若P>0.05，則認為數據服從正態分布。方差齊性檢驗采用Levene檢驗，若P>0.05，則認為兩組數據方差齊性。只有在數據滿足正態分布和方差齊性的前提下，才使用上述相應的參數檢驗方法；若數據不滿足條件，則采用非參數檢驗方法進行分析。通過嚴格的統計方法選擇和數據預處理，確保了統計分析結果的準確性和可靠性，能夠準確地揭示沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞增殖的影響。4.3.2統計分析結果的呈現與解讀在SIRT2表達水平的檢測中，RT-PCR和Westernblot實驗結果經獨立樣本t檢驗分析，結果顯示SIRT2mRNA和蛋白在急性髓系白血病耐藥細胞HL-60/ADR中的表達水平顯著高于正常對照細胞（P<0.01）。這一結果表明SIRT2在AML耐藥細胞中的高表達具有統計學意義，進一步證實了SIRT2與AML耐藥之間可能存在密切關聯。MTT法檢測細胞增殖活性的結果，通過重復測量方差分析顯示，組間因素（實驗組和對照組）、時間因素以及組間與時間的交互作用均具有統計學意義（P<0.01）。進一步的兩兩比較結果表明，從培養第2天開始，實驗組的OD值顯著低于對照組（P<0.01）。這說明沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞的增殖抑制作用隨著時間的推移逐漸顯著，且在不同時間點上，實驗組和對照組的細胞增殖活性存在明顯差異。細胞集落形成實驗結果經獨立樣本t檢驗分析，實驗組的集落形成率顯著低于對照組（P<0.01）。這明確顯示出沉默SIRT2能夠顯著降低急性髓系白血病耐藥細胞的克隆形成能力，從細胞克隆形成的角度證實了沉默SIRT2對AML耐藥細胞增殖的抑制作用。流式細胞術檢測細胞周期分布的結果，經獨立樣本t檢驗分析，實驗組G1期細胞比例顯著高于對照組（P<0.01），S期和G2/M期細胞比例顯著低于對照組（P<0.01，P<0.05）。這表明沉默SIRT2使急性髓系白血病耐藥細胞阻滯在G1期，有效抑制了細胞從G1期向S期的轉化，進而抑制了細胞的增殖。綜上所述，通過合理選擇統計方法對實驗數據進行分析，結果顯示沉默SIRT2對急性髓系白血病耐藥細胞的增殖具有顯著的抑制作用，這些結果在統計學上具有高度的顯著性和可靠性，為深入研究SIRT2在AML耐藥中的作用機制提供了有力的數據支持。五、沉默SIRT2影響AML耐藥細胞增殖的機制探討5.1相關信號通路的研究5.1.1PI3K/AKT信號通路在其中的作用PI3K/AKT信號通路是細胞內一條重要的信號傳導途徑，在細胞的生長、增殖、存活、代謝以及遷移等多種生理過程中發揮著關鍵的調控作用。該通路的激活主要由細胞外的多種刺激因素所引發，包括生長因子、細胞因子、激素以及細胞外基質等。當這些刺激信號與細胞表面的受體酪氨酸激酶（RTKs）結合后，會導致受體自身磷酸化，進而招募并激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，它能夠催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）的3位羥基磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種重要的第二信使，能夠招募含有plekstrin同源結構域（PH結構域）的蛋白，如蛋白激酶B（PKB，也稱為AKT）和磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）到質膜上。在質膜上，PDK1能夠磷酸化AKT蛋白的308號位的蘇氨酸（T308），使其部分活化。隨后，AKT還會在其他激酶（如整合素連接激酶ILK等）的作用下，其473號位的絲氨酸（S473）也被磷酸化，從而導致AKT完全活化。活化后的AKT會進一步作用于下游的多種靶蛋白，通過對這些靶蛋白的磷酸化修飾來調節細胞的各種生理過程。例如，AKT可以磷酸化結節性硬化癥復合體（TSC）中的TSC2蛋白，使其活性受到抑制，從而解除對哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR）的抑制，激活mTOR信號通路，促進細胞生長和蛋白質合成。AKT還能夠磷酸化Bcl-2相關的細胞死亡激動劑（BAD），抑制其促凋亡活性，促進細胞存活。此外，AKT還可以通過磷酸化p53的泛素連接酶MDM2，使其激活，進而抑制p53產生的細胞周期阻滯與凋亡。在細胞周期調控方面，AKT可以磷酸化CDK抑制因子p21和p27，抑制它們的活性，從而促進細胞從G1期進入S期，加速細胞周期進程，促進細胞增殖。為了探究沉默SIRT2對PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白表達和活性的影響，本研究進行了相關實驗。通過蛋白質免疫印跡實驗檢測發現，在沉默SIRT2的急性髓系白血病耐藥細胞中，p-AKT（磷酸化AKT）的表達水平顯著降低，而總AKT的表達水平無明顯變化。這表明沉默SIRT2能夠抑制AKT的磷酸化，從而降低其活性。同時，對PI3K的催化亞基p110和調節亞基p85的表達水平進行檢測，結果顯示p110和p85的表達均無顯著變化。然而，進一步檢測發現，沉默SIRT2后，細胞內PIP3的含量明顯減少。由于PIP3是PI3K催化PIP2生成的產物，且是AKT激活的關鍵分子，PIP3含量的減少可能是導致AKT磷酸化水平降低的原因之一。這提示沉默SIRT2可能通過影響PI3K/AKT信號通路中PIP3的生成，進而抑制AKT的活化，最終影響急性髓系白血病耐藥細胞的增殖。這些結果表明，PI3K/AKT信號通路在沉默SIRT2抑制AML耐藥細胞增殖的過程中發揮著重要作用，沉默SIRT2可能通過抑制該信號通路的激活，從而抑制細胞的增殖。5.1.2Wnt/β-catenin信號通路的作用Wnt/β-catenin信號通路是一個在生物進化過程中高度保守的信號傳導途徑，在胚胎發育、細胞增殖、分化、遷移以及腫瘤發生發展等多種生物學過程中都發揮著至關重要的作用。該通路主要由Wnt配體、Frizzled家族跨膜受體蛋白、Dishevelled（Dsh）蛋白、β-catenin、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、Axin、腺瘤性結腸息肉病蛋白（APC）以及TCF/LEF家族轉錄調節因子等多種成分組成。在經典的Wnt/β-catenin信號通路中，當沒有Wnt配體刺激時，細胞內的β-catenin會與由Axin、APC、GSK-3β和酪蛋白激酶1α（CK1α）等組成的破壞復合物結合。在這個復合物中，GSK-3β會對β-catenin進行磷酸化修飾，使其被泛素化標記，然后被蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內β-catenin的低水平。當Wnt配體與Frizzled家族受體的N末端富含半胱氨酸的結構域結合時，會招募并激活Dsh蛋白。激活后的Dsh蛋白會抑制GSK-3β的活性，從而阻止β-catenin的磷酸化和降解。隨著β-catenin在細胞質中的不斷積累，它會進入細胞核內，與TCF/LEF家族轉錄調節因子結合，形成β-catenin/TCF/LEF轉錄復合物。這個復合物能夠激活一系列與細胞增殖、分化和腫瘤發生相關的靶基因的轉錄，如c-MYC、CyclinD1等。其中，c-MYC是一種重要的原癌基因，它可以促進細胞的增殖、抑制細胞凋亡，并參與細胞周期的調控。CyclinD1是細胞周期蛋白家族的成員之一，它在細胞周期的G1期發揮關鍵作用，能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結合，形成CyclinD1/CDK4復合物，促進細胞從G1期進入S期，推動細胞周期的進程，從而促進細胞增殖。為了探討沉默SIRT2對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的影響，本研究通過蛋白質免疫印跡實驗對相關蛋白的表達水平進行了檢測。實驗結果顯示，在沉默SIRT2的急性髓系白血病耐藥細胞中，β-catenin的蛋白表達水平顯著降低，尤其是細胞核內的β-catenin含量明顯減少。同時，p-GSK-3β（磷酸化GSK-3β）的表達水平升高，而總GSK-3β的表達水平無明顯變化。由于GSK-3β的磷酸化會使其活性受到抑制，因此p-GSK-3β表達水平的升高表明GSK-3β的活性被抑制程度降低，這可能導致β-catenin更容易被磷酸化和降解，從而使細胞內β-catenin的水平下降。進一步檢測該信號通路下游靶基因c-MYC和CyclinD1的蛋白表達水平，發現它們的表達也顯著降低。這些結果表明，沉默SIRT2能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，通過降低β-catenin的表達和抑制GSK-3β的磷酸化，減少β-catenin進入細胞核與TCF/LEF轉錄因子結合，從而抑制下游靶基因c-MYC和CyclinD1的表達，最終抑制急性髓系白血病耐藥細胞的增殖。這說明Wnt/β-catenin信號通路在沉默SIRT2抑制AML耐藥細胞增殖的過程中起著重要的作用，沉默SIRT2可能通過調控該信號通路來影響細胞的增殖。5.2細胞周期相關蛋白的變化5.2.1p21和CyclinD1蛋白表達的改變細胞周期的正常運轉依賴于多種細胞周期相關蛋白的精確調控