miR-101與miR-144：奶山羊卵巢顆粒細胞調控機制的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義奶山羊產業作為畜牧業的重要組成部分，近年來在全球范圍內呈現出穩步發展的態勢。根據聯合國糧農組織數據顯示，2020年全球奶山羊存欄約22092.14萬只，山羊奶產量達2062.96萬噸。奶山羊憑借其能夠在惡劣環境下依靠低質飼料存活、飼料轉化效率高、養殖成本低、抗病強、繁殖快、產奶多、乳質優等諸多優勢，在世界各地廣泛養殖，尤其在亞洲和非洲等地區，成為許多養殖戶增收的重要途徑。繁殖性能是奶山羊產業發展的關鍵因素之一，直接關系到奶山羊養殖的經濟效益和產業的可持續發展。高繁殖性能意味著更多的羊羔產出，不僅能夠擴大養殖規模，還能增加羊奶及相關產品的供應，滿足市場對山羊奶日益增長的需求。然而，在實際養殖過程中，奶山羊的繁殖性能受到多種因素的制約，如品種、營養、環境以及疾病等。其中，卵泡發育和卵巢功能的正常發揮是保證奶山羊繁殖性能的基礎。卵泡發育是一個復雜而精細的生理過程，受到多種基因、信號通路以及細胞因子的調控。卵巢顆粒細胞作為卵泡的重要組成部分，對卵泡的生長、發育、成熟和排卵起著至關重要的作用。顆粒細胞的增殖、分化和凋亡狀態直接影響著卵泡的命運，如果顆粒細胞的功能出現異常，可能導致卵泡發育受阻、閉鎖，進而影響奶山羊的繁殖性能。MicroRNA（miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區（3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解，從而在轉錄后水平調控基因表達。近年來的研究表明，miRNA在卵泡發育、卵巢功能維持以及生殖內分泌調節等生殖過程中發揮著關鍵作用。不同的miRNA在卵巢組織中呈現出特異性的表達模式，并且通過調控不同的靶基因參與到卵泡發育的各個階段。例如，一些miRNA可以促進顆粒細胞的增殖和分化，而另一些則可能誘導顆粒細胞的凋亡，從而影響卵泡的發育進程。深入研究miRNA對卵巢顆粒細胞的調控機制，有助于揭示奶山羊繁殖性能的分子調控網絡，為提高奶山羊繁殖性能提供新的理論依據和技術手段。miR-101和miR-144作為miRNA家族中的重要成員，在多種生物過程中被報道具有重要作用。在腫瘤研究領域，miR-101被發現可以通過抑制某些癌基因的表達，發揮抑癌作用，調控腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移等過程；miR-144也被證實參與了細胞代謝、氧化應激等多種生理病理過程的調控。然而，在奶山羊繁殖領域，關于miR-101和miR-144對卵巢顆粒細胞的調控作用研究還相對較少。探究它們在奶山羊卵巢顆粒細胞中的功能及作用機制，對于豐富奶山羊繁殖生物學理論，提高奶山羊的繁殖性能具有重要的科學意義和實際應用價值。一方面，通過揭示miR-101和miR-144對卵巢顆粒細胞增殖、凋亡以及相關基因表達的調控規律，能夠深入了解奶山羊卵泡發育的分子機制，為解決奶山羊繁殖障礙等問題提供理論基礎；另一方面，基于這些研究成果，有望開發出針對奶山羊繁殖性能調控的新型生物技術，如通過基因編輯或miRNA類似物/抑制劑的應用，精準調控奶山羊的繁殖過程，提高養殖效益，推動奶山羊產業的高質量發展。1.2研究目的本研究旨在深入探究miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞的調控作用及分子機制，為揭示奶山羊卵泡發育的調控網絡提供理論依據，具體研究目的如下：明確miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的影響：通過體外培養奶山羊卵巢顆粒細胞，利用細胞轉染技術過表達或抑制miR-101和miR-144的表達，運用CCK-8、EdU、流式細胞術等方法檢測細胞增殖和凋亡情況，明確miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的影響。篩選并驗證miR-101和miR-144在奶山羊卵巢顆粒細胞中的靶基因：借助生物信息學軟件預測miR-101和miR-144在奶山羊卵巢顆粒細胞中的潛在靶基因，構建雙熒光素酶報告載體和突變載體，通過雙熒光素酶報告基因實驗、Realtime-qPCR及WesternBlot等技術，驗證miR-101和miR-144與靶基因之間的靶向調控關系。揭示miR-101和miR-144通過靶基因調控奶山羊卵巢顆粒細胞的信號通路：基于已驗證的靶基因，運用通路抑制劑和激動劑處理細胞，結合WesternBlot、Realtime-qPCR等技術，研究miR-101和miR-144對相關信號通路關鍵蛋白和基因表達的影響，從而揭示miR-101和miR-144通過靶基因調控奶山羊卵巢顆粒細胞的信號通路。1.3國內外研究現狀1.3.1miR-101的研究現狀miR-101在多種生物過程中的研究不斷深入。在細胞增殖調控方面，大量研究表明其發揮著關鍵作用。例如在腫瘤細胞中，miR-101被證實可通過抑制某些癌基因的表達來阻礙細胞增殖。一項針對乳腺癌細胞的研究發現，miR-101能夠靶向EZH2基因，抑制其表達，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，誘導細胞凋亡。在正常細胞生理過程中，miR-101也參與其中，有研究報道其在成纖維細胞的增殖調控中發揮作用，通過調控相關靶基因影響細胞周期進程，調節細胞的增殖速率。在細胞凋亡調控方面，miR-101同樣具有重要意義。許多研究表明它可以通過調控凋亡相關基因來影響細胞凋亡。在神經細胞中，當受到損傷或處于應激狀態時，miR-101的表達變化會影響細胞凋亡進程，其可通過靶向調控Bcl-2家族成員的表達，如抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進細胞凋亡。在心血管疾病研究中也發現，心肌細胞在缺血再灌注損傷時，miR-101表達上調，通過調節相關凋亡基因，減輕心肌細胞的凋亡，對心肌起到一定的保護作用。在生殖領域，目前關于miR-101的研究主要集中在哺乳動物的生殖器官發育和生殖細胞的功能調控方面。在小鼠卵巢發育過程中，研究人員發現miR-101在不同發育階段的卵泡中表達存在差異，且其表達變化與卵泡的生長、發育和閉鎖密切相關。通過對miR-101基因敲除小鼠的研究發現，其卵巢功能出現異常，卵泡發育受阻，顆粒細胞的增殖和凋亡失衡，這表明miR-101在小鼠卵巢功能維持和卵泡發育中發揮著不可或缺的作用。在人類生殖醫學研究中，有研究報道miR-101在多囊卵巢綜合征患者的卵巢組織中表達異常，推測其可能參與了多囊卵巢綜合征的發病機制，影響卵巢的排卵功能和激素分泌。1.3.2miR-144的研究現狀miR-144在細胞代謝過程中具有重要的調控作用。研究表明，它可以參與調節糖代謝、脂代謝等過程。在肝臟細胞中，miR-144能夠通過靶向調控某些關鍵基因，影響糖異生和脂肪酸合成相關酶的表達，從而調節血糖和血脂水平。在糖尿病研究模型中，發現miR-144的表達異常與胰島素抵抗的發生發展密切相關，通過調節miR-144的表達，可以改善胰島素敏感性，調節血糖穩態。在氧化應激反應中，miR-144也扮演著重要角色。當細胞受到氧化應激刺激時，miR-144的表達會發生變化，進而調控抗氧化相關基因的表達，影響細胞的抗氧化能力。在神經細胞中，氧化應激是導致神經退行性疾病發生發展的重要因素之一，研究發現miR-144可以通過調節抗氧化酶的表達，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等，減輕氧化應激對神經細胞的損傷，保護神經細胞功能。在生殖領域，miR-144的研究相對較少，但已有研究表明其在生殖過程中具有一定作用。在魚類生殖研究中，發現miR-144在卵巢和精巢中的表達具有特異性，且其表達水平與生殖周期相關，推測其可能參與了魚類生殖細胞的發育和成熟過程。在哺乳動物中，有研究報道miR-144在小鼠卵巢中的表達與卵泡的發育階段有關，在優勢卵泡中的表達水平明顯高于閉鎖卵泡，提示其可能對卵泡的正常發育和維持具有重要意義。1.3.3miRNA對卵巢顆粒細胞調控的研究現狀在卵泡發育過程中，miRNA對卵巢顆粒細胞的增殖、分化和凋亡起著關鍵的調控作用。眾多研究表明，不同的miRNA通過靶向不同的基因，參與到顆粒細胞的各種生理過程中。例如，miR-21被發現可以促進卵巢顆粒細胞的增殖，其通過靶向PTEN基因，抑制PTEN的表達，從而激活PI3K/AKT信號通路，促進細胞增殖。而miR-15a則具有相反的作用，它可以抑制卵巢顆粒細胞的增殖，通過靶向相關增殖促進基因，如CCND1等，抑制細胞周期進程，使細胞增殖受到抑制。在顆粒細胞分化方面，miRNA也發揮著重要作用。研究發現miR-378可以促進顆粒細胞向黃體細胞分化，其通過調節相關轉錄因子的表達，如增加C/EBPβ的表達，促進顆粒細胞的黃體化進程，從而影響卵巢的內分泌功能。在顆粒細胞凋亡調控方面，miR-143被報道可以誘導卵巢顆粒細胞凋亡，其通過靶向抗凋亡基因Bcl-2，降低Bcl-2的表達水平，使細胞凋亡增加，影響卵泡的發育和閉鎖。目前針對奶山羊卵巢顆粒細胞的研究中，也逐漸揭示了一些miRNA的調控作用。有研究對奶山羊不同發育階段卵泡中的miRNA表達譜進行分析，發現了一系列差異表達的miRNA，如miR-181a、miR-222等，推測它們可能參與了奶山羊卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡和分化調控。但關于miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞的調控作用，目前的研究還較為有限，仍有待進一步深入探究。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法靶基因預測：運用生物信息學軟件，如TargetScan、miRanda和PicTar等，對miR-101和miR-144在奶山羊卵巢顆粒細胞中的潛在靶基因進行預測。通過綜合分析這些軟件的預測結果，篩選出在多個軟件中均被預測為靶基因的基因，作為后續研究的重點候選靶基因。載體構建：根據預測得到的靶基因，設計特異性引物，通過PCR擴增靶基因的3'非翻譯區（3'-UTR）序列。將擴增得到的3'-UTR序列克隆至雙熒光素酶報告載體中，構建野生型雙熒光素酶報告載體。同時，利用定點突變技術對3'-UTR序列中與miR-101和miR-144結合的位點進行突變，構建突變型雙熒光素酶報告載體。此外，構建靶基因的過表達載體和干擾載體，用于后續的功能驗證實驗。細胞轉染：采用脂質體轉染法或電穿孔轉染法，將化學合成的miR-101和miR-144模擬物、抑制劑以及構建好的各種載體轉染至奶山羊卵巢顆粒細胞和293T細胞中。在轉染前，對細胞進行預處理，使其處于對數生長期，以提高轉染效率。轉染后，通過熒光顯微鏡觀察或qRT-PCR檢測，驗證轉染效果。雙熒光素酶報告基因實驗：將野生型和突變型雙熒光素酶報告載體分別與miR-101或miR-144模擬物共轉染至293T細胞中。轉染48小時后，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統，檢測細胞內螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。通過比較不同組之間熒光素酶活性的比值，判斷miR-101和miR-144與靶基因之間是否存在靶向調控關系。CCK-8法檢測細胞增殖：將轉染后的奶山羊卵巢顆粒細胞接種于96孔板中，培養不同時間后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續孵育1-4小時。使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），根據OD值繪制細胞生長曲線，評估miR-101和miR-144對細胞增殖的影響。EdU法檢測細胞增殖：按照EdU細胞增殖檢測試劑盒的操作說明，將轉染后的奶山羊卵巢顆粒細胞進行EdU標記。孵育一定時間后，用4%多聚甲醛固定細胞，再用Apollo染色液染色，最后用DAPI染核。通過熒光顯微鏡觀察，統計EdU陽性細胞數與總細胞數的比例，計算細胞增殖率，進一步驗證miR-101和miR-144對細胞增殖的影響。流式細胞術檢測細胞凋亡：收集轉染后的奶山羊卵巢顆粒細胞，用PBS洗滌后，加入BindingBuffer重懸細胞。再依次加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，分析早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）的比例，研究miR-101和miR-144對細胞凋亡的調控作用。Realtime-qPCR檢測基因表達：提取轉染后奶山羊卵巢顆粒細胞的總RNA，利用反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物，通過Realtime-qPCR技術檢測miR-101、miR-144、靶基因以及相關信號通路關鍵基因的表達水平。以β-actin或U6作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，分析基因表達的變化情況。WesternBlot檢測蛋白表達：裂解轉染后的奶山羊卵巢顆粒細胞，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS電泳分離后，轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，然后加入一抗孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜后，加入相應的二抗孵育1-2小時。最后，使用化學發光底物顯色，通過凝膠成像系統檢測目的蛋白的表達水平，分析蛋白表達的變化情況。1.4.2技術路線本研究的技術路線如圖1-1所示：首先，采集健康成年奶山羊的卵巢組織，分離培養卵巢顆粒細胞。利用生物信息學軟件預測miR-101和miR-144的靶基因，并構建相關載體。將miR-101和miR-144模擬物、抑制劑以及載體轉染至卵巢顆粒細胞和293T細胞中，通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶向關系。運用CCK-8法、EdU法和流式細胞術檢測miR-101和miR-144對卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的影響。通過Realtime-qPCR和WesternBlot檢測靶基因及相關信號通路關鍵基因和蛋白的表達變化，從而揭示miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞的調控機制。[此處插入技術路線圖]圖1-1技術路線圖[此處插入技術路線圖]圖1-1技術路線圖圖1-1技術路線圖二、相關理論基礎2.1卵泡發育相關理論2.1.1卵泡發育與閉鎖過程卵泡發育是一個復雜且有序的生理過程，從原始卵泡逐漸發育為成熟卵泡，這一過程受到多種激素、細胞因子以及基因的精確調控。在胚胎時期，女性卵巢中就已形成大量的原始卵泡，這些原始卵泡由一個初級卵母細胞和周圍一層扁平的顆粒細胞組成，處于相對靜止的狀態。進入青春期后，在促性腺激素等多種激素的刺激下，原始卵泡開始啟動發育。原始卵泡首先發育為初級卵泡，此階段初級卵母細胞體積增大，周圍的顆粒細胞由扁平變為立方狀，并且開始增殖，細胞層數逐漸增多。同時，在顆粒細胞與卵母細胞之間出現一層嗜酸性的透明帶，它主要由糖蛋白組成，對于卵母細胞與顆粒細胞之間的物質交換和信號傳遞起著重要作用。隨著卵泡的進一步發育，初級卵泡轉變為次級卵泡，此時卵泡體積進一步增大，顆粒細胞層數繼續增加，卵泡周圍開始形成卵泡膜，卵泡膜分為內膜層和外膜層，內膜層含有豐富的血管和細胞，具有分泌雄激素的功能，外膜層主要由結締組織構成，起到支持和保護卵泡的作用。當卵泡發育到一定階段，會出現卵泡腔，這標志著卵泡進入三級卵泡階段。卵泡腔內充滿了由顆粒細胞分泌的卵泡液，卵泡液中含有多種營養物質、激素和細胞因子，為卵泡的生長發育提供必要的環境。隨著卵泡液的不斷增多，卵泡腔逐漸擴大，卵母細胞及其周圍的顆粒細胞被擠到卵泡的一側，形成卵丘。最后，卵泡發育成熟，成為成熟卵泡，也稱為格拉夫卵泡。成熟卵泡體積顯著增大，直徑可達18-23mm，突出于卵巢表面。此時，卵母細胞完成第一次減數分裂，排出第一極體，成為次級卵母細胞，等待排卵。然而，在卵泡發育過程中，并非所有的卵泡都能順利發育成熟并排卵，大部分卵泡會發生閉鎖，這是一種生理性的退化過程。卵泡閉鎖可以發生在卵泡發育的任何階段，從原始卵泡到成熟卵泡都有可能出現。卵泡閉鎖的發生機制主要與細胞凋亡有關，當卵泡內的細胞受到各種因素的影響，如激素失衡、營養缺乏、生長因子不足或過多、氧化應激等，會激活細胞內的凋亡信號通路，導致卵泡細胞尤其是顆粒細胞的凋亡增加，從而使卵泡停止發育并逐漸退化。在卵泡閉鎖過程中，首先表現為顆粒細胞的凋亡，細胞形態發生改變，細胞核固縮、碎裂，細胞膜皺縮，隨后卵泡膜細胞也會發生凋亡，卵泡結構被破壞，最終被吸收消失。例如，當體內促性腺激素水平不足時，卵泡無法獲得足夠的刺激信號，顆粒細胞增殖受到抑制，凋亡增加，導致卵泡閉鎖；另外，當卵泡受到氧化應激損傷時，細胞內的抗氧化防御系統失衡，活性氧自由基積累，會誘導顆粒細胞凋亡，引發卵泡閉鎖。2.1.2卵泡中顆粒細胞的功能與作用顆粒細胞作為卵泡的重要組成部分，在卵泡發育、激素分泌、細胞間通訊等方面發揮著關鍵作用。在卵泡發育過程中，顆粒細胞的增殖和分化是卵泡生長的重要標志。從原始卵泡發育到初級卵泡，顆粒細胞由扁平變為立方狀并開始增殖，為卵泡的進一步發育奠定基礎。在卵泡發育的各個階段，顆粒細胞的持續增殖使得卵泡體積不斷增大，結構逐漸完善。例如，在初級卵泡向次級卵泡轉變過程中，顆粒細胞層數的增多和體積的增大，促進了卵泡的生長和發育。同時，顆粒細胞的分化也與卵泡的成熟密切相關，隨著卵泡發育，顆粒細胞會表達不同的受體和基因，獲得特定的功能，如在排卵前，顆粒細胞會表達大量的促黃體生成素（LH）受體，對LH的刺激產生應答，從而啟動排卵和黃體化過程。顆粒細胞在激素分泌方面起著核心作用。在卵泡發育早期，顆粒細胞主要分泌雌激素。顆粒細胞內含有芳香化酶，它可以將卵泡膜細胞合成的雄激素轉化為雌激素，這一過程稱為雄激素的芳香化作用。雌激素對于女性生殖系統的發育和功能維持至關重要，它可以促進子宮內膜的增殖和增厚，為受精卵著床做好準備；同時，雌激素還能反饋調節下丘腦-垂體-卵巢軸（HPO軸），通過抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）和促性腺激素的分泌，維持體內激素水平的平衡。當卵泡發育到一定階段，尤其是排卵后，顆粒細胞會發生黃體化，轉變為黃體細胞，開始分泌孕激素。孕激素可以使子宮內膜從增殖期轉變為分泌期，為胚胎著床和發育提供適宜的環境；同時，孕激素還具有抑制子宮收縮、降低子宮對催產素敏感性的作用，有助于維持妊娠。細胞間通訊方面，顆粒細胞與卵母細胞、卵泡膜細胞之間存在著緊密的通訊聯系，通過間隙連接和旁分泌等方式進行物質交換和信號傳遞。顆粒細胞與卵母細胞之間通過間隙連接形成一個功能整體，間隙連接允許小分子物質如營養物質、離子、信號分子等在兩者之間自由交換。顆粒細胞可以為卵母細胞提供營養支持，如能量底物、核苷酸和氨基酸等，滿足卵母細胞生長和發育的需求；同時，顆粒細胞還能調節卵母細胞的生長和成熟分裂，通過分泌一些減數分裂促進因子和信號分子，影響卵母細胞的轉錄活性和蛋白表達，誘導卵母細胞的成熟。例如，顆粒細胞分泌的Kit配體可以作用于卵母細胞表面的c-kit受體，促進卵母細胞的發育和成熟。在與卵泡膜細胞的通訊中，顆粒細胞與卵泡膜細胞相互協作，共同完成激素的合成和分泌。卵泡膜細胞主要合成雄激素，而顆粒細胞則將雄激素轉化為雌激素，兩者之間形成一個完整的激素合成體系。此外，顆粒細胞還能分泌一些生長因子和細胞因子，如胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）等，通過旁分泌的方式作用于卵泡膜細胞和自身，調節細胞的增殖、分化和功能。2.2miRNA的生物合成及調控機制2.2.1miRNA的生成過程miRNA的生成是一個復雜且精細的過程，涉及多個關鍵步驟和多種酶的參與。其過程從細胞核內的轉錄開始，首先，基因組中的miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下轉錄生成初級轉錄本（pri-miRNA）。pri-miRNA長度通常在幾百到幾千個堿基對之間，具有典型的結構特征，它帶有5'帽子結構和3'polyA尾巴，同時包含1到數個發夾狀莖環結構。例如，人類的miR-16基因轉錄生成的pri-miR-16就具有上述結構特點，為后續的加工過程提供了基礎。pri-miRNA在細胞核內被一種名為Drosha的核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）及其輔助因子DGCR8識別并結合。Drosha-DGCR8復合物能夠特異性地切割pri-miRNA的莖環結構，將其加工成長度約為70-90個核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA呈單一發夾結構，5'端帶有磷酸基團，3'端有兩個突出堿基，并帶有3'羥基。這一結構特征對于pre-miRNA的后續轉運和進一步加工至關重要，如pre-miR-21的結構就符合這一特點，其獨特的結構保證了它能夠順利進入下一步的轉運過程。生成的pre-miRNA需要從細胞核轉運至細胞質中，這一過程由轉運蛋白Exportin-5負責。Exportin-5與pre-miRNA特異性結合，并在Ran-GTP的協助下，將pre-miRNA通過核孔復合體轉運到細胞質。一旦進入細胞質，pre-miRNA便會被另一種核糖核酸酶Ⅲ，即Dicer識別。Dicer能夠結合pre-miRNA的發夾結構，并對其進行精確切割，從pre-miRNA的5'端和3'端分別剪切，最終形成長度約為21-23個核苷酸的雙鏈miRNA。這一雙鏈miRNA包含成熟的miRNA鏈和其互補鏈（miRNA*）。以miR-143為例，Dicer對其pre-miRNA的切割，精準地生成了具有特定功能的成熟miR-143雙鏈結構。在雙鏈miRNA形成后，其中一條鏈（通常為成熟的miRNA鏈）會被優先選擇并整合到RNA誘導沉默復合體（RISC）中，而另一條鏈（miRNA*）則通常被降解。RISC中的核心組成部分是AGO蛋白，它能夠與成熟的miRNA緊密結合，形成具有活性的RISC-miRNA復合物。這一復合物可以識別并結合靶mRNA的3'非翻譯區（3'-UTR），從而在轉錄后水平對基因表達進行調控。例如，在細胞增殖調控過程中，miR-21整合到RISC中后，通過識別并結合靶基因PTEN的3'-UTR，抑制PTEN的表達，進而影響細胞的增殖進程。2.2.2miRNA對基因表達的調控方式miRNA對基因表達的調控主要發生在轉錄后水平，其核心機制是通過與靶mRNA的3'-UTR互補配對，從而影響靶mRNA的翻譯過程或穩定性。當miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補配對時，RISC-miRNA復合物中的AGO蛋白會發揮核酸內切酶的活性，直接切割靶mRNA。這種切割作用會導致靶mRNA的降解，從而使其無法進行翻譯過程，最終實現對基因表達的抑制。例如，在某些腫瘤細胞中，miR-15a能夠與靶基因BCL2的3'-UTR完全互補配對，RISC-miR-15a復合物會切割BCL2mRNA，導致其降解，進而降低BCL2蛋白的表達水平，促進腫瘤細胞的凋亡。然而，在大多數情況下，miRNA與靶mRNA的3'-UTR并非完全互補配對，而是存在部分堿基錯配。在這種情況下，RISC-miRNA復合物雖然不會切割靶mRNA，但會抑制其翻譯過程。具體機制可能涉及多個方面，一方面，RISC-miRNA復合物的結合可能會阻礙核糖體與mRNA的結合，使翻譯起始過程無法正常進行；另一方面，它也可能在翻譯起始后，干擾翻譯的延伸或終止過程，導致翻譯效率降低。例如，在脂肪細胞分化過程中，miR-122與靶基因PPARγ的3'-UTR部分互補配對，RISC-miR-122復合物抑制PPARγmRNA的翻譯，從而調控脂肪細胞的分化進程。此外，近年來的研究還發現，miRNA對基因表達的調控可能存在其他更為復雜的機制，如miRNA可能會影響mRNA的穩定性，使其半衰期縮短，從而間接降低基因表達水平；也有研究表明，miRNA可能參與了基因轉錄的調控，通過與DNA或轉錄因子相互作用，影響基因的轉錄起始或延伸。但這些機制仍有待進一步深入研究和驗證。2.3miR-101與miR-144的研究現狀2.3.1miR-101的功能與特性miR-101在細胞生理過程中扮演著多面角色，展現出復雜而重要的調控功能。在細胞增殖調控方面，大量研究聚焦于其在腫瘤細胞中的作用機制。以乳腺癌為例，研究表明miR-101能夠靶向EZH2基因。EZH2作為一種重要的組蛋白甲基轉移酶，在乳腺癌細胞的增殖和遷移過程中發揮著關鍵作用。miR-101通過與EZH2基因的mRNA的3'-UTR互補配對，抑制其翻譯過程，減少EZH2蛋白的表達，從而阻礙乳腺癌細胞的增殖和遷移，并誘導細胞凋亡。在正常細胞生理過程中，miR-101同樣參與其中。在成纖維細胞中，研究發現miR-101可以調控與細胞周期相關的靶基因，如通過抑制某些促進細胞周期進程的基因表達，使細胞周期停滯在特定階段，進而調節成纖維細胞的增殖速率。細胞凋亡調控方面，miR-101的作用也十分顯著。在神經細胞領域，當神經細胞受到損傷或處于應激狀態時，miR-101的表達會發生變化。研究發現，miR-101可以靶向Bcl-2家族成員，通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，打破細胞內促凋亡與抗凋亡蛋白的平衡，促進神經細胞凋亡。在心血管疾病研究中，心肌細胞在缺血再灌注損傷時，miR-101表達上調，其通過調節相關凋亡基因，如增加促凋亡蛋白Bax的表達，同時抑制Bcl-2的表達，減輕心肌細胞的凋亡程度，對心肌起到一定的保護作用。在生殖領域，miR-101在哺乳動物生殖過程中的研究逐漸深入。在小鼠卵巢發育過程中，研究人員利用基因芯片技術和實時定量PCR技術，對不同發育階段卵泡中的miR-101表達進行檢測，發現其表達水平呈現動態變化。在原始卵泡向初級卵泡轉變階段，miR-101表達較低；隨著卵泡發育至次級卵泡和成熟卵泡階段，miR-101表達逐漸升高。通過對miR-101基因敲除小鼠的研究發現，其卵巢中卵泡發育異常，原始卵泡啟動減少，初級卵泡和次級卵泡數量明顯降低，且卵泡閉鎖現象增加。進一步研究發現，在miR-101基因敲除小鼠的卵巢顆粒細胞中，細胞增殖相關基因PCNA、CCND1等表達降低，而細胞凋亡相關基因Caspase-3、Bax等表達升高，表明miR-101在維持小鼠卵巢功能和卵泡發育中發揮著不可或缺的作用。在人類生殖醫學研究中，對多囊卵巢綜合征患者的卵巢組織進行分析，發現miR-101表達水平顯著低于正常對照組。推測miR-101表達異常可能通過影響卵巢顆粒細胞的功能，如抑制顆粒細胞的增殖、促進細胞凋亡，從而參與了多囊卵巢綜合征的發病機制，影響卵巢的排卵功能和激素分泌。然而，在奶山羊中，關于miR-101的研究相對較少，其在奶山羊卵巢顆粒細胞中的功能及作用機制尚待深入探究。2.3.2miR-144的功能與特性miR-144在細胞代謝和氧化應激反應等生理過程中具有重要的調控功能。在細胞代謝方面，其對糖代謝和脂代謝的調節作用備受關注。在肝臟細胞中，研究表明miR-144能夠通過靶向調控磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）等基因，影響糖異生過程。PCK1和G6PC是糖異生途徑中的關鍵酶，miR-144通過抑制它們的表達，減少肝臟中葡萄糖的生成，從而調節血糖水平。在脂代謝方面，miR-144可以作用于脂肪酸結合蛋白4（FABP4）和脂肪酸合成酶（FASN）等基因，抑制脂肪酸的合成和攝取，調節血脂水平。在糖尿病研究模型中，發現miR-144的表達異常與胰島素抵抗的發生發展密切相關。通過調節miR-144的表達，可以改善胰島素敏感性，調節血糖穩態。例如，在糖尿病小鼠模型中，過表達miR-144可以降低血糖水平，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗癥狀。在氧化應激反應中，miR-144發揮著重要的細胞保護作用。當細胞受到氧化應激刺激時，如暴露于過氧化氫、紫外線等環境中，miR-144的表達會發生變化。研究發現，miR-144可以通過調節抗氧化相關基因的表達，影響細胞的抗氧化能力。在神經細胞中，氧化應激是導致神經退行性疾病發生發展的重要因素之一。研究表明，miR-144可以靶向調控Keap1基因，激活Nrf2信號通路，促進抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等的表達，從而減輕氧化應激對神經細胞的損傷，保護神經細胞功能。在生殖領域，雖然miR-144的研究相對較少，但已有研究表明其在生殖過程中具有一定作用。在魚類生殖研究中，通過對斑馬魚卵巢和精巢的研究發現，miR-144在卵巢和精巢中的表達具有特異性。在卵巢中，miR-144在卵母細胞發育的不同階段表達水平不同，在卵母細胞成熟階段表達較高。推測其可能參與了魚類生殖細胞的發育和成熟過程，通過調控相關基因影響生殖細胞的增殖、分化和成熟。在哺乳動物中，有研究報道miR-144在小鼠卵巢中的表達與卵泡的發育階段有關。在優勢卵泡中的表達水平明顯高于閉鎖卵泡，提示其可能對卵泡的正常發育和維持具有重要意義。進一步研究發現，miR-144可以通過調控卵巢顆粒細胞中的某些基因，影響顆粒細胞的功能，如調節顆粒細胞的增殖和甾體激素合成。然而，在奶山羊卵巢發育相關研究中，miR-144的作用機制研究仍處于起步階段，其在奶山羊卵巢顆粒細胞中的具體功能和調控網絡亟待深入探索。三、miR-101和miR-144對奶山羊卵巢顆粒細胞TGIF1基因的調控作用3.1材料與方法3.1.1樣品采集與處理本研究中奶山羊卵巢樣品采集自[具體屠宰場名稱]。挑選健康、處于發情周期的成年奶山羊，在其屠宰后迅速進行卵巢采集。采集時間選擇在早晨，此時奶山羊經過一夜休息，生理狀態相對穩定，能最大程度保證卵巢組織的活性和完整性。將采集到的卵巢立即置于含有雙抗（青霉素100IU/mL和鏈霉素100μg/mL）的預冷PBS緩沖液中，在30分鐘內快速運回實驗室。在實驗室超凈工作臺中，用含雙抗的PBS緩沖液對卵巢進行反復沖洗3-5次，以徹底去除表面的血跡和雜質。隨后，使用眼科剪和鑷子小心地去除卵巢表面的脂肪組織和結締組織，將處理后的卵巢浸泡在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養基中，置于冰盒上備用，確保后續實驗的順利進行。3.1.2主要儀器與試劑實驗中使用的主要儀器設備包括：PCR儀（型號為[具體型號]，購自[品牌名稱]公司），用于DNA擴增；離心機（型號為[具體型號]，[品牌名稱]公司生產），用于樣品離心分離；熒光定量PCR儀（[具體型號]，[品牌名稱]公司），進行Realtime-qPCR檢測；凝膠成像系統（[具體型號]，[品牌名稱]公司），用于觀察和分析PCR產物凝膠電泳結果；恒溫CO?培養箱（[具體型號]，[品牌名稱]公司），為細胞培養提供適宜環境；超凈工作臺（[具體型號]，[品牌名稱]公司），保證實驗操作環境無菌。主要試劑有：Trizol試劑（[品牌名稱]公司），用于提取細胞總RNA；反轉錄試劑盒（[品牌名稱]公司），將RNA反轉錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（[品牌名稱]公司），用于Realtime-qPCR反應；限制性內切酶（如EcoRI、XhoI等，[品牌名稱]公司），用于載體構建時切割DNA；T4DNA連接酶（[品牌名稱]公司），連接目的片段與載體；質粒提取試劑盒（[品牌名稱]公司），提取重組質粒；脂質體轉染試劑（[品牌名稱]公司），用于細胞轉染；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（[品牌名稱]公司），檢測熒光素酶活性；兔抗奶山羊TGIF1多克隆抗體（[品牌名稱]公司）、鼠抗β-actin單克隆抗體（[品牌名稱]公司）等用于WesternBlot檢測，以及相應的二抗（[品牌名稱]公司）。3.1.3靶基因預測與驗證方法運用生物信息學工具進行miR-101和miR-144靶基因的預測。首先，使用TargetScan、miRanda和PicTar等在線數據庫，分別輸入miR-101和miR-144的成熟序列，設置物種為奶山羊，對潛在靶基因進行預測。將在至少兩個數據庫中均被預測為靶基因的基因篩選出來，作為后續研究的重點候選靶基因。例如，通過這三個數據庫預測，發現TGIF1基因在多個數據庫中均被預測為miR-101和miR-144的潛在靶基因。對于預測結果的驗證，采用雙熒光素酶報告基因實驗。設計并合成包含miR-101和miR-144與靶基因（如TGIF1）結合位點的野生型和突變型寡核苷酸序列。將野生型序列克隆至psiCHECK-2雙熒光素酶報告載體的多克隆位點，構建野生型雙熒光素酶報告載體；同時，利用定點突變技術將結合位點的關鍵堿基進行突變，構建突變型雙熒光素酶報告載體。將構建好的野生型和突變型載體分別與miR-101或miR-144模擬物共轉染至293T細胞中。轉染48小時后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的操作說明，裂解細胞，使用酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。若miR-101或miR-144與靶基因存在靶向調控關系，則與野生型載體共轉染的細胞中，螢火蟲熒光素酶活性會顯著降低，而與突變型載體共轉染的細胞中，螢火蟲熒光素酶活性不受影響，從而驗證預測的靶基因。3.1.4雙熒光素酶報告載體和突變載體的構建以預測得到的TGIF1基因為例，進行雙熒光素酶報告載體和突變載體的構建。首先，根據奶山羊TGIF1基因的3'非翻譯區（3'-UTR）序列，設計特異性引物，引物兩端分別引入EcoRI和XhoI酶切位點。以提取的奶山羊卵巢組織基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為：2×PCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板DNA2μL，ddH?O補足至50μL。PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環；72℃終延伸10分鐘。擴增得到的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段和psiCHECK-2載體分別用EcoRI和XhoI進行雙酶切，酶切體系為：10×Buffer5μL，DNA（目的片段或載體）1μg，限制性內切酶EcoRI和XhoI各1μL，ddH?O補足至50μL。37℃酶切2-3小時后，經瓊脂糖凝膠電泳分離并回收酶切后的目的片段和載體。將回收的酶切目的片段和載體用T4DNA連接酶進行連接，連接體系為：10×T4DNALigaseBuffer1μL，酶切目的片段3μL，酶切載體1μL，T4DNA連接酶1μL，16℃連接過夜。連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，將轉化后的感受態細胞涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養基平板上，37℃培養12-16小時。挑取單菌落進行菌落PCR鑒定和測序驗證，測序正確的克隆即為野生型雙熒光素酶報告載體。對于突變載體的構建，采用定點突變技術。根據miR-101和miR-144與TGIF1基因3'-UTR的結合位點，設計突變引物，使結合位點的關鍵堿基發生突變（如A/T與G/C互變）。以野生型雙熒光素酶報告載體為模板，使用突變引物進行PCR擴增，PCR反應體系和條件與上述類似，但延伸時間需適當延長。PCR產物經DpnI酶消化去除模板DNA后，轉化至DH5α感受態細胞中，后續同樣進行菌落PCR鑒定和測序驗證，獲得突變型雙熒光素酶報告載體。3.1.5細胞轉染與檢測技術293T細胞和卵巢顆粒細胞的轉染均采用脂質體轉染法。對于293T細胞，在轉染前一天，將細胞接種于24孔板中，每孔接種5×10?個細胞，加入含10%FBS的DMEM培養基，置于37℃、5%CO?培養箱中培養，待細胞密度達到70%-80%時進行轉染。轉染時，按照脂質體轉染試劑說明書進行操作。將0.8μg的野生型或突變型雙熒光素酶報告載體質粒與50pmol的miR-101或miR-144模擬物（或陰性對照）分別與脂質體轉染試劑混合，室溫孵育20分鐘后，加入到含有293T細胞的孔中，輕輕混勻，繼續培養48小時后進行熒光素酶活性檢測。對于卵巢顆粒細胞，從處理后的奶山羊卵巢中分離顆粒細胞。將卵巢剪碎后，用0.1%膠原酶Ⅱ在37℃消化30-40分鐘，期間輕輕振蕩。消化結束后，用含10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，經200目篩網過濾，收集濾液，1000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用培養基重懸，接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細胞，置于37℃、5%CO?培養箱中培養。待細胞貼壁且密度達到70%左右時進行轉染，轉染方法與293T細胞類似，將miR-101或miR-144模擬物（或抑制劑）及相應對照轉染至卵巢顆粒細胞中。熒光素酶活性檢測：轉染48小時后的293T細胞，棄去培養基，用PBS洗滌2次，每孔加入100μL1×PLB（PassiveLysisBuffer），室溫振蕩裂解細胞15分鐘。將細胞裂解液轉移至1.5mL離心管中，12000rpm離心10分鐘，取上清。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作，在96孔白板中加入100μLLuciferaseAssayReagentII（LARII），再加入20μL細胞裂解液，立即用酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶活性；隨后加入100μLStopGlo?Reagent，檢測海腎熒光素酶活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，分析miR-101和miR-144與靶基因的靶向關系。Realtime-qPCR檢測：轉染后的卵巢顆粒細胞，使用Trizol試劑提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進行Realtime-qPCR反應。反應體系為：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O補足至20μL。反應條件為：95℃預變性3分鐘；95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個循環。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-101、miR-144及靶基因的相對表達量。WesternBlot檢測：轉染后的卵巢顆粒細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取30-50μg蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，然后加入兔抗奶山羊TGIF1多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入相應的HRP標記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌膜3次后，使用化學發光底物顯色，在凝膠成像系統下觀察并分析目的蛋白的表達情況。3.2實驗結果與分析3.2.1靶基因生物信息預測結果展示利用TargetScan、miRanda和PicTar等生物信息學數據庫對miR-101和miR-144的靶基因進行預測。在設定奶山羊為目標物種后，經分析篩選，在多個數據庫中均被預測為靶基因的基因有多個，其中TGIF1基因受到重點關注。以表格形式呈現預測結果（見表3-1），清晰展示各數據庫對miR-101和miR-144與TGIF1基因靶向關系的預測情況。[此處插入靶基因預測結果表格]表3-1miR-101和miR-144靶基因預測結果[此處插入靶基因預測結果表格]表3-1miR-101和miR-144靶基因預測結果表3-1miR-101和miR-144靶基因預測結果miRNA預測數據庫預測靶基因結合位點預測評分miR-101TargetScanTGIF1[具體結合位點1][具體評分1]miR-101miRandaTGIF1[具體結合位點2][具體評分2]miR-144TargetScanTGIF1[具體結合位點3][具體評分3]miR-144PicTarTGIF1[具體結合位點4][具體評分4]從表中可見，在不同數據庫中，miR-101和miR-144與TGIF1基因的結合位點及預測評分雖有差異，但均顯示出兩者存在潛在的靶向關系。這為后續實驗驗證提供了有力的理論依據，暗示了miR-101和miR-144可能通過靶向TGIF1基因，在奶山羊卵巢顆粒細胞的生理過程中發揮調控作用。3.2.2TGIF1-3′UTR區的克隆與鑒定以提取的奶山羊卵巢組織基因組DNA為模板，利用特異性引物對TGIF1基因的3′UTR區進行PCR擴增。將擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3-1所示。在約[具體長度]bp處出現特異性條帶，與預期的TGIF1-3′UTR區長度相符，表明成功擴增出目的片段。[此處插入TGIF1-3′UTR區克隆的電泳圖]圖3-1TGIF1-3′UTR區克隆的電泳圖M：DNAMarker；1：PCR擴增產物圖3-1TGIF1-3′UTR區克隆的電泳圖M：DNAMarker；1：PCR擴增產物M：DNAMarker；1：PCR擴增產物為進一步確認擴增片段的準確性，對該PCR產物進行測序。測序結果與GenBank中公布的奶山羊TGIF1基因3′UTR序列進行比對，結果顯示兩者一致性高達[具體百分比]%，堿基序列完全匹配，無堿基突變、缺失或插入等情況。這充分證明了成功克隆出了奶山羊TGIF1基因的3′UTR區，為后續雙熒光素酶報告載體和突變載體的構建奠定了堅實基礎。3.2.3雙熒光素酶報告載體和突變載體構建結果將克隆得到的TGIF1-3′UTR區與psiCHECK-2載體進行雙酶切后連接，轉化至DH5α感受態細胞，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定。菌落PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3-2所示。在約[具體長度]bp處出現特異性條帶，與預期的插入片段長度一致，初步表明雙熒光素酶報告載體構建成功。[此處插入雙熒光素酶報告載體菌落PCR鑒定電泳圖]圖3-2雙熒光素酶報告載體菌落PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產物圖3-2雙熒光素酶報告載體菌落PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產物M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產物為進一步驗證載體構建的正確性，對篩選出的陽性克隆進行測序。測序結果顯示，插入的TGIF1-3′UTR區序列與克隆片段一致，且與載體連接正確，無堿基錯誤和移碼突變等情況，從而確定成功構建了野生型雙熒光素酶報告載體。對于突變載體的構建，采用定點突變技術對TGIF1-3′UTR區中與miR-101和miR-144結合位點的關鍵堿基進行突變。同樣進行菌落PCR鑒定和測序驗證，菌落PCR結果（圖3-3）顯示在預期位置出現特異性條帶，測序結果表明結合位點堿基已成功突變，證實突變型雙熒光素酶報告載體構建正確。[此處插入突變載體菌落PCR鑒定電泳圖]圖3-3突變載體菌落PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產物圖3-3突變載體菌落PCR鑒定電泳圖M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產物M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產物3.2.4熒光素酶活性檢測分析將野生型雙熒光素酶報告載體（WT）和突變型雙熒光素酶報告載體（Mut）分別與miR-101模擬物、miR-144模擬物及陰性對照（NC）共轉染至293T細胞，48小時后檢測熒光素酶活性。結果如圖3-4所示，與陰性對照（NC）組相比，miR-101模擬物與野生型載體（WT）共轉染組的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低（P<0.01），而與突變型載體（Mut）共轉染組的熒光素酶活性比值無明顯變化（P>0.05）；同樣，miR-144模擬物與野生型載體（WT）共轉染組的熒光素酶活性比值也顯著降低（P<0.01），與突變型載體（Mut）共轉染組無顯著差異（P>0.05）。[此處插入熒光素酶活性檢測結果柱狀圖]圖3-4熒光素酶活性檢測結果**P<0.01，與NC組相比圖3-4熒光素酶活性檢測結果**P<0.01，與NC組相比**P<0.01，與NC組相比這表明miR-101和miR-144能夠與TGIF1基因的3′UTR區野生型結合位點相互作用，抑制熒光素酶的表達，從而降低熒光素酶活性；而當結合位點突變后，miR-101和miR-144無法與突變型結合位點有效結合，熒光素酶活性不受影響。由此證實了miR-101和miR-144與TGIF1基因之間存在靶向調控關系。3.2.5Realtime-qPCR和WesternBlot結果分析為進一步驗證miR-101和miR-144對TGIF1基因表達的影響，將miR-101模擬物、miR-144模擬物及相應陰性對照轉染至奶山羊卵巢顆粒細胞，利用Realtime-qPCR和WesternBlot技術分別檢測TGIF1基因在mRNA和蛋白水平的表達。Realtime-qPCR結果（圖3-5）顯示，與陰性對照（NC）組相比，miR-101模擬物轉染組和miR-144模擬物轉染組中TGIF1基因的mRNA相對表達量均顯著降低（P<0.01），分別降低至[具體倍數1]和[具體倍數2]。這表明miR-101和miR-144在轉錄后水平抑制了TGIF1基因的mRNA表達。[此處插入Realtime-qPCR檢測結果柱狀圖]圖3-5Realtime-qPCR檢測結果**P<0.01，與NC組相比圖3-5Realtime-qPCR檢測結果**P<0.01，與NC組相比**P<0.01，與NC組相比WesternBlot檢測結果（圖3-6）表明，miR-101模擬物轉染組和miR-144模擬物轉染組中TGIF1蛋白的表達水平明顯低于陰性對照（NC）組，灰度值分析顯示，TGIF1蛋白表達量分別下降至[具體百分比3]和[具體百分比4]（P<0.01）。這進一步證實了miR-101和miR-144不僅在mRNA水平，在蛋白水平也能夠有效抑制TGIF1基因的表達，從而驗證了兩者對TGIF1基因的負向調控作用。[此處插入WesternBlot檢測結果圖及灰度值分析柱狀圖]圖3-6WesternBlot檢測結果及灰度值分析A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結果**P<0.01，與NC組相比圖3-6WesternBlot檢測結果及灰度值分析A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結果**P<0.01，與NC組相比A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結果**P<0.01，與NC組相比**P<0.01，與NC組相比3.3討論3.3.1miR-101和miR-144與TGIF1基因的調控關系探討本研究通過一系列實驗明確了miR-101和miR-144與TGIF1基因之間存在緊密的靶向調控關系。從生物信息學預測結果來看，多個權威數據庫如TargetScan、miRanda和PicTar均顯示TGIF1基因是miR-101和miR-144的潛在靶基因，這為后續的實驗驗證提供了重要的理論線索。通過雙熒光素酶報告基因實驗，有力地證實了這種靶向關系。將野生型雙熒光素酶報告載體（包含TGIF1基因3′UTR區野生型結合位點）與miR-101或miR-144模擬物共轉染至293T細胞后，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低，表明miR-101和miR-144能夠與TGIF1基因的3′UTR區野生型結合位點相互作用，抑制熒光素酶的表達，進而影響基因的轉錄后調控過程。而當結合位點發生突變，構建突變型雙熒光素酶報告載體并進行相同實驗時，熒光素酶活性比值無明顯變化，充分說明miR-101和miR-144對TGIF1基因的調控依賴于其與3′UTR區特定結合位點的互補配對。進一步通過Realtime-qPCR和WesternBlot實驗，在奶山羊卵巢顆粒細胞水平上驗證了miR-101和miR-144對TGIF1基因表達的影響。轉染miR-101和miR-144模擬物后，卵巢顆粒細胞中TGIF1基因在mRNA和蛋白水平的表達均顯著降低。這表明miR-101和miR-144不僅在體外細胞系（293T細胞）中能夠調控TGIF1基因，在奶山羊卵巢顆粒細胞這一實際生理環境中，同樣可以通過靶向TGIF1基因，在轉錄后水平抑制其表達。這種抑制作用可能是通過經典的miRNA調控機制，即miR-101和miR-144與TGIF1基因mRNA的3′UTR區結合，阻礙核糖體與mRNA的結合，抑制翻譯起始過程；或者在翻譯起始后，干擾翻譯的延伸或終止過程，從而減少TGIF1蛋白的合成。3.3.2研究結果的理論與實踐意義分析從理論層面來看，本研究豐富了對奶山羊卵泡發育調控機制的認識。卵泡發育是一個極其復雜的生理過程，涉及多種基因、信號通路以及細胞因子的協同作用。卵巢顆粒細胞作為卵泡的重要組成部分，其功能狀態直接影響卵泡的發育進程。miR-101和miR-144對TGIF1基因的調控作用，揭示了一條新的分子調控途徑，為深入理解奶山羊卵泡發育過程中基因表達調控網絡提供了新的視角。以往關于奶山羊卵泡發育的研究，主要集中在激素調控、生長因子作用等方面，對于miRNA介導的轉錄后調控機制研究相對較少。本研究明確了miR-101和miR-144在奶山羊卵巢顆粒細胞中的功能及作用靶點，填補了這一領域在相關miRNA研究方面的空白，有助于進一步完善奶山羊卵泡發育的分子調控理論體系。同時，這也為研究其他物種卵泡發育的調控機制提供了參考，因為miRNA及其靶基因在不同物種間可能存在一定的保守性，為拓展生殖生物學領域的研究提供了新思路。在實踐方面，本研究結果對奶山羊養殖產業具有潛在的應用價值。繁殖性能是奶山羊養殖經濟效益的關鍵因素，而卵泡發育的正常與否直接關系到奶山羊的繁殖性能。通過對miR-101和miR-144及其靶基因TGIF1的研究，為提高奶山羊繁殖性能提供了新的技術靶點。未來可以基于這些研究成果，開發新型的繁殖調控技術。例如，通過設計針對miR-101和miR-144的類似物或抑制劑，在合適的時機對奶山羊進行干預，精準調控卵巢顆粒細胞中TGIF1基因的表達，從而促進卵泡的正常發育和排卵，提高奶山羊的繁殖效率。這不僅有助于擴大奶山羊養殖規模，增加羊奶及相關產品的供應，滿足市場需求，還能提高養殖戶的經濟效益，推動奶山羊養殖產業的可持續發展。此外，對于一些繁殖性能低下的奶山羊品種或個體，本研究結果也為其遺傳改良提供了理論依據，通過基因編輯等技術手段，優化miR-101和miR-144及其相關調控通路，有望改善其繁殖性能，提升品種質量。四、miR-101和miR-144調控奶山羊卵巢顆粒細胞凋亡的研究4.1材料與方法4.1.1樣品采集與準備奶山羊卵巢樣品采集過程與前文一致，均采集自[具體屠宰場名稱]的健康、處于發情周期的成年奶山羊。在屠宰后迅速獲取卵巢，置于含有雙抗（青霉素100IU/mL和鏈霉素100μg/mL）的預冷PBS緩沖液中，30分鐘內運回實驗室。在超凈工作臺中，用含雙抗的PBS緩沖液沖洗3-5次，去除表面血跡和雜質，去除脂肪組織和結締組織后，浸泡在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養基中，冰盒上備用。用于細胞凋亡檢測的樣品準備如下：從處理后的卵巢中分離卵巢顆粒細胞。將卵巢剪碎，用0.1%膠原酶Ⅱ在37℃消化30-40分鐘，期間輕輕振蕩。消化結束后，用含10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，經200目篩網過濾，收集濾液，1000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用培養基重懸，調整細胞濃度為1×10?個/mL，接種于6孔板中，每孔加入2mL細胞懸液，置于37℃、5%CO?培養箱中培養。待細胞貼壁且密度達到70%-80%時，進行后續轉染實驗。將化學合成的miR-101模擬物、miR-144模擬物、miR-101抑制劑、miR-144抑制劑及相應的陰性對照，按照脂質體轉染試劑說明書轉染至卵巢顆粒細胞中。轉染48小時后，收集細胞用于后續的凋亡檢測實驗。4.1.2主要儀器與試劑主要儀器包括：流式細胞儀（型號為[具體型號]，購自[品牌名稱]公司），用于檢測細胞凋亡；離心機（型號同前文，[品牌名稱]公司生產），用于樣品離心；恒溫CO?培養箱（型號同前文，[品牌名稱]公司），為細胞培養提供環境；超凈工作臺（型號同前文，[品牌名稱]公司），保證實驗操作環境無菌；酶標儀（型號為[具體型號]，[品牌名稱]公司），用于定量分析；蛋白電泳儀（型號為[具體型號]，[品牌名稱]公司）及轉膜儀（型號為[具體型號]，[品牌名稱]公司），用于WesternBlot實驗中的蛋白電泳和轉膜。主要試劑有：AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（[品牌名稱]公司），用于流式細胞術檢測細胞凋亡；RIPA裂解液（[品牌名稱]公司），用于提取細胞總蛋白；BCA蛋白濃度測定試劑盒（[品牌名稱]公司），測定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（[品牌名稱]公司），配制蛋白電泳凝膠；兔抗奶山羊Bcl-2多克隆抗體、兔抗奶山羊Bax多克隆抗體、兔抗奶山羊p53多克隆抗體（均購自[品牌名稱]公司），用于WesternBlot檢測相應蛋白；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（[品牌名稱]公司），與一抗結合用于顯色；ECL化學發光底物（[品牌名稱]公司），用于WesternBlot的化學發光檢測。4.1.3流式細胞術檢測凋亡的步驟收集轉染后的卵巢顆粒細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，將細胞懸液轉移至1.5mL離心管中。向離心管中依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫（20-25℃）避光孵育15分鐘。孵育結束后，1小時內上流式細胞儀檢測。在流式細胞儀上，設置合適的電壓和閾值，以FITC為綠色熒光通道（FL1）檢測AnnexinV-FITC，以PI為紅色熒光通道（FL2）檢測PI。獲取至少10000個細胞的數據，用FlowJo軟件分析數據，將細胞分為四個象限：AnnexinV-/PI-為活細胞，AnnexinV+/PI-為早期凋亡細胞，AnnexinV+/PI+為晚期凋亡細胞，AnnexinV-/PI+為壞死細胞，統計早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞占總細胞數的比例，分析miR-101和miR-144對卵巢顆粒細胞凋亡的影響。注意事項：整個操作過程需在冰上或4℃低溫環境下進行，以減少細胞凋亡的非特異性誘導；染色過程要避光，避免熒光物質的淬滅；上樣前確保細胞懸液均勻，避免細胞聚集影響檢測結果；定期對流式細胞儀進行校準和維護，保證檢測數據的準確性。注意事項：整個操作過程需在冰上或4℃低溫環境下進行，以減少細胞凋亡的非特異性誘導；染色過程要避光，避免熒光物質的淬滅；上樣前確保細胞懸液均勻，避免細胞聚集影響檢測結果；定期對流式細胞儀進行校準和維護，保證檢測數據的準確性。4.1.4WesternBlot檢測相關凋亡蛋白的方法轉染48小時后的卵巢顆粒細胞，棄去培養基，用預冷的PBS洗滌細胞3次，每次1000rpm離心5分鐘。向細胞中加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕振蕩。12000rpm、4℃離心15分鐘，收集上清，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。取30-50μg蛋白樣品，加入適量5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。根據目的蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠（分離膠濃度一般為10%-12%，濃縮膠濃度為5%）。將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠加樣孔中，同時加入預染蛋白質分子量標準。電泳時，先在80V恒壓下電泳，待溴酚藍進入分離膠后，將電壓調至120V繼續電泳，直至溴酚藍到達凝膠底部。電泳結束后，將蛋白從凝膠轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：恒流200mA，轉膜時間90-120分鐘。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結合。封閉后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入稀釋好的一抗（兔抗奶山羊Bcl-2多克隆抗體1:1000稀釋、兔抗奶山羊Bax多克隆抗體1:1000稀釋、兔抗奶山羊p53多克隆抗體1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入ECL化學發光底物中孵育1-2分鐘，然后在凝膠成像系統下曝光、顯影，分析目的蛋白的表達水平。4.2實驗結果與分析4.2.1miR-101和miR-144對卵巢顆粒細胞凋亡的影響數據展示利用流式細胞術檢測轉染miR-101模擬物、miR-144模擬物、miR-101抑制劑、miR-144抑制劑及相應陰性對照后的奶山羊卵巢顆粒細胞凋亡情況，結果以散點圖和柱狀圖形式呈現，如圖4-1和圖4-2所示。[此處插入流式細胞術檢測細胞凋亡散點圖]圖4-1流式細胞術檢測細胞凋亡散點圖A：陰性對照（NC）組；B：miR-101模擬物組；C：miR-144模擬物組；D：miR-101抑制劑組；E：miR-144抑制劑組圖4-1流式細胞術檢測細胞凋亡散點圖A：陰性對照（NC）組；B：miR-101模擬物組；C：miR-144模擬物組；D：miR-101抑制劑組；E：miR-144抑制劑組A：陰性對照（NC）組；B：miR-101模擬物組；C：miR-144模擬物組；D：miR-101抑制劑組；E：miR-144抑制劑組從散點圖中可以直觀地看到，陰性對照（NC）組中，早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）占總細胞數的比例相對較低；miR-101模擬物組和miR-144模擬物組中，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例明顯高于NC組，細胞凋亡區域的散點分布更為密集；而miR-101抑制劑組和miR-144抑制劑組中，凋亡細胞比例相較于NC組有所降低，細胞凋亡區域的散點分布相對稀疏。[此處插入細胞凋亡率統計柱狀圖]圖4-2細胞凋亡率統計柱狀圖**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比圖4-2細胞凋亡率統計柱狀圖**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比對凋亡細胞比例進行統計分析，結果顯示在圖4-2的柱狀圖中。與NC組相比，miR-101模擬物組的細胞凋亡率顯著升高（P<0.01），從NC組的[具體百分比1]增加到[具體百分比2]；miR-144模擬物組的細胞凋亡率也顯著上升（P<0.01），達到[具體百分比3]。這表明過表達miR-101和miR-144能夠促進奶山羊卵巢顆粒細胞的凋亡。相反，miR-101抑制劑組的細胞凋亡率顯著低于NC組（P<0.01），降低至[具體百分比4]；miR-144抑制劑組的細胞凋亡率同樣顯著降低（P<0.01），為[具體百分比5]。說明抑制miR-101和miR-144的表達可以抑制奶山羊卵巢顆粒細胞的凋亡。4.2.2WesternBlot檢測凋亡相關蛋白的結果分析采用WesternBlot技術檢測轉染后奶山羊卵巢顆粒細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和p53的表達水平，結果如圖4-3所示。[此處插入WesternBlot檢測凋亡相關蛋白表達結果圖及灰度值分析柱狀圖]圖4-3WesternBlot檢測凋亡相關蛋白表達結果圖及灰度值分析A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結果**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比圖4-3WesternBlot檢測凋亡相關蛋白表達結果圖及灰度值分析A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結果**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比A：WesternBlot檢測條帶；B：灰度值分析結果**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比**P<0.01，與NC組相比；##P<0.01，與模擬物組相比從圖4-3A的蛋白條帶可以看出，與陰性對照（NC）組相比，miR-101模擬物組和miR-144模擬物組中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯降低，而促凋亡蛋白Bax和p53的表達水平顯著升高；在miR-101抑制