乙型腦炎病毒E蛋白多表位基因重組痘苗病毒安卡拉株（rMVA-mep）構(gòu)建與免疫效果的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義日本乙型腦炎病毒（JapaneseEncephalitisVirus，JEV），簡稱乙腦病毒，隸屬黃病毒科黃病毒屬，是一種以蚊蟲為主要傳播媒介的人畜共患病毒。乙腦病毒的危害不容小覷，嚴(yán)重威脅著人類健康和動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。對于人類而言，乙腦病毒感染是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的重要原因之一，是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一。當(dāng)人體被攜帶乙腦病毒的蚊蟲叮咬后，病毒隨蚊蟲唾液進(jìn)入人體皮下，先在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及局部淋巴結(jié)等處的細(xì)胞中增殖，隨后少量病毒進(jìn)入血循環(huán)，形成短暫的第一次病毒血癥。之后病毒隨血循環(huán)散布到肝脾等處的細(xì)胞中繼續(xù)增殖，約經(jīng)4-7日潛伏期后，大量增殖的病毒再次侵入血流，引發(fā)第二次病毒血癥，此時患者會出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)及全身不適等癥狀。若病毒突破血腦屏障，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，就會導(dǎo)致嚴(yán)重的病變，引發(fā)高熱、意識障礙、抽搐、顱內(nèi)高壓、腦膜刺激征等臨床表現(xiàn)。重癥患者可因呼吸循環(huán)衰竭而死亡，部分幸存者還會遺留失語、癲癇、智力障礙、精神障礙等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，給患者及其家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。在動物養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其是養(yǎng)豬業(yè)，乙腦病毒的感染可引起豬的繁殖障礙，導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，公豬睪丸炎等，嚴(yán)重影響豬群的繁殖性能，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬作為乙腦病毒的中間宿主，帶毒豬在病毒的傳播過程中起著關(guān)鍵作用，是乙腦病毒傳播給人類的重要傳染源。因此，有效控制豬的乙腦感染，不僅對保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要，對于降低人類感染乙腦病毒的風(fēng)險，保護(hù)人類健康也具有不可忽視的意義。目前，用于預(yù)防乙腦的疫苗主要包括傳統(tǒng)的弱毒苗和滅活苗。傳統(tǒng)疫苗在乙腦的預(yù)防工作中發(fā)揮了一定的作用，但隨著研究的深入和應(yīng)用的推廣，其局限性也逐漸凸顯。傳統(tǒng)弱毒苗存在毒力返強的風(fēng)險，可能會導(dǎo)致接種動物出現(xiàn)感染發(fā)病的情況，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來潛在威脅。而滅活苗雖然安全性相對較高，但免疫原性較差，需要多次接種才能達(dá)到較好的免疫效果，這不僅增加了免疫成本和工作量，還可能因免疫程序的復(fù)雜性導(dǎo)致免疫失敗。此外，傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)過程往往涉及病毒的大量培養(yǎng)，存在生物安全隱患，且生產(chǎn)成本較高，限制了其在一些地區(qū)的廣泛應(yīng)用。為了克服傳統(tǒng)乙腦疫苗的局限性，研發(fā)新型、高效、安全的乙腦疫苗迫在眉睫。基因工程疫苗作為疫苗研發(fā)領(lǐng)域的重要方向，具有諸多優(yōu)勢，成為了研究的熱點。其中，痘苗病毒安卡拉株（ModifiedVacciniaAnkara，MVA）作為一種理想的病毒載體，在基因工程疫苗的構(gòu)建中展現(xiàn)出獨特的潛力。MVA是經(jīng)過雞胚成纖維細(xì)胞多次傳代致弱的痘苗病毒株，它不僅保留了良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)機體的免疫反應(yīng)，而且在哺乳動物體內(nèi)不能有效繁殖，毒副作用小，安全性高。基于MVA載體構(gòu)建的重組疫苗，能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)霗C體，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對特定抗原的免疫應(yīng)答。本研究聚焦于構(gòu)建表達(dá)乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原的重組痘苗病毒安卡拉株（rMVA-mep）。乙腦病毒的E蛋白在病毒感染過程中起著關(guān)鍵作用，它與病毒和細(xì)胞受體結(jié)合、膜融合密切相關(guān)，同時也是引起中和抗體及宿主保護(hù)的主要免疫蛋白。多表位疫苗是近年來發(fā)展起來的一種新型疫苗設(shè)計思路，它同時攜帶多個與目標(biāo)抗原相關(guān)的及輔助性表位，能夠被具有多種遺傳背景的MHC分子識別、結(jié)合，從而高效遞呈抗原，在細(xì)胞免疫方面具有獨特優(yōu)勢，可有效應(yīng)對病原微生物的變異和免疫反應(yīng)中的諸多不利因素。通過合理選擇乙腦病毒E蛋白上的多個B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，構(gòu)建rMVA-mep，有望獲得一種能夠同時激發(fā)機體體液免疫和細(xì)胞免疫的新型乙腦疫苗。對rMVA-mep的免疫效果進(jìn)行全面評價，具有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。從現(xiàn)實應(yīng)用角度來看，若rMVA-mep表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)效果，將為乙腦的防控提供一種全新的、更有效的手段，有助于降低乙腦在人類和動物中的發(fā)病率，減少疾病帶來的危害和經(jīng)濟(jì)損失。在疫苗研發(fā)的理論研究方面，本研究將深入探討多表位疫苗在痘苗病毒載體中的表達(dá)、免疫應(yīng)答機制等問題，為其他基因工程疫苗的研發(fā)提供寶貴的經(jīng)驗和技術(shù)參考，推動整個疫苗研發(fā)領(lǐng)域的發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乙腦疫苗的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者一直致力于開發(fā)更安全、高效的疫苗。早期，傳統(tǒng)的乙腦疫苗如弱毒苗和滅活苗的研發(fā)取得了顯著成果，為乙腦的防控提供了重要手段。隨著科技的不斷進(jìn)步，基因工程疫苗逐漸成為研究熱點，其中基于痘苗病毒安卡拉株（MVA）載體構(gòu)建的重組疫苗受到了廣泛關(guān)注。國外對于MVA載體的研究起步較早，在多個領(lǐng)域進(jìn)行了深入探索。在疫苗研發(fā)方面，利用MVA載體表達(dá)多種病原體的抗原基因，如流感病毒、人類免疫缺陷病毒（HIV）、結(jié)核分枝桿菌等抗原，在動物模型中取得了一定的免疫效果，部分研究已進(jìn)入臨床試驗階段。例如，在流感疫苗研究中，重組MVA載體表達(dá)的流感病毒血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，有效抵抗流感病毒的攻擊。在HIV疫苗研究中，以MVA為載體表達(dá)HIV的gag、pol和env等基因，激發(fā)了機體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，為HIV疫苗的研發(fā)提供了新的思路。這些研究充分展示了MVA載體在疫苗構(gòu)建中的巨大潛力和優(yōu)勢。在乙型腦炎疫苗的研究方面，國外也有學(xué)者嘗試?yán)肕VA載體表達(dá)乙腦病毒的相關(guān)抗原。他們對乙腦病毒的基因結(jié)構(gòu)和免疫原性進(jìn)行了深入分析，篩選出具有良好免疫原性的抗原表位，并將其導(dǎo)入MVA載體中。通過動物實驗，初步評估了重組疫苗的免疫效果，發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一定水平的抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)。然而，這些研究仍存在一些問題，如免疫原性不夠強、免疫保護(hù)效果有待進(jìn)一步提高等，需要進(jìn)一步優(yōu)化疫苗的設(shè)計和制備工藝。國內(nèi)在乙腦疫苗研究領(lǐng)域同樣取得了豐碩成果。傳統(tǒng)乙腦疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用在我國已有多年歷史，為控制乙腦的流行發(fā)揮了重要作用。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)學(xué)者也積極開展基于MVA載體的乙腦重組疫苗的研究。通過對乙腦病毒E蛋白的深入研究，篩選出多個B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，并將其串聯(lián)構(gòu)建成多表位基因。利用分子克隆技術(shù)，將多表位基因插入MVA載體中，成功構(gòu)建了表達(dá)乙腦病毒E蛋白多表位抗原的重組痘苗病毒安卡拉株（rMVA-mep）。在對rMVA-mep的研究中，國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了一系列的實驗，包括病毒的構(gòu)建、鑒定、免疫原性和免疫保護(hù)效果的評估等。通過PCR、Westernblot等方法對重組病毒進(jìn)行鑒定，證實了多表位基因在MVA載體中的穩(wěn)定整合和表達(dá)。在動物實驗中，以rMVA-mep免疫小鼠，檢測小鼠體內(nèi)的抗體水平、細(xì)胞免疫反應(yīng)以及對致死量乙腦病毒攻擊的保護(hù)效果。結(jié)果表明，rMVA-mep能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對乙腦病毒的攻擊具有一定的保護(hù)作用。盡管國內(nèi)外在基于MVA載體的乙腦重組疫苗研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。目前對于多表位基因的設(shè)計和篩選還缺乏系統(tǒng)的理論和方法，表位的組合和排列方式對免疫效果的影響尚不明確。重組疫苗在體內(nèi)的免疫應(yīng)答機制還需要進(jìn)一步深入研究，以更好地理解疫苗的作用原理，為疫苗的優(yōu)化提供理論依據(jù)。此外，重組疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)還需要進(jìn)一步完善，以確保疫苗的安全性和有效性，滿足實際應(yīng)用的需求。本研究將在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化多表位基因的設(shè)計，深入探討rMVA-mep在小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答機制，全面評價其免疫效果，旨在為新型乙腦疫苗的研發(fā)提供更堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1日本乙型腦炎病毒（JEV）2.1.1JEV的分類與結(jié)構(gòu)日本乙型腦炎病毒（JEV）在病毒分類學(xué)中，隸屬于黃病毒科黃病毒屬。黃病毒科包含眾多對人類和動物健康具有重要影響的病毒成員，黃病毒屬內(nèi)的病毒具有一些共同的特征，JEV在其中占據(jù)著獨特的地位。JEV的基因組為單股正鏈RNA，長度約為10.9kb。這一基因組結(jié)構(gòu)使其具有獨特的遺傳信息傳遞和表達(dá)機制。它僅包含一個開放閱讀框（ORF），該閱讀框編碼一個多聚蛋白前體。這個多聚蛋白前體在病毒感染細(xì)胞的過程中，會被宿主細(xì)胞或病毒自身編碼的蛋白酶精確切割，從而產(chǎn)生出三種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白。三種結(jié)構(gòu)蛋白分別為衣殼蛋白（C）、膜蛋白（M）和包膜蛋白（E）。衣殼蛋白主要參與病毒核心結(jié)構(gòu)的形成，對病毒基因組起到保護(hù)作用，確保病毒在傳播和感染過程中基因組的完整性；膜蛋白相對較小，在病毒粒子的組裝和成熟過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它參與維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，與病毒的感染性密切相關(guān)；包膜蛋白則是JEV的主要表面蛋白，在病毒的感染機制中扮演著核心角色，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性直接影響著病毒與宿主細(xì)胞的相互作用。在這三種結(jié)構(gòu)蛋白中，包膜蛋白（E蛋白）尤為重要。E蛋白的分子量約為53kDa，其結(jié)構(gòu)中存在多個抗原表位，這些表位是病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的關(guān)鍵部位。其中，一些表位能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，這些中和抗體可以特異性地識別并結(jié)合E蛋白上的相應(yīng)表位，從而阻斷病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合，抑制病毒的感染過程，為宿主提供重要的免疫保護(hù)。E蛋白還參與了病毒與宿主細(xì)胞的膜融合過程，在病毒感染細(xì)胞時，E蛋白會發(fā)生構(gòu)象變化，使其能夠與宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜相互作用，促進(jìn)病毒包膜與細(xì)胞膜的融合，進(jìn)而將病毒基因組釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)，啟動病毒的復(fù)制周期。E蛋白上存在與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的位點，不同的宿主細(xì)胞表面可能存在不同的受體，但E蛋白能夠通過其特定的結(jié)構(gòu)域與這些受體精準(zhǔn)結(jié)合，實現(xiàn)病毒對宿主細(xì)胞的特異性識別和感染。2.1.2JEV的致病機理與流行特征JEV的致病過程是一個復(fù)雜且有序的過程。當(dāng)攜帶JEV的蚊蟲叮咬宿主后，病毒首先隨蚊蟲唾液進(jìn)入人體皮下組織。在皮下組織中，病毒會迅速與局部的細(xì)胞相互作用，主要是毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及局部淋巴結(jié)等處的細(xì)胞。病毒利用這些細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量進(jìn)行自身的增殖，在細(xì)胞內(nèi)，病毒基因組會被轉(zhuǎn)錄和翻譯，合成大量的病毒蛋白和核酸，組裝成新的病毒粒子。隨后，少量病毒粒子會進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)第一次病毒血癥。在第一次病毒血癥期間，病毒隨血流散布到全身各處，但此時病毒數(shù)量相對較少，尚未引發(fā)明顯的臨床癥狀。隨著病毒在肝脾等器官的細(xì)胞中進(jìn)一步大量增殖，大量新合成的病毒再次侵入血流，形成第二次病毒血癥。此時，病毒數(shù)量大幅增加，病毒血癥更為明顯，患者開始出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)及全身不適等非特異性癥狀，這些癥狀是機體對病毒感染的一種全身性反應(yīng)。如果病毒在這一階段能夠突破血腦屏障，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，就會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。血腦屏障是保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要生理結(jié)構(gòu)，正常情況下能夠阻止病原體和有害物質(zhì)進(jìn)入大腦。然而，JEV可能通過多種機制突破血腦屏障，一種可能的機制是病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能改變，使血腦屏障的通透性增加，從而使病毒得以進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；另一種可能是病毒借助感染的免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，通過這些細(xì)胞的“特洛伊木馬”作用，攜帶病毒穿過血腦屏障。一旦病毒侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，就會在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，引發(fā)一系列病理變化。病毒的增殖會直接破壞神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡。同時，病毒感染會引發(fā)機體的免疫反應(yīng)，免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等會聚集到感染部位，釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)。這些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)雖然在一定程度上有助于機體抵抗病毒感染，但過度的免疫反應(yīng)也會導(dǎo)致炎癥損傷，引起腦組織的充血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變。這些病理變化會干擾神經(jīng)信號的正常傳遞，導(dǎo)致患者出現(xiàn)高熱、意識障礙、抽搐、顱內(nèi)高壓、腦膜刺激征等典型的乙腦臨床癥狀。重癥患者由于腦部病變嚴(yán)重，可因呼吸循環(huán)衰竭而死亡，部分幸存者也可能因為神經(jīng)細(xì)胞的不可逆損傷而遺留失語、癲癇、智力障礙、精神障礙等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。JEV的流行具有明顯的地域特征，主要集中在亞洲地區(qū)。亞洲的氣候條件、生態(tài)環(huán)境以及人口和動物分布特點為JEV的傳播提供了適宜的條件。在東南亞、南亞和東亞等地區(qū)，JEV的流行較為頻繁。這些地區(qū)氣候溫暖濕潤，蚊蟲滋生繁殖迅速，為JEV的傳播媒介——蚊蟲提供了良好的生存環(huán)境。人口密度大、衛(wèi)生條件相對較差以及人與動物的密切接觸也增加了病毒傳播的機會。在中國，除了東北、青海、新疆及西藏等部分地區(qū)外，其他地區(qū)均有JEV的流行報道。其中，農(nóng)村地區(qū)的發(fā)病率通常高于城市，這可能與農(nóng)村地區(qū)的衛(wèi)生設(shè)施相對落后、蚊蟲防控難度較大以及居民的生活方式更易接觸到病毒傳染源有關(guān)。JEV的流行還呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性，這與蚊蟲的生態(tài)學(xué)密切相關(guān)。在溫帶和亞熱帶地區(qū)，JEV的流行主要集中在夏秋季節(jié)，尤其是7-9月份，這期間約90%的病例會發(fā)生。夏季氣溫升高，蚊蟲活動頻繁，繁殖速度加快，病毒在蚊蟲體內(nèi)的增殖和傳播效率也相應(yīng)提高。同時，人們在夏季戶外活動增多，更容易被攜帶病毒的蚊蟲叮咬，從而增加了感染的風(fēng)險。在一些熱帶地區(qū)，由于氣候常年溫暖，蚊蟲全年均可繁殖，JEV的傳播相對更為持續(xù)，甚至可能全年都有病例發(fā)生，但在雨季等蚊蟲密度高峰期，病例數(shù)通常會明顯增加。動物宿主在JEV的傳播和流行中起著關(guān)鍵作用。豬是JEV最重要的擴(kuò)增宿主和傳染源。豬對JEV具有較高的易感性，感染率可接近100%。豬感染JEV后，雖然大多數(shù)不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但會出現(xiàn)病毒血癥，且毒血癥期較長。在病毒血癥期間，豬血液中的病毒可以被蚊蟲吸食，蚊蟲再叮咬其他動物或人類時，就會將病毒傳播出去。豬的養(yǎng)殖數(shù)量大、分布廣泛，且與人類生活密切相關(guān)，這使得豬在JEV從動物傳播給人類的過程中扮演了重要的橋梁角色。馬、牛、羊、雞、鴨等家畜和家禽也可以感染JEV，但大多表現(xiàn)為隱性感染，它們在病毒的傳播過程中也可能起到一定的作用。鳥類尤其是野鳥，也可能感染JEV并成為病毒的宿主，它們的遷徙活動可能會將病毒傳播到更遠(yuǎn)的地區(qū)，擴(kuò)大病毒的傳播范圍。2.2痘苗病毒安卡拉株（MVA）2.2.1MVA的生物學(xué)特性痘苗病毒安卡拉株（ModifiedVacciniaAnkara，MVA）起源于1958年，它是從痘苗病毒天壇株（TianTanstrain）經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）連續(xù)傳代致弱而獲得的高度減毒痘苗病毒株。在傳代過程中，MVA經(jīng)歷了多達(dá)570次的傳代，這一過程使其生物學(xué)特性發(fā)生了顯著改變。MVA具有獨特的生長許可性。與野生型痘苗病毒相比，MVA在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中呈現(xiàn)出復(fù)制缺陷的特性。研究表明，MVA在人源細(xì)胞系如HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞，以及鼠源細(xì)胞系如NIH/3T3細(xì)胞中，均無法進(jìn)行有效的復(fù)制和增殖。這主要是因為MVA在傳代過程中發(fā)生了大量的基因缺失，這些缺失導(dǎo)致了一些與病毒復(fù)制和宿主范圍相關(guān)基因的功能喪失。例如，MVA缺失了多個編碼宿主范圍相關(guān)蛋白的基因，使得其無法在哺乳動物細(xì)胞中完成完整的病毒復(fù)制周期。在雞胚成纖維細(xì)胞中，MVA卻能夠進(jìn)行正常的復(fù)制和增殖，這為其疫苗生產(chǎn)提供了便利條件，可通過雞胚成纖維細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得足夠的病毒量。在基因組成方面，MVA的基因組與野生型痘苗病毒相比，存在多處基因缺失，缺失區(qū)域達(dá)31.5kb，涉及約25個基因。這些基因缺失涵蓋了多個功能類別，其中包括與病毒毒力相關(guān)的基因。例如，MVA缺失了一些編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因，這些蛋白在野生型痘苗病毒感染宿主時，能夠抑制宿主的免疫反應(yīng)，從而增強病毒的毒力。MVA缺失了這些基因后，其毒力大幅降低，在哺乳動物體內(nèi)幾乎不會引發(fā)嚴(yán)重的病理反應(yīng)。MVA還缺失了一些與病毒宿主范圍相關(guān)的基因，這使得它在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中失去了有效的繁殖能力，進(jìn)一步保障了其安全性。從體內(nèi)免疫特性來看，MVA雖然在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制受限，但它仍能夠有效激發(fā)機體的免疫反應(yīng)。當(dāng)MVA進(jìn)入機體后，其病毒粒子表面的蛋白以及表達(dá)的外源抗原能夠被抗原遞呈細(xì)胞（APC）識別和攝取。APC將抗原加工處理后，通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子呈遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。MVA還能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。研究發(fā)現(xiàn)，用MVA免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)可檢測到高水平的特異性抗體，這些抗體能夠與MVA表面的抗原或表達(dá)的外源抗原結(jié)合，發(fā)揮中和病毒、清除病原體等作用。MVA誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)也十分顯著，能夠激活CD4+和CD8+T細(xì)胞，使其增殖并分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子在抗病毒感染、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。2.2.2MVA作為病毒載體的優(yōu)勢MVA作為一種病毒載體，在疫苗研發(fā)和基因治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢，尤其是在安全性、免疫原性及抗原遞呈等方面表現(xiàn)突出。安全性是MVA作為病毒載體的一大顯著優(yōu)勢。由于MVA經(jīng)過多次傳代致弱，其在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制能力受限，毒力大幅降低。在過去的應(yīng)用中，MVA表現(xiàn)出良好的安全性記錄。例如，在早期的臨床試驗中，將MVA用于人類接種，結(jié)果顯示MVA幾乎不會引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，僅有輕微的局部反應(yīng)，如注射部位的紅腫、疼痛等，且這些反應(yīng)通常在短時間內(nèi)即可自行緩解。MVA缺失了多個與毒力和宿主范圍相關(guān)的基因，這使得它在進(jìn)入機體后，難以對宿主細(xì)胞造成嚴(yán)重的損害，極大地降低了疫苗接種后的風(fēng)險。在一些免疫功能低下的人群中，使用MVA載體疫苗也具有較高的安全性，不會因機體免疫功能的缺陷而導(dǎo)致病毒的過度增殖和發(fā)病。MVA具有良好的免疫原性。盡管MVA在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制受限，但它仍能夠有效地激活機體的免疫系統(tǒng)。MVA進(jìn)入機體后，能夠被抗原遞呈細(xì)胞（APC）迅速識別和攝取。APC將MVA攜帶的抗原信息進(jìn)行加工處理，并通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子呈遞給T細(xì)胞，從而激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究表明，用MVA免疫動物后，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性T細(xì)胞，這些T細(xì)胞具有強大的殺傷活性，能夠識別并清除被病毒感染的細(xì)胞。MVA還能夠刺激B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。例如，在針對流感病毒的MVA載體疫苗研究中，用表達(dá)流感病毒抗原的MVA免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)可檢測到高水平的流感病毒特異性抗體，這些抗體能夠中和流感病毒，有效保護(hù)小鼠免受流感病毒的攻擊。MVA誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有持久性，一次免疫后，機體能夠在較長時間內(nèi)維持較高水平的免疫記憶，當(dāng)再次接觸相同或相似的病原體時，能夠迅速啟動免疫反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)作用。在抗原遞呈方面，MVA也具有獨特的優(yōu)勢。MVA的病毒粒子結(jié)構(gòu)和感染特性使其能夠高效地將攜帶的外源抗原遞呈給機體的免疫系統(tǒng)。MVA進(jìn)入APC后，能夠利用自身的基因表達(dá)機制，高效表達(dá)外源抗原。MVA自身的啟動子和調(diào)控元件能夠驅(qū)動外源基因的穩(wěn)定表達(dá)，使得APC能夠持續(xù)地將外源抗原加工處理并呈遞給T細(xì)胞。MVA感染APC后，能夠激活A(yù)PC的成熟和活化信號通路，增強APC的抗原遞呈能力。例如，MVA感染樹突狀細(xì)胞（DC）后，能夠上調(diào)DC表面的共刺激分子如CD80、CD86的表達(dá)，這些共刺激分子與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，能夠提供額外的激活信號，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。MVA還能夠誘導(dǎo)APC分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-12（IL-12）、CC趨化因子配體2（CCL2）等，這些細(xì)胞因子和趨化因子能夠招募和激活其他免疫細(xì)胞，進(jìn)一步增強免疫應(yīng)答的強度和廣度。2.3表位與多表位疫苗2.3.1表位的概念與分類表位，又稱抗原決定基（antigenicdeterminant），是存在于抗原分子表面決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。它是抗原與T細(xì)胞抗原受體（TCR）、B細(xì)胞抗原受體（BCR）或抗體特異性結(jié)合的基本結(jié)構(gòu)單位，在免疫應(yīng)答過程中起著核心作用。表位的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)決定了抗原的免疫原性和免疫特異性，不同的表位能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生不同類型的免疫反應(yīng)。根據(jù)與免疫細(xì)胞相互作用的方式和所激活的免疫應(yīng)答類型，表位主要分為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。T細(xì)胞表位是指能夠被T細(xì)胞識別的抗原表位。T細(xì)胞不能直接識別天然抗原，必須先由抗原遞呈細(xì)胞（APC）將抗原攝取、加工處理成抗原肽，并與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成抗原肽-MHC復(fù)合物，然后呈遞給T細(xì)胞，T細(xì)胞才能識別。T細(xì)胞表位通常由8-25個氨基酸殘基組成，可分為兩類：MHCⅠ類分子限制性T細(xì)胞表位和MHCⅡ類分子限制性T細(xì)胞表位。MHCⅠ類分子限制性T細(xì)胞表位主要被CD8+T細(xì)胞識別，這類表位一般由8-10個氨基酸殘基組成，多為內(nèi)源性抗原在細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶體降解后產(chǎn)生的抗原肽，如病毒感染細(xì)胞后，病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)被降解產(chǎn)生的抗原肽。MHCⅡ類分子限制性T細(xì)胞表位主要被CD4+T細(xì)胞識別，通常由13-25個氨基酸殘基組成，多為外源性抗原被APC攝取后，在溶酶體等細(xì)胞器內(nèi)降解產(chǎn)生的抗原肽，如細(xì)菌等病原體被吞噬細(xì)胞吞噬后，在細(xì)胞內(nèi)被降解產(chǎn)生的抗原肽。T細(xì)胞表位主要通過激活T細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，在抗病毒、抗腫瘤以及對細(xì)胞內(nèi)寄生菌的免疫防御中發(fā)揮重要作用。例如，在病毒感染過程中，被病毒感染的細(xì)胞表面會表達(dá)病毒抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物，CD8+T細(xì)胞識別該復(fù)合物后，被激活并增殖分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），CTL能夠特異性地殺傷被病毒感染的細(xì)胞，從而清除病毒感染。B細(xì)胞表位是指能夠被B細(xì)胞直接識別的抗原表位。B細(xì)胞可以直接識別天然抗原表面的表位，無需抗原遞呈細(xì)胞的加工處理。B細(xì)胞表位可分為線性表位和構(gòu)象表位。線性表位由連續(xù)排列的氨基酸殘基組成，其氨基酸序列是決定表位特異性的關(guān)鍵因素。構(gòu)象表位則是由不連續(xù)的氨基酸殘基通過蛋白質(zhì)的折疊形成特定的空間構(gòu)象而構(gòu)成，其空間結(jié)構(gòu)對表位的特異性起關(guān)鍵作用。B細(xì)胞表位一般由5-15個氨基酸殘基或5-7個單糖殘基、核苷酸殘基組成。B細(xì)胞識別B細(xì)胞表位后，在T細(xì)胞的輔助下活化、增殖分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌抗體。抗體能夠與抗原表位特異性結(jié)合，通過中和作用、凝集作用、調(diào)理作用等方式清除抗原，發(fā)揮體液免疫的效應(yīng)。例如，在細(xì)菌感染時，B細(xì)胞識別細(xì)菌表面的抗原表位后產(chǎn)生抗體，抗體與細(xì)菌結(jié)合，可阻止細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞，促進(jìn)吞噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬和清除。2.3.2多表位疫苗的設(shè)計原理多表位疫苗是一種新型的疫苗設(shè)計理念，它通過將多個不同的表位進(jìn)行合理組合，構(gòu)建成一個包含多種免疫信息的疫苗分子。這種設(shè)計旨在克服傳統(tǒng)疫苗的一些局限性，如免疫原性不足、不能有效應(yīng)對病原體的變異等問題，從而增強疫苗的免疫效果，激發(fā)更全面、更強大的免疫應(yīng)答。多表位疫苗的設(shè)計基于對病原體抗原表位的深入研究和篩選。首先，需要對目標(biāo)病原體的抗原進(jìn)行全面分析，通過生物信息學(xué)、免疫學(xué)等技術(shù)手段，確定其具有免疫原性的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。對于病毒抗原，如乙型腦炎病毒的E蛋白，需要分析其氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)，找出能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的B細(xì)胞表位，以及能夠激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答的T細(xì)胞表位。在篩選表位時，要考慮表位的保守性、免疫原性和MHC限制性等因素。保守性高的表位在不同毒株間序列差異小，能夠提供更廣泛的免疫保護(hù)；免疫原性強的表位能夠更有效地激發(fā)機體的免疫反應(yīng)；選擇不同MHC限制性的表位，可以使疫苗適應(yīng)不同遺傳背景的人群，提高疫苗的適用性。將篩選得到的多個表位進(jìn)行合理的排列和組合是多表位疫苗設(shè)計的關(guān)鍵步驟。表位的排列順序和連接方式會影響疫苗的免疫效果。一般來說，T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位需要按照一定的順序進(jìn)行串聯(lián)，以確保它們能夠在體內(nèi)被免疫系統(tǒng)有效地識別和處理。例如，可以將T細(xì)胞表位置于B細(xì)胞表位的兩側(cè)，或者將不同類型的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位交替排列。連接肽的選擇也很重要，連接肽要具有柔韌性，能夠保證各個表位在空間上的獨立性，不影響它們與免疫細(xì)胞受體的結(jié)合。連接肽還不能具有免疫原性，以免干擾疫苗對目標(biāo)表位的免疫應(yīng)答。多表位疫苗能夠同時激活機體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。當(dāng)多表位疫苗進(jìn)入機體后，其中的T細(xì)胞表位被抗原遞呈細(xì)胞攝取、加工處理，并與MHC分子結(jié)合，呈遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。CD4+T細(xì)胞被激活后，能夠分泌細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞活化、增殖分化，同時也能增強CD8+T細(xì)胞的活性。CD8+T細(xì)胞被激活后，分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，能夠特異性地殺傷被病原體感染的細(xì)胞。多表位疫苗中的B細(xì)胞表位能夠直接被B細(xì)胞識別，激活B細(xì)胞，使其增殖分化為漿細(xì)胞，分泌抗體。這些抗體可以中和病原體，阻止其感染宿主細(xì)胞，還可以通過調(diào)理作用、補體激活等方式增強機體對病原體的清除能力。通過同時激活細(xì)胞免疫和體液免疫，多表位疫苗能夠提供更全面、更持久的免疫保護(hù)。例如，在針對腫瘤的多表位疫苗研究中，疫苗中的T細(xì)胞表位可以激活機體的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答，殺傷腫瘤細(xì)胞；B細(xì)胞表位可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗腫瘤抗體，通過抗體依賴的細(xì)胞毒作用（ADCC）等機制殺傷腫瘤細(xì)胞，兩者協(xié)同作用，提高對腫瘤的治療效果。多表位疫苗還具有應(yīng)對病原體變異的優(yōu)勢。由于病原體的抗原容易發(fā)生變異，傳統(tǒng)疫苗可能因為抗原變異而失去免疫保護(hù)效果。多表位疫苗包含多個表位，即使部分表位發(fā)生變異，其他未變異的表位仍能激發(fā)免疫應(yīng)答，提供一定程度的免疫保護(hù)。例如，在流感病毒的多表位疫苗研究中，流感病毒的抗原經(jīng)常發(fā)生變異，但多表位疫苗中的多個保守表位可以針對不同變異株提供交叉保護(hù)，降低流感病毒變異對疫苗效果的影響。三、rMVA-mep的構(gòu)建3.1材料準(zhǔn)備3.1.1實驗所需質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞實驗選用的質(zhì)粒包括pMD18-TSimpleVector，購自TaKaRa公司，它是一種常用的克隆載體，具有操作簡便、克隆效率高等特點，常用于PCR產(chǎn)物的克隆。其多克隆位點兩側(cè)帶有T7和SP6啟動子，便于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和測序分析。本研究中，將目的基因多表位基因（mep）克隆至該載體，用于后續(xù)的測序鑒定和基因操作。痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L由本實驗室保存。該載體是以pGEM系列載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，引入了痘苗病毒的K1L基因相關(guān)序列。K1L基因在痘苗病毒的宿主范圍和毒力等方面具有重要作用，通過對其進(jìn)行改造和利用，可實現(xiàn)外源基因在痘苗病毒中的穩(wěn)定整合和表達(dá)。pGEM-K1L載體含有多個限制性內(nèi)切酶酶切位點，方便外源基因的插入，同時還攜帶氨芐青霉素抗性基因，用于在大腸桿菌中的篩選。實驗使用的菌株為大腸桿菌DH5α，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DH5α是一種常用于分子克隆的感受態(tài)細(xì)胞，具有生長迅速、轉(zhuǎn)化效率高的特點。其基因型為F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rK-，mK+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1，這些基因特性使得它對多種抗生素敏感，便于后續(xù)的篩選和操作。在實驗中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用其高效的轉(zhuǎn)化能力，實現(xiàn)質(zhì)粒的擴(kuò)增和保存。選用的細(xì)胞系包括RK-13細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞。RK-13細(xì)胞是兔腎細(xì)胞系，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞對痘苗病毒具有較高的敏感性，能夠支持痘苗病毒的復(fù)制和增殖。在重組痘苗病毒的構(gòu)建過程中，將野生型MVA與攜帶目的基因的轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞，利用細(xì)胞內(nèi)的同源重組機制，實現(xiàn)目的基因在痘苗病毒基因組中的整合。BHK-21細(xì)胞是幼倉鼠腎細(xì)胞系，同樣購自CCTCC。BHK-21細(xì)胞具有生長迅速、易于培養(yǎng)的特點，在重組痘苗病毒的篩選和純化過程中發(fā)揮重要作用。通過在BHK-21細(xì)胞上進(jìn)行多次蝕斑純化，可獲得高純度的重組痘苗病毒rMVA-mep。3.1.2主要試劑與儀器設(shè)備主要試劑包括各種限制性內(nèi)切酶，如BamHI、HindIII等，購自NEB公司。這些限制性內(nèi)切酶能夠識別特定的DNA序列，并在相應(yīng)位點進(jìn)行切割，用于質(zhì)粒的酶切和目的基因的獲取。在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，利用BamHI和HindIII對pMD18-TSimpleVector和含有目的基因的DNA片段進(jìn)行雙酶切，使兩者產(chǎn)生互補的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶購自TaKaRa公司，它能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，實現(xiàn)DNA片段的連接。在連接反應(yīng)體系中，T4DNA連接酶將酶切后的載體和目的基因片段連接起來，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。DNAMarker用于判斷DNA片段的大小，實驗中使用的DL2000DNAMarker購自TaKaRa公司。在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時，將DNAMarker與樣品一起上樣，通過對比Marker條帶的位置和亮度，可準(zhǔn)確判斷樣品中DNA片段的大小，從而對PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物等進(jìn)行鑒定。質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒分別購自O(shè)MEGA公司和Qiagen公司。質(zhì)粒提取試劑盒用于從大腸桿菌中提取質(zhì)粒，其原理是利用堿裂解法裂解細(xì)菌細(xì)胞，然后通過一系列的吸附、洗滌和洗脫步驟，獲得高純度的質(zhì)粒DNA。DNA凝膠回收試劑盒則用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，通過凝膠溶解、吸附柱吸附、洗滌和洗脫等操作，可將特定大小的DNA片段從凝膠中分離出來，用于后續(xù)的基因操作。細(xì)胞培養(yǎng)所需的試劑包括DMEM培養(yǎng)基（高糖）、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗等，均購自Gibco公司。DMEM培養(yǎng)基為細(xì)胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，高糖配方適合多種細(xì)胞的生長。胎牛血清含有豐富的生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長。青霉素-鏈霉素雙抗用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。實驗用到的主要儀器設(shè)備有PCR儀（Bio-Rad公司），用于目的基因的擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)中，通過設(shè)置不同的溫度循環(huán)，實現(xiàn)DNA模板的變性、引物退火和DNA聚合酶延伸等過程，從而大量擴(kuò)增目的基因。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）用于觀察和分析瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶。它能夠?qū)δz進(jìn)行拍照，并通過軟件分析條帶的亮度、位置等信息，幫助判斷PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物等的質(zhì)量和大小。高速離心機（Eppendorf公司）用于細(xì)胞和質(zhì)粒的離心分離。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過離心可收集細(xì)胞沉淀，用于后續(xù)的實驗操作；在質(zhì)粒提取過程中，離心可使細(xì)菌沉淀與上清液分離，便于后續(xù)的裂解和質(zhì)粒提取。二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisher公司）為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和二氧化碳濃度環(huán)境。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中生長，二氧化碳可維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞的正常生長和代謝。恒溫?fù)u床用于大腸桿菌的培養(yǎng)和擴(kuò)增。在搖床中，大腸桿菌能夠在適宜的溫度和振蕩條件下快速生長，實現(xiàn)質(zhì)粒的大量擴(kuò)增。超凈工作臺用于提供無菌的操作環(huán)境，防止實驗過程中的微生物污染。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化等操作時，均需在超凈工作臺中進(jìn)行，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2構(gòu)建過程3.2.1目的基因的獲取與克隆根據(jù)已公布的乙型腦炎病毒（JEV）E蛋白基因序列，利用生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行深入分析，結(jié)合T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的預(yù)測算法，篩選出多個具有良好免疫原性的表位。這些表位涵蓋了不同類型的免疫表位，包括能夠誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的B細(xì)胞表位，以及激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答的T細(xì)胞表位，如Th1表位、Th2表位和CTL表位。將篩選得到的表位按照特定的順序進(jìn)行串聯(lián)，設(shè)計合成JEVE蛋白多表位基因mep。在設(shè)計過程中，充分考慮表位之間的連接方式，選擇合適的連接肽，以確保各個表位在空間結(jié)構(gòu)上能夠保持相對獨立，不影響其與免疫細(xì)胞受體的結(jié)合，同時又能保證整個多表位基因的穩(wěn)定性和表達(dá)效率。以含有mep基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)mep基因的序列特點，設(shè)計特異性引物，引物的5'端分別引入BamHI和HindIII酶切位點，以便后續(xù)的基因克隆操作。PCR反應(yīng)體系包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。通過PCR擴(kuò)增，獲得大量的mep基因片段。將擴(kuò)增得到的mep基因片段與pMD18-TSimpleVector進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系包括mep基因片段、pMD18-TSimpleVector、T4DNA連接酶和連接緩沖液，在16℃條件下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化過程如下：從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴解凍；將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后將細(xì)胞置于42℃水浴中熱激90s，迅速冰浴冷卻5min；加入無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞恢復(fù)生長。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。采用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組克隆載體pMD18-mep。提取過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，通過堿裂解法裂解細(xì)菌細(xì)胞，然后經(jīng)過一系列的吸附、洗滌和洗脫步驟，獲得高純度的質(zhì)粒DNA。對提取的重組克隆載體pMD18-mep進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系包括pMD18-mep質(zhì)粒、BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶、酶切緩沖液，37℃酶切2-3h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察是否出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的mep基因片段，從而初步判斷重組克隆載體的構(gòu)建是否成功。將酶切鑒定正確的重組克隆載體送往測序公司進(jìn)行測序，通過與原始mep基因序列進(jìn)行比對，進(jìn)一步驗證mep基因的準(zhǔn)確性和完整性。3.2.2痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建將重組克隆載體pMD18-mep和痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切。酶切體系同上述酶切鑒定體系，37℃酶切2-3h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用DNA凝膠回收試劑盒分別回收mep基因片段和線性化的pGEM-K1L載體片段。回收過程按照試劑盒說明書進(jìn)行，通過凝膠溶解、吸附柱吸附、洗滌和洗脫等步驟，獲得高純度的目的DNA片段。將回收的mep基因片段與線性化的pGEM-K1L載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系包含mep基因片段、線性化的pGEM-K1L載體、T4DNA連接酶和連接緩沖液，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法同前。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L-mep，同樣采用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行操作。對重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L-mep進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系和條件與上述一致。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的mep基因片段和載體片段，則表明重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。對酶切鑒定正確的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L-mep進(jìn)行測序驗證，確保mep基因準(zhǔn)確無誤地插入到痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體中。3.2.3重組痘苗病毒的獲得與篩選將RK-13細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入適量的DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗），置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%-90%融合時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L-mep與野生型痘苗病毒安卡拉株（MVA）共轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體步驟如下：將適量的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L-mep和野生型MVA分別與脂質(zhì)體試劑按照一定比例混合，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育20min，使脂質(zhì)體與DNA充分結(jié)合，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。將孵育好的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物加入到RK-13細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞內(nèi)，重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-K1L-mep與野生型MVA的基因組通過同源重組機制發(fā)生重組，使mep基因整合到MVA的基因組中。轉(zhuǎn)染48-72h后，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，如細(xì)胞變圓、脫落等，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為含有重組痘苗病毒rMVA-mep的粗提液。將BHK-21細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至80%-90%融合。將含有重組痘苗病毒rMVA-mep的粗提液接種到BHK-21細(xì)胞上，進(jìn)行蝕斑純化。具體操作如下：將粗提液進(jìn)行10倍系列稀釋，取不同稀釋度的病毒液加入到BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每個稀釋度設(shè)置3個復(fù)孔，37℃吸附1-2h，期間每隔15-30min輕輕晃動培養(yǎng)板，使病毒液均勻分布。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，每孔加入適量的含2%低熔點瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基（含2%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗），待瓊脂糖凝固后，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3-5天后，觀察蝕斑形成情況。用移液器挑取單個蝕斑，加入適量的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打使蝕斑中的病毒釋放出來。將含有病毒的培養(yǎng)液接種到新的BHK-21細(xì)胞上，再次進(jìn)行蝕斑純化，如此重復(fù)3-4次，直至獲得純化的重組痘苗病毒rMVA-mep。對純化后的重組痘苗病毒rMVA-mep進(jìn)行鑒定，采用PCR和Westernblot等方法。PCR鑒定時，設(shè)計特異性引物擴(kuò)增mep基因，若能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的條帶，則表明mep基因已整合到MVA基因組中。Westernblot鑒定時，將重組痘苗病毒感染細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用抗JEVE蛋白的特異性抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)。通過化學(xué)發(fā)光法檢測，若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明重組痘苗病毒能夠表達(dá)JEVE蛋白多表位抗原。3.3病毒重組與表達(dá)鑒定3.3.1PCR鑒定為了驗證重組痘苗病毒rMVA-mep中mep基因的成功整合，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。根據(jù)mep基因的序列信息，設(shè)計特異性引物，引物的設(shè)計需確保其能夠特異性地擴(kuò)增mep基因片段，同時避免與痘苗病毒MVA的其他基因序列發(fā)生非特異性結(jié)合。引物的5'端和3'端分別與mep基因的兩端序列互補，且引物的長度、GC含量等參數(shù)經(jīng)過優(yōu)化，以保證PCR擴(kuò)增的特異性和效率。以重組痘苗病毒rMVA-mep的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系的組成至關(guān)重要，它直接影響擴(kuò)增的效果。反應(yīng)體系中包含適量的模板DNA，模板DNA的量需經(jīng)過優(yōu)化，過多或過少都可能影響擴(kuò)增結(jié)果。若模板DNA量過多，可能會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；若量過少，則可能無法獲得足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物。還需加入上下游引物，引物的濃度需精確控制，以保證其能夠與模板DNA充分結(jié)合，啟動擴(kuò)增反應(yīng)。dNTPs為PCR反應(yīng)提供合成DNA所需的原料，其濃度也需嚴(yán)格控制，確保各種dNTPs的比例合適，以保證DNA合成的準(zhǔn)確性。TaqDNA聚合酶是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵酶，它能夠催化DNA的合成，其活性和用量對擴(kuò)增結(jié)果有重要影響。此外，還需加入PCR緩沖液，PCR緩沖液為反應(yīng)提供適宜的pH值和離子強度，維持酶的活性和反應(yīng)的穩(wěn)定性。PCR反應(yīng)條件的設(shè)置也經(jīng)過了反復(fù)優(yōu)化。首先進(jìn)行95℃預(yù)變性5min，預(yù)變性的目的是使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)做好準(zhǔn)備。然后進(jìn)入循環(huán)階段，95℃變性30s，使DNA雙鏈解鏈；55℃退火30s，引物與模板DNA互補結(jié)合；72℃延伸30s，TaqDNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下，以dNTPs為原料，合成新的DNA鏈。共進(jìn)行30個循環(huán)，通過多次循環(huán)，使mep基因片段得到大量擴(kuò)增。最后72℃延伸10min，確保所有的擴(kuò)增產(chǎn)物都能夠充分延伸，形成完整的DNA片段。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。瓊脂糖凝膠的濃度根據(jù)mep基因片段的大小進(jìn)行選擇，一般選擇1%-2%的瓊脂糖凝膠，以保證DNA片段在凝膠中能夠得到良好的分離。電泳緩沖液采用TAE或TBE緩沖液，緩沖液的pH值和離子強度對DNA的遷移率有重要影響。在電泳過程中，將DNAMarker同時上樣，DNAMarker包含已知大小的DNA片段，通過與DNAMarker的條帶進(jìn)行對比，可以準(zhǔn)確判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。如果在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，且條帶清晰、明亮，則表明mep基因已成功整合到痘苗病毒MVA的基因組中。若未出現(xiàn)預(yù)期條帶，可能是由于引物設(shè)計不合理、PCR反應(yīng)條件不合適、模板DNA質(zhì)量不佳等原因?qū)е拢枰獙嶒灄l件進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。通過PCR鑒定，可以初步確定重組痘苗病毒rMVA-mep的構(gòu)建是否成功，為后續(xù)的研究提供重要的依據(jù)。3.3.2Westernblot鑒定為了進(jìn)一步驗證重組痘苗病毒rMVA-mep是否能夠表達(dá)JEVE蛋白多表位抗原，采用Westernblot技術(shù)進(jìn)行檢測。將重組痘苗病毒rMVA-mep感染BHK-21細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（MOI）設(shè)置為一定比例，如MOI=5，以確保細(xì)胞能夠被有效感染。感染后，將細(xì)胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間根據(jù)病毒的生長特性和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行優(yōu)化，一般培養(yǎng)48-72h。在培養(yǎng)過程中，病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和基因表達(dá)，產(chǎn)生JEVE蛋白多表位抗原。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解液的選擇至關(guān)重要，需根據(jù)細(xì)胞類型和目的蛋白的特性進(jìn)行選擇。常用的細(xì)胞裂解液如RIPA裂解液，能夠有效裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。在裂解過程中，需加入蛋白酶抑制劑，以防止蛋白質(zhì)被降解。蛋白酶抑制劑能夠抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的活性，保護(hù)目的蛋白的完整性。將裂解后的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心處理，離心條件為12000rpm，4℃，離心15min。離心的目的是去除細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)，獲得澄清的細(xì)胞裂解上清液，其中包含了細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)。采用BCA法測定細(xì)胞裂解上清液中蛋白質(zhì)的濃度。BCA法是一種常用的蛋白質(zhì)定量方法，其原理是利用蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下與Cu2?結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-Cu2?復(fù)合物，該復(fù)合物能夠?qū)CA試劑中的二價銅離子還原為一價銅離子，一價銅離子與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。通過測定紫色絡(luò)合物在562nm處的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，即可準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)的濃度。將定量后的蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，上樣緩沖液中含有SDS、β-巰基乙醇等成分。SDS能夠使蛋白質(zhì)變性，使其帶上負(fù)電荷，并且消除蛋白質(zhì)分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，使蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）中的遷移率僅與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。β-巰基乙醇能夠還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)的變性。將混合后的樣品在100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)充分變性。進(jìn)行SDS電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適的分離膠濃度。一般來說，對于分子量較小的蛋白質(zhì)，選擇12%-15%的分離膠；對于分子量較大的蛋白質(zhì)，選擇8%-10%的分離膠。電泳過程中，采用恒壓或恒流的方式進(jìn)行，電壓或電流的設(shè)置需根據(jù)凝膠的大小和厚度進(jìn)行調(diào)整，以保證蛋白質(zhì)能夠在凝膠中得到良好的分離。在電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移方法采用半干轉(zhuǎn)或濕轉(zhuǎn)。半干轉(zhuǎn)速度較快，但轉(zhuǎn)移效率相對較低；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移效率高，但時間較長。在轉(zhuǎn)移過程中，需注意保持膜與凝膠的緊密接觸，避免出現(xiàn)氣泡，影響轉(zhuǎn)移效果。將轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉，封閉的目的是防止非特異性結(jié)合。脫脂牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)，能夠占據(jù)PVDF膜上的非特異性結(jié)合位點，減少后續(xù)檢測過程中的背景信號。封閉條件為室溫振蕩孵育1-2h，或4℃過夜孵育。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次洗滌5min，以去除未結(jié)合的脫脂牛奶。加入抗JEVE蛋白的特異性抗體作為一抗，一抗的稀釋度根據(jù)抗體的說明書進(jìn)行優(yōu)化，一般為1:1000-1:5000。在4℃條件下孵育過夜，使一抗與PVDF膜上的JEVE蛋白多表位抗原特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次洗滌10min，以去除未結(jié)合的一抗。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，二抗的稀釋度一般為1:5000-1:10000。在室溫下振蕩孵育1-2h，使二抗與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次洗滌10min，以去除未結(jié)合的二抗。采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。將化學(xué)發(fā)光底物均勻地滴加到PVDF膜上，底物與HRP反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。通過凝膠成像系統(tǒng)對化學(xué)發(fā)光信號進(jìn)行采集和分析，若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，且條帶清晰、明亮，則表明重組痘苗病毒rMVA-mep能夠表達(dá)JEVE蛋白多表位抗原。若未出現(xiàn)預(yù)期條帶，可能是由于抗體特異性不佳、抗原表達(dá)量過低、實驗操作不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е拢枰獙嶒灄l件進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。通過Westernblot鑒定，可以明確重組痘苗病毒rMVA-mep中目的蛋白的表達(dá)情況，為后續(xù)的免疫效果評價提供有力的證據(jù)。四、rMVA-mep免疫效果評價實驗設(shè)計4.1實驗動物與分組4.1.1實驗動物選擇本研究選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為實驗動物，體重范圍在18-22g。BALB/c小鼠是一種廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域研究的近交系小鼠，具有獨特的生物學(xué)特性，使其成為本研究中評估rMVA-mep免疫效果的理想選擇。從遺傳背景來看，BALB/c小鼠基因高度純合，這一特性使得同批次小鼠個體之間的遺傳差異極小，在實驗過程中能夠有效減少因遺傳因素導(dǎo)致的個體差異對實驗結(jié)果的干擾。基因的高度純合保證了小鼠對相同刺激的反應(yīng)具有較高的一致性，使得實驗結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，便于進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和結(jié)果的準(zhǔn)確解讀。在疫苗免疫效果研究中，遺傳背景的一致性能夠使不同實驗組之間的差異更清晰地反映出疫苗的作用效果，避免了遺傳因素對疫苗免疫應(yīng)答的影響，從而提高實驗的準(zhǔn)確性和可信度。在免疫特性方面，BALB/c小鼠對多種抗原能夠產(chǎn)生強烈且穩(wěn)定的免疫應(yīng)答。當(dāng)受到抗原刺激時，其免疫系統(tǒng)能夠迅速識別抗原，并啟動特異性免疫反應(yīng)。在接種疫苗后，BALB/c小鼠的B細(xì)胞能夠快速分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量特異性抗體，同時T細(xì)胞也能被有效激活，引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。這種對疫苗抗原良好的免疫反應(yīng)性，使得BALB/c小鼠能夠更有效地模擬人體對疫苗的免疫反應(yīng)過程，為評估rMVA-mep的免疫效果提供了可靠的實驗?zāi)Ｐ汀＠纾谝酝难芯恐校褂肂ALB/c小鼠進(jìn)行流感疫苗的免疫實驗，小鼠在接種疫苗后，體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的流感病毒特異性抗體，且T細(xì)胞的活性也顯著增強，有效抵抗了流感病毒的攻擊，充分證明了BALB/c小鼠在疫苗免疫研究中的有效性。BALB/c小鼠的繁殖能力較強，易于飼養(yǎng)和管理。其繁殖周期短，產(chǎn)仔數(shù)量較多，能夠保證實驗所需小鼠的充足供應(yīng)。在飼養(yǎng)過程中，BALB/c小鼠對環(huán)境條件的要求相對較為常規(guī)，在適宜的溫度、濕度和光照條件下，以及提供常規(guī)的飼料和清潔的飲用水，即可維持其良好的生長狀態(tài)。這使得在大規(guī)模實驗中，能夠方便地進(jìn)行小鼠的飼養(yǎng)和管理，降低實驗成本，提高實驗效率。在本研究中，選擇BALB/c小鼠能夠確保在實驗周期內(nèi)，隨時獲取足夠數(shù)量的健康小鼠，滿足不同實驗階段的需求，保障實驗的順利進(jìn)行。4.1.2分組方式與目的將選取的BALB/c小鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為3組，每組10只小鼠。分組情況及每組設(shè)置的目的如下：rMVA-mep免疫組：該組小鼠接種重組痘苗病毒安卡拉株rMVA-mep，接種劑量為1×10?PFU/只，接種途徑為肌肉注射。設(shè)置該組的目的是評估rMVA-mep在小鼠體內(nèi)的免疫原性和免疫保護(hù)效果。通過接種rMVA-mep，觀察小鼠體內(nèi)針對乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原的免疫應(yīng)答情況，包括體液免疫應(yīng)答，如抗體的產(chǎn)生水平、抗體亞型的分布等；以及細(xì)胞免疫應(yīng)答，如T淋巴細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞因子的分泌等。該組還用于檢測小鼠在接種rMVA-mep后，對致死量乙型腦炎病毒攻擊的抵抗能力，以評價rMVA-mep的免疫保護(hù)效果。野生型MVA免疫組：此組小鼠接種野生型痘苗病毒安卡拉株（MVA），接種劑量同樣為1×10?PFU/只，接種途徑也是肌肉注射。設(shè)置該組作為對照，主要目的是排除MVA載體本身對小鼠免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)效果的非特異性影響。野生型MVA不攜帶乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原，通過觀察該組小鼠的免疫反應(yīng)和對病毒攻擊的抵抗力，能夠明確rMVA-mep免疫組中觀察到的免疫效果是由乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原引起的，而不是MVA載體本身的作用。如果野生型MVA免疫組小鼠在接種后未產(chǎn)生針對乙型腦炎病毒的特異性免疫應(yīng)答，且在病毒攻擊后未表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，而rMVA-mep免疫組小鼠產(chǎn)生了特異性免疫應(yīng)答并具有保護(hù)作用，那么就可以有力地證明rMVA-mep的免疫效果是由其攜帶的乙型腦炎病毒E蛋白多表位抗原所導(dǎo)致的。PBS對照組：該組小鼠接種等量的無菌PBS溶液，接種途徑為肌肉注射。設(shè)置PBS對照組的目的是作為空白對照，用于評估小鼠在正常生理狀態(tài)下的免疫水平和對病毒攻擊的自然抵抗力。通過與rMVA-mep免疫組和野生型MVA免疫組進(jìn)行對比，可以更清晰地看出疫苗接種對小鼠免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)效果的影響。PBS對照組小鼠在接種后不接受任何具有免疫原性的物質(zhì)刺激，其體內(nèi)的免疫水平代表了小鼠的基礎(chǔ)免疫狀態(tài)。在病毒攻擊實驗中，PBS對照組小鼠的發(fā)病情況和死亡率可以作為參考指標(biāo)，用于判斷rMVA-mep免疫組和野生型MVA免疫組小鼠的免疫保護(hù)效果是否顯著優(yōu)于自然狀態(tài)。4.2免疫方案與攻毒實驗4.2.1免疫途徑與劑量在本研究中，對不同組小鼠進(jìn)行免疫時采用肌肉注射的接種途徑。肌肉注射是一種常用的疫苗接種方式，它具有操作相對簡便、疫苗吸收較快且能有效激發(fā)機體免疫反應(yīng)等優(yōu)點。通過肌肉注射，疫苗能夠迅速進(jìn)入肌肉組織，被肌肉中的抗原遞呈細(xì)胞攝取和處理，進(jìn)而激活免疫系統(tǒng)。肌肉組織中豐富的血管和淋巴管也有助于疫苗成分的擴(kuò)散和運輸，使其能夠更快地到達(dá)局部淋巴結(jié)等免疫器官，啟動免疫應(yīng)答。rMVA-mep免疫組和野生型MVA免疫組小鼠的接種劑量均設(shè)定為1×10?PFU/只。PFU（Plaque-FormingUnit）即蝕斑形成單位，是衡量病毒感染性的重要指標(biāo)。選擇這一劑量是基于前期的預(yù)實驗以及相關(guān)文獻(xiàn)的參考。前期預(yù)實驗中，對不同劑量的rMVA-mep和野生型MVA進(jìn)行了測試，觀察小鼠的免疫反應(yīng)和安全性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)劑量低于1×10?PFU/只時，小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答強度相對較弱，無法有效激發(fā)全面的免疫反應(yīng)。而當(dāng)劑量高于1×10?PFU/只時，雖然免疫應(yīng)答有所增強，但小鼠出現(xiàn)了一些不良反應(yīng)，如體重下降、精神萎靡等，影響了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和小鼠的健康。綜合考慮免疫效果和安全性，確定1×10?PFU/只為最佳接種劑量。相關(guān)文獻(xiàn)研究也表明，在類似的病毒載體疫苗研究中，這一劑量范圍能夠有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時保證疫苗的安全性。PBS對照組小鼠則接種等量的無菌PBS溶液，同樣采用肌肉注射的方式。設(shè)置PBS對照組的目的是作為空白對照，用于評估小鼠在正常生理狀態(tài)下的免疫水平和對病毒攻擊的自然抵抗力。通過與rMVA-mep免疫組和野生型MVA免疫組進(jìn)行對比，可以更清晰地看出疫苗接種對小鼠免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)效果的影響。PBS溶液不含有任何具有免疫原性的物質(zhì)，不會對小鼠的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激，其接種后的小鼠免疫狀態(tài)代表了小鼠的基礎(chǔ)免疫水平。在后續(xù)的實驗中，通過比較PBS對照組與其他兩組小鼠的免疫指標(biāo)和對病毒攻擊的反應(yīng)，能夠準(zhǔn)確判斷rMVA-mep的免疫效果是否顯著優(yōu)于自然狀態(tài)。4.2.2攻毒操作與觀察指標(biāo)在小鼠免疫后的第3周，對其進(jìn)行JEV攻毒實驗。選擇免疫后第3周進(jìn)行攻毒，是因為經(jīng)過前期的研究和預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，在這一時間段，小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答達(dá)到相對較高的水平。免疫后的前兩周，小鼠的免疫系統(tǒng)逐漸被激活，開始產(chǎn)生特異性抗體和激活T細(xì)胞，但免疫應(yīng)答尚未達(dá)到峰值。到第3周時，特異性抗體水平達(dá)到較高值，T細(xì)胞的活性也處于較強狀態(tài)，此時進(jìn)行攻毒能夠更好地評估疫苗的免疫保護(hù)效果。若攻毒時間過早，小鼠免疫應(yīng)答尚未充分激發(fā)，可能無法有效抵抗病毒攻擊，導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差；若攻毒時間過晚，小鼠的免疫應(yīng)答可能開始逐漸下降，也不利于準(zhǔn)確評估疫苗的長期保護(hù)效果。攻毒時，采用腹腔注射的方式，給每只小鼠注射10LD??（半數(shù)致死量）的JEV強毒株。腹腔注射是一種常用的病毒感染途徑，能夠使病毒迅速進(jìn)入小鼠體內(nèi)，分布到各個組織和器官。通過腹腔注射，病毒可以直接進(jìn)入腹腔，與腹腔內(nèi)的組織和器官接觸，如肝臟、脾臟等，這些器官是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，病毒與它們的接觸能夠快速引發(fā)免疫反應(yīng)。選擇10LD??的JEV強毒株，是為了確保在攻毒后能夠觀察到明顯的發(fā)病和死亡情況。若攻毒劑量過低，可能部分小鼠不會發(fā)病或死亡，無法準(zhǔn)確評估疫苗的保護(hù)效果；若攻毒劑量過高，小鼠可能會在短時間內(nèi)迅速死亡，無法觀察到完整的發(fā)病過程和免疫應(yīng)答變化。經(jīng)過前期的預(yù)實驗和參考相關(guān)研究，確定10LD??的劑量能夠在保證實驗可操作性的前提下，準(zhǔn)確評估rMVA-mep對小鼠的免疫保護(hù)效果。在攻毒后，對小鼠進(jìn)行為期14天的連續(xù)觀察。觀察期間，記錄小鼠的發(fā)病情況，包括是否出現(xiàn)發(fā)熱、精神萎靡、食欲不振、行動遲緩、抽搐等典型的乙腦癥狀。發(fā)熱是乙腦病毒感染的常見癥狀之一，病毒感染導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)激活，釋放炎癥介質(zhì)，引起體溫升高。精神萎靡和食欲不振是由于病毒感染影響了小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)功能，導(dǎo)致小鼠精神狀態(tài)不佳，食欲減退。行動遲緩是因為病毒對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，影響了小鼠的運動功能。抽搐則是乙腦病毒感染嚴(yán)重時，導(dǎo)致大腦神經(jīng)元異常放電，引起的肌肉痙攣現(xiàn)象。這些癥狀的出現(xiàn)和發(fā)展情況，能夠反映病毒在小鼠體內(nèi)的感染和致病過程，以及疫苗對小鼠的保護(hù)作用。每天定時記錄小鼠的體重變化。體重變化是評估小鼠健康狀況的重要指標(biāo)之一。在病毒感染后，由于小鼠的食欲減退、代謝紊亂以及身體的應(yīng)激反應(yīng)，體重通常會出現(xiàn)下降。通過監(jiān)測體重變化，可以了解小鼠的身體狀況和病情發(fā)展程度。如果疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果，小鼠的體重下降幅度可能較小，或者在感染后能夠較快恢復(fù)體重；而未接種疫苗或疫苗保護(hù)效果不佳的小鼠，體重可能會持續(xù)下降，甚至出現(xiàn)急劇下降的情況。詳細(xì)記錄小鼠的死亡情況，包括死亡時間和累計死亡數(shù)量。死亡時間能夠反映病毒感染的嚴(yán)重程度和疫苗的保護(hù)時效。如果疫苗能夠有效保護(hù)小鼠，小鼠的死亡時間可能會延遲，甚至不出現(xiàn)死亡；而未受保護(hù)的小鼠可能會在攻毒后的較短時間內(nèi)死亡。累計死亡數(shù)量則直接反映了疫苗的免疫保護(hù)效果，通過比較不同組小鼠的累計死亡數(shù)量，可以直觀地評估rMVA-mep對小鼠的保護(hù)作用。根據(jù)死亡情況，計算小鼠的存活率，存活率=（初始小鼠數(shù)量-死亡小鼠數(shù)量）/初始小鼠數(shù)量×100%。存活率是評估疫苗免疫保護(hù)效果的關(guān)鍵指標(biāo)之一，存活率越高，說明疫苗的保護(hù)效果越好。4.3檢測指標(biāo)與方法4.3.1體液免疫指標(biāo)檢測在免疫后的第1周、第2周和第3周，分別采集小鼠的血清樣本，用于檢測JEV特異性抗體水平和中和抗體滴度。采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測小鼠血清中JEV特異性抗體水平。首先，將純化的JEV抗原包被于96孔酶標(biāo)板中，每孔加入100μl抗原溶液，濃度為1μg/ml，4℃孵育過夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用含0.05%Tween-20的PBS（PBST）洗滌3次，每次3min，以去除未結(jié)合的抗原。然后，每孔加入200μl5%脫脂牛奶，37℃封閉1h，封閉的目的是防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，再次用PBST洗滌3次。將小鼠血清樣本進(jìn)行倍比稀釋，從1:100開始，依次稀釋為1:200、1:400、1:800等，每孔加入100μl稀釋后的血清，37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌3次。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，稀釋度為1:5000，每孔100μl，37℃孵育1h。最后，用PBST洗滌5次。每孔加入100μlTMB底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-20min，當(dāng)顏色變化明顯時，每孔加入50μl2MH?SO?終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以PBS對照組小鼠血清的OD值作為陰性對照，當(dāng)樣本的OD值大于陰性對照OD值的2.1倍時，判定為陽性。根據(jù)不同稀釋度血清的OD值，繪制抗體滴度曲線，從而確定小鼠血清中JEV特異性抗體的滴度。采用中和試驗檢測小鼠血清中的中和抗體滴度。將小鼠血清樣本進(jìn)行56℃、30min滅活處理，以去除血清中的補體等干擾物質(zhì)。將滅活后的血清進(jìn)行倍比稀釋，從1:10開始，依次稀釋為1:20、1:40、1:80等。取不同稀釋度的血清50μl，分別與等體積的含有100TCID??（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）的JEV病毒液混合，37℃孵育1h，使血清中的中和抗體與病毒充分結(jié)合。將混合液接種到BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μl，每個稀釋度設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置病毒對照孔（只加入病毒液，不加血清）和細(xì)胞對照孔（只加入細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加病毒和血清）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。當(dāng)病毒對照孔中的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，如細(xì)胞變圓、脫落等，而細(xì)胞對照孔中的細(xì)胞生長正常時，記錄各孔的CPE情況。中和抗體滴度以能夠保護(hù)50%細(xì)胞不出現(xiàn)CPE的血清最高稀釋度的倒數(shù)來表示。例如，當(dāng)1:80稀釋度的血清能夠保護(hù)50%細(xì)胞不出現(xiàn)CPE，而1:160稀釋度的血清不能保護(hù)50%細(xì)胞時，則該小鼠血清的中和抗體滴度為80。4.3.2細(xì)胞免疫指標(biāo)檢測在免疫后的第2周，處死部分小鼠，無菌取出脾臟，制備脾細(xì)胞懸液。采用MTT法檢測脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞的增殖活性。將脾細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10?個/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。同時設(shè)置陰性對照組（只加入脾細(xì)胞，不加刺激物）和陽性對照組（加入刀豆蛋白A，ConA，終濃度為5μg/ml）。實驗組分別加入不同濃度的JEV特異性抗原肽，終濃度分別為1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μl5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖率=（實驗組OD值-陰性對照組OD值）/陰性對照組OD值×100%。通過比較不同組的細(xì)胞增殖率，評估JEV特異性抗原肽對T淋巴細(xì)胞增殖的刺激作用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的水平。將脾細(xì)胞懸液按照上述方法接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入JEV特異性抗原肽進(jìn)行刺激，培養(yǎng)48h。收集培養(yǎng)上清液，按照細(xì)胞因子ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作。以小鼠干擾素-γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素-4（IL-4）為例，首先將抗小鼠IFN-γ或IL-4的捕獲抗體包被于96孔酶標(biāo)板中，4℃孵育過夜。次日，洗滌、封閉后，加入脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37℃孵育1h。洗滌后，加入生物素標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ或IL-4的檢測抗體，37℃孵育1h。再次洗滌后，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育30min。最后，加入TMB底物溶液顯色，終止反應(yīng)后，在450nm波長處測定OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-4的濃度。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，反映細(xì)胞免疫應(yīng)答的強度；IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，反映體液免疫應(yīng)答的強度。通過檢測這兩種細(xì)胞因子的水平，評估小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的平衡情況。五、rMVA-mep免疫效果評價實驗結(jié)果與分析5.1免疫小鼠的體液免疫應(yīng)答結(jié)果5.1.1特異性抗體水平變化通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對不同實驗組小鼠血清中JEV特異性抗體水平隨時間的變化進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出明顯的差異。在免疫后的第1周，rMVA-mep免疫組小鼠血清中JEV特異性抗體水平開始升高，雖然此時抗體水平相對較低，但已顯著高于PBS對照組（P<0.05）。這表明rMVA-mep能夠在免疫早期就刺激小鼠的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對JEV的特異性抗體。野生型MVA免疫組小鼠血清中的抗體水平與PBS對照組相比，無顯著差異（P>0.05），說明野生型MVA本身不會誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對JEV的特異性抗體。隨著時間的推移，在免疫后的第2周，rMVA-mep免疫組小鼠血清中JEV特異性抗體水平繼續(xù)上升，增長幅度較為明顯，與第1周相比有顯著差異（P<0.05）。此時，rMVA-mep免疫組的抗體水平已經(jīng)達(dá)到了一定的高度，顯示出rMVA-mep對小鼠體液免疫應(yīng)答的持續(xù)刺激作用。野生型MVA免疫組和PBS對照組小鼠血清中的抗體水平仍然維持在較低水平，且兩組之間無顯著差異（P>0.05）。到免疫后的第3周，rMVA-mep免疫組小鼠血清中JEV特異性抗體水平達(dá)到峰值，與第2周相比，雖然增長幅度有所減緩，但仍具有顯著差異（P<0.05）。這表明在免疫后的第3周，rMVA-mep誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答達(dá)到了相對穩(wěn)定且較強的狀態(tài)。野生型MVA免疫組和PBS對照組小鼠血清中的抗體水平依舊沒有明顯變化，與rMVA-mep免疫組相比，差異極顯著（P<0.01）。從抗體水平變化曲線的整體趨勢來看，rMVA-mep免疫組小鼠血清中JEV特異性抗體水平呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢，且在免疫后的第3周達(dá)到較高水平，這充分證明了rMVA-mep能夠有效地誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對JEV