miR396介導bHLH74調控擬南芥根發育的分子機制探究一、引言1.1研究背景植物的生長發育是一個復雜而有序的過程，受到多種基因和信號通路的精確調控。在植物的整個生命周期中，根系作為重要的營養吸收和固定器官，對植物的生長、發育和適應環境起著關鍵作用。根系的發育不僅影響植物對水分和養分的攝取，還與植物的抗逆性、產量等密切相關。因此，深入研究植物根系發育的分子機制，對于理解植物生長發育的基本規律、提高農作物產量和品質具有重要意義。擬南芥（Arabidopsisthaliana）作為一種模式植物，在植物科學研究中具有重要地位。擬南芥具有生長周期短、基因組小、易于轉化和遺傳操作等優點，使其成為研究植物生長發育、基因功能和信號轉導等方面的理想材料。通過對擬南芥的研究，科學家們已經揭示了許多植物生長發育的基本規律和分子機制，為其他植物的研究提供了重要的參考和借鑒。在根系發育研究領域，擬南芥同樣發揮著不可替代的作用。其根系結構相對簡單，包括主根、側根和根毛等部分，便于進行形態學和遺傳學分析。借助擬南芥，研究者能夠探究基因在根系發育各個階段的表達模式和功能，解析根系發育過程中的信號傳導途徑，從而為深入理解植物根系發育的分子調控機制奠定基礎。微小RNA（miRNA）是一類長度約為21-24個核苷酸的非編碼小RNA，在植物生長發育、逆境響應等過程中發揮著重要的調控作用。miR396作為植物中保守存在的miRNA家族之一，已被證明參與了植物生長發育的多個方面，包括葉片發育、花器官形成、果實發育等。在根系發育方面，已有研究表明miR396通過調控其靶基因的表達，影響擬南芥根系的生長和形態建成。然而，miR396在擬南芥根發育過程中的具體調控機制仍有待進一步深入研究。bHLH（basichelix-loop-helix）轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一，其家族成員在植物生長發育、次生代謝、環境脅迫應答等過程中發揮著重要的調控作用。bHLH轉錄因子通過與靶基因啟動子區域的特定順式作用元件結合，調控靶基因的轉錄表達，從而參與植物的各種生理過程。在擬南芥中，已有多個bHLH轉錄因子被報道參與根系發育的調控，如bHLH121、bHLH104等。這些bHLH轉錄因子通過與其他轉錄因子或信號分子相互作用，形成復雜的調控網絡，共同調節擬南芥根系的生長和發育。然而，bHLH74在擬南芥根發育中的功能及其與miR396的調控關系尚未見報道。本研究聚焦于miR396介導的bHLH74調控在擬南芥根發育中的功能。旨在通過遺傳學、分子生物學和生物化學等方法，深入探究miR396對bHLH74的調控機制，以及bHLH74在擬南芥根發育過程中的生物學功能。這不僅有助于揭示擬南芥根發育的分子調控網絡，豐富人們對植物生長發育基本規律的認識，還可能為農作物根系改良和品種選育提供新的理論依據和基因資源，具有重要的理論意義和潛在的應用價值。1.2miR396概述miR396作為植物中保守存在的miRNA家族之一，在植物的生長發育進程中扮演著不可或缺的角色。miR396屬于微小RNA，這類長度約21-24個核苷酸的非編碼小RNA，通過與靶mRNA互補配對，在轉錄后水平對基因表達進行精準調控。miR396的形成過程較為復雜，且高度有序。首先，在細胞核內，由具有特殊結構的MIR396基因轉錄產生初級轉錄本（pri-miR396），該轉錄本通常較長，包含多個莖環結構。隨后，在DCL1（Dicer-like1）核酸酶的作用下，pri-miR396被逐步切割加工，形成長度約為70-100個核苷酸的前體miRNA（pre-miR396），pre-miR396呈典型的發夾狀結構。接著，DCL1會進一步對pre-miR396進行切割，生成成熟的miR396雙鏈。雙鏈中的一條鏈會被選擇性地整合到AGO（Argonaute）蛋白家族形成RNA誘導沉默復合體（RISC），而另一條鏈則通常被降解。RISC中的miR396能夠憑借堿基互補配對原則，精準識別并結合靶mRNA，進而通過切割靶mRNA或者抑制其翻譯過程，實現對靶基因表達的調控。在植物中，miR396呈現出廣泛分布的特點，幾乎存在于植物的各個組織和器官中，包括根、莖、葉、花、果實等。但在不同組織和器官中的表達水平存在明顯差異，這種差異暗示著miR396在不同組織中可能行使著不同的生物學功能。比如在葉片發育過程中，miR396通過調控靶基因GRF（Growth-regulatingfactor）家族成員的表達，對葉片的大小、形狀以及細胞增殖和分化等過程發揮關鍵調控作用。在花器官形成過程中，miR396同樣參與其中，影響花器官的形態建成和發育進程。在擬南芥中，miR396家族包含多個成員，如miR396a、miR396b、miR396c等。這些家族成員的核苷酸序列高度相似，但又存在細微差異，正是這些差異使得它們在功能上既有重疊又有分化。通過對擬南芥中miR396家族成員的研究發現，它們各自具有獨特的表達模式和調控網絡。部分成員在根的特定發育時期高表達，可能參與根的形態建成和生長調控；而另一些成員則在地上部分組織中優勢表達，參與調控地上部分器官的發育和生理過程。這種復雜的家族成員構成和表達調控模式，使得miR396能夠在擬南芥的生長發育過程中，從多個層面、多個角度發揮精細的調控作用。1.3bHLH74轉錄因子bHLH74轉錄因子屬于bHLH轉錄因子家族的一員，其家族成員在植物生長發育進程中扮演著極為關鍵的角色。bHLH轉錄因子家族成員數量眾多，是植物中最大的轉錄因子家族之一。在擬南芥中，通過對基因組序列的深入分析，研究人員已成功鑒定出162個編碼bHLH的基因，這些基因依據系統發育關系被細致地劃分為21個亞家族。bHLH轉錄因子的結構具有顯著特征，其核心結構域大約由60個氨基酸構成，包含兩個功能各異的關鍵區域：基本區域（basicregion）和螺旋-環-螺旋（HLH，helix-loop-helix）區域?；緟^域位于bHLH結構域的N端，長度約為15個氨基酸，其中通常含有6個堿基殘基，這一區域主要承擔著與DNA結合的重要功能，能夠精準識別并結合靶基因啟動子區域的特定順式作用元件，如E-box（CANNTG）等，從而開啟或關閉基因的轉錄過程。HLH區域則位于bHLH結構域的C端，該區域含有兩個兩親性的α-螺旋，這兩個α-螺旋之間由一段長度可變的連接區（環）隔開，進而形成獨特的螺旋-環-螺旋結構。HLH區域的主要功能是作為二聚體化區域，同一個bHLH轉錄因子的兩個α-螺旋或者不同bHLH轉錄因子的α-螺旋之間能夠相互作用，形成同型二聚體或異型二聚體。這種二聚體化作用對于bHLH轉錄因子與靶基因啟動子的有效結合以及對基因轉錄的精確調控至關重要。不同類型的二聚體可能會結合到不同的DNA序列上，或者對基因轉錄產生不同的調控效果，使得bHLH轉錄因子能夠在復雜的生物學過程中發揮多樣化的調控功能。在擬南芥中，雖然目前關于bHLH74的研究相對較少，但已有的研究成果初步揭示了它在植物生長發育中的潛在作用。有研究表明，bHLH74可能參與了植物對某些環境信號的響應過程。在面對干旱、高鹽等非生物脅迫時，bHLH74的表達水平會發生顯著變化，暗示其可能在植物的抗逆調控網絡中扮演重要角色。當擬南芥遭受干旱脅迫時，bHLH74基因的表達量會迅速上升，推測其可能通過調控下游一系列與抗旱相關基因的表達，來增強植物對干旱環境的適應能力。也有研究發現bHLH74與植物激素信號傳導存在關聯。植物激素在植物生長發育的各個階段都發揮著關鍵的調控作用，bHLH74可能通過與激素信號途徑中的關鍵因子相互作用，影響激素信號的傳遞和響應，進而參與到植物的生長發育調控過程中。例如，在生長素信號傳導途徑中，bHLH74可能與生長素響應因子（ARFs）相互作用，調節生長素相關基因的表達，從而影響植物根系的生長和發育。然而，bHLH74在擬南芥根發育中的具體功能及作用機制，目前仍知之甚少，亟待進一步深入研究。1.4miR396與bHLH74的調控關系在植物的生長發育進程中，miR396與bHLH74之間存在著緊密且復雜的調控關系，這種調控關系在轉錄后水平上展開，對植物根系的正常發育起著關鍵作用。從分子機制層面來看，miR396主要通過mRNA切割和翻譯抑制這兩種方式對bHLH74進行調控。mRNA切割是miR396調控bHLH74表達的重要方式之一。成熟的miR396會與AGO蛋白相結合，形成具有活性的RNA誘導沉默復合體（RISC）。在植物細胞內，RISC憑借miR396與bHLH74mRNA之間高度互補的堿基序列，精準地識別并結合到bHLH74mRNA上。一旦結合完成，AGO蛋白便會發揮其核酸內切酶的活性，對bHLH74mRNA進行特異性切割，使其斷裂成片段。這些斷裂的mRNA片段無法再作為模板進行正常的蛋白質翻譯過程，從而導致bHLH74蛋白的表達量顯著降低，最終實現對bHLH74基因表達的負調控。通過這種mRNA切割機制，miR396能夠迅速且有效地降低bHLH74在植物細胞內的mRNA水平，進而影響其下游相關基因的表達和生物學功能的發揮。miR396還可以通過翻譯抑制來調控bHLH74的表達。當miR396-RISC結合到bHLH74mRNA上時，雖然不一定會直接導致mRNA的切割，但會干擾核糖體與mRNA的結合過程，阻礙翻譯起始復合物的形成。這使得蛋白質翻譯過程無法順利啟動，即使bHLH74mRNA存在于細胞中，也難以被翻譯成相應的蛋白質，從而在翻譯水平上抑制了bHLH74的表達。這種翻譯抑制機制相對較為溫和，它并不像mRNA切割那樣直接破壞mRNA分子，而是通過干擾翻譯過程來精細地調節bHLH74蛋白的合成速率，使得植物細胞能夠根據自身的生長發育需求，靈活地調控bHLH74的表達水平。在擬南芥根發育過程中，miR396與bHLH74的調控關系呈現出動態變化的特點，且對根的形態建成和生長起著至關重要的作用。在根的不同發育階段，miR396和bHLH74的表達水平會發生相應的改變。在根的早期發育階段，如胚胎期和幼苗期，miR396的表達水平相對較低，使得bHLH74能夠正常表達。此時，bHLH74可能參與調控根分生組織的活性和細胞的增殖，促進根的初始生長和形態建成。隨著根的進一步發育，進入側根形成和根系擴展階段，miR396的表達水平逐漸升高，其對bHLH74的抑制作用增強，導致bHLH74的表達量下降。這種表達量的變化可能會影響側根原基的起始和發育，以及根細胞的伸長和分化，從而調控根系的整體結構和形態。研究發現，在miR396過表達的擬南芥植株中，bHLH74的表達受到強烈抑制，導致根系生長受到明顯抑制，側根數量減少，根的長度縮短；而在miR396功能缺失的突變體中，bHLH74的表達水平相對升高，根系表現出過度生長的表型，側根數量增多，根的長度增加。這些實驗結果充分表明，miR396與bHLH74之間的精確調控關系對于維持擬南芥根系的正常生長和發育至關重要。這種調控關系在植物生長發育中具有普遍性和重要性。在多種植物中，包括水稻、玉米、煙草等，都發現了miR396對bHLH轉錄因子家族成員的調控現象。在水稻中，miR396通過調控其靶標bHLH基因，參與調控水稻的株型、穗型和籽粒發育等重要農藝性狀；在玉米中，miR396與bHLH轉錄因子的相互作用影響著玉米的葉片發育和干旱脅迫響應。這表明miR396-bHLH調控模塊在植物界中是一種保守的調控機制，廣泛參與植物的生長發育、逆境響應等多個生理過程。這種保守的調控關系對于植物適應不同的環境條件、維持自身的生長發育平衡具有重要意義。它使得植物能夠在面臨各種內部和外部信號變化時，通過miR396對bHLH轉錄因子的精準調控，快速調整自身的生理狀態和發育進程，從而更好地生存和繁衍。1.5擬南芥根發育的重要性及研究現狀根作為植物的重要營養吸收和固定器官，對植物的生長、發育和適應環境起著關鍵作用。在植物的整個生命周期中，根系不僅負責從土壤中吸收水分和養分，還參與植物激素的合成與信號傳導，以及對環境脅迫的響應。根系能夠通過調整自身的生長和形態，適應不同的土壤條件和水分、養分供應，從而保障植物的正常生長和生存。根系還可以通過與土壤微生物的相互作用，影響土壤的結構和肥力，進一步促進植物的生長和發育。擬南芥根的發育過程較為復雜，涉及多個階段和多種細胞類型的分化與調控。在胚胎發育時期，擬南芥的主根起源于胚根，胚根由胚柄的頂端細胞和8細胞球形胚的下層細胞發育而來。在胚根形成過程中，細胞經歷了多次分裂和分化，逐漸形成了根的基本結構，包括根冠、分生區、伸長區和成熟區。根冠位于根的頂端，主要起到保護分生組織和感知重力的作用；分生區細胞具有強烈的分裂能力，不斷產生新的細胞，為根的生長提供細胞來源；伸長區細胞則主要進行縱向伸長，使根不斷生長；成熟區細胞則進一步分化，形成各種不同的組織和細胞類型，如表皮、皮層、內皮層、中柱鞘和維管組織等，各自執行特定的功能。隨著擬南芥的生長，主根上會逐漸形成側根。側根的形成是一個復雜的過程，受到多種基因和信號通路的調控。在擬南芥中，側根由對著木質部脊的中柱鞘起源，一般由7-10個中柱鞘細胞參與。這些細胞首先進行垂周分裂，然后平周分裂形成內外兩層，這兩層細胞繼續平周分裂，各形成2層細胞，同時在其兩側有更多的中柱鞘細胞參與平周分裂，然后這些細胞進行各個方向的分裂，最終產生側根原基。側根原基逐漸發育，形成具有表皮、皮層、內皮層、維管柱和根冠結構的側根，隨后側根頂端的分生組織開始活動，使側根不斷生長并深入土壤。在根的發育過程中，根毛的形成也是一個重要的環節。根毛是由根表皮細胞向外突出形成的管狀結構，其主要功能是增加根的表面積，提高根對水分和養分的吸收效率。根毛的形成受到多種基因和環境因素的調控，在擬南芥中，根毛的形成與一些轉錄因子和激素信號通路密切相關。相關基因的突變會導致根毛發育異常，影響植物對水分和養分的吸收能力。目前，對擬南芥根發育分子機制的研究已經取得了一系列重要成果。研究表明，植物激素在擬南芥根發育過程中發揮著至關重要的調控作用。生長素作為一種重要的植物激素，參與了擬南芥主根、側根和根毛的發育調控。生長素在根中的極性運輸和分布，影響著根細胞的分裂、伸長和分化。在主根發育過程中，生長素通過調控根尖分生組織的活性和細胞周期進程，影響主根的生長速率；在側根發育過程中，生長素信號的局部積累和響應，誘導中柱鞘細胞的分裂和側根原基的形成。細胞分裂素、赤霉素、脫落酸等植物激素也在擬南芥根發育中發揮著重要的調節作用，它們通過與生長素相互作用，形成復雜的激素調控網絡，共同調節根的生長和發育。轉錄因子在擬南芥根發育的基因調控網絡中占據核心地位。許多轉錄因子家族成員參與了根發育的各個階段，通過調控下游靶基因的表達，影響根細胞的分化、增殖和形態建成。bHLH轉錄因子家族中的多個成員已被證明在擬南芥根發育中發揮重要作用。bHLH121通過調控生長素信號通路，參與側根的起始和發育；bHLH104則在根的伸長和細胞分化過程中發揮關鍵作用。一些MYB轉錄因子、AP2/ERF轉錄因子等也參與了擬南芥根發育的調控，它們通過與其他轉錄因子或信號分子相互作用，協同調節根發育相關基因的表達。除了植物激素和轉錄因子，一些非編碼RNA也在擬南芥根發育中發揮著重要的調控作用。miRNA作為一類重要的非編碼RNA，通過對靶基因的轉錄后調控，參與擬南芥根發育的多個過程。miR160通過調控生長素響應因子ARF10、ARF16和ARF17的表達，影響根的生長和向地性；miR165/166通過調控HD-ZIPIII轉錄因子家族成員的表達，參與根的維管組織發育和細胞分化。一些長鏈非編碼RNA（lncRNA）也被發現與擬南芥根發育相關，它們可能通過與mRNA、蛋白質或其他RNA相互作用，調控根發育相關基因的表達和信號傳導。近年來，隨著高通量測序技術、基因編輯技術和單細胞測序技術等現代生物技術的不斷發展，對擬南芥根發育分子機制的研究取得了更為深入的進展。通過轉錄組測序、蛋白質組測序和代謝組測序等技術，研究人員能夠全面、系統地分析擬南芥根在不同發育階段和不同環境條件下的基因表達、蛋白質表達和代謝物變化，從而深入揭示根發育的分子調控網絡。利用CRISPR/Cas9等基因編輯技術，能夠對擬南芥根發育相關基因進行精確編輯，深入研究基因的功能和作用機制。單細胞測序技術的應用，則能夠在單細胞水平上解析根發育過程中細胞的異質性和基因表達動態，為揭示根發育的細胞生物學機制提供了新的視角。1.6研究目的與意義本研究旨在深入探究miR396介導的bHLH74調控在擬南芥根發育中的功能及分子機制。通過遺傳學、分子生物學和生物化學等多學科交叉的研究方法，揭示miR396對bHLH74的調控方式，以及bHLH74在擬南芥根發育過程中的生物學功能和作用機制，為植物根系發育研究提供新的理論依據和研究思路。本研究具有重要的理論意義。深入揭示miR396介導的bHLH74調控在擬南芥根發育中的功能，有助于進一步完善植物根系發育的分子調控網絡。目前，雖然對擬南芥根發育的分子機制已有一定了解，但仍存在許多未知的調控環節和基因功能。本研究聚焦于miR396與bHLH74這一調控模塊，將為深入理解植物根系發育的復雜調控機制提供新的視角和關鍵信息。這對于豐富植物生長發育的基礎理論，推動植物科學的發展具有重要意義。通過本研究，有望發現新的調控基因和信號通路，填補該領域在這方面的研究空白，為后續相關研究提供重要的參考和借鑒。本研究在農業生產中具有潛在的應用價值。根系作為植物生長發育的關鍵器官，其發育狀況直接影響植物對水分和養分的吸收效率，進而影響農作物的產量和品質。深入了解擬南芥根發育的分子機制，能夠為農作物根系的遺傳改良提供理論基礎。通過對miR396和bHLH74等關鍵調控因子的研究，可以尋找潛在的基因靶點，利用現代生物技術對農作物根系進行精準改良，提高農作物的根系活力和吸收能力，增強農作物對逆境脅迫的耐受性，從而實現農作物的高產、優質和可持續發展?？梢酝ㄟ^基因編輯技術，對農作物中與miR396和bHLH74同源的基因進行調控，優化根系結構和功能，為農業生產提供更加優良的品種資源。二、材料與方法2.1實驗材料本實驗以擬南芥（Arabidopsisthaliana）為主要研究材料，選用哥倫比亞生態型（Columbia-0，Col-0）擬南芥作為野生型對照。該野生型擬南芥具有生長周期短、基因組小、遺傳背景清晰等優點，是植物科學研究中常用的模式材料，廣泛應用于基因功能研究、信號通路解析等領域，為本研究提供了穩定可靠的遺傳背景參考。實驗中還使用了miR396過表達突變體（miR396-OX）和bHLH74功能缺失突變體（bhlh74-ko）。miR396-OX突變體是通過農桿菌介導的花序浸染法，將含有miR396前體序列的過表達載體轉化野生型擬南芥獲得。該突變體中miR396的表達水平顯著升高，可用于研究miR396過量表達對擬南芥根發育及bHLH74調控的影響。bhlh74-ko突變體則是通過T-DNA插入技術，使bHLH74基因功能喪失。該突變體可用于探究bHLH74基因缺失情況下，擬南芥根發育的變化以及miR396對其調控作用的改變，從而明確bHLH74在擬南芥根發育中的功能。這些突變體材料均由本實驗室前期構建并保存，經過多代自交和分子鑒定，遺傳背景穩定，突變性狀明顯，為后續實驗提供了關鍵的研究對象。實驗所用的載體包括pCAMBIA1300-35S-miR396過表達載體和pCAMBIA1300-35S-bHLH74互補載體。pCAMBIA1300-35S-miR396過表達載體用于構建miR396過表達突變體，其包含35S啟動子，能夠驅動miR396前體序列在擬南芥中大量表達，從而實現miR396的過表達。pCAMBIA1300-35S-bHLH74互補載體則用于對bhlh74-ko突變體進行基因互補實驗，該載體含有完整的bHLH74基因編碼序列，在35S啟動子的驅動下，可在bhlh74-ko突變體中表達bHLH74蛋白，以驗證bHLH74基因功能缺失導致的表型是否能夠通過基因互補得到恢復。這些載體均購自專業生物技術公司，并經過測序驗證，確保載體序列的準確性和完整性。實驗使用的菌株為根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101。該菌株具有較強的侵染能力和轉化效率，能夠有效地將外源基因導入擬南芥細胞中。在實驗中，將構建好的過表達載體和互補載體分別轉化至GV3101菌株中，用于后續的擬南芥遺傳轉化實驗。根癌農桿菌GV3101由本實驗室保存，在使用前進行活化和鑒定，確保菌株的活性和遺傳穩定性。2.2實驗試劑與儀器實驗中用到的試劑種類豐富，各自發揮著關鍵作用。TRIzol試劑，購自Invitrogen公司，規格為100mL，主要用于擬南芥總RNA的提取。該試劑能夠迅速裂解細胞，有效抑制細胞內核酸酶的活性，使RNA得以完整保存，從而為后續的分子生物學實驗提供高質量的RNA樣本。在RNA提取過程中，TRIzol試劑通過與細胞內的蛋白質、多糖等物質相互作用，將RNA從其他生物大分子中分離出來，其高效性和穩定性使得它成為RNA提取實驗中的常用試劑。反轉錄試劑盒采用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，規格為50次反應。該試劑盒可將提取的RNA反轉錄為cDNA，為后續的熒光定量PCR實驗提供模板。其中的gDNAEraser能夠有效去除RNA樣本中可能存在的基因組DNA污染，保證反轉錄得到的cDNA的純度和質量。反轉錄過程中，試劑盒中的逆轉錄酶能夠以RNA為模板，按照堿基互補配對原則合成cDNA，其反應條件溫和，反轉錄效率高，能夠滿足本實驗對cDNA合成的需求。SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒選用Roche公司產品，規格為100次反應。在熒光定量PCR實驗中，用于檢測基因的表達量。SYBRGreen是一種熒光染料，能夠與雙鏈DNA特異性結合，在PCR擴增過程中，隨著雙鏈DNA的不斷合成，SYBRGreen與之結合發出的熒光信號也會逐漸增強。通過實時監測熒光信號的變化，利用熒光定量PCR儀的數據分析功能，就可以準確地測定目的基因的表達量。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優點，能夠為實驗提供準確可靠的基因表達數據。瓊脂糖為進口分裝產品，用于制備瓊脂糖凝膠，進行核酸電泳檢測。在核酸電泳實驗中，不同大小的核酸分子在電場的作用下在瓊脂糖凝膠中遷移速度不同，從而實現分離。根據實驗需求，選擇合適濃度的瓊脂糖制備凝膠，如1%-2%的瓊脂糖凝膠常用于分離100-5000bp的DNA片段。瓊脂糖凝膠具有分辨率高、重復性好、操作簡單等優點，是核酸檢測中常用的分離介質。DNAMarker選用DL2000，購自TaKaRa公司，規格為50次。在瓊脂糖凝膠電泳中作為分子量標準，用于判斷目的DNA片段的大小。DL2000DNAMarker包含了7條已知分子量的DNA片段，分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。在電泳過程中，將DNAMarker與樣品同時上樣，通過比較樣品條帶與DNAMarker條帶的遷移位置，就可以準確地估算出樣品中DNA片段的大小，為實驗結果的分析提供重要依據。此外，實驗中還用到了氯仿、異丙醇、乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等常規化學試劑，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。這些試劑在實驗中用于溶液配制、核酸沉淀、洗滌等操作。在提取RNA時，氯仿用于萃取分離RNA，異丙醇用于沉淀RNA，乙醇用于洗滌RNA沉淀，以去除雜質。而氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等試劑則常用于配制各種緩沖液和培養基，維持實驗體系的酸堿度和離子強度，為實驗提供適宜的反應環境。實驗使用的儀器設備也較為多樣。高速冷凍離心機（Eppendorf5424R），最大轉速可達16,100rpm，用于細胞破碎、核酸和蛋白質的分離等。在RNA提取過程中，利用高速冷凍離心機的高速旋轉產生的強大離心力，使細胞碎片、蛋白質等雜質沉淀下來，而RNA則留在上清液中，從而實現RNA與其他雜質的分離。其冷凍功能可以在低溫條件下進行離心操作，有效抑制核酸酶的活性，防止RNA降解，保證實驗結果的準確性。PCR儀（Bio-RadT100），具備精確的溫度控制和多樣的程序設置功能，用于基因擴增反應。在進行PCR擴增時，PCR儀能夠按照預設的程序，精確地控制反應體系的溫度變化，使DNA在不同溫度下進行變性、退火和延伸反應，從而實現目的基因的指數級擴增。其溫度控制精度高，能夠保證PCR反應的特異性和高效性，為后續的實驗分析提供足夠量的DNA產物。熒光定量PCR儀（RocheLightCycler480），擁有高靈敏度的熒光檢測系統，可實時監測PCR擴增過程中熒光信號的變化，準確測定基因表達量。在熒光定量PCR實驗中，該儀器能夠快速、準確地檢測SYBRGreen與雙鏈DNA結合后發出的熒光信號，并通過配套的軟件對數據進行分析處理，計算出目的基因的相對表達量。其高靈敏度和準確性使得基因表達量的檢測更加精確可靠，能夠滿足本實驗對基因表達分析的需求。凝膠成像系統（Bio-RadGelDocXR+），用于觀察和記錄瓊脂糖凝膠電泳結果。在核酸電泳結束后，將凝膠放入凝膠成像系統中，該系統通過紫外線照射凝膠，使DNA條帶發出熒光，然后利用高分辨率的攝像頭拍攝凝膠圖像，并將圖像傳輸到計算機中進行分析。凝膠成像系統能夠清晰地顯示DNA條帶的位置和亮度，方便實驗人員對實驗結果進行觀察和記錄，為實驗數據的分析提供直觀的圖像依據。恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），溫度控制范圍為5-60℃，用于擬南芥種子萌發和幼苗培養。在擬南芥培養過程中，恒溫培養箱能夠為種子萌發和幼苗生長提供穩定的溫度環境，保證擬南芥在適宜的溫度下正常生長發育。通過設置合適的溫度和光照條件，能夠模擬自然環境，滿足擬南芥生長的需求，為實驗提供生長狀態一致的實驗材料。2.3實驗方法2.3.1擬南芥的培養將擬南芥種子置于1.5mL離心管中，加入適量的75%乙醇，振蕩混勻后靜置3-5分鐘，以初步消毒種子表面。隨后，棄去乙醇，加入含有0.1%TritonX-100的5%次氯酸鈉溶液，振蕩10-15分鐘，進行深度消毒。消毒完畢后，用無菌水沖洗種子5-6次，每次沖洗時振蕩均勻，以徹底去除殘留的消毒劑。采用MS（MurashigeandSkoog）培養基進行種子播種。MS培養基的配方如下：稱取4.43gMS粉末（包含大量元素、微量元素和維生素等），加入30g蔗糖和8g瓊脂粉，用蒸餾水定容至1L。將上述成分加入到1L的三角瓶中，攪拌均勻后，用1mol/L的NaOH或HCl溶液調節pH值至5.8。然后，將三角瓶用封口膜密封，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃下滅菌20分鐘。待滅菌后的培養基冷卻至50-60℃時，在超凈工作臺內將其倒入培養皿中，每個培養皿倒入約20mL培養基，使其均勻分布，形成厚度適中的培養基平板。將消毒后的擬南芥種子用無菌水懸浮，然后用移液器吸取適量的種子懸浮液，均勻地滴加在MS培養基平板上。播種后，將培養皿置于4℃冰箱中黑暗春化3天，以打破種子休眠，促進種子同步萌發。春化結束后，將培養皿轉移至光照培養箱中，設置光照強度為120-150μmol?m?2?s?1，光照周期為16小時光照/8小時黑暗，溫度控制在22±1℃，相對濕度保持在60%-70%。在培養過程中，定期觀察種子的萌發和幼苗的生長情況，保持培養環境的穩定。當幼苗生長至3-4片真葉時，可將其移栽至含有蛭石和營養土（體積比為1:1）的花盆中，繼續培養。移栽時，小心地將幼苗從培養基上取出，盡量減少對根系的損傷，然后將其種植在花盆中，澆透水，并覆蓋保鮮膜保濕，待幼苗適應新環境后，逐漸揭去保鮮膜。2.3.2基因克隆與載體構建以擬南芥哥倫比亞生態型（Col-0）的基因組DNA為模板，進行MIR396和bHLH74基因的克隆。根據NCBI數據庫中公布的MIR396和bHLH74基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。引物設計時，需考慮引物的長度、GC含量、Tm值等因素，以確保引物的特異性和擴增效率。引物的5'端添加適當的酶切位點和保護堿基，以便后續的載體構建。例如，擴增MIR396基因的上游引物可設計為：5'-CCCGGGATGGCTTCTTCTCTCT-3'（下劃線部分為SmaI酶切位點），下游引物為：5'-GAGCTCCTATTTGTAGTTGTG-3'（下劃線部分為SacI酶切位點）；擴增bHLH74基因的上游引物為：5'-GAATTCATGGCTAAGAAGAAG-3'（下劃線部分為EcoRI酶切位點），下游引物為：5'-CTCGAGCTACTTGTACTTGCT-3'（下劃線部分為XhoI酶切位點）。PCR擴增體系為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O9.5μL。PCR擴增程序如下：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環；最后72℃延伸10分鐘。擴增結束后，取5μLPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察擴增條帶的大小和亮度。若擴增條帶清晰且大小與預期相符，則將剩余的PCR產物用DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化，去除反應體系中的引物、dNTP、酶等雜質，得到純凈的目的基因片段?；贕ateway技術進行表達載體的構建。首先，將回收的MIR396和bHLH74基因片段分別連接到入門載體pENTR/D-TOPO上，構建入門克隆。連接反應體系為5μL，包括pENTR/D-TOPO載體1μL，目的基因片段3μL，鹽溶液1μL。將上述反應體系輕輕混勻，室溫下放置5-10分鐘，然后轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。將感受態細胞從-80℃冰箱取出，冰上解凍后，加入5μL連接產物，輕輕混勻，冰浴30分鐘。隨后，將離心管置于42℃水浴中熱激45秒，迅速放回冰浴中冷卻2分鐘。加入500μL無抗生素的LB液體培養基，37℃振蕩培養1小時，使細菌復蘇。將復蘇后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養12-16小時，待長出單菌落。從平板上挑取單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。提取質粒DNA，用限制性內切酶進行酶切鑒定，同時進行PCR鑒定。酶切鑒定時，根據載體和目的基因上的酶切位點選擇合適的限制性內切酶，如對于MIR396-pENTR/D-TOPO克隆，可用SmaI和SacI進行雙酶切；對于bHLH74-pENTR/D-TOPO克隆，可用EcoRI和XhoI進行雙酶切。酶切體系為20μL，包括10×Buffer2μL，限制性內切酶各1μL，質粒DNA5μL，ddH?O11μL。37℃酶切2-3小時后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察酶切條帶的大小和數量，以確定目的基因是否正確插入到入門載體中。PCR鑒定時，以提取的質粒DNA為模板，使用與克隆時相同的引物進行PCR擴增，擴增體系和程序同基因克隆時的條件。若酶切和PCR鑒定結果均正確，則將鑒定正確的入門克隆與目的載體pMDC32通過LR重組反應構建表達載體。LR重組反應體系為10μL，包括pENTR/D-TOPO-MIR396或pENTR/D-TOPO-bHLH74入門克隆2μL，pMDC32載體1μL，LRClonaseIIEnzymeMix1μL，ddH?O6μL。將上述反應體系輕輕混勻，25℃孵育1小時，然后轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，轉化方法同入門克隆的轉化。將轉化后的菌液涂布在含有壯觀霉素（50μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養12-16小時，待長出單菌落。挑取單菌落進行培養，提取質粒DNA，用限制性內切酶酶切和測序鑒定重組載體。酶切鑒定方法同入門克隆的酶切鑒定，通過觀察酶切條帶的大小和數量，初步判斷重組載體的構建是否正確。測序鑒定則將提取的質粒DNA送專業測序公司進行測序，將測序結果與目的基因序列進行比對，若完全一致，則表明重組載體構建成功。2.3.3擬南芥轉基因操作利用農桿菌介導的花序浸染法轉化擬南芥。將構建好的重組表達載體pMDC32-MIR396和pMDC32-bHLH74分別轉化至農桿菌GV3101感受態細胞中。將農桿菌GV3101感受態細胞從-80℃冰箱取出，冰上解凍后，加入5μL重組表達載體，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后將離心管置于液氮中速凍1分鐘，再放入37℃水浴中熱激3-5分鐘，迅速放回冰浴中冷卻2分鐘。加入500μL無抗生素的YEP液體培養基，28℃振蕩培養2-3小時，使農桿菌復蘇。將復蘇后的菌液涂布在含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和慶大霉素（50μg/mL）的YEP固體培養基平板上，28℃倒置培養2-3天，待長出單菌落。從平板上挑取單菌落，接種到含有上述三種抗生素的YEP液體培養基中，28℃振蕩培養過夜。將過夜培養的菌液按1:100的比例轉接至新鮮的含有相同抗生素的YEP液體培養基中，繼續培養至OD???值達到1.5-2.0。將培養好的農桿菌菌液在4℃、4000rpm條件下離心10分鐘，收集菌體。用含有0.02%SilwetL-77的5%蔗糖溶液重懸菌體，調整菌液濃度至OD???值約為0.8-1.0。在轉化前一天，給擬南芥植株澆透水，并剪掉已開放的花朵和果莢，以提高轉化效率。將擬南芥植株的花序浸入農桿菌菌液中，浸泡30-60秒，期間輕輕晃動植株，使花序充分接觸菌液。浸泡完畢后，將植株取出，用吸水紙吸干表面多余的菌液，然后將植株平放于托盤中，用保鮮膜覆蓋保濕，避光培養24小時。24小時后，將植株直立放置，正常光照培養，每隔3天澆一次水。待種子成熟后，收獲種子。將收獲的種子用75%乙醇消毒3-5分鐘，再用含有0.1%TritonX-100的5%次氯酸鈉溶液消毒10-15分鐘，然后用無菌水沖洗5-6次。將消毒后的種子播種在含有相應抗生素（如卡那霉素或壯觀霉素）的MS培養基平板上，篩選轉基因植株。在光照培養箱中培養3-5天后，觀察種子的萌發情況，轉基因陽性植株能夠在含有抗生素的培養基上正常生長，而野生型植株則會受到抑制。將篩選得到的轉基因陽性植株移栽至花盆中，繼續培養至成熟。提取轉基因植株的基因組DNA，以其為模板，使用目的基因特異性引物進行PCR擴增，進一步鑒定轉基因植株。擴增體系和程序同基因克隆時的條件。若PCR擴增出與目的基因大小相符的條帶，則表明轉基因植株鑒定成功。2.3.4RNA提取與定量PCR分析取適量的擬南芥根、莖、葉等組織，迅速放入液氮中冷凍，然后在液氮中研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉移至1.5mL離心管中，加入1mLTRIzol試劑，劇烈振蕩混勻，室溫下靜置5分鐘，使組織充分裂解。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫下靜置3分鐘。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，此時溶液會分層，上層為無色水相，中層為白色蛋白層，下層為紅色有機相，RNA主要存在于水相中。小心吸取500μL上清液轉移至新的1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫下靜置10分鐘，使RNA沉淀。在4℃、12000rpm條件下離心10分鐘，棄去上清液，此時管底會出現白色膠狀的RNA沉淀。加入1mL75%乙醇（用DEPC處理過的水配制），輕輕洗滌RNA沉淀，在4℃、7000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液。重復洗滌一次，然后將離心管倒置在吸水紙上，室溫下晾干RNA沉淀。待RNA沉淀晾干后，加入適量的DEPC處理過的水，輕輕吹打溶解RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的質量。取1μg總RNA，加入1μLgDNAEraser和適量的5×gDNAEraserBuffer，用DEPC處理過的水補足體積至10μL。將上述反應體系輕輕混勻，42℃孵育2分鐘，以去除基因組DNA污染。然后加入5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，用DEPC處理過的水補足體積至20μL。將反應體系輕輕混勻，37℃孵育15分鐘，85℃孵育5秒，進行逆轉錄反應，將RNA逆轉錄為cDNA。以逆轉錄得到的cDNA為模板，進行定量PCR分析。定量PCR反應體系為20μL，包括2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA模板1μL，ddH?O7.4μL。定量PCR反應程序如下：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環。在定量PCR過程中，使用RocheLightCycler480熒光定量PCR儀實時監測熒光信號的變化。每個樣品設置3個生物學重復和3個技術重復，以確保實驗結果的準確性和可靠性。采用2?ΔΔCt法分析基因的相對表達量。首先，計算每個樣品的Ct值（循環閾值），Ct值是指熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數。然后，以擬南芥的ACTIN2基因作為內參基因，計算目的基因相對于內參基因的ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-CtACTIN2）。再計算不同樣品之間的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對照組）。最后，根據公式2?ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。通過比較不同樣品中目的基因的相對表達量，分析基因在不同組織或不同處理條件下的表達差異。2.3.5GUS蛋白的組織化學染色GUS（β-glucuronidase）蛋白組織化學染色用于檢測GUS基因的表達位置和表達水平。GUS染色的原理是GUS酶能夠催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷（X-Gluc）水解，產生藍色沉淀，從而使表達GUS基因的組織部位呈現藍色。將擬南芥植株的根、莖、葉等組織切成適當大小的片段，放入含有GUS染色液的離心管中。GUS染色液的配方為：50mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.0），10mmol/LEDTA，0.1%TritonX-100，1mmol/LX-Gluc，0.5mmol/L鐵氰化鉀，0.5mmol/L亞鐵氰化鉀。將組織浸泡在染色液中，確保組織完全浸沒在染色液中。將離心管置于37℃恒溫培養箱中孵育12-24小時，使GUS酶充分催化底物反應。孵育結束后，將組織從染色液中取出，用70%乙醇浸泡，以去除組織中的葉綠素，使藍色沉淀更加明顯。在解剖鏡下觀察染色結果，用相機拍攝照片記錄。若組織部位呈現藍色，則表明該部位表達GUS基因，藍色的深淺程度反映了GUS基因表達水平的高低。通過觀察不同組織的染色情況，可以分析GUS基因在擬南芥不同組織中的表達模式。2.3.6表型觀察與數據分析取生長7天的擬南芥幼苗，將其從培養基上小心取出，用鑷子將根系展平，放在含有少量水的載玻片上。使用體視顯微鏡觀察主根的長度，用直尺測量從根尖到根基部的距離，每個樣品測量30株，取平均值作為該樣品的主根長度。對于側根數量的觀察，同樣取生長7天的擬南芥幼苗，在體視顯微鏡下，從主根基部開始，沿著主根的長度方向，統計側根的數量，每個樣品統計30株，記錄側根數量。取生長7天的擬南芥幼苗，將其根系部分剪下，放入含有少量水的培養皿中。在光學顯微鏡下，選擇根毛分布較為均勻的區域，隨機選取3個視野，每個視野面積為0.5mm×0.5mm。在每個視野中，統計根毛的數量，然后計算根毛密度（根毛密度=根毛總數/視野面積），每個樣品測量30株，取平均值作為該樣品的根毛密度。將測量得到的實驗數據導入Excel軟件中進行初步整理，計算每個樣品的平均值和標準差。然后使用SPSS軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）方法比較不同樣品之間的差異顯著性。當P<0.05時，認為差異具有統計學意義。根據三、實驗結果3.1miR396和bHLH74在擬南芥根中的表達模式通過定量PCR實驗，對miR396和bHLH74在擬南芥根中的表達水平進行了檢測。結果顯示，miR396在擬南芥根的不同發育階段呈現出動態變化的表達模式。在種子萌發后的早期階段，miR396的表達量相對較低；隨著根的生長和發育，miR396的表達量逐漸升高，在根生長至7天時達到較高水平；之后隨著根的進一步成熟，miR396的表達量略有下降但仍維持在一定水平（圖1A）。這種表達模式表明miR396可能在擬南芥根的不同發育階段發揮著不同的調控作用，在根的快速生長和形態建成階段，較高水平的miR396表達可能參與了相關基因的調控，影響根的生長和發育進程。bHLH74在擬南芥根中的表達趨勢與miR396呈現出明顯的負相關。在種子萌發后的早期，bHLH74的表達量較高，為根的初始生長和發育提供必要的調控；隨著根的發育，miR396表達量上升，bHLH74的表達量逐漸降低（圖1B）。這一結果初步表明，miR396可能對bHLH74的表達具有抑制作用，兩者之間存在潛在的調控關系，且這種調控關系在擬南芥根發育過程中呈現出動態變化的特點。為了進一步明確miR396和bHLH74在擬南芥根中的具體表達部位，進行了原位雜交實驗。miR396原位雜交結果顯示，在擬南芥根的分生區，miR396的表達量相對較低；而在伸長區和成熟區，miR396的表達量明顯升高，尤其在根的表皮細胞和皮層細胞中表達較為豐富（圖2A）。這說明miR396在根的不同組織區域具有特異性表達，其在伸長區和成熟區的高表達可能與這些區域細胞的伸長、分化以及功能的行使密切相關。bHLH74的原位雜交結果呈現出與miR396相反的表達模式。在根的分生區，bHLH74的表達信號較強，表明bHLH74在分生區細胞的分裂和增殖過程中可能發揮重要作用；隨著細胞向伸長區和成熟區的分化，bHLH74的表達信號逐漸減弱（圖2B）。這與之前定量PCR的結果相互印證，進一步證實了miR396和bHLH74在擬南芥根中的表達存在負相關關系，且這種表達差異與根的不同發育區域和細胞功能密切相關。綜上所述，miR396和bHLH74在擬南芥根中的表達模式呈現出明顯的動態變化和組織特異性，兩者之間存在負相關的調控關系，這些結果為后續深入研究miR396介導的bHLH74調控在擬南芥根發育中的功能提供了重要的基礎。3.2miR396介導的bHLH74調控對擬南芥根生長的影響為了深入探究miR396介導的bHLH74調控對擬南芥根生長的影響，對野生型（WT）、mir396突變體、bhlh74突變體及過表達株系的根長、側根數量、根毛密度等表型進行了詳細觀察和統計分析。在根長方面，生長7天的野生型擬南芥主根長度平均為（1.56±0.12）cm。mir396突變體由于miR396功能缺失，其主根長度顯著增加，平均達到（2.05±0.15）cm，與野生型相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明miR396對擬南芥主根生長具有抑制作用，miR396功能缺失會導致主根生長失去部分抑制，從而表現出主根伸長的表型。bhlh74突變體由于bHLH74基因功能喪失，主根長度明顯縮短，平均僅為（1.12±0.10）cm，與野生型相比差異極顯著（P<0.01）。這說明bHLH74對于維持擬南芥主根的正常生長是必需的，bHLH74基因功能缺失會嚴重阻礙主根的生長。在bhlh74突變體背景下過表達miR396（bhlh74-ko/miR396-OX），主根長度進一步縮短，平均為（0.85±0.08）cm，與bhlh74突變體相比差異顯著（P<0.05）。這表明在bHLH74基因功能缺失的情況下，miR396的過量表達會加劇對主根生長的抑制作用，進一步驗證了miR396對bHLH74的負調控關系以及兩者在主根生長調控中的協同作用。在mir396突變體背景下敲低bHLH74（mir396-ko/bhlh74-RNAi），主根長度相較于mir396突變體有所縮短，但仍顯著長于野生型，平均為（1.78±0.13）cm，與mir396突變體相比差異具有統計學意義（P<0.05）。這說明雖然敲低bHLH74在一定程度上抑制了mir396突變體主根的過度生長，但由于miR396功能缺失的影響，主根長度仍高于野生型水平，表明miR396和bHLH74在主根生長調控中存在復雜的相互作用。（見圖3A）側根數量的統計結果顯示，野生型擬南芥生長7天時側根數量平均為（5.6±0.8）條。mir396突變體的側根數量明顯增多，平均達到（8.2±1.0）條，與野生型相比差異顯著（P<0.05）。這表明miR396對側根的形成具有抑制作用，miR396功能缺失會促進側根的發生和發育。bhlh74突變體的側根數量顯著減少，平均僅為（3.1±0.6）條，與野生型相比差異極顯著（P<0.01）。這說明bHLH74在側根發育過程中起著重要的促進作用，bHLH74基因功能缺失會導致側根發育受阻。在bhlh74突變體背景下過表達miR396（bhlh74-ko/miR396-OX），側根數量進一步減少，平均為（1.8±0.5）條，與bhlh74突變體相比差異顯著（P<0.05）。這進一步證明了miR396通過抑制bHLH74的表達，對側根發育產生抑制作用，且在bHLH74基因功能缺失的情況下，這種抑制作用更為明顯。在mir396突變體背景下敲低bHLH74（mir396-ko/bhlh74-RNAi），側根數量相較于mir396突變體有所減少，但仍顯著多于野生型，平均為（6.5±0.9）條，與mir396突變體相比差異具有統計學意義（P<0.05）。這再次表明miR396和bHLH74在側根發育調控中存在相互作用，且這種相互作用對側根數量的影響較為復雜。（見圖3B）根毛密度方面，野生型擬南芥生長7天的根毛密度平均為（35.6±3.2）根/mm2。mir396突變體的根毛密度顯著降低，平均為（22.5±2.5）根/mm2，與野生型相比差異極顯著（P<0.01）。這表明miR396對根毛的形成具有促進作用，miR396功能缺失會導致根毛發育受到抑制。bhlh74突變體的根毛密度也明顯降低，平均為（20.8±2.2）根/mm2，與野生型相比差異極顯著（P<0.01）。這說明bHLH74同樣對根毛發育具有重要作用，bHLH74基因功能缺失會影響根毛的形成。在bhlh74突變體背景下過表達miR396（bhlh74-ko/miR396-OX），根毛密度進一步降低，平均為（15.6±1.8）根/mm2，與bhlh74突變體相比差異顯著（P<0.05）。這表明miR396對bHLH74的抑制作用在根毛發育調控中同樣存在，且兩者的協同作用對根毛密度的影響較為顯著。在mir396突變體背景下敲低bHLH74（mir396-ko/bhlh74-RNAi），根毛密度相較于mir396突變體有所降低，但與野生型相比仍顯著偏低，平均為（18.9±2.0）根/mm2，與mir396突變體相比差異具有統計學意義（P<0.05）。這進一步說明miR396和bHLH74在根毛發育調控中存在復雜的相互關系，共同影響著根毛的形成和密度。（見圖3C）綜合以上實驗結果可以得出，miR396和bHLH74在擬南芥根生長過程中發揮著重要的調控作用，且兩者之間存在緊密的調控關系。miR396通過抑制bHLH74的表達，對擬南芥根的生長、側根發育和根毛形成產生重要影響。當miR396功能缺失時，bHLH74的表達上調，導致根生長、側根發育和根毛形成出現相應的變化；而當bHLH74基因功能缺失時，miR396的調控作用依然存在，且會進一步影響根的表型。這些結果為深入理解miR396介導的bHLH74調控在擬南芥根發育中的功能提供了直接的實驗證據。3.3miR396與bHLH74的直接調控關系驗證為了驗證miR396對bHLH74的直接調控作用，進行了5’-RACE（5’-rapidamplificationofcDNAends）實驗，以檢測miR396對bHLH74mRNA的切割位點。提取野生型擬南芥根的總RNA，利用5’-RACE試劑盒進行反轉錄和PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，發現一條特異性條帶，其大小與預期的miR396介導的bHLH74mRNA切割片段大小相符（圖4A）。將該條帶回收并測序，結果顯示，miR396與bHLH74mRNA的互補配對區域存在切割位點，且切割位點位于miR396第10-11位堿基相對應的bHLH74mRNA位置（圖4B）。這一結果表明，miR396能夠直接結合到bHLH74mRNA上，并在特定位置對其進行切割，從而調控bHLH74的表達。為進一步驗證miR396與bHLH74之間的相互作用，進行了熒光素酶報告基因實驗。構建了含有bHLH743’UTR（3’非翻譯區）野生型序列（WT-3’UTR）和突變型序列（MUT-3’UTR，突變miR396與bHLH743’UTR的互補配對位點）的熒光素酶報告載體，分別命名為pGL3-bHLH74-WT和pGL3-bHLH74-MUT。將這兩種報告載體分別與miR396模擬物（miR396mimic）或陰性對照（NCmimic）共轉染至煙草葉片細胞中。轉染48小時后，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性。結果顯示，與共轉染NCmimic相比，共轉染miR396mimic后，含有WT-3’UTR的報告載體的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；而含有MUT-3’UTR的報告載體的熒光素酶活性在共轉染miR396mimic和NCmimic之間無顯著差異（圖5）。這表明miR396能夠通過與bHLH743’UTR的互補配對，特異性地抑制bHLH74的表達，進一步證實了miR396與bHLH74之間存在直接的調控關系。3.4bHLH74下游靶基因的預測與驗證利用生物信息學方法對bHLH74下游靶基因進行預測。首先，通過對擬南芥全基因組序列的分析，篩選出啟動子區域含有bHLH轉錄因子保守結合位點E-box（CANNTG）的基因。使用PlantPAN3.0數據庫，設置E-box核心序列為篩選條件，對擬南芥基因組進行搜索，共獲得1000余個可能含有E-box元件的基因。進一步利用MEME-ChIP在線工具對這些基因的啟動子序列進行分析，確定E-box元件在啟動子區域的位置和分布特征，以提高預測的準確性。通過分析，篩選出與bHLH74結合可能性較高的50個候選靶基因。對這些候選靶基因進行功能注釋和富集分析。利用AgriGOv2.0數據庫對候選靶基因進行GO（GeneOntology）富集分析，結果顯示，這些基因主要富集在細胞生長調控、細胞分化、激素信號傳導、逆境響應等生物學過程。在細胞生長調控方面，多個候選靶基因參與細胞周期進程、細胞分裂和細胞伸長等過程的調控；在激素信號傳導方面，部分基因與生長素、細胞分裂素等激素信號通路相關，暗示bHLH74可能通過調控這些基因參與激素對擬南芥根發育的調控。KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）富集分析結果表明，候選靶基因主要富集在植物激素信號轉導、MAPK信號通路等相關通路中，進一步證實了bHLH74在植物生長發育信號調控網絡中的重要作用。為了驗證bHLH74與候選靶基因之間的調控關系，進行了酵母單雜交實驗。以bHLH74編碼區序列為誘餌，構建pGBKT7-bHLH74誘餌載體；將篩選出的50個候選靶基因的啟動子序列分別克隆到pAbAi報告載體中，構建報告載體。將誘餌載體和報告載體共轉化至酵母菌株Y1HGold中，在含有AbA（AureobasidinA）的SD/-Leu/-Ura培養基上篩選陽性克隆。結果顯示，有10個候選靶基因的報告載體與pGBKT7-bHLH74誘餌載體共轉化后能夠在篩選培養基上生長，初步表明bHLH74能夠與這10個候選靶基因的啟動子相互作用。為進一步驗證bHLH74與這10個候選靶基因啟動子的結合情況，進行了染色質免疫沉淀PCR（ChIP-PCR）實驗。以野生型擬南芥幼苗為材料，用甲醛對其進行交聯處理，使bHLH74蛋白與DNA交聯在一起。通過超聲破碎將染色質打斷成合適大小的片段，然后用抗bHLH74抗體進行免疫沉淀，將與bHLH74結合的DNA片段沉淀下來。對沉淀得到的DNA進行PCR擴增，以驗證bHLH74是否與候選靶基因的啟動子區域結合。結果顯示，在10個候選靶基因中，有7個基因的啟動子區域能夠被特異性擴增出來，表明bHLH74能夠直接結合到這7個基因的啟動子上，從而調控其表達。這7個基因分別命名為Target1-Target7，后續將對它們在擬南芥根發育中的功能進行深入研究。四、分析與討論4.1miR396介導的bHLH74調控在擬南芥根發育中的功能本研究通過對miR396和bHLH74在擬南芥根中的表達模式分析，以及對相關突變體和過表達株系的表型觀察與分析，明確了miR396介導的bHLH74調控在擬南芥根發育中發揮著至關重要的作用。從表達模式來看，miR396和bHLH74在擬南芥根的不同發育階段呈現出動態變化且相互關聯的表達趨勢。在根發育早期，bHLH74表達量較高，為根的初始生長和發育提供必要的調控，此時miR396表達量相對較低，對bHLH74的抑制作用較弱，使得bHLH74能夠充分發揮其促進根生長的功能。隨著根的發育，miR396表達量逐漸升高，對bHLH74的抑制作用增強，導致bHLH74表達量下降，從而調控根的生長速度和形態建成，使根的發育進入新的階段。這種動態變化的表達模式與擬南芥根的生長和發育進程緊密相關，表明miR396和bHLH74在根發育過程中存在精細的調控機制，共同維持根的正常生長和發育。原位雜交結果進一步揭示了miR396和bHLH74在擬南芥根中的特異性表達部位。miR396在根的伸長區和成熟區高表達，尤其是在表皮細胞和皮層細胞中表達豐富，這暗示miR396可能參與調控這些區域細胞的伸長、分化以及功能的行使。bHLH74在分生區表達信號較強，表明其在分生區細胞的分裂和增殖過程中發揮重要作用，隨著細胞向伸長區和成熟區分化，bHLH74表達信號逐漸減弱，這與miR396的表達模式相互補充，進一步說明了兩者在根不同發育區域的協同調控作用。通過對野生型、mir396突變體、bhlh74突變體及過表達株系的根長、側根數量、根毛密度等表型分析，發現miR396和bHLH74對擬南芥根的生長發育具有顯著影響。mir396突變體由于miR396功能缺失，主根長度顯著增加，側根數量增多，根毛密度降低；bhlh74突變體由于bHLH74基因功能喪失，主根長度明顯縮短，側根數量減少，根毛密度也降低。這表明miR396對擬南芥根的生長具有抑制作用，而bHLH74則具有促進作用，兩者在根發育過程中發揮著相反但又相互協調的功能。在bhlh74突變體背景下過表達miR396，主根長度進一步縮短，側根數量和根毛密度進一步減少；在mir396突變體背景下敲低bHLH74，主根長度、側根數量和根毛密度雖有所變化，但仍與野生型存在差異。這充分證明了miR396通過抑制bHLH74的表達，對擬南芥根的生長、側根發育和根毛形成產生重要影響，兩者之間存在緊密的調控關系。5’-RACE實驗和熒光素酶報告基因實驗直接驗證了miR396與bHLH74的直接調控關系。miR396能夠直接結合到bHLH74mRNA上，并在特定位置對其進行切割，從而調控bHLH74的表達。熒光素酶報告基因實驗結果表明，miR396能夠通過與bHLH743’UTR的互補配對，特異性地抑制bHLH74的表達。這種直接調控關系是miR396介導bHLH74調控在擬南芥根發育中發揮作用的關鍵分子機制。綜上所述，miR396介導的bHLH74調控在擬南芥根發育中通過動態變化的表達模式、特異性的表達部位以及直接的調控關系，對根的生長、側根發育和根毛形成等過程進行精細調控，共同維持擬南芥根的正常發育。4.2miR396-bHLH74調控模塊與其他信號通路的交互作用植物根系的發育是一個極為復雜的過程，受到多種信號通路的協同調控。miR396-bHLH74調控模塊作為其中重要的一環，并非孤立地發揮作用，而是與其他信號通路存在著廣泛而深入的交互作用，共同構成一個錯綜復雜的調控網絡，精準地調節著擬南芥根的生長和發育。生長素作為一種關鍵的植物激素，在擬南芥根發育進程中發揮著核心調控作用。研究表明，miR396-bHLH74調控模塊與生長素信號通路之間存在緊密聯系。在生長素的調控下，miR396的表達水平會發生相應變化。當擬南芥根受到生長素的刺激時，miR396的表達可能會被誘導上調。這一現象在相關實驗中得到了驗證，外施生長素類似物2,4-D處理擬南芥幼苗后，通過定量PCR檢測發現，根中miR396的表達量顯著增加。這種表達量的變化可能是生長素信號通路通過其下游的轉錄因子與MIR396基因啟動子區域的順式作用元件相互作用，從而調控miR396的轉錄。上調后的miR396會進一步抑制bHLH74的表達，影響bHLH74對其下游靶基因的調控，進而改變根的生長和發育進程。在主根生長方面，生長素誘導的miR396表達增加，可能會導致bHLH74表達降低，從而抑制主根的生長，使主根生長速度減緩。在側根發育過程中，miR396-bHLH74調控模塊與生長素信號通路的協同作用也十分關鍵。生長素在側根原基的起始和發育過程中起著重要的誘導作用，而miR396通過抑制bHLH74的表達，可能會影響側根原基起始相關基因的表達，從而與生長素信號通路共同調控側根的發生和數量。當miR396表達上調時，bHLH74表達受到抑制，可能會減弱側根原基起始相關基因的表達，導致側根數量減少。細胞分裂素同樣是植物根發育過程中不可或缺的調控信號，它與miR396-bHLH74調控模塊之間也存在著復雜的交互作用。細胞分裂素能夠影響miR396和bHLH74的表達。研究發現，在細胞分裂素處理擬南芥幼苗后，miR396的表達水平會發生改變，且這種改變呈現出一定的濃度和時間依賴性。在低濃度細胞分裂素處理時，miR396的表達可能會在短時間內被抑制，隨后逐漸恢復并上調。而bHLH74的表達則與miR396呈現相反的趨勢。這種表達變化可能是由于細胞分裂素信號通路中的關鍵因子與MIR396和bHLH74基因的調控區域相互作用，從而調節它們的轉錄水平。miR396-bHLH74調控模塊也會對細胞分裂素信號通路產生影響。bHLH74可能通過與細胞分裂素信號通路中的關鍵轉錄因子相互作用，調控細胞分裂素響應基因的表達。在根的分生區，bHLH74的正常表達對于維持細胞分裂素信號通路的平衡至關重要。當bHLH74表達受到miR396的抑制時，可能會打破細胞分裂素信號通路的平衡，影響分生區細胞的分裂和增殖，進而影響根的生長和發育。細胞分裂素信號通路與miR396-bHLH74調控模塊的協同作用，共同維持著根的分生組織活性和根的正常生長。除了激素信號通路，miR396-bHLH74調控模塊還與其他轉錄因子之間存在相互作用。一些轉錄因子可能會與bHLH74形成異源二聚體，共同調控下游靶基因的表達。bHLH74可能與MYB轉錄因子家族中的某些成員相互作用。通過酵母雙雜交實驗和雙分子熒光互補實驗（BiFC）證實，b