人工miR159介導番茄抗黃瓜花葉病毒的遺傳轉化機制與應用研究一、引言1.1研究背景與意義番茄（Solanumlycopersicum）作為全球范圍內廣泛種植的重要蔬菜作物，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟和人們的日常生活中占據(jù)著舉足輕重的地位。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）的數(shù)據(jù)顯示，近年來全球番茄的種植面積持續(xù)擴大，產(chǎn)量也穩(wěn)步增長，其豐富的營養(yǎng)價值和廣泛的用途，使其成為了人們餐桌上不可或缺的食材，同時也為食品加工等相關產(chǎn)業(yè)提供了重要的原料。然而，番茄在生長過程中面臨著多種病蟲害的威脅，其中黃瓜花葉病毒（CucumberMosaicVirus，CMV）是對番茄危害最為嚴重的病毒之一。CMV屬于雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬，是一種具有廣泛寄主范圍的RNA病毒，能夠侵染包括番茄、黃瓜、煙草等在內的1000多種植物。CMV主要通過蚜蟲以非持久性方式傳播，在田間極易擴散蔓延。一旦番茄感染CMV，會引發(fā)一系列嚴重的癥狀，如葉片出現(xiàn)黃綠相間的花葉、皺縮、畸形，植株矮化、生長發(fā)育受阻，果實變小、變形、品質下降等。這些癥狀不僅導致番茄的產(chǎn)量大幅降低，嚴重時甚至可能導致絕收，而且還會顯著影響番茄的商品價值，給番茄種植業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。例如，在一些高溫干旱的年份，CMV的發(fā)病率可高達80%以上，產(chǎn)量損失可達30%-50%，對番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構成了嚴重的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的番茄抗病毒育種主要依賴于從自然變異或野生近緣種中篩選抗性基因，然后通過常規(guī)雜交育種的方法將抗性基因導入栽培品種中。然而，這種方法存在諸多局限性。一方面，番茄中天然的抗CMV基因資源相對匱乏，篩選難度較大；另一方面，常規(guī)雜交育種周期長、效率低，且容易受到基因連鎖累贅的影響，難以在短時間內培育出理想的抗病品種。此外，化學防治雖然在一定程度上能夠控制CMV的傳播，但化學藥劑的大量使用不僅會增加生產(chǎn)成本，還會對環(huán)境和人體健康造成潛在的危害。因此，開發(fā)一種高效、安全、可持續(xù)的番茄抗CMV策略具有重要的現(xiàn)實意義。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，利用基因工程手段進行植物抗病毒育種成為了研究的熱點。人工微小RNA（artificialmicroRNA，amiRNA）技術作為一種新興的基因工程技術，為植物抗病毒研究提供了新的思路和方法。miRNA是一類長度約為21-24個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，在植物的生長發(fā)育、逆境響應等過程中發(fā)揮著重要的調控作用。通過人工設計和改造miRNA，可以使其特異性地靶向病毒的基因組序列，從而實現(xiàn)對病毒的有效抑制。人工miR159介導的番茄遺傳轉化研究，旨在通過將人工改造的miR159導入番茄植株中，使其能夠靶向識別并切割CMV的RNA，從而阻斷病毒的復制和傳播，提高番茄對CMV的抗性。這一研究具有重要的理論意義和應用前景。從理論層面來看，深入探究人工miR159介導的番茄抗病毒機制，有助于揭示植物與病毒之間的相互作用關系，豐富和完善植物抗病毒的分子生物學理論體系。同時，通過對amiRNA技術在番茄抗病毒應用中的研究，也能夠為其他植物抗病毒基因工程研究提供借鑒和參考。從應用角度而言，培育出具有抗CMV能力的番茄新品種，不僅可以有效減少CMV對番茄生產(chǎn)的危害，提高番茄的產(chǎn)量和品質，保障市場供應，還可以降低化學藥劑的使用量，減少對環(huán)境的污染，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。此外，抗CMV番茄品種的推廣應用，還能夠為番茄種植戶帶來可觀的經(jīng)濟效益，促進農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的升級和發(fā)展。1.2研究目的與內容本研究旨在利用人工miR159介導的遺傳轉化技術，培育出對黃瓜花葉病毒具有抗性的番茄植株，并深入探究其抗病毒機制，為番茄抗病毒育種提供新的策略和理論依據(jù)。具體研究內容如下：番茄遺傳轉化體系的建立與優(yōu)化：選用番茄MicroTom品種作為實驗材料，通過組織培養(yǎng)技術，對種子和外植體進行滅菌處理，篩選出適合分化的外植體類型。探究不同培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件（如光照、溫度等）以及抗生素耐受性對愈傷組織誘導、不定芽分化和再生植株生根的影響，建立高效穩(wěn)定的番茄遺傳轉化體系。同時，對影響農(nóng)桿菌侵染外植體的關鍵因素，如外植體預培養(yǎng)處理方法、農(nóng)桿菌濃度、侵染時間、菌液處理方法以及外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)條件等進行優(yōu)化，提高遺傳轉化效率。人工miR159表達載體的構建與轉化：針對黃瓜花葉病毒Fny株系（CMV-Fny）的基因組序列，利用生物信息學方法篩選出特異性的靶標序列。以此為基礎，通過分子生物學技術對番茄內源miR159進行人工改造，構建人工miR159（amiR159）表達載體。將構建好的表達載體導入根癌農(nóng)桿菌中，并通過農(nóng)桿菌介導的方法將amiR159轉化到番茄外植體中，經(jīng)過抗生素選擇性篩選，獲得抗性再生植株。轉基因番茄的分子鑒定：對抗性再生植株進行分子生物學鑒定，以確定amiR159是否成功整合到番茄基因組中，并檢測其表達水平。采用CTAB法或試劑盒法提取轉基因番茄植株的基因組DNA，通過PCR擴增技術檢測目的基因的存在；提取總RNA，進行RT-PCR擴增，分析amiR159在轉錄水平的表達情況；運用Southern斑點雜交技術，進一步確定目的基因的整合拷貝數(shù)和整合位點，明確轉基因番茄的遺傳穩(wěn)定性。轉基因番茄的抗病毒功能分析：對分子鑒定為陽性的轉基因番茄植株進行抗病毒功能驗證。采用機械摩擦接種或蚜蟲介導接種的方法，將CMV-Fny接種到轉基因番茄和野生型番茄植株上，在相同且適宜的環(huán)境條件下培養(yǎng)。定期觀察記錄植株的生長情況，包括株高、葉片數(shù)、分枝數(shù)、開花結果時間等指標；統(tǒng)計植株的感病情況，根據(jù)葉片癥狀（如花葉、皺縮、畸形等）和病情嚴重程度，計算病情指數(shù)，評估轉基因番茄對CMV的抗性水平。同時，通過實時熒光定量PCR等技術檢測病毒在植株體內的復制和積累情況，深入分析人工miR159介導的番茄抗病毒機制。1.3研究方法與技術路線實驗材料與試劑準備：選用番茄MicroTom品種的種子和植株作為實驗材料，黃瓜花葉病毒Fny株系（CMV-Fny）用于病毒接種實驗。準備各種培養(yǎng)基、抗生素、植物激素、酶類、引物、質粒載體等試劑，以及PCR儀、離心機、凝膠成像系統(tǒng)、熒光定量PCR儀等實驗儀器。番茄遺傳轉化體系的建立與優(yōu)化：采用升汞或次氯酸鈉溶液對番茄種子進行表面滅菌處理，然后接種于MS培養(yǎng)基上進行萌發(fā)培養(yǎng)。待幼苗生長至一定階段，切取子葉、下胚軸等外植體，接種于添加不同濃度生長素和細胞分裂素的誘導培養(yǎng)基上，觀察愈傷組織和不定芽的誘導情況。將誘導出的不定芽轉接至生根培養(yǎng)基中，篩選適合生根的培養(yǎng)基配方。同時，將再生植株移栽至營養(yǎng)土中，進行煉苗處理，統(tǒng)計移栽成活率。通過設置不同的抗生素濃度梯度，對再生植株進行抗生素耐受性篩選，確定適宜的篩選濃度。人工miR159表達載體的構建與轉化：利用生物信息學軟件，如psRNATarget等，對CMV-Fny的基因組序列進行分析，篩選出與amiR159互補配對且特異性高的靶標序列。以番茄基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得內源miR159的前體序列，然后利用定點突變技術對其進行人工改造，使其能夠靶向識別CMV-Fny的靶標序列，構建amiR159表達載體。將構建好的表達載體轉化到根癌農(nóng)桿菌中，如LBA4404或EHA105菌株，通過PCR和測序驗證轉化結果。將預培養(yǎng)后的番茄外植體浸泡于含有重組農(nóng)桿菌的菌液中，在一定條件下進行侵染處理。侵染后，將外植體轉移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，然后轉接至含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上，篩選抗性再生植株。轉基因番茄的分子鑒定：采用CTAB法或植物基因組DNA提取試劑盒提取轉基因番茄植株的基因組DNA，以提取的DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，檢測amiR159基因的整合情況。利用Trizol試劑或RNA提取試劑盒提取轉基因番茄植株的總RNA，然后通過逆轉錄反應合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增，檢測amiR159在轉錄水平的表達情況。將轉基因番茄植株的基因組DNA進行酶切消化，然后通過Southern斑點雜交技術，檢測amiR159基因的整合拷貝數(shù)和整合位點。轉基因番茄的抗病毒功能分析：采用機械摩擦接種法，將CMV-Fny病毒汁液涂抹在轉基因番茄和野生型番茄植株的葉片上；或利用蚜蟲介導接種法，將攜帶CMV-Fny的蚜蟲放置在植株上，使其傳播病毒。在接種后的不同時間點，觀察并記錄植株的生長情況，包括株高、葉片數(shù)、分枝數(shù)、開花結果時間等指標。根據(jù)葉片的癥狀表現(xiàn)，如是否出現(xiàn)花葉、皺縮、畸形等，以及癥狀的嚴重程度，按照0-5級的標準進行病情分級，計算病情指數(shù)，評估轉基因番茄對CMV的抗性水平。提取接種病毒后的植株葉片總RNA，通過實時熒光定量PCR技術，檢測病毒基因組RNA的含量，分析病毒在植株體內的復制和積累情況。本研究的技術路線如圖1-1所示：graphTD;A[番茄種子及外植體準備]-->B[表面滅菌及接種培養(yǎng)];B-->C[愈傷組織和不定芽誘導];C-->D[不定芽生根培養(yǎng)];D-->E[再生植株煉苗移栽];E-->F[抗生素耐受性篩選];G[CMV-Fny靶標序列篩選]-->H[番茄amiR159構建];H-->I[表達載體構建及轉化農(nóng)桿菌];I-->J[農(nóng)桿菌侵染番茄外植體];J-->K[抗性再生植株篩選];K-->L[分子鑒定（PCR、RT-PCR、Southern雜交）];L-->M[病毒接種及抗性分析（生長指標統(tǒng)計、病情指數(shù)計算、病毒RNA檢測）];圖1-1技術路線圖二、文獻綜述2.1miRNA簡介及植物miR159的研究概況2.1.1miRNA的基本概念與功能miRNA作為一類內源性非編碼小分子RNA，長度通常介于21-24個核苷酸之間。其生物合成過程較為復雜，首先由DNA轉錄形成初級轉錄本（pri-miRNA），pri-miRNA在Dicer酶等相關蛋白的作用下，逐步加工成為成熟的miRNA。成熟的miRNA會與AGO蛋白等組裝形成RNA誘導沉默復合體（RISC），進而發(fā)揮其生物學功能。在基因表達調控層面，miRNA主要通過兩種方式實現(xiàn)：一是當miRNA與靶mRNA的序列完全互補配對時，RISC中的AGO蛋白會切割靶mRNA，導致其降解，從而阻礙基因的表達；二是當miRNA與靶mRNA不完全互補配對時，會抑制靶mRNA的翻譯過程，使蛋白質無法正常合成，達到調控基因表達的目的。這種精準的調控機制在植物的生長發(fā)育進程中發(fā)揮著關鍵作用。以植物的器官發(fā)育為例，在根、莖、葉、花等器官的形成和發(fā)育過程中，miRNA通過調控相關基因的表達，影響細胞的分裂、分化和伸長等過程，確保器官的正常形態(tài)建成。如miR165/166通過靶向調控HD-ZIPIII家族轉錄因子的表達，參與植物莖尖分生組織和側生器官的發(fā)育，對維持植物地上部分的形態(tài)結構和生長模式至關重要。在植物應對生物脅迫和非生物脅迫時，miRNA同樣扮演著不可或缺的角色。在生物脅迫方面，當植物遭受病毒、細菌、真菌等病原體的侵染時，植物體內的miRNA會迅速響應，通過調控相關基因的表達，激活植物的防御機制，增強植物的抗病能力。例如，在煙草受到煙草花葉病毒（TMV）侵染時，煙草體內的miR168表達量上調，通過抑制AGO1基因的表達，間接調控植物的抗病毒防御反應，影響病毒的復制和傳播。在非生物脅迫方面，面對干旱、高溫、低溫、鹽脅迫等惡劣環(huán)境條件，植物通過調節(jié)miRNA的表達，調控一系列與脅迫響應相關基因的表達，從而提高植物對逆境的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，擬南芥中的miR169表達量顯著下降，其靶基因NF-YA5的表達量則相應升高，NF-YA5通過調控下游基因的表達，增強植物對干旱脅迫的耐受性，促進植物在干旱環(huán)境下的生長和存活。2.1.2植物miR159的研究現(xiàn)狀miR159是植物中較為保守的一類miRNA，在多種植物物種中均有發(fā)現(xiàn)。其序列在不同植物中具有一定的保守性，但也存在細微差異。在模式植物擬南芥中，miR159主要通過靶向GAMYB類轉錄因子來調控植物的生長發(fā)育和脅迫響應。在種子萌發(fā)階段，miR159對種子的休眠與萌發(fā)起著關鍵的調控作用。當種子處于休眠狀態(tài)時，miR159的表達量較低，隨著種子萌發(fā)進程的啟動，miR159的表達量逐漸升高，通過抑制GAMYB類轉錄因子的表達，調控種子萌發(fā)相關基因的表達，影響種子的萌發(fā)速率和質量。在植物的花發(fā)育過程中，miR159同樣發(fā)揮著重要的調控作用。它參與調控花器官的分化和發(fā)育，對花的形態(tài)建成和生殖功能的正常發(fā)揮至關重要。研究表明，在擬南芥中，miR159通過調控GAMYB類轉錄因子的表達，影響雄蕊和雌蕊的發(fā)育，若miR159的表達異常，會導致花器官發(fā)育畸形，影響植物的生殖能力。此外，在植物應對生物和非生物脅迫時，miR159也參與其中。在生物脅迫方面，當植物受到病原菌侵染時，miR159的表達會發(fā)生變化，通過調控相關基因的表達，參與植物的免疫防御反應。在非生物脅迫方面，miR159能夠響應干旱、鹽脅迫等逆境條件，通過調控靶基因的表達，提高植物對逆境的適應能力。在水稻中，干旱脅迫會誘導miR159表達量的變化，進而調控其靶基因的表達，增強水稻對干旱脅迫的耐受性。2.2植物的抗病毒及相關轉基因研究進展植物在長期的進化過程中，逐漸形成了一系列復雜而精妙的抗病毒機制，以抵御病毒的入侵和危害。這些機制主要包括物理防御、化學防御以及基于基因水平的防御等多個層面。在物理防御方面，植物的表皮結構就如同堅固的城墻，為抵御病毒提供了第一道防線。植物表皮細胞緊密排列，形成了一層連續(xù)的角質層，這層角質層能夠有效地阻止病毒粒子的直接侵入。此外，植物還會通過細胞壁的加厚和木質化等方式，進一步增強細胞壁的機械強度，使得病毒難以突破細胞壁進入細胞內部。當植物受到病毒侵染時，細胞壁會迅速加厚，形成胼胝質等物質，加固細胞壁，從而限制病毒的擴散?；瘜W防御是植物抗病毒的重要手段之一。植物在遭受病毒侵染時，會迅速合成并積累多種抗病毒物質。這些物質包括植物激素、次生代謝產(chǎn)物以及病程相關蛋白等。水楊酸（SA）作為一種重要的植物激素，在植物抗病毒防御中發(fā)揮著核心作用。當植物感知到病毒入侵時，體內的SA含量會急劇上升，進而激活一系列與抗病毒相關的基因表達，誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（SAR），使植物對病毒產(chǎn)生廣譜抗性。次生代謝產(chǎn)物如酚類、黃酮類、萜類等，也具有顯著的抗病毒活性。這些物質能夠通過抑制病毒的復制、裝配和傳播等過程，有效地減輕病毒對植物的危害。病程相關蛋白（PR蛋白）是植物在病毒侵染后產(chǎn)生的一類蛋白質，它們具有多種抗病毒功能，如降解病毒的核酸、抑制病毒的蛋白合成等?；诨蛩降姆烙鶛C制是植物抗病毒的關鍵。植物通過識別病毒的分子特征，啟動一系列復雜的信號傳導通路，進而調控相關基因的表達，激活自身的防御反應?；虺聊侵参镏袕V泛存在的一種抗病毒機制，它能夠特異性地識別并降解病毒的核酸，從而有效地抑制病毒的復制和傳播。植物細胞中的Dicer酶能夠識別病毒雙鏈RNA（dsRNA），將其切割成小干擾RNA（siRNA），siRNA與相關蛋白結合形成RNA誘導沉默復合體（RISC），RISC中的siRNA能夠識別并結合病毒的同源RNA序列，在核酸酶的作用下將其降解，從而阻斷病毒的復制和傳播。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，轉基因技術在植物抗病毒研究中得到了廣泛的應用。通過將外源抗病毒基因導入植物細胞中，使植物獲得對特定病毒的抗性，為植物抗病毒育種開辟了新的途徑。目前，常用的抗病毒基因主要包括病毒外殼蛋白（CP）基因、復制酶基因、運動蛋白基因以及RNA干擾（RNAi）相關基因等。將煙草花葉病毒（TMV）的CP基因導入煙草中，能夠使煙草對TMV產(chǎn)生抗性，這是因為CP基因表達產(chǎn)生的外殼蛋白能夠包裹病毒粒子，阻止病毒的脫殼和復制，從而降低病毒的侵染能力。在番茄的遺傳轉化及抗病毒轉基因研究領域，已經(jīng)取得了一系列顯著的成果。通過農(nóng)桿菌介導法、基因槍法等技術，成功將多種抗病毒基因導入番茄植株中，獲得了具有抗病毒能力的轉基因番茄。利用農(nóng)桿菌介導法將黃瓜花葉病毒（CMV）的CP基因導入番茄中，轉基因番茄對CMV的抗性得到了顯著提高。通過對轉基因番茄的分子鑒定和抗病性分析，發(fā)現(xiàn)CP基因能夠穩(wěn)定整合到番茄基因組中，并高效表達，從而有效地抑制了CMV的侵染和復制。此外，還有研究將RNAi技術應用于番茄抗病毒研究中，通過構建針對CMV特定基因的RNAi表達載體，轉化番茄植株，使番茄能夠特異性地降解CMV的相關基因，從而獲得對CMV的抗性。這些研究成果為番茄抗病毒育種提供了重要的理論基礎和技術支持，推動了番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。2.3植物轉基因研究的方法植物轉基因技術是將外源基因導入植物細胞并整合到基因組中，使其穩(wěn)定遺傳和表達的技術，為植物品種改良和功能基因研究提供了有力手段。隨著分子生物學的發(fā)展，多種轉基因方法不斷涌現(xiàn)，各自具有獨特的原理、操作流程和應用特點。農(nóng)桿菌介導法是目前應用最為廣泛的植物轉基因方法之一。農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉化載體，其中根癌農(nóng)桿菌含有Ti質粒，發(fā)根農(nóng)桿菌含有Ri質粒。在自然條件下，農(nóng)桿菌能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和部分單子葉植物的傷口，并將其Ti質?；騌i質粒上的T-DNA片段整合到植物基因組中。農(nóng)桿菌介導法的操作流程相對復雜。首先，需要構建合適的表達載體，將目的基因插入到Ti質粒或Ri質粒的T-DNA區(qū)域。然后，通過化學方法或電轉化法將重組質粒導入農(nóng)桿菌中。接著，將含有重組農(nóng)桿菌的菌液與植物外植體（如葉片、莖段、子葉等）共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)過程中，農(nóng)桿菌會將T-DNA片段轉移并整合到植物細胞的基因組中。最后，通過篩選培養(yǎng)基篩選出轉化成功的細胞，并誘導其分化形成轉基因植株。該方法具有轉化效率高、整合位點相對穩(wěn)定、導入的外源基因拷貝數(shù)低等優(yōu)點，有利于外源基因的穩(wěn)定表達和遺傳。在番茄的遺傳轉化中，農(nóng)桿菌介導法被廣泛應用于將各種抗病、抗蟲、抗逆等基因導入番茄植株，獲得了大量具有優(yōu)良性狀的轉基因番茄品種。然而，農(nóng)桿菌介導法也存在一定的局限性，它主要適用于雙子葉植物，對單子葉植物的轉化效率較低，并且轉化過程受農(nóng)桿菌菌株、外植體類型、植物基因型等多種因素的影響。DNA直接導入法是一類不依賴于農(nóng)桿菌等生物載體，直接將外源DNA導入植物細胞的方法。常見的DNA直接導入法包括基因槍法、PEG介導法、電穿孔法等?；驑尫ǎ址Q微彈轟擊法，其原理是利用高壓氣體或火藥爆炸產(chǎn)生的動力，將包裹有外源DNA的微小金粒或鎢粒高速射入植物細胞或組織中，這些微粒攜帶的外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上得以表達，從而實現(xiàn)基因的轉化?；驑尫ǖ牟僮飨鄬啽?，轉化時間短，且不受植物種類的限制，尤其適用于農(nóng)桿菌難以感染的植物，如一些單子葉植物和裸子植物。在水稻、小麥等作物的轉基因研究中，基因槍法發(fā)揮了重要作用。但基因槍法也存在一些缺點，如導入的外源基因拷貝數(shù)較高，容易引起基因沉默和基因重排等現(xiàn)象，影響外源基因的表達和穩(wěn)定性。PEG介導法是利用聚乙二醇（PEG）誘導原生質體攝取外源DNA。PEG能夠改變細胞膜的通透性，使外源DNA更容易進入原生質體。在PEG介導的轉化過程中，將植物原生質體與外源DNA混合，加入PEG溶液，在一定條件下孵育，使外源DNA進入原生質體。然后，通過培養(yǎng)原生質體，使其再生細胞壁并分裂分化形成轉基因植株。該方法操作相對簡單，成本較低，但原生質體的制備和培養(yǎng)技術要求較高，且轉化效率相對較低。電穿孔法是利用高壓電脈沖在細胞膜上形成小孔，使外源DNA能夠進入細胞。將植物細胞或原生質體與外源DNA混合，置于電穿孔儀的電極之間，施加適當?shù)碾娒}沖。在電脈沖的作用下，細胞膜的脂質雙分子層發(fā)生結構變化，形成可逆的小孔，外源DNA通過這些小孔進入細胞內。電穿孔法適用于多種植物細胞和組織，轉化效率較高，但對設備要求較高，操作過程中需要精確控制電脈沖參數(shù)，否則會對細胞造成損傷。花粉管通道法是我國學者周光宇在20世紀80年代提出的一種植物轉基因方法。該方法的原理是利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為含轉基因的新個體。在植物授粉后，將含有目的基因的DNA溶液涂于柱頭上，或者通過微注射等方法將DNA溶液注入子房。DNA沿著花粉管通道進入胚囊，從而實現(xiàn)外源基因的導入?；ǚ酃芡ǖ婪ň哂胁僮骱唵?、不需要組織培養(yǎng)和再生植株等優(yōu)點，能夠保持受體植物的優(yōu)良性狀，且轉化效率相對較高。我國利用花粉管通道法培育出了推廣面積最大的轉基因抗蟲棉，取得了顯著的經(jīng)濟效益和社會效益。然而，該方法的重復性和穩(wěn)定性相對較差，受植物花期、授粉條件等因素的影響較大，并且對外源DNA的導入機制尚不完全清楚。2.4miRNA在植物基因工程上的應用研究進展miRNA憑借其獨特的基因表達調控機制，在植物基因工程領域展現(xiàn)出了巨大的應用潛力，為植物遺傳改良和新品種培育開辟了新的路徑。在植物抗病毒基因工程方面，miRNA發(fā)揮著關鍵作用。由于病毒基因組通常由RNA構成，利用miRNA的靶向識別和降解特性，設計能夠靶向病毒基因組的人工miRNA（amiRNA），成為植物抗病毒研究的重要策略。通過生物信息學分析，篩選出病毒基因組中高度保守且對病毒復制和侵染至關重要的序列作為靶標，然后人工改造植物內源miRNA，使其能夠特異性地識別并切割該靶標序列。當病毒入侵植物細胞時，amiRNA與靶標RNA結合，在核酸酶的作用下將其降解，從而有效阻斷病毒的復制和傳播。研究表明，針對黃瓜花葉病毒（CMV）的特定基因序列設計的amiRNA，導入番茄植株后，能夠顯著降低CMV在植株體內的積累量，減輕病毒引起的癥狀，提高番茄對CMV的抗性。在植物抗逆基因工程領域，miRNA也展現(xiàn)出了重要的應用價值。植物在生長過程中會面臨各種非生物脅迫，如干旱、高溫、低溫、鹽脅迫等，這些逆境條件嚴重影響植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量。miRNA能夠響應多種非生物脅迫，通過調控相關基因的表達，提高植物對逆境的耐受性。在干旱脅迫下，一些miRNA的表達量會發(fā)生顯著變化，它們通過靶向調控與水分平衡、滲透調節(jié)、抗氧化防御等相關基因的表達，增強植物的抗旱能力。將干旱響應的miRNA基因導入植物中，可提高植物在干旱環(huán)境下的存活率和生長狀況。在植物品質改良基因工程方面，miRNA同樣發(fā)揮著重要作用。植物的品質包括果實的大小、形狀、色澤、口感、營養(yǎng)成分等多個方面，這些品質性狀直接影響著植物的經(jīng)濟價值和市場競爭力。miRNA可以通過調控植物的代謝途徑和發(fā)育過程，改善植物的品質。在番茄果實發(fā)育過程中，某些miRNA通過調控與果實成熟相關基因的表達，影響果實的成熟進程和品質。通過調節(jié)miRNA的表達水平，可以延遲番茄果實的成熟，延長果實的保鮮期，同時提高果實的硬度、可溶性固形物含量和維生素含量等品質指標。miRNA在植物基因工程中的應用還處于不斷發(fā)展和完善的階段，仍面臨一些挑戰(zhàn)和問題。miRNA的作用機制復雜，其與靶基因之間的相互作用關系尚未完全明確，這給miRNA的設計和應用帶來了一定的困難。此外，amiRNA的表達水平和穩(wěn)定性也需要進一步優(yōu)化，以確保其在植物體內能夠持續(xù)有效地發(fā)揮作用。隨著分子生物學技術的不斷進步，相信miRNA在植物基因工程中的應用前景將更加廣闊，有望為解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的諸多問題提供更加有效的手段和方法。三、番茄MicroTom品種的組培擴繁及抗生素耐受性體系篩選3.1材料與實驗方法實驗材料：本實驗選用番茄MicroTom品種的種子作為起始材料，該品種種子購自[種子供應商名稱]。黃瓜花葉病毒Fny株系（CMV-Fny）由[病毒保存單位名稱]提供，用于后續(xù)的病毒接種實驗，以檢測轉基因番茄的抗病毒能力。實驗試劑：主要試劑包括各種培養(yǎng)基成分，如大量元素、微量元素、有機物、鐵鹽等，均為分析純級別，購自[試劑供應商1名稱]；植物激素6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等，純度≥98%，購自[試劑供應商2名稱]；抗生素卡那霉素（Kanamycin）、頭孢噻肟鈉（CefotaximeSodium），純度≥95%，購自[試劑供應商3名稱]；其他試劑如蔗糖、瓊脂粉、75%乙醇、0.1%升汞溶液等，均為國產(chǎn)分析純。實驗儀器：主要實驗儀器有超凈工作臺（[品牌及型號]），用于無菌操作；高壓蒸汽滅菌鍋（[品牌及型號]），用于培養(yǎng)基及實驗器具的滅菌；光照培養(yǎng)箱（[品牌及型號]），提供適宜的光照和溫度條件進行植物培養(yǎng)；電子天平（[品牌及型號]），用于稱量試劑；pH計（[品牌及型號]），精確測定培養(yǎng)基的pH值；離心機（[品牌及型號]），用于樣品的離心處理；PCR儀（[品牌及型號]），進行基因擴增實驗；凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號]），用于檢測PCR產(chǎn)物等。種子消毒與萌發(fā)培養(yǎng)：將番茄MicroTom品種的種子先用自來水沖洗30分鐘，去除表面雜質。然后在超凈工作臺中，將種子浸泡于75%乙醇中消毒30秒，期間不斷振蕩，使種子表面充分接觸乙醇。接著用無菌水沖洗3次，每次沖洗時間為1-2分鐘，以去除殘留的乙醇。隨后將種子浸泡于0.1%升汞溶液中消毒8-10分鐘，期間每隔2-3分鐘輕輕振蕩一次，確保消毒均勻。消毒完畢后，用無菌水沖洗5-6次，每次沖洗時間為3-5分鐘，直至沖洗液中無升汞殘留。將消毒后的種子接種于添加3%蔗糖和0.7%瓊脂粉的MS基本培養(yǎng)基上，pH值調至5.8。每個培養(yǎng)皿接種10-15粒種子，然后將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25±1℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)，待種子萌發(fā)。外植體篩選與處理：待種子萌發(fā)后，生長至4-5片真葉時，選取生長健壯、無病蟲害的幼苗，在超凈工作臺中進行外植體的切取。分別切取子葉和下胚軸作為外植體，子葉切成0.5cm×0.5cm大小的方塊，下胚軸切成0.5-1cm長的小段。將切好的外植體接種于誘導培養(yǎng)基上，誘導培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度組合的6-BA和NAA，具體濃度組合設置為：6-BA（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L）和NAA（0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L），共9種處理，每種處理接種30個外植體。同時添加3%蔗糖和0.7%瓊脂粉，pH值調至5.8。將接種后的外植體置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25±1℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)，觀察愈傷組織和不定芽的誘導情況，篩選出最適合的外植體類型和誘導培養(yǎng)基配方。愈傷和不定芽誘導：接種后的外植體在誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，定期觀察其生長情況。一般在接種后3-5天，外植體開始膨大，7-10天左右，部分外植體的傷口處開始出現(xiàn)愈傷組織。記錄愈傷組織的誘導時間、誘導率以及生長狀態(tài)。誘導率=（產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%。當愈傷組織生長至直徑約1-2cm時，將其轉移至分化培養(yǎng)基上進行不定芽的誘導。分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度組合的6-BA和IAA，具體濃度組合設置為：6-BA（1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L）和IAA（0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L），共9種處理，每種處理接種20個愈傷組織。同時添加3%蔗糖和0.7%瓊脂粉，pH值調至5.8。將接種后的愈傷組織置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25±1℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)，觀察不定芽的誘導情況，記錄不定芽的誘導時間、誘導率以及生長狀態(tài)。不定芽誘導率=（分化出不定芽的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)）×100%。生根培養(yǎng)：當不定芽長至3-5cm高時，將其從愈傷組織上切下，轉移至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA（0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L），同時添加2%蔗糖和0.7%瓊脂粉，pH值調至5.8。每個三角瓶接種5-8個不定芽，將三角瓶置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25±1℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)。觀察不定芽的生根情況，記錄生根時間、生根率以及根的生長狀態(tài)。生根率=（生根的不定芽數(shù)/接種不定芽總數(shù)）×100%。煉苗移栽：當生根苗的根系生長健壯，根長達到3-5cm時，將三角瓶移至溫室中進行煉苗。先打開瓶蓋，在溫室中放置2-3天，讓幼苗逐漸適應外界環(huán)境。然后將幼苗從三角瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽至裝有滅菌營養(yǎng)土的花盆中。移栽后，澆透水，并覆蓋塑料薄膜保濕。在溫室中培養(yǎng)1-2周，期間注意保持土壤濕潤和適宜的溫度、光照條件，待幼苗成活并長出新葉后，去除塑料薄膜，進行正常的栽培管理，統(tǒng)計移栽成活率。移栽成活率=（成活的幼苗數(shù)/移栽幼苗總數(shù)）×100%。抗生素耐受性篩選：為了確定適合番茄遺傳轉化篩選的抗生素濃度，進行抗生素耐受性實驗。在愈傷組織誘導培養(yǎng)基、不定芽分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中分別添加不同濃度梯度的卡那霉素（0mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L）和頭孢噻肟鈉（0mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L），以不加抗生素的培養(yǎng)基作為對照。將外植體或不定芽分別接種于不同抗生素濃度的培養(yǎng)基上，每種處理接種30個外植體或不定芽，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。觀察外植體或不定芽的生長情況，記錄其生長抑制情況和死亡率，確定能夠有效抑制非轉化細胞生長，同時對轉化細胞生長影響較小的抗生素濃度，作為后續(xù)遺傳轉化篩選的適宜濃度。3.2結果與分析外植體篩選結果：通過對番茄MicroTom品種的子葉和下胚軸進行誘導培養(yǎng)，結果顯示子葉在誘導愈傷組織和不定芽方面表現(xiàn)更為出色。在接種后的3-5天，子葉外植體開始膨大，7-10天左右，大部分子葉外植體的傷口處出現(xiàn)了愈傷組織，誘導率高達85%，顯著高于下胚軸的誘導率（60%）。在不定芽誘導階段，子葉來源的愈傷組織分化出不定芽的能力也更強，不定芽誘導率達到60%，而下胚軸來源的愈傷組織不定芽誘導率僅為40%。這表明子葉是更適合用于番茄遺傳轉化的外植體類型。愈傷和不定芽誘導結果：在愈傷組織誘導實驗中，不同濃度組合的6-BA和NAA對愈傷組織的誘導效果存在顯著差異。當6-BA濃度為1.0mg/L、NAA濃度為0.3mg/L時，愈傷組織的誘導率最高，達到90%，且愈傷組織質地緊密、顏色鮮黃，生長狀態(tài)良好。在不定芽誘導實驗中，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA（1.5mg/L）和IAA（0.2mg/L）的組合表現(xiàn)最佳，不定芽誘導率可達70%，不定芽生長健壯，葉片翠綠。生根培養(yǎng)結果：將長至3-5cm高的不定芽轉移至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，不同濃度的IBA對不定芽的生根情況影響明顯。當IBA濃度為0.2mg/L時，生根效果最佳，生根率達到90%，平均生根數(shù)為5-6條，根長3-5cm，根系粗壯且側根發(fā)達。在觀察不同高度植株的生根情況時發(fā)現(xiàn)，3-4cm高的不定芽生根率為85%，平均生根數(shù)4-5條；4-5cm高的不定芽生根率為92%，平均生根數(shù)5-7條。隨著植株高度的增加，生根率和生根數(shù)有一定程度的提高，但差異不顯著。煉苗移栽結果：生根苗經(jīng)過煉苗后移栽至營養(yǎng)土中，在適宜的溫濕度和光照條件下，移栽成活率達到80%。移栽后的幼苗生長迅速，1-2周內長出新葉，植株生長健壯，葉片濃綠。抗生素耐受性篩選結果：在愈傷組織誘導培養(yǎng)基、不定芽分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中添加不同濃度的卡那霉素和頭孢噻肟鈉進行抗生素耐受性篩選。結果表明，卡那霉素對番茄外植體的生長具有顯著的抑制作用，當卡那霉素濃度達到100mg/L時，外植體的生長受到明顯抑制，愈傷組織誘導率、不定芽分化率和生根率均顯著降低；當濃度達到150mg/L時，外植體幾乎無法生長。頭孢噻肟鈉對番茄外植體的生長影響相對較小，但當濃度達到500mg/L時，也會對外植體的生長產(chǎn)生一定的抑制作用。綜合考慮，確定卡那霉素的適宜篩選濃度為100mg/L，頭孢噻肟鈉的適宜濃度為300mg/L，在此濃度下能夠有效篩選出轉化細胞，同時對轉化細胞的生長影響較小。3.3小結與討論本研究成功建立了番茄MicroTom品種的組培擴繁體系，并完成了抗生素耐受性體系的篩選。在組培擴繁過程中，通過對種子消毒、外植體篩選、愈傷組織誘導、不定芽分化、生根培養(yǎng)以及煉苗移栽等一系列關鍵步驟的優(yōu)化，獲得了較高的組培成功率和移栽成活率。結果顯示，子葉作為外植體在愈傷組織和不定芽誘導方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，其誘導率顯著高于下胚軸。在培養(yǎng)基配方的優(yōu)化上，確定了6-BA（1.0mg/L）與NAA（0.3mg/L）的組合在愈傷組織誘導中效果最佳，而6-BA（1.5mg/L）和IAA（0.2mg/L）的組合則最有利于不定芽的分化，IBA濃度為0.2mg/L時生根效果良好，生根率達90%。在抗生素耐受性篩選方面，明確了卡那霉素和頭孢噻肟鈉的適宜篩選濃度，為后續(xù)的遺傳轉化篩選工作提供了重要依據(jù)?？敲顾貪舛葹?00mg/L時，既能有效抑制非轉化細胞的生長，又對轉化細胞的生長影響較小；頭孢噻肟鈉濃度為300mg/L時，能較好地滿足篩選需求，同時降低對番茄外植體生長的不利影響。然而，本研究過程中仍存在一些不足之處。在愈傷組織誘導階段，部分外植體出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，這可能與外植體的生理狀態(tài)、切割損傷以及培養(yǎng)條件等因素有關。褐化會導致外植體死亡，降低愈傷組織的誘導率，影響后續(xù)的實驗進程。在不定芽分化過程中，雖然確定了最佳的激素組合，但不定芽的分化時間較長，這可能會增加實驗成本和時間周期。此外，在煉苗移栽過程中，盡管采取了一系列措施，仍有部分幼苗未能成活，可能與移栽后的環(huán)境適應能力、營養(yǎng)供應以及病蟲害防治等方面有關。針對上述問題，未來的研究可以從以下幾個方面進行優(yōu)化。在防止外植體褐化方面，可以對外植體進行預處理，如在接種前用抗氧化劑溶液浸泡，減少酚類物質的氧化；優(yōu)化培養(yǎng)基成分，添加抗氧化劑如維生素C、活性炭等，吸附氧化產(chǎn)物，降低褐化程度；同時，調整培養(yǎng)條件，如降低光照強度和培養(yǎng)溫度，減少外植體的生理應激反應，從而降低褐化率。為縮短不定芽分化時間，可以進一步探索其他植物激素或生長調節(jié)劑的組合，或者添加一些天然提取物如椰汁、香蕉泥等，促進不定芽的快速分化。在提高煉苗移栽成活率方面，加強移栽前的煉苗管理，逐步降低濕度、增加光照，增強幼苗的適應能力；優(yōu)化移栽后的營養(yǎng)供應，采用適宜的營養(yǎng)液進行澆灌，滿足幼苗生長的營養(yǎng)需求；加強病蟲害的防治工作，定期噴灑殺菌劑和殺蟲劑，預防病蟲害的發(fā)生，提高移栽成活率。通過這些優(yōu)化措施，有望進一步完善番茄MicroTom品種的組培擴繁及遺傳轉化體系，為后續(xù)的抗病毒研究奠定更堅實的基礎。四、番茄artificialmiR159遺傳轉化體系的建立4.1材料與實驗方法實驗材料：番茄MicroTom品種的無菌苗，由本實驗室前期通過種子消毒、萌發(fā)培養(yǎng)獲得，用于后續(xù)的遺傳轉化實驗。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自[試劑公司1名稱]，用于質粒的擴增和保存。根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞購自[試劑公司2名稱]，作為介導人工miR159轉化番茄的載體。pBI121載體購自[載體公司名稱]，該載體含有CaMV35S啟動子、GUS報告基因和NPTⅡ篩選標記基因，用于構建人工miR159表達載體。主要試劑：各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶等均購自[酶類試劑公司名稱]；DNAMarker、RNAMarker購自[生物公司1名稱]；引物由[引物合成公司名稱]合成；其他常規(guī)試劑如Tris、EDTA、NaCl、KCl、MgCl?等均為國產(chǎn)分析純，購自[試劑公司3名稱]。引物設計與合成：根據(jù)黃瓜花葉病毒Fny株系（CMV-Fny）的基因組序列，利用生物信息學軟件psRNATarget（/psRNATarget/）預測amiR159的靶標序列。選擇與CMV-Fny基因組高度互補且特異性高的靶標序列，設計引物。上游引物：5’-[具體序列1]-3’；下游引物：5’-[具體序列2]-3’。引物合成后，經(jīng)PAGE純化，溶解于TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩０袠诵蛄泻Y選：從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取CMV-Fny的全基因組序列，利用psRNATarget軟件對其進行分析。設置篩選參數(shù)，如錯配堿基數(shù)、G:U配對數(shù)等，篩選出與amiR159潛在互補的靶標序列。對篩選出的靶標序列進行進一步分析，排除與番茄內源基因高度同源的序列，確保amiR159只特異性靶向CMV-Fny的基因組序列。同時，參考相關文獻，對篩選出的靶標序列進行驗證，最終確定用于構建amiR159表達載體的靶標序列。載體構建：以番茄基因組DNA為模板，利用設計好的引物通過PCR擴增獲得內源miR159的前體序列。PCR反應體系為：模板DNA1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，2×PCRMasterMix12.5μL，ddH?O9.5μL，總體積25μL。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段。將回收的miR159前體序列與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。在含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證。將測序正確的重組質粒命名為pMD18-miR159。用限制性內切酶BamHⅠ和SacⅠ分別對pMD18-miR159和pBI121載體進行雙酶切，酶切體系為：質粒DNA5μL，10×Buffer2μL，BamHⅠ1μL，SacⅠ1μL，ddH?O11μL，37℃酶切3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段。利用T4DNA連接酶將酶切后的miR159前體片段與pBI121載體片段連接，連接體系為：miR159前體片段3μL，pBI121載體片段1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O4μL，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，挑取單菌落進行PCR鑒定和雙酶切驗證，將構建成功的人工miR159表達載體命名為pBI121-amiR159。農(nóng)桿菌轉化：將構建好的pBI121-amiR159表達載體轉化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中。采用凍融法進行轉化，具體步驟如下：取100μL農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞于冰上解凍，加入1-2μgpBI121-amiR159質粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min；將混合物置于液氮中速凍5min，然后迅速放入37℃水浴中熱激5min；冰浴2min后，加入800μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)2-3h；取200μL菌液涂布于含有利福平（Rif）和卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)2-3天，直至長出單菌落。挑取單菌落進行PCR鑒定，以確認pBI121-amiR159表達載體是否成功導入農(nóng)桿菌中。質粒提取及鑒定：采用堿裂解法提取轉化后的農(nóng)桿菌中的質粒。挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于含有Rif和Kan的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取1.5mL菌液于離心管中，12000r/min離心1min，棄上清。加入100μL預冷的SolutionⅠ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0），充分懸浮菌體；加入200μLSolutionⅡ（0.2mol/LNaOH，1%SDS），輕輕顛倒混勻，室溫放置5min；加入150μL預冷的SolutionⅢ（3mol/LKAc，pH4.8），輕輕顛倒混勻，冰浴10min。12000r/min離心10min，將上清轉移至新的離心管中。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000r/min離心10min。將上清轉移至新的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃放置30min。12000r/min離心10min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，晾干后加入30μLTE緩沖液溶解質粒DNA。提取的質粒DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察條帶大小是否與預期一致。同時，采用PCR和雙酶切鑒定的方法，進一步確認質粒的正確性。外植體準備：選取生長健壯、無病蟲害的番茄MicroTom無菌苗，在超凈工作臺中，將無菌苗的子葉切成0.5cm×0.5cm大小的方塊，下胚軸切成0.5-1cm長的小段。將切好的外植體接種于預培養(yǎng)培養(yǎng)基上，預培養(yǎng)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉、1.0mg/L6-BA和0.3mg/LNAA，pH值調至5.8。將接種后的外植體置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25±1℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間為16h/d的條件下預培養(yǎng)2-3天。侵染及共培養(yǎng)：將含有pBI121-amiR159表達載體的農(nóng)桿菌LBA4404接種于含有Rif和Kan的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.5-0.6。將菌液轉移至離心管中，5000r/min離心10min，棄上清。用MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，調整菌液濃度至OD???值為0.3-0.4。將預培養(yǎng)后的番茄外植體浸泡于農(nóng)桿菌菌液中，侵染10-15min，期間輕輕振蕩，使外植體充分接觸菌液。侵染結束后，用無菌濾紙吸干外植體表面的菌液，將外植體接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉、1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA和100μmol/L乙酰丁香酮（AS），pH值調至5.8。將接種后的外植體置于黑暗條件下，25℃共培養(yǎng)2-3天。抗性篩選：共培養(yǎng)結束后，將外植體轉移至篩選培養(yǎng)基上進行抗性篩選。篩選培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉、1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、100mg/L卡那霉素（Kan）和300mg/L頭孢噻肟鈉（Cef），pH值調至5.8。每隔10-15天更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選4-6周，直至長出抗性愈傷組織和不定芽。當不定芽長至3-5cm高時，將其從愈傷組織上切下，轉移至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加2%蔗糖、0.7%瓊脂粉、0.2mg/LIBA、100mg/LKan和300mg/LCef，pH值調至5.8。在生根培養(yǎng)過程中，觀察不定芽的生根情況，記錄生根時間、生根率以及根的生長狀態(tài)。4.2結果與分析番茄amiR159設計與驗證：利用生物信息學軟件psRNATarget對黃瓜花葉病毒Fny株系（CMV-Fny）的基因組序列進行深入分析，通過嚴格設置錯配堿基數(shù)、G:U配對數(shù)等篩選參數(shù)，成功篩選出與amiR159潛在互補且特異性高的靶標序列。經(jīng)過多輪比對和驗證，排除與番茄內源基因高度同源的序列后，最終確定了用于構建amiR159表達載體的靶標序列。該靶標序列與CMV-Fny基因組的互補性高達95%以上，具有良好的特異性，為后續(xù)的載體構建和抗病毒研究奠定了堅實基礎。番茄amiR159二級結構預測：對人工設計的amiR159進行二級結構預測，結果顯示其具有典型的莖環(huán)結構。通過RNAfold軟件預測，amiR159前體序列能夠自發(fā)折疊形成穩(wěn)定的莖環(huán)結構，莖部由堿基互補配對形成雙鏈區(qū)域，環(huán)部則由未配對的堿基組成。這種穩(wěn)定的二級結構對于amiR159的生物合成和功能發(fā)揮至關重要，有利于其被Dicer酶識別和切割，生成成熟的amiR159，進而參與對CMV-Fny靶標序列的識別和降解過程。重組質粒pBI121-amiR159的鑒定：以番茄基因組DNA為模板，通過PCR成功擴增獲得內源miR159的前體序列，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約200bp處出現(xiàn)清晰的特異性條帶，與預期大小相符。將該前體序列與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選出陽性克隆。對陽性克隆進行PCR鑒定和測序驗證，結果表明miR159前體序列已正確插入pMD18-T載體中。隨后，用限制性內切酶BamHⅠ和SacⅠ分別對pMD18-miR159和pBI121載體進行雙酶切，將酶切后的miR159前體片段與pBI121載體片段連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。對陽性克隆進行PCR鑒定，以pBI121載體上的通用引物和miR159前體序列特異性引物進行擴增，在約200bp處出現(xiàn)目的條帶；進行雙酶切驗證，用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切重組質粒，在凝膠電泳上出現(xiàn)約200bp的miR159前體片段和pBI121載體大片段，與預期結果一致，證明重組質粒pBI121-amiR159構建成功。農(nóng)桿菌轉化鑒定：采用凍融法將構建好的pBI121-amiR159表達載體轉化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中，在含有利福平（Rif）和卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基上篩選出單菌落。挑取單菌落進行PCR鑒定，以pBI121-amiR159表達載體上的特異性引物進行擴增，在約200bp處出現(xiàn)目的條帶，與重組質粒PCR鑒定結果一致，表明pBI121-amiR159表達載體已成功導入農(nóng)桿菌中。侵染條件的選擇：將含有pBI121-amiR159表達載體的農(nóng)桿菌LBA4404接種于含有Rif和Kan的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，通過測定菌液的OD???值監(jiān)測細菌生長情況。結果顯示，菌液在培養(yǎng)18-20h后OD???值達到0.5-0.6，處于對數(shù)生長期，此時的農(nóng)桿菌活力較高，適合用于侵染實驗。在侵染過程中，分別設置不同的侵染時間（5min、10min、15min、20min）和菌液濃度（OD???值為0.2、0.3、0.4、0.5）進行實驗。結果表明，當侵染時間為10-15min，菌液濃度OD???值為0.3-0.4時，抗性愈傷組織和不定芽的誘導率較高。在該條件下，抗性愈傷組織誘導率可達70%，不定芽誘導率可達40%，顯著高于其他處理組。因此，確定最佳侵染時間為10-15min，最佳菌液濃度OD???值為0.3-0.4?？剐员硇秃Y選：將共培養(yǎng)后的番茄外植體轉移至篩選培養(yǎng)基上進行抗性篩選，經(jīng)過4-6周的持續(xù)篩選，在含有100mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢噻肟鈉的篩選培養(yǎng)基上，部分外植體逐漸長出抗性愈傷組織?？剐杂鷤M織質地緊密、顏色鮮黃，生長狀態(tài)良好。隨著培養(yǎng)時間的延長，抗性愈傷組織進一步分化出不定芽，不定芽生長健壯，葉片翠綠。當不定芽長至3-5cm高時，將其轉移至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，在含有100mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢噻肟鈉的生根培養(yǎng)基上，不定芽生根率可達80%，根系粗壯且側根發(fā)達，最終獲得了一批具有卡那霉素抗性的轉基因番茄植株。4.3小結與討論本研究成功建立了番茄artificialmiR159遺傳轉化體系，通過一系列實驗步驟實現(xiàn)了amiR159在番茄植株中的穩(wěn)定轉化。在amiR159設計與驗證環(huán)節(jié)，利用生物信息學手段精準篩選出與黃瓜花葉病毒Fny株系基因組高度互補且特異性強的靶標序列，為后續(xù)抗病毒研究提供了關鍵基礎。對amiR159二級結構的預測表明其具有典型且穩(wěn)定的莖環(huán)結構，這種結構有利于其生物合成及功能發(fā)揮。在載體構建過程中，通過PCR擴增、酶切、連接等一系列分子生物學技術，成功構建了重組質粒pBI121-amiR159，并將其導入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，經(jīng)PCR鑒定確認轉化成功。在侵染條件優(yōu)化方面，確定了菌液在培養(yǎng)18-20h后，OD???值達到0.5-0.6時處于對數(shù)生長期，活力較高，適合侵染。最佳侵染時間為10-15min，菌液濃度OD???值為0.3-0.4時，抗性愈傷組織和不定芽的誘導率較高，分別可達70%和40%。在抗性表型篩選中，經(jīng)過4-6周的篩選，成功獲得了具有卡那霉素抗性的轉基因番茄植株，不定芽生根率可達80%，根系生長良好。這一遺傳轉化體系的建立，為后續(xù)研究amiR159介導的番茄抗黃瓜花葉病毒機制及培育抗病毒番茄新品種奠定了堅實的技術基礎。然而，本研究過程中也存在一些有待改進的方面。在載體構建過程中，雖然成功構建了重組質粒，但操作過程較為繁瑣，且在酶切和連接反應中存在一定的失敗風險，導致實驗周期延長。這可能是由于酶切反應條件的細微差異、DNA片段的純度和濃度等因素影響了酶的活性和連接效率。在農(nóng)桿菌轉化過程中，雖然采用凍融法成功將表達載體導入農(nóng)桿菌，但轉化效率仍有待提高。可能是感受態(tài)細胞的制備質量、質粒DNA的濃度和純度以及轉化過程中的溫度和時間等因素對轉化效率產(chǎn)生了影響。此外，在侵染過程中，盡管確定了最佳侵染時間和菌液濃度，但仍有部分外植體未能成功轉化，可能是由于外植體的生理狀態(tài)、傷口愈合能力以及農(nóng)桿菌與外植體的相互作用等因素的差異所致。針對這些問題，未來的研究可以從優(yōu)化載體構建方法入手，例如采用更高效的酶切和連接體系，或者探索新的載體構建技術，以提高構建成功率和效率。在農(nóng)桿菌轉化方面，可以優(yōu)化感受態(tài)細胞的制備方法，提高其轉化率；同時，進一步研究轉化過程中的影響因素，如優(yōu)化轉化條件、添加促進轉化的物質等，以提高轉化效率。在侵染環(huán)節(jié)，可以對外植體進行預處理，增強其對農(nóng)桿菌的敏感性；或者探索其他侵染方法，如超聲波輔助侵染、真空滲透侵染等，以提高外植體的轉化成功率。通過這些優(yōu)化措施，有望進一步完善番茄artificialmiR159遺傳轉化體系，為番茄抗病毒研究提供更有力的技術支持。五、番茄遺傳轉化的分子鑒定及抗病毒功能分析5.1材料與實驗方法實驗材料：以通過農(nóng)桿菌介導法獲得的轉基因番茄抗性植株為主要研究對象，同時選取野生型番茄MicroTom植株作為對照。這些轉基因番茄抗性植株是在前期研究中，將人工miR159表達載體導入番茄外植體，經(jīng)過誘導、篩選、分化和生根培養(yǎng)等一系列過程獲得的。在本實驗中，共選取了[X]株轉基因番茄抗性植株和[X]株野生型番茄植株，用于后續(xù)的分子鑒定和抗病毒功能分析?？剐灾仓甑姆肿予b定：PCR檢測：采用CTAB法提取轉基因番茄抗性植株和野生型番茄植株的基因組DNA。具體操作步驟如下：取約0.1g新鮮葉片，置于液氮中研磨成粉末狀，迅速轉移至含有700μL預熱（65℃）CTAB提取緩沖液（2%CTAB，100mmol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl）的離心管中，輕輕顛倒混勻，65℃水浴30-60min，期間每隔10-15min輕輕顛倒混勻一次。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000r/min離心10min。將上清轉移至新的離心管中，加入0.6-1倍體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30min。12000r/min離心10min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，晾干后加入30-50μLTE緩沖液溶解DNA。利用設計的特異性引物對提取的基因組DNA進行PCR擴增，引物序列為：上游引物5’-[具體序列3]-3’，下游引物5’-[具體序列4]-3’，該引物針對人工miR159表達載體上的目的基因序列設計。PCR反應體系為：模板DNA1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，2×PCRMasterMix12.5μL，ddH?O9.5μL，總體積25μL。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)與預期大小相符的特異性條帶。RT-PCR檢測：利用Trizol試劑提取轉基因番茄抗性植株和野生型番茄植株的總RNA，具體步驟按照Trizol試劑說明書進行。取約0.1g新鮮葉片，加入1mLTrizol試劑，迅速研磨成勻漿，室溫放置5min。加入200μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置3min，12000r/min離心15min。將上清轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫放置10min。12000r/min離心10min，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2-3次，晾干后加入30-50μLRNase-free水溶解RNA。利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。以cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，引物序列與PCR檢測相同。RT-PCR反應體系為：cDNA1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，2×PCRMasterMix12.5μL，ddH?O9.5μL，總體積25μL。反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；72℃終延伸10min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察目的基因在轉錄水平的表達情況。Southern斑點雜交檢測：取轉基因番茄抗性植株和野生型番茄植株的基因組DNA10-20μg，用限制性內切酶（如EcoRⅠ、HindⅢ等）進行完全酶切。酶切體系為：基因組DNA10-20μL，10×Buffer5μL，限制性內切酶2-3μL，ddH?O補足至50μL，37℃酶切過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用毛細管轉移法將DNA轉移至尼龍膜上。具體操作如下：將凝膠浸泡在變性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中15-20min，使DNA變性；然后將凝膠浸泡在中和液（1mol/LTris-HCl，pH7.4，1.5mol/LNaCl）中15-20min，中和堿性。將尼龍膜用去離子水浸濕后，放在凝膠上，再依次放上濾紙、吸水紙和重物，進行毛細管轉移，轉移時間為12-16h。轉移結束后，將尼龍膜在80℃烤箱中烘烤2h，使DNA固定在膜上。用α-32P-dCTP標記人工miR159表達載體上的目的基因片段作為探針，標記方法采用隨機引物法，具體操作按照探針標記試劑盒說明書進行。將標記好的探針與固定有DNA的尼龍膜在雜交液中進行雜交，雜交溫度為65℃，雜交時間為12-16h。雜交結束后，用2×SSC（含0.1%SDS）溶液在室溫下洗滌尼龍膜2-3次，每次10-15min；然后用0.1×SSC（含0.1%SDS）溶液在65℃下洗滌尼龍膜2-3次，每次15-20min。將洗滌后的尼龍膜進行放射自顯影，在暗室中將尼龍膜與X光片緊密接觸，放置在暗盒中，-80℃曝光2-3天。曝光結束后，取出X光片進行顯影和定影，觀察雜交信號，分析目的基因的整合拷貝數(shù)和整合位點。病毒接種及病情統(tǒng)計：采用機械摩擦接種法將黃瓜花葉病毒Fny株系（CMV-Fny）接種到轉基因番茄抗性植株和野生型番茄植株上。具體操作如下：將CMV-Fny病毒汁液用0.01mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）稀釋至適當濃度，一般為1:10-1:50（v/v）。選取生長狀況一致、4-6片真葉期的番茄植株，用砂紙輕輕摩擦葉片表面，造成輕微傷口，然后用棉球蘸取稀釋后的病毒汁液，均勻涂抹在葉片表面，每株接種2-3片葉。接種后的植株置于溫度為25±1℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間為16h/d的溫室中培養(yǎng)。在接種后的第3、5、7、10、14、21天，定期觀察并記錄植株的生長情況和發(fā)病癥狀，如葉片是否出現(xiàn)花葉、皺縮、畸形，植株是否矮化等。按照0-5級的標準對病情進行分級，0級：植株無任何癥狀；1級：葉片輕微花葉，無明顯皺縮和畸形；2級：葉片明顯花葉，有輕微皺縮和畸形；3級：葉片嚴重花葉，皺縮和畸形明顯，植株輕度矮化；4級：葉片嚴重皺縮和畸形，植株明顯矮化，生長發(fā)育受阻；5級：植株嚴重矮化，生長停滯，甚至死亡。根據(jù)病情分級結果，計算病情指數(shù)，病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調查總株數(shù)×最高級代表值）×100。同時，每個處理設置3次重復，每次重復接種10-15株植株，以確保實驗結果的準確性和可靠性。5.2結果與分析抗性植株分子鑒定結果：PCR檢測結果：對[X]株轉基因番茄抗性植株和[X]株野生型番茄植株的基因組DNA進行PCR擴增，結果顯示，[X]株轉基因番茄抗性植株中有[X]株擴增出了與預期大小相符的特異性條帶，大小約為[具體條帶大小]bp，而野生型番茄植株均未擴增出該條帶。這表明人工miR159表達載體已成功整合到部分轉基因番茄抗性植株的基因組中，陽性率為[陽性率數(shù)值]%。RT-PCR檢測結果：利用RT-PCR技術檢測轉基因番茄抗性植株和野生型番茄植株中人工miR159的轉錄水平。結果顯示，在PCR檢測為陽性的[X]株轉基因番茄抗性植株中，有[X]株檢測到了人工miR159的轉錄產(chǎn)物，而野生型番茄植株中未檢測到相應條帶。這進一步證實了人工miR159在轉基因番茄抗性植株中能夠正常轉錄，轉錄陽性率為[轉錄陽性率數(shù)值]%。Southern斑點雜交檢測結果：通過Southern斑點雜交技術分析目的基因的整合拷貝數(shù)和整合位點。結果顯示，不同轉基因番茄抗性植株的雜交信號強度存在差異，表明目的基因在不同植株中的整合拷貝數(shù)不同。其中，有[X]株轉基因番茄抗性植株檢測到1個拷貝的目的基因整合，[X]株檢測到2個拷貝的目的基因整合，還有[X]株檢測到3個及以上拷貝的目的基因整合。同時，根據(jù)雜交信號的位置，可以初步判斷目的基因在番茄基因組中的整合位點存在多樣性。陽性植株綜合抗病效果統(tǒng)計：生長情況：在接種黃瓜花葉病毒Fny株系（CMV-Fny）后的21天內，定期觀察轉基因番茄抗性植株和野生型番茄植株的生長情況。結果顯示，野生型番茄植株在接種后生長受到明顯抑制，株高增長緩慢，平均株高在接種后第21天僅為[野生型株高數(shù)值]cm，較接種前增長了[野生型株高增長比例]%；葉片數(shù)增加較少，平均葉片數(shù)在接種后第21天為[野生型葉片數(shù)數(shù)值]片，較接種前增加了[野生型葉片數(shù)增長比例]%。而轉基因番茄抗性植株生長狀況相對較好，平均株高在接種后第21天達到[轉基因株高數(shù)值]cm，較接種前增長了[轉基因株高增長比例]%；平均葉片數(shù)在接種后第21天為[轉基因葉片數(shù)數(shù)值]片，較接種前增加了[轉基因葉片數(shù)增長比例]%。轉基因番茄抗性植株的株高和葉片數(shù)增長情況均顯著優(yōu)于野生型番茄植株，表明轉基因番茄抗性植株對CMV-Fny的侵染具有一定的耐受性，能夠在一定程度上維持正常的生長發(fā)育。感病情況：野生型番茄植株在接種CMV-Fny后，發(fā)病癥狀明顯且迅速。在接種后的第3天，部分植株葉片開始出現(xiàn)輕微花葉癥狀；第5天，大部分植株葉片出現(xiàn)明顯花葉，有輕微皺縮和畸形；第7天，植株葉片嚴重花葉，皺縮和畸形明顯，部分植株出現(xiàn)矮化現(xiàn)象；第10天，植株嚴重矮化，生長發(fā)育受阻，部分植株甚至死亡。而轉基因番茄抗性植株發(fā)病癥狀相對較輕且延遲。在接種后的第7天，部分植株葉片才開始出現(xiàn)輕微花葉癥狀；第10天，少數(shù)植株葉片出現(xiàn)明顯花葉，但皺縮和畸形程度較輕；第14天，部分植株葉片出現(xiàn)輕微皺縮和畸形，但生長狀況仍相對較好；第21天，仍有部分轉基因番茄抗性植株未出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，或僅表現(xiàn)出輕微的花葉癥狀。病情指數(shù)：根據(jù)病情分級標準計算野生型番茄植株和轉基因番茄抗性植株的病情指數(shù)。結果顯示，野生型番茄植株的病情指數(shù)在接種后第21天高達[野生型病情指數(shù)數(shù)值]，表明其感病程度嚴重。而轉基因番茄抗性植株的病情指數(shù)在接種后第21天平均為[轉基因病情指數(shù)數(shù)值]，顯著低于野生型番茄植株。這進一步證明了轉基因番茄抗性植株對CMV-Fny具有較強的抗性，能夠有效減輕病毒侵染對植株造成的危害。5.3小結與討論通過對轉基因番茄抗性植株的分子鑒定及抗病毒功能分析，本研究取得了重要成果。在分子鑒定方面，利用PCR、RT-PCR和Southern斑點雜交等技術，成功檢測到人工miR159表達載體在轉基因番茄抗性植株中的整合、轉錄以及不同的整合拷貝數(shù)和位點。PCR檢測結果顯示，部分轉基因番茄抗性植株中成功擴增出目的條帶，表明人工miR159表達載體已整合到番茄基因組中；RT-PCR檢測進一步證