產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素不同重組片段免疫原性的深度剖析與比較一、引言1.1產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌概述多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida，Pm）屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬，是該屬中最為重要的畜禽致病菌之一，在自然界中廣泛分布，常作為一種條件致病菌存在于多種健康動(dòng)物的口腔和咽部黏膜。該菌為球桿狀或短桿狀，兩端鈍圓，大小約為0.25-0.4μm×0.5-2.5μm，通常單個(gè)存在，有時(shí)也會(huì)成雙排列。新分離的強(qiáng)毒菌株具有莢膜，但在培養(yǎng)過(guò)程中莢膜會(huì)迅速消失，其無(wú)鞭毛，不形成芽孢，革蘭氏染色呈陰性。當(dāng)使用瑞氏染色或美蘭染色病料時(shí)，可見典型的兩極著色現(xiàn)象，即菌體兩端染色深，中間淺。從培養(yǎng)及生化特性來(lái)看，多殺性巴氏桿菌為需氧或兼性厭氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較為嚴(yán)格。在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況不佳，在麥康凱培養(yǎng)基上甚至無(wú)法生長(zhǎng)，但在添加了血液、血清或微量血紅素的培養(yǎng)基中則能良好生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適pH值為7.2-7.4。在血清瓊脂平板上培養(yǎng)24小時(shí)后，可形成淡灰白色、邊緣整齊、表面光滑且閃光的露珠狀小菌落；在血瓊脂平板上，菌落呈水滴樣，且無(wú)溶血現(xiàn)象；在血清肉湯中培養(yǎng)時(shí)，起初輕度渾濁，4-6天后液體變清朗，管底出現(xiàn)黏稠沉淀，振搖后不分散，表面形成菌環(huán)。此外，該菌可分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多數(shù)菌株可發(fā)酵甘露醇，一般不發(fā)酵乳糖，可形成靛基質(zhì)，甲基紅試驗(yàn)和VP試驗(yàn)均為陰性，不液化明膠，能產(chǎn)生硫化氫。多殺性巴氏桿菌主要依據(jù)莢膜抗原和菌體抗原進(jìn)行血清型的區(qū)分，其中莢膜抗原有6個(gè)型，菌體抗原分為16個(gè)型，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示菌體抗原型，大寫英文字母表示莢膜抗原型。在我國(guó)，分離得到的禽多殺性巴氏桿菌以5：A最為多見，其次是8：A；豬的多殺性巴氏桿菌主要是5：A和6：B，8：A與2：D次之；羊的多殺性巴氏桿菌則以6：B居多；家兔的多殺性巴氏桿菌以7：A為主，5：A次之。產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌（toxigenicPasteurellamultocida，T+Pm）作為多殺性巴氏桿菌的一種特殊類型，其分泌的皮膚壞死毒素（Pasteurellamultocidatoxin，PMT）是引發(fā)諸多嚴(yán)重疾病的關(guān)鍵因素。以豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎（progressiveatrophicrhinitis，PAR）為例，T+Pm便是主要的致病菌。PAR是一種以面部變形、鼻部扭曲、鼻衄為主要特征的呼吸道傳染病，在養(yǎng)豬業(yè)中流行廣泛。感染該病的豬生長(zhǎng)速度明顯減緩，飼料利用率大幅降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除了豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎外，產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌還可能引發(fā)其他動(dòng)物的多種疾病，嚴(yán)重威脅著動(dòng)物的健康和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。鑒于產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌所帶來(lái)的嚴(yán)重危害，研發(fā)有效的防控措施顯得尤為重要。疫苗免疫作為預(yù)防和控制相關(guān)疾病的主要手段，一直是研究的重點(diǎn)方向。而PMT雖然本身是一個(gè)弱免疫原，但當(dāng)對(duì)其自然結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞后，其免疫原性會(huì)有所增強(qiáng)，部分截短的PMT片段被預(yù)測(cè)具有良好的抗原特性。因此，深入研究產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素不同重組片段的免疫原性，對(duì)于開發(fā)高效的疫苗，有效預(yù)防和控制由產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌引起的疾病具有至關(guān)重要的意義，這不僅有助于保障動(dòng)物健康，還能減少養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，維護(hù)畜牧業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。1.2研究背景與意義產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌引發(fā)的疾病在全球范圍內(nèi)給畜牧業(yè)帶來(lái)了沉重的打擊。以豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎為例，其在養(yǎng)豬業(yè)中廣泛流行，嚴(yán)重影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育和健康。病豬不僅生長(zhǎng)速度減緩，飼料利用率降低，而且還可能繼發(fā)其他疾病，進(jìn)一步增加了養(yǎng)殖成本和損失。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在一些養(yǎng)豬密集地區(qū)，該病的感染率可達(dá)30%-50%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除了豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎，產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌還能引發(fā)其他動(dòng)物的多種疾病，如牛的出血性敗血癥、禽的霍亂等，這些疾病同樣具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅著動(dòng)物的健康和養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。疫苗免疫作為防控產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌疾病的主要手段，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)接種疫苗，可以刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而提高動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力，有效預(yù)防疾病的發(fā)生。然而，目前市場(chǎng)上的疫苗在免疫效果上存在一定的局限性，部分疫苗的保護(hù)率不夠理想，無(wú)法滿足養(yǎng)殖業(yè)對(duì)疾病防控的需求。這主要是因?yàn)楫a(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素的免疫原性較弱，且其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使得傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)面臨諸多挑戰(zhàn)。PMT作為產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌的主要致病因子，對(duì)其結(jié)構(gòu)和免疫原性的研究成為了開發(fā)高效疫苗的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，PMT的不同重組片段可能具有不同的免疫原性。通過(guò)對(duì)這些重組片段免疫原性的比較研究，可以篩選出具有高免疫原性的片段，為開發(fā)新型高效疫苗提供有力的理論依據(jù)和候選抗原。這不僅有助于提高疫苗的免疫效果，增強(qiáng)對(duì)產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌疾病的防控能力，還能減少抗生素的使用，降低藥物殘留和耐藥性的產(chǎn)生，對(duì)于保障動(dòng)物健康、促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.3研究目的與問(wèn)題提出本研究聚焦于產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素，旨在深入比較其不同重組片段的免疫原性。通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，篩選出具有高免疫原性的重組片段，為開發(fā)高效的產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌疫苗奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和提供優(yōu)質(zhì)的候選抗原。具體而言，本研究擬解決以下關(guān)鍵問(wèn)題：首先，明確產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素的眾多重組片段中，哪些片段展現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫原性。不同的重組片段可能因其氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)的差異，在刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力上有所不同。準(zhǔn)確篩選出高免疫原性的片段，對(duì)于疫苗研發(fā)至關(guān)重要，能提高疫苗的免疫效果，增強(qiáng)對(duì)相關(guān)疾病的防控能力。其次，探究影響產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素重組片段免疫原性的關(guān)鍵因素。這些因素可能包括片段的結(jié)構(gòu)特征，如是否具有特定的抗原表位、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等；還可能涉及片段與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用方式，如與免疫細(xì)胞表面受體的結(jié)合親和力等。深入了解這些影響因素，有助于在疫苗設(shè)計(jì)過(guò)程中，通過(guò)合理的分子改造，優(yōu)化重組片段的免疫原性，從而開發(fā)出更有效的疫苗。二、產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1毒素種類與結(jié)構(gòu)2.1.1主要毒素類型產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌能夠產(chǎn)生多種毒素，其中皮膚壞死毒素（PMT）是最為關(guān)鍵且研究較為深入的一種毒素。PMT是一種由toxA基因編碼的蛋白質(zhì)毒素，其分子量約為146kDa，由1285個(gè)氨基酸組成。它在產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌引發(fā)的疾病中扮演著核心角色，尤其是在豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎的發(fā)病過(guò)程中。當(dāng)豬感染產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌后，該菌分泌的PMT會(huì)作用于豬的鼻甲骨等組織。PMT一方面使破骨細(xì)胞數(shù)量增多且功能增強(qiáng)，從而極大地增強(qiáng)了骨的吸收能力；另一方面，它會(huì)使成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞生長(zhǎng)加快，但卻抑制其分裂，已成熟的成骨細(xì)胞還會(huì)進(jìn)行性變性且得不到補(bǔ)充，最終導(dǎo)致骨的合成能力大幅下降。在這兩方面因素的共同作用下，鼻甲骨生長(zhǎng)過(guò)程中的合成與吸收平衡被打破，進(jìn)而引發(fā)鼻甲骨萎縮，這也是豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎的典型病理特征。除了PMT外，產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌可能還會(huì)產(chǎn)生其他一些毒素，雖然目前對(duì)這些毒素的研究相對(duì)較少，但它們?cè)诓≡虏∵^(guò)程中或許也發(fā)揮著不可或缺的協(xié)同作用。例如，某些毒素可能會(huì)影響宿主的免疫系統(tǒng)，降低宿主的抵抗力，從而為產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌的感染和繁殖創(chuàng)造更有利的條件。未來(lái)，隨著研究的不斷深入，有望發(fā)現(xiàn)更多類型的毒素，并明確它們?cè)谥虏∵^(guò)程中的具體作用機(jī)制。2.1.2毒素的分子結(jié)構(gòu)特征從氨基酸組成來(lái)看，PMT的1285個(gè)氨基酸通過(guò)特定的排列順序，形成了其獨(dú)特的一級(jí)結(jié)構(gòu)。這種氨基酸序列的特異性決定了PMT的基本性質(zhì)和功能。其中，某些氨基酸殘基對(duì)于PMT與靶細(xì)胞表面受體的結(jié)合至關(guān)重要。研究表明，PMT的N端區(qū)域富含一些具有特殊化學(xué)性質(zhì)的氨基酸，這些氨基酸能夠與靶細(xì)胞表面的特定受體發(fā)生特異性相互作用，從而介導(dǎo)PMT進(jìn)入靶細(xì)胞。在空間結(jié)構(gòu)上，PMT可分為N端和C端兩大結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為主要與受體結(jié)合以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程密切相關(guān)。它具有特定的三維結(jié)構(gòu)，能夠與靶細(xì)胞表面的受體精準(zhǔn)識(shí)別并結(jié)合，隨后通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。C端結(jié)構(gòu)域則具有催化活性，它在PMT發(fā)揮毒性作用的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。C端結(jié)構(gòu)域能夠催化細(xì)胞內(nèi)的一些關(guān)鍵信號(hào)通路的激活或抑制，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和代謝等生理過(guò)程。具體來(lái)說(shuō)，C端結(jié)構(gòu)域可能會(huì)對(duì)某些細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子進(jìn)行修飾，如磷酸化或去磷酸化，進(jìn)而改變細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能的異常。PMT的整體空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一種緊密且有序的折疊狀態(tài)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于維持其穩(wěn)定性和功能完整性至關(guān)重要。一旦PMT的空間結(jié)構(gòu)受到破壞，如高溫、化學(xué)物質(zhì)等因素的影響，其與受體的結(jié)合能力以及催化活性都可能會(huì)顯著降低，從而減弱其毒性作用。2.2毒素致病機(jī)制PMT進(jìn)入宿主機(jī)體后，會(huì)通過(guò)一系列復(fù)雜的過(guò)程作用于宿主細(xì)胞，從而引發(fā)嚴(yán)重的病理變化。首先，PMT憑借其N端結(jié)構(gòu)域與靶細(xì)胞表面的特定受體進(jìn)行特異性結(jié)合。這種結(jié)合具有高度的選擇性，只有靶細(xì)胞表面存在相應(yīng)的受體時(shí)，PMT才能與之結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，某些細(xì)胞表面的受體蛋白可能是PMT的結(jié)合位點(diǎn)，這些受體蛋白在細(xì)胞的生理功能中起著重要作用。當(dāng)PMT與受體結(jié)合后，會(huì)通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，形成內(nèi)體。在細(xì)胞內(nèi)，PMT會(huì)經(jīng)歷一系列的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。內(nèi)體中的PMT會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的特定細(xì)胞器中，如溶酶體等。在溶酶體的酸性環(huán)境下，PMT會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而暴露出其具有催化活性的C端結(jié)構(gòu)域。C端結(jié)構(gòu)域的催化活性對(duì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。它能夠催化細(xì)胞內(nèi)的一些關(guān)鍵信號(hào)分子，如G蛋白等，使其發(fā)生修飾。具體來(lái)說(shuō)，C端結(jié)構(gòu)域可以將G蛋白的精氨酸殘基進(jìn)行ADP-核糖基化修飾，這種修飾會(huì)導(dǎo)致G蛋白的活性發(fā)生改變。正常情況下，G蛋白在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，它可以將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理功能。然而，當(dāng)G蛋白被PMT修飾后，其信號(hào)傳導(dǎo)功能會(huì)受到干擾，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路發(fā)生紊亂。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的紊亂進(jìn)一步引發(fā)了一系列的細(xì)胞病變。例如，細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程受到影響。在正常情況下，細(xì)胞的增殖和分化是受到嚴(yán)格調(diào)控的，以維持組織和器官的正常發(fā)育和功能。但由于PMT的作用，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路異常，使得細(xì)胞的增殖和分化失去平衡。一些細(xì)胞可能會(huì)過(guò)度增殖，而另一些細(xì)胞則可能無(wú)法正常分化，從而導(dǎo)致組織和器官的結(jié)構(gòu)和功能異常。細(xì)胞的代謝活動(dòng)也會(huì)受到干擾。細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程需要各種酶和信號(hào)分子的協(xié)同作用，而PMT導(dǎo)致的信號(hào)通路紊亂會(huì)影響這些酶和信號(hào)分子的功能，進(jìn)而干擾細(xì)胞的正常代謝。細(xì)胞可能無(wú)法正常攝取和利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，或者無(wú)法正常合成和分泌細(xì)胞內(nèi)的各種物質(zhì)，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的能量供應(yīng)不足，功能受損。隨著細(xì)胞病變的不斷發(fā)展，組織損傷也逐漸顯現(xiàn)。以豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎為例，PMT作用于鼻甲骨組織，使破骨細(xì)胞數(shù)量增多且功能增強(qiáng)，成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞生長(zhǎng)加快但不能分裂，已成熟的成骨細(xì)胞進(jìn)行性變性且得不到補(bǔ)充。破骨細(xì)胞主要負(fù)責(zé)骨的吸收，其數(shù)量和功能的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致骨吸收作用顯著增強(qiáng)。而成骨細(xì)胞則主要負(fù)責(zé)骨的合成，成骨細(xì)胞的異常會(huì)使得骨的合成能力下降。在這種情況下，鼻甲骨生長(zhǎng)過(guò)程中的合成與吸收平衡被打破，鼻甲骨逐漸萎縮，導(dǎo)致鼻腔結(jié)構(gòu)變形，影響豬的呼吸和嗅覺功能。除了鼻甲骨組織，PMT還可能對(duì)其他組織產(chǎn)生損傷。它可能會(huì)影響呼吸道黏膜的正常功能，使呼吸道黏膜的屏障作用減弱，從而容易引發(fā)呼吸道感染。PMT還可能對(duì)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞產(chǎn)生影響，導(dǎo)致免疫功能下降。PMT對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響也是多方面的。一方面，它會(huì)干擾免疫細(xì)胞的正常功能。例如，PMT可能會(huì)影響T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化、增殖和分化過(guò)程。T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞免疫中起著關(guān)鍵作用，它可以識(shí)別被病原體感染的細(xì)胞，并通過(guò)釋放細(xì)胞因子等方式來(lái)殺傷病原體和被感染的細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞則主要參與體液免疫，它可以產(chǎn)生抗體，中和病原體及其毒素。然而，PMT的存在會(huì)使T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能受到抑制，導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫能力下降。PMT還可能影響巨噬細(xì)胞的吞噬和抗原呈遞功能。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要細(xì)胞，它可以吞噬和清除病原體，并將病原體的抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。但PMT會(huì)干擾巨噬細(xì)胞的這些功能，使其無(wú)法有效地發(fā)揮免疫防御作用。另一方面，PMT可能會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受。免疫耐受是指機(jī)體對(duì)某種抗原不產(chǎn)生免疫應(yīng)答的狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期暴露于PMT時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)PMT產(chǎn)生耐受，使得機(jī)體無(wú)法有效地識(shí)別和清除產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌，從而增加了感染和發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。2.3免疫原性相關(guān)概念免疫原性是指抗原能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)如抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是一種物質(zhì)引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力。例如，當(dāng)外來(lái)的病原體如細(xì)菌、病毒等侵入機(jī)體時(shí)，它們攜帶的抗原物質(zhì)就會(huì)刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，啟動(dòng)免疫應(yīng)答過(guò)程。衡量免疫原性的指標(biāo)是多方面的。抗體效價(jià)是一個(gè)重要指標(biāo)，它反映了機(jī)體產(chǎn)生抗體的水平。在免疫實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)血清中抗體的效價(jià)，可以了解免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。一般來(lái)說(shuō)，抗體效價(jià)越高，說(shuō)明免疫原的免疫原性越強(qiáng)。細(xì)胞免疫應(yīng)答水平也是衡量免疫原性的關(guān)鍵指標(biāo)。細(xì)胞免疫主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，通過(guò)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞因子的分泌水平等，可以評(píng)估免疫原對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的刺激作用。T淋巴細(xì)胞在受到免疫原刺激后，會(huì)發(fā)生增殖反應(yīng)，同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ、白細(xì)胞介素-2等，這些細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。免疫保護(hù)效果是衡量免疫原性的最終指標(biāo)。如果一種免疫原能夠使機(jī)體在受到病原體攻擊時(shí)，有效抵抗感染，減少疾病的發(fā)生，那么就說(shuō)明它具有良好的免疫原性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通常會(huì)對(duì)免疫后的動(dòng)物進(jìn)行病原體攻毒實(shí)驗(yàn)，觀察動(dòng)物的發(fā)病情況、死亡率等，以此來(lái)評(píng)估免疫原的免疫保護(hù)效果。免疫原性在疫苗研發(fā)中占據(jù)著核心地位，是疫苗發(fā)揮有效保護(hù)作用的關(guān)鍵因素。疫苗的本質(zhì)就是利用抗原的免疫原性，通過(guò)接種疫苗，使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)特定病原體的免疫記憶。當(dāng)機(jī)體再次接觸到相同的病原體時(shí)，免疫系統(tǒng)能夠迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的抗體和致敏淋巴細(xì)胞，從而有效地清除病原體，預(yù)防疾病的發(fā)生。在產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌疫苗的研發(fā)中，免疫原性的研究尤為重要。由于產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素的免疫原性較弱，如何提高其免疫原性成為了疫苗研發(fā)的關(guān)鍵問(wèn)題。通過(guò)對(duì)毒素不同重組片段免疫原性的比較研究，可以篩選出免疫原性強(qiáng)的片段，作為疫苗的候選抗原。對(duì)免疫原性的研究還可以幫助我們深入了解疫苗的作用機(jī)制，優(yōu)化疫苗的配方和生產(chǎn)工藝，提高疫苗的質(zhì)量和安全性。三、不同重組片段的篩選與獲取3.1重組片段篩選依據(jù)PMT的結(jié)構(gòu)與功能域是篩選重組片段的重要基礎(chǔ)。從結(jié)構(gòu)上看，PMT由1285個(gè)氨基酸組成，分為N端和C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。研究表明，該區(qū)域的某些氨基酸序列對(duì)于受體識(shí)別和結(jié)合至關(guān)重要。例如，在一些相關(guān)研究中，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)改變N端的特定氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)PMT與受體的結(jié)合能力明顯下降，進(jìn)而影響了其進(jìn)入靶細(xì)胞的效率。因此，篩選包含N端關(guān)鍵受體結(jié)合區(qū)域的重組片段，有可能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)受體結(jié)合位點(diǎn)的抗體，從而阻斷PMT與靶細(xì)胞的結(jié)合，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。C端結(jié)構(gòu)域具有催化活性，能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子進(jìn)行修飾，從而影響細(xì)胞的生理功能。一些研究指出，C端結(jié)構(gòu)域中的特定催化活性位點(diǎn)對(duì)于PMT的毒性發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。通過(guò)篩選含有C端催化活性關(guān)鍵區(qū)域的重組片段，可能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生能夠中和其催化活性的免疫應(yīng)答，使PMT無(wú)法對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路產(chǎn)生干擾，達(dá)到免疫保護(hù)的目的。已有的研究報(bào)道為重組片段的篩選提供了寶貴的參考。許多研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PMT不同區(qū)域的免疫原性和功能。有研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一系列PMT的截短體，并對(duì)它們的免疫原性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，某些特定長(zhǎng)度和序列的重組片段能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出一定的免疫保護(hù)效果。在這些研究中，對(duì)不同重組片段的氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)以及它們與免疫系統(tǒng)的相互作用方式都進(jìn)行了詳細(xì)的分析。通過(guò)對(duì)這些研究成果的綜合分析，可以確定一些具有潛在高免疫原性的重組片段，作為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)對(duì)象。一些研究還探討了PMT重組片段與佐劑的協(xié)同作用。不同的佐劑能夠通過(guò)不同的機(jī)制增強(qiáng)免疫原的免疫原性。某些佐劑可以刺激免疫細(xì)胞的活化和增殖，提高免疫細(xì)胞對(duì)重組片段的攝取和處理能力。通過(guò)參考這些研究，篩選出的重組片段可以與合適的佐劑進(jìn)行搭配，進(jìn)一步提高其免疫原性和免疫保護(hù)效果。3.2實(shí)驗(yàn)菌株與材料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所用的產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌菌株（T+Pm）來(lái)源于[具體來(lái)源，如某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病豬的鼻腔拭子分離培養(yǎng)所得]。將該菌株接種于添加了5%小牛血清和1%酵母浸出物的胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床，以180r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)18-24小時(shí)，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，此時(shí)菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，代謝活性較高，有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。培養(yǎng)后的菌株可通過(guò)平板劃線法進(jìn)行純化，將其接種于含5%小牛血清的TSA平板上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行再次劃線培養(yǎng)，重復(fù)2-3次，以確保獲得純的菌株。在試劑方面，各種限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、HindIII等）、T4DNA連接酶購(gòu)自[具體品牌，如Takara公司]，這些酶在基因克隆和重組過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。限制性內(nèi)切酶能夠特異性地切割DNA片段，為后續(xù)的基因拼接提供合適的末端；T4DNA連接酶則可以將不同的DNA片段連接起來(lái)，構(gòu)建重組質(zhì)粒。DNA凝膠回收試劑盒選用[具體品牌，如Omega公司的E.Z.N.A.GelExtractionKit]，該試劑盒能夠高效地從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，具有回收率高、純度好等優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)粒提取試劑盒采用[具體品牌，如Qiagen公司的PlasmidMiniKit]，可快速、簡(jiǎn)便地從細(xì)菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)粒的需求。蛋白Marker（PrestainedProteinMarker）購(gòu)自[具體品牌，如ThermoFisherScientific公司]，在蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)中，它可作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷目的蛋白的大小。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自[具體品牌，如JacksonImmunoResearchLaboratories公司]，在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，該抗體用于檢測(cè)目標(biāo)蛋白，通過(guò)與目標(biāo)蛋白上結(jié)合的一抗相互作用，再利用HRP的催化作用，使底物顯色，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)所需的儀器也較為關(guān)鍵。PCR儀選用[具體品牌和型號(hào)，如Bio-Rad公司的T100ThermalCycler]，它具有精確的溫度控制能力，能夠滿足PCR反應(yīng)中對(duì)不同溫度階段的嚴(yán)格要求，確保擴(kuò)增反應(yīng)的高效和特異性。核酸電泳儀為[具體品牌和型號(hào)，如北京六一儀器廠的DYY-6C型]，用于核酸的電泳分離，通過(guò)在電場(chǎng)作用下，使不同大小的核酸片段在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)分離和檢測(cè)。蛋白電泳儀采用[具體品牌和型號(hào)，如Bio-Rad公司的Mini-PROTEANTetraCell]，適用于蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳，能夠清晰地分離不同分子量的蛋白質(zhì)，便于后續(xù)的分析。凝膠成像系統(tǒng)為[具體品牌和型號(hào)，如Bio-Rad公司的GelDocXR+]，可對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行成像和分析，準(zhǔn)確地記錄核酸和蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果，方便數(shù)據(jù)的保存和處理。恒溫?fù)u床選用[具體品牌和型號(hào)，如上海智城分析儀器制造有限公司的ZQZY-50F]，為細(xì)菌的培養(yǎng)提供穩(wěn)定的振蕩培養(yǎng)環(huán)境，保證細(xì)菌在適宜的條件下生長(zhǎng)繁殖。離心機(jī)采用[具體品牌和型號(hào)，如Eppendorf公司的5424R型離心機(jī)]，用于樣品的離心分離，能夠快速、有效地將細(xì)胞、蛋白質(zhì)等物質(zhì)從溶液中分離出來(lái)。三、不同重組片段的篩選與獲取3.1重組片段篩選依據(jù)PMT的結(jié)構(gòu)與功能域是篩選重組片段的重要基礎(chǔ)。從結(jié)構(gòu)上看，PMT由1285個(gè)氨基酸組成，分為N端和C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。研究表明，該區(qū)域的某些氨基酸序列對(duì)于受體識(shí)別和結(jié)合至關(guān)重要。例如，在一些相關(guān)研究中，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)改變N端的特定氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)PMT與受體的結(jié)合能力明顯下降，進(jìn)而影響了其進(jìn)入靶細(xì)胞的效率。因此，篩選包含N端關(guān)鍵受體結(jié)合區(qū)域的重組片段，有可能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)受體結(jié)合位點(diǎn)的抗體，從而阻斷PMT與靶細(xì)胞的結(jié)合，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。C端結(jié)構(gòu)域具有催化活性，能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子進(jìn)行修飾，從而影響細(xì)胞的生理功能。一些研究指出，C端結(jié)構(gòu)域中的特定催化活性位點(diǎn)對(duì)于PMT的毒性發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。通過(guò)篩選含有C端催化活性關(guān)鍵區(qū)域的重組片段，可能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生能夠中和其催化活性的免疫應(yīng)答，使PMT無(wú)法對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路產(chǎn)生干擾，達(dá)到免疫保護(hù)的目的。已有的研究報(bào)道為重組片段的篩選提供了寶貴的參考。許多研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PMT不同區(qū)域的免疫原性和功能。有研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一系列PMT的截短體，并對(duì)它們的免疫原性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，某些特定長(zhǎng)度和序列的重組片段能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出一定的免疫保護(hù)效果。在這些研究中，對(duì)不同重組片段的氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)以及它們與免疫系統(tǒng)的相互作用方式都進(jìn)行了詳細(xì)的分析。通過(guò)對(duì)這些研究成果的綜合分析，可以確定一些具有潛在高免疫原性的重組片段，作為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)對(duì)象。一些研究還探討了PMT重組片段與佐劑的協(xié)同作用。不同的佐劑能夠通過(guò)不同的機(jī)制增強(qiáng)免疫原的免疫原性。某些佐劑可以刺激免疫細(xì)胞的活化和增殖，提高免疫細(xì)胞對(duì)重組片段的攝取和處理能力。通過(guò)參考這些研究，篩選出的重組片段可以與合適的佐劑進(jìn)行搭配，進(jìn)一步提高其免疫原性和免疫保護(hù)效果。3.2實(shí)驗(yàn)菌株與材料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所用的產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌菌株（T+Pm）來(lái)源于[具體來(lái)源，如某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病豬的鼻腔拭子分離培養(yǎng)所得]。將該菌株接種于添加了5%小牛血清和1%酵母浸出物的胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床，以180r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)18-24小時(shí)，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，此時(shí)菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，代謝活性較高，有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。培養(yǎng)后的菌株可通過(guò)平板劃線法進(jìn)行純化，將其接種于含5%小牛血清的TSA平板上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行再次劃線培養(yǎng)，重復(fù)2-3次，以確保獲得純的菌株。在試劑方面，各種限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、HindIII等）、T4DNA連接酶購(gòu)自[具體品牌，如Takara公司]，這些酶在基因克隆和重組過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。限制性內(nèi)切酶能夠特異性地切割DNA片段，為后續(xù)的基因拼接提供合適的末端；T4DNA連接酶則可以將不同的DNA片段連接起來(lái)，構(gòu)建重組質(zhì)粒。DNA凝膠回收試劑盒選用[具體品牌，如Omega公司的E.Z.N.A.GelExtractionKit]，該試劑盒能夠高效地從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，具有回收率高、純度好等優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)粒提取試劑盒采用[具體品牌，如Qiagen公司的PlasmidMiniKit]，可快速、簡(jiǎn)便地從細(xì)菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)粒的需求。蛋白Marker（PrestainedProteinMarker）購(gòu)自[具體品牌，如ThermoFisherScientific公司]，在蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)中，它可作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷目的蛋白的大小。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自[具體品牌，如JacksonImmunoResearchLaboratories公司]，在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，該抗體用于檢測(cè)目標(biāo)蛋白，通過(guò)與目標(biāo)蛋白上結(jié)合的一抗相互作用，再利用HRP的催化作用，使底物顯色，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)所需的儀器也較為關(guān)鍵。PCR儀選用[具體品牌和型號(hào)，如Bio-Rad公司的T100ThermalCycler]，它具有精確的溫度控制能力，能夠滿足PCR反應(yīng)中對(duì)不同溫度階段的嚴(yán)格要求，確保擴(kuò)增反應(yīng)的高效和特異性。核酸電泳儀為[具體品牌和型號(hào)，如北京六一儀器廠的DYY-6C型]，用于核酸的電泳分離，通過(guò)在電場(chǎng)作用下，使不同大小的核酸片段在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)分離和檢測(cè)。蛋白電泳儀采用[具體品牌和型號(hào)，如Bio-Rad公司的Mini-PROTEANTetraCell]，適用于蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳，能夠清晰地分離不同分子量的蛋白質(zhì)，便于后續(xù)的分析。凝膠成像系統(tǒng)為[具體品牌和型號(hào)，如Bio-Rad公司的GelDocXR+]，可對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行成像和分析，準(zhǔn)確地記錄核酸和蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果，方便數(shù)據(jù)的保存和處理。恒溫?fù)u床選用[具體品牌和型號(hào)，如上海智城分析儀器制造有限公司的ZQZY-50F]，為細(xì)菌的培養(yǎng)提供穩(wěn)定的振蕩培養(yǎng)環(huán)境，保證細(xì)菌在適宜的條件下生長(zhǎng)繁殖。離心機(jī)采用[具體品牌和型號(hào)，如Eppendorf公司的5424R型離心機(jī)]，用于樣品的離心分離，能夠快速、有效地將細(xì)胞、蛋白質(zhì)等物質(zhì)從溶液中分離出來(lái)。3.3基因克隆與表達(dá)3.3.1引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增依據(jù)已篩選出的產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素不同重組片段的基因序列，借助專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0來(lái)精心設(shè)計(jì)引物。在設(shè)計(jì)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循相關(guān)的引物設(shè)計(jì)原則，以確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物長(zhǎng)度設(shè)定在18-25bp之間，這一長(zhǎng)度范圍既能保證引物與模板的特異性結(jié)合，又能避免引物過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的合成成本增加和擴(kuò)增效率降低。GC含量控制在40%-60%，合適的GC含量有助于維持引物的穩(wěn)定性和Tm值。Tm值則控制在55-65℃之間，使引物在PCR反應(yīng)的退火溫度下能夠與模板有效結(jié)合。同時(shí)，通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，仔細(xì)分析引物與模板序列的互補(bǔ)性以及引物之間的二聚體形成可能性，以進(jìn)一步確保引物的特異性，避免非特異性擴(kuò)增。以提取的產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌基因組DNA作為模板，開展PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，其中包含10×PCRBuffer5μL，該緩沖液為PCR反應(yīng)提供了適宜的離子強(qiáng)度和pH環(huán)境，保證DNA聚合酶的活性；2.5mMdNTPs4μL，dNTPs作為PCR反應(yīng)的原料，在DNA聚合酶的作用下參與DNA鏈的延伸；10μM上下游引物各1μL，引物在PCR反應(yīng)中引導(dǎo)DNA聚合酶合成目的基因片段；模板DNA1μL，模板DNA提供了擴(kuò)增的起始序列；TaqDNA聚合酶0.5μL，TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性，能夠在PCR反應(yīng)的高溫條件下催化DNA的合成；最后用ddH?O補(bǔ)足至50μL。將上述反應(yīng)體系充分混勻后，短暫離心，使反應(yīng)液集中于管底，隨后置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序如下：首先進(jìn)行預(yù)變性，在95℃條件下加熱5分鐘，這一步驟的目的是使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)的引物結(jié)合和擴(kuò)增反應(yīng)創(chuàng)造條件。接著進(jìn)入30個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸階段。變性條件為95℃，持續(xù)30秒，在高溫下，DNA雙鏈解開，形成單鏈模板；退火溫度根據(jù)引物的Tm值而定，一般在55-65℃之間，持續(xù)30秒，在此溫度下，引物與模板單鏈特異性結(jié)合；延伸階段溫度設(shè)定為72℃，持續(xù)1-2分鐘，DNA聚合酶在這一溫度下以dNTPs為原料，從引物的3'端開始延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。30個(gè)循環(huán)結(jié)束后，再進(jìn)行72℃，10分鐘的終延伸，確保所有的DNA片段都能得到充分的延伸。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物與適量的上樣緩沖液混合后，加入到含有核酸染料（如GoldView）的1%瓊脂糖凝膠的加樣孔中。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間約為30-40分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。在紫外光的照射下，若在預(yù)期的分子量位置出現(xiàn)清晰、單一的條帶，則表明PCR擴(kuò)增成功，獲得了目的基因片段。3.3.2表達(dá)載體構(gòu)建將擴(kuò)增得到的目的基因片段和表達(dá)載體pET-32a（+）分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI和HindIII）進(jìn)行雙酶切處理。酶切反應(yīng)體系為20μL，包含10×Buffer2μL，為酶切反應(yīng)提供合適的緩沖環(huán)境；目的基因片段或表達(dá)載體DNA5μL；限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII各1μL，這兩種酶能夠特異性地切割DNA片段，產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端；最后用ddH?O補(bǔ)足至20μL。將上述反應(yīng)體系在37℃恒溫金屬浴中孵育3-4小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切反應(yīng)結(jié)束后，利用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的目的基因片段和表達(dá)載體進(jìn)行回收。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，首先將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外燈下切下含有目的條帶的凝膠塊。將凝膠塊放入離心管中，加入適量的溶膠液，在50-60℃水浴中孵育，使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，離心，使DNA吸附在柱膜上。依次用洗滌液1和洗滌液2對(duì)吸附柱進(jìn)行洗滌，去除雜質(zhì)。最后，加入適量的洗脫緩沖液，離心，將吸附在柱膜上的DNA洗脫下來(lái)，得到純化的酶切目的基因片段和表達(dá)載體。取回收的目的基因片段和表達(dá)載體pET-32a（+），按照摩爾比3：1的比例加入到連接反應(yīng)體系中。連接反應(yīng)體系總體積為10μL，其中包含10×T4DNALigaseBuffer1μL，為連接反應(yīng)提供必要的緩沖條件；T4DNA連接酶0.5μL，它能夠催化目的基因片段與表達(dá)載體之間的磷酸二酯鍵形成，實(shí)現(xiàn)兩者的連接；目的基因片段和表達(dá)載體DNA適量，使它們的摩爾比達(dá)到3：1，以提高連接效率；最后用ddH?O補(bǔ)足至10μL。將連接反應(yīng)體系在16℃恒溫金屬浴中孵育過(guò)夜，使連接反應(yīng)充分進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化采用熱激法。將10μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，使連接產(chǎn)物充分進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。然后將離心管迅速放入42℃水浴中熱激90秒，這一步驟能夠使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，促進(jìn)連接產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)胞。熱激結(jié)束后，立即將離心管置于冰浴中2-3分鐘，使細(xì)胞膜恢復(fù)正常狀態(tài)。向離心管中加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃恒溫?fù)u床中，以180r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將復(fù)蘇后的菌液以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去800μL上清液，將剩余的菌液混勻后，涂布于含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，氨芐青霉素能夠抑制未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的生長(zhǎng)，只有成功轉(zhuǎn)化了含有氨芐抗性基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能在平板上生長(zhǎng)。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，待菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。菌落PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序與之前的PCR擴(kuò)增類似，只是模板為挑取的單菌落。將菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的單菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。若雙酶切鑒定后在凝膠電泳上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，且測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致，則表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。3.3.3誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白純化將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pET-32a（+）-[目的基因]轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。具體轉(zhuǎn)化方法與之前轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞類似，采用熱激法，將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)冰浴、熱激、冰浴和復(fù)蘇培養(yǎng)等步驟后，將菌液涂布于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，待菌落長(zhǎng)出。挑取單菌落接種于5mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床以180r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，作為種子液。將種子液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至500mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD???值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG能夠誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，它作為一種誘導(dǎo)劑，能夠與阻遏蛋白結(jié)合，解除阻遏蛋白對(duì)基因表達(dá)的抑制作用，從而使重組蛋白得以表達(dá)。加入IPTG后，繼續(xù)在37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)4-6小時(shí)，使重組蛋白充分表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集菌體沉淀。棄去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體沉淀3次，每次洗滌后以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液，盡量去除雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基。將洗滌后的菌體沉淀重懸于適量的裂解緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，1mMEDTA，1%TritonX-100，1mMPMSF）中，冰浴超聲破碎菌體。超聲條件為：功率200W，超聲3秒，間隔5秒，總時(shí)間30分鐘。超聲破碎后，將裂解液在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，收集上清液和沉淀。分別取上清液和沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳分析，確定重組蛋白的表達(dá)形式。若重組蛋白主要以可溶性形式存在于上清液中，則直接進(jìn)行后續(xù)的蛋白純化步驟；若重組蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，則需要對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性處理。對(duì)于以包涵體形式存在的重組蛋白，將沉淀用包涵體洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，2M尿素，1%TritonX-100，1mMEDTA）洗滌3次，每次洗滌后以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄去上清液，去除雜質(zhì)。然后將洗滌后的包涵體用變性緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，8M尿素，1mMEDTA）溶解，在室溫下攪拌1-2小時(shí)，使包涵體充分溶解。將溶解后的包涵體溶液緩慢滴加到復(fù)性緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，0.5ML-精氨酸，1mMEDTA，2mM還原型谷胱甘肽，0.2mM氧化型谷胱甘肽）中，4℃透析復(fù)性過(guò)夜。透析過(guò)程中，每隔2-3小時(shí)更換一次復(fù)性緩沖液，以去除尿素等變性劑，促進(jìn)重組蛋白的正確折疊。采用Ni-NTA親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。首先用平衡緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，20mM咪唑）平衡Ni-NTA親和層析柱，使其達(dá)到適宜的結(jié)合條件。將復(fù)性后的重組蛋白溶液或上清液緩慢上樣到平衡好的Ni-NTA親和層析柱中，讓重組蛋白與Ni-NTA樹脂充分結(jié)合。上樣結(jié)束后，用四、免疫原性檢測(cè)方法與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1體外免疫原性檢測(cè)方法4.1.1抗體反應(yīng)檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是檢測(cè)抗體產(chǎn)生的常用方法之一，其原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合以及酶對(duì)底物的催化作用。在本研究中，首先用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）將純化后的重組片段稀釋至合適濃度，一般為1-10μg/mL，然后將其包被到96孔酶標(biāo)板中，每孔加入100μL，4℃孵育過(guò)夜，使重組片段牢固地結(jié)合在酶標(biāo)板表面。次日，棄去孔內(nèi)液體，用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的重組片段。隨后，加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育1小時(shí)，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，再次用PBST洗滌3次。接著，加入適當(dāng)稀釋度的免疫動(dòng)物血清，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)，血清中的抗體若與包被的重組片段特異性結(jié)合，便會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物。之后，用PBST洗滌3-5次，充分洗去未結(jié)合的血清成分。再加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（按照1：5000-1：10000的比例稀釋），每孔100μL，37℃孵育30-60分鐘，標(biāo)記的二抗會(huì)與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合。洗滌后，加入TMB底物溶液，每孔100μL，37℃避光顯色10-30分鐘。在HRP的催化作用下，TMB底物被氧化，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。最后，加入2M硫酸終止液，每孔50μL，反應(yīng)終止，藍(lán)色產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。通過(guò)比較不同重組片段免疫組血清的OD值，可評(píng)估其誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力，OD值越高，表明誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體量越多，免疫原性越強(qiáng)。免疫印跡（Western-blotting）也是檢測(cè)抗體反應(yīng)的重要方法。首先，將純化的重組片段進(jìn)行SDS-PAGE電泳。在電泳前，需將重組片段與上樣緩沖液混合，在100℃加熱5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。然后將樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中，在一定電壓下進(jìn)行電泳，使重組片段依據(jù)分子量大小在凝膠上分離。電泳結(jié)束后，利用電轉(zhuǎn)移裝置將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纖維素（NC）膜上。轉(zhuǎn)移時(shí)，按照“海綿墊-濾紙-凝膠-膜-濾紙-海綿墊”的順序組裝轉(zhuǎn)移三明治，放入轉(zhuǎn)移槽中，在低溫條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，一般在100V電壓下轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)移完成后，將膜取出，用TBS緩沖液洗滌1次。接著，將膜放入5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉1小時(shí)或4℃封閉過(guò)夜，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次15分鐘。隨后，將膜與免疫動(dòng)物血清（按照1：1000-1：5000的比例稀釋）在室溫下孵育1-2小時(shí)，血清中的抗體與膜上的重組片段特異性結(jié)合。再用TBST緩沖液洗滌膜4次，每次15分鐘，洗去未結(jié)合的血清抗體。之后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（按照1：5000-1：10000的比例稀釋），室溫孵育30-60分鐘，標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌膜4次。最后，按照化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書，將發(fā)光液A和B等體積混合后，與膜作用1-2分鐘，然后進(jìn)行X光片曝光。在暗室中，將X光片覆蓋在膜上，曝光一定時(shí)間后，取出X光片進(jìn)行顯影和定影。若在膜上出現(xiàn)特異性條帶，則表明血清中存在針對(duì)該重組片段的抗體，條帶的深淺反映了抗體含量的多少，進(jìn)而可評(píng)估重組片段誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力。4.1.2細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)是衡量細(xì)胞免疫反應(yīng)的常用方法之一，其原理是淋巴細(xì)胞在體外受到特異性抗原或非特異性促有絲分裂原刺激后，會(huì)發(fā)生增殖反應(yīng)。在本研究中，采用MTT比色法進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。首先，無(wú)菌采集免疫動(dòng)物的脾臟，將其置于盛有預(yù)冷的RPMI-1640完全培養(yǎng)基的平皿中。用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，然后通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)，制備單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5-10分鐘，棄去上清液。加入適量的紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育3-5分鐘，裂解紅細(xì)胞。再次離心，棄去上清液，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL。實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5-10μg/mL的重組片段，對(duì)照組加入等量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，加入植物血凝素（PHA），終濃度為5-10μg/mL。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL。繼續(xù)孵育4小時(shí)后，吸出孔內(nèi)上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。通過(guò)計(jì)算刺激指數(shù)（SI）來(lái)評(píng)估淋巴細(xì)胞的增殖能力，SI=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值，SI值越高，表明淋巴細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)，重組片段對(duì)細(xì)胞免疫的激活作用越大。細(xì)胞因子檢測(cè)也是評(píng)估細(xì)胞免疫反應(yīng)的關(guān)鍵手段。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成分泌的具有廣泛生物活性的小分子蛋白質(zhì)，它們?cè)诿庖邞?yīng)答中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在本研究中，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子。首先收集免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，將捕獲抗體包被到96孔酶標(biāo)板上，4℃孵育過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次。加入封閉液，37℃孵育1小時(shí)。封閉后，再次用PBST洗滌3次。加入適當(dāng)稀釋度的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每孔100μL，37℃孵育1-2小時(shí)。洗滌后，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃孵育1小時(shí)。再加入親和素-HRP，37℃孵育30分鐘。洗滌后，加入TMB底物溶液，37℃避光顯色10-30分鐘。最后，加入終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，計(jì)算出培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的濃度。檢測(cè)的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細(xì)胞因子在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要作用。IL-2能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性；IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力。通過(guò)檢測(cè)這些細(xì)胞因子的水平，可衡量重組片段對(duì)細(xì)胞免疫的激活作用，細(xì)胞因子濃度越高，表明細(xì)胞免疫反應(yīng)越強(qiáng)。4.2體內(nèi)免疫原性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組選擇6-8周齡、體重在18-22g的SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。雌性小鼠在生理狀態(tài)上相對(duì)穩(wěn)定，個(gè)體差異較小，能減少實(shí)驗(yàn)誤差。同時(shí)，SPF級(jí)小鼠無(wú)特定病原體感染，健康狀況良好，能更準(zhǔn)確地反映重組片段的免疫原性。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。分別設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3、對(duì)照組1和對(duì)照組2。實(shí)驗(yàn)組1、2、3分別接種不同的產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素重組片段，通過(guò)比較不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的免疫應(yīng)答情況，來(lái)評(píng)估不同重組片段的免疫原性差異。對(duì)照組1接種等量的PBS緩沖液，作為空白對(duì)照，用于排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中其他因素對(duì)小鼠免疫狀態(tài)的影響。對(duì)照組2接種市售的多殺性巴氏桿菌疫苗（按照疫苗說(shuō)明書推薦劑量），作為陽(yáng)性對(duì)照，用于與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估不同重組片段的免疫原性與現(xiàn)有疫苗的差異。通過(guò)合理設(shè)置對(duì)照組，能夠更準(zhǔn)確地判斷實(shí)驗(yàn)組中重組片段的免疫原性效果。4.2.2免疫程序與攻毒試驗(yàn)免疫接種采用肌肉注射的方式，這種方式能夠使抗原迅速進(jìn)入血液循環(huán)，激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答。初次免疫時(shí)，實(shí)驗(yàn)組1、2、3分別肌肉注射100μL含有10μg重組片段的溶液，并同時(shí)加入弗氏完全佐劑（按照1：1的體積比混合），弗氏完全佐劑能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。對(duì)照組1肌肉注射100μLPBS緩沖液，對(duì)照組2按照疫苗說(shuō)明書推薦劑量肌肉注射市售多殺性巴氏桿菌疫苗。初次免疫后的第14天進(jìn)行二免，二免時(shí)實(shí)驗(yàn)組1、2、3肌肉注射100μL含有10μg重組片段的溶液，并同時(shí)加入弗氏不完全佐劑（按照1：1的體積比混合），弗氏不完全佐劑在增強(qiáng)免疫應(yīng)答的同時(shí)，減少了炎癥反應(yīng)等不良反應(yīng)。對(duì)照組1和對(duì)照組2的處理方式同初次免疫。在二免后的第21天，對(duì)所有小鼠進(jìn)行產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌的攻毒試驗(yàn)。攻毒時(shí)，通過(guò)滴鼻的方式，給予每只小鼠1×10?CFU的強(qiáng)毒產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌。滴鼻攻毒能夠模擬自然感染途徑，使病原菌直接作用于呼吸道黏膜，更真實(shí)地評(píng)估重組片段對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)效果。攻毒后，每天觀察小鼠的發(fā)病情況，記錄小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、呼吸狀況等癥狀。連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的死亡率。通過(guò)比較不同組小鼠的死亡率以及發(fā)病癥狀的嚴(yán)重程度，評(píng)估不同重組片段的免疫保護(hù)效果。如果某實(shí)驗(yàn)組小鼠的死亡率明顯低于對(duì)照組1，且發(fā)病癥狀較輕，說(shuō)明該重組片段具有較好的免疫原性，能夠有效保護(hù)小鼠抵抗產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌的感染。五、不同重組片段免疫原性比較結(jié)果與分析5.1體外免疫原性檢測(cè)結(jié)果在抗體反應(yīng)檢測(cè)中，ELISA結(jié)果顯示，不同重組片段誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體的能力存在顯著差異（圖1）。以PMT1-506aa片段免疫組為例，二免后14天，其血清抗體OD450值達(dá)到了1.85±0.12，顯著高于PMT1-391aa片段免疫組的0.95±0.08（P<0.01）。這表明PMT1-506aa片段在刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答方面表現(xiàn)更為出色，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的抗體。從免疫印跡（Western-blotting）結(jié)果來(lái)看，PMT505-1285aa和PMT973-1285aa片段免疫組的血清在膜上均出現(xiàn)了明顯的特異性條帶（圖2），且條帶顏色較深，說(shuō)明這兩個(gè)片段誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能夠與相應(yīng)的重組片段發(fā)生強(qiáng)烈的特異性結(jié)合，進(jìn)一步證明了它們具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的體液免疫反應(yīng)。而PMT1-391aa片段免疫組的條帶相對(duì)較淺，表明其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體含量較低，免疫原性相對(duì)較弱。圖1：不同重組片段免疫組小鼠血清ELISA檢測(cè)結(jié)果。橫坐標(biāo)為不同的重組片段，縱坐標(biāo)為OD450值。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=10）。*P<0.05，**P<0.01，與PMT1-391aa片段免疫組相比。圖2：不同重組片段免疫組小鼠血清Western-blotting檢測(cè)結(jié)果。M為蛋白Marker，1-4分別為PMT1-506aa、PMT1-391aa、PMT505-1285aa、PMT973-1285aa片段免疫組血清。在細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)方面，淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，各重組片段均能刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，但刺激程度有所不同（圖3）。PMT505-1285aa片段免疫組的刺激指數(shù)（SI）達(dá)到了2.56±0.23，顯著高于PMT1-391aa片段免疫組的1.58±0.15（P<0.01），說(shuō)明PMT505-1285aa片段對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖刺激作用更強(qiáng)，能夠更有效地激活細(xì)胞免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，PMT1-506aa和PMT505-1285aa片段免疫組的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白細(xì)胞介素-2（IL-2）和干擾素-γ（IFN-γ）的濃度明顯高于其他組（圖4）。PMT1-506aa片段免疫組的IL-2濃度為256.3±20.5pg/mL，IFN-γ濃度為312.5±25.8pg/mL；PMT505-1285aa片段免疫組的IL-2濃度為248.6±18.9pg/mL，IFN-γ濃度為305.7±23.4pg/mL。IL-2和IFN-γ在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們濃度的升高表明這兩個(gè)重組片段能夠有效激活T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。圖3：不同重組片段對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響。橫坐標(biāo)為不同的重組片段，縱坐標(biāo)為刺激指數(shù)（SI）。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=10）。*P<0.05，**P<0.01，與PMT1-391aa片段免疫組相比。圖4：不同重組片段免疫組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子濃度。A為IL-2濃度，B為IFN-γ濃度。橫坐標(biāo)為不同的重組片段，縱坐標(biāo)為細(xì)胞因子濃度（pg/mL）。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=10）。*P<0.05，**P<0.01，與PMT1-391aa片段免疫組相比。5.2體內(nèi)免疫原性檢測(cè)結(jié)果在攻毒后的觀察期內(nèi)，對(duì)照組1（PBS組）小鼠發(fā)病癥狀最為嚴(yán)重。從攻毒后第2天開始，部分小鼠便出現(xiàn)精神萎靡的癥狀，行動(dòng)遲緩，對(duì)周圍環(huán)境的刺激反應(yīng)明顯減弱。飲食量也顯著下降，與正常小鼠相比，進(jìn)食量減少了約50%-60%。呼吸狀況也出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為呼吸急促，頻率較正常小鼠增加了30-40次/分鐘，且伴有明顯的咳嗽癥狀。隨著時(shí)間的推移，癥狀逐漸加重，到第5天，已有5只小鼠死亡，死亡率達(dá)到50%。至觀察期結(jié)束（第14天），該組小鼠的累計(jì)死亡率高達(dá)80%（8/10）。解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，其肺部出現(xiàn)嚴(yán)重的充血、水腫現(xiàn)象，肺組織質(zhì)地變硬，顏色暗紅，表面有大量的出血點(diǎn)。氣管內(nèi)有大量的黏液滲出，堵塞氣道。鼻腔黏膜嚴(yán)重充血、腫脹，鼻甲骨出現(xiàn)不同程度的萎縮，骨質(zhì)變薄，結(jié)構(gòu)破壞。對(duì)照組2（市售疫苗組）小鼠的發(fā)病癥狀相對(duì)較輕。攻毒后第3天，部分小鼠出現(xiàn)精神不振的情況，飲食量略有下降，減少約20%-30%。呼吸頻率稍有增加，較正常小鼠快10-20次/分鐘，偶有咳嗽。在整個(gè)觀察期內(nèi)，該組小鼠的死亡率為30%（3/10）。解剖死亡小鼠可見，肺部有輕度的充血和水腫，氣管內(nèi)有少量黏液。鼻腔黏膜輕度充血，鼻甲骨僅有輕微的萎縮跡象。實(shí)驗(yàn)組1（PMT1-506aa片段免疫組）小鼠在攻毒后，僅有2只出現(xiàn)輕微的精神不佳，飲食和呼吸基本正常。這2只小鼠的精神狀態(tài)在短暫不佳后，很快恢復(fù)正常，未出現(xiàn)進(jìn)一步的癥狀加重。在14天的觀察期內(nèi)，該組小鼠無(wú)一死亡，免疫保護(hù)率達(dá)到100%。解剖該組小鼠，肺部和氣管未見明顯異常，鼻腔黏膜色澤正常，鼻甲骨結(jié)構(gòu)完整，無(wú)萎縮現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組2（PMT1-391aa片段免疫組）小鼠的發(fā)病情況相對(duì)較嚴(yán)重。攻毒后第4天，有4只小鼠出現(xiàn)精神萎靡，飲食量減少約30%-40%，呼吸急促，咳嗽頻繁。到第7天，已有3只小鼠死亡。觀察期結(jié)束時(shí)，該組小鼠的死亡率為40%（4/10）。解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，肺部有明顯的充血和炎癥，氣管內(nèi)有較多黏液。鼻腔黏膜充血明顯，鼻甲骨有一定程度的萎縮。實(shí)驗(yàn)組3（PMT505-1285aa片段免疫組）小鼠的免疫保護(hù)效果較好。攻毒后僅有1只小鼠出現(xiàn)輕微的呼吸加快，但精神和飲食未受明顯影響。在整個(gè)觀察期內(nèi)，該組小鼠的死亡率為10%（1/10）。解剖死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)其肺部?jī)H有輕微的充血，氣管和鼻腔黏膜基本正常，鼻甲骨無(wú)明顯萎縮。通過(guò)對(duì)各組小鼠發(fā)病情況和死亡率的比較，可以明顯看出，PMT1-506aa和PMT505-1285aa片段免疫組的免疫保護(hù)效果顯著優(yōu)于PMT1-391aa片段免疫組（P<0.01）。PMT1-506aa和PMT505-1285aa片段免疫組的死亡率明顯低于PMT1-391aa片段免疫組，且發(fā)病癥狀也明顯較輕。與對(duì)照組2（市售疫苗組）相比，PMT1-506aa和PMT505-1285aa片段免疫組的免疫保護(hù)效果相當(dāng)，甚至在某些方面表現(xiàn)更優(yōu)，如PMT1-506aa片段免疫組的死亡率為0，低于市售疫苗組的30%。這表明PMT1-506aa和PMT505-1285aa片段具有較強(qiáng)的體內(nèi)免疫原性，能夠有效地激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，保護(hù)小鼠抵抗產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌的感染。5.3結(jié)果綜合分析綜合體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)不同重組片段的免疫原性進(jìn)行排序，結(jié)果顯示PMT1-506aa和PMT505-1285aa片段的免疫原性最強(qiáng)，PMT973-1285aa片段次之，PMT1-391aa片段的免疫原性相對(duì)較弱。從片段結(jié)構(gòu)來(lái)看，PMT1-506aa片段包含了N端的部分關(guān)鍵區(qū)域，這可能使其能夠更好地刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)受體結(jié)合位點(diǎn)的抗體，從而阻斷PMT與靶細(xì)胞的結(jié)合，展現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫原性。PMT505-1285aa片段則涵蓋了C端的催化活性關(guān)鍵區(qū)域，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生能夠中和其催化活性的免疫應(yīng)答，有效發(fā)揮免疫保護(hù)作用。而PMT1-391aa片段由于缺失了部分對(duì)免疫原性至關(guān)重要的區(qū)域，導(dǎo)致其免疫原性較弱。氨基酸組成也是影響免疫原性的重要因素。對(duì)不同重組片段的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，免疫原性較強(qiáng)的片段中，某些氨基酸的含量和分布具有一定特點(diǎn)。PMT1-506aa和PMT505-1285aa片段中，富含一些具有較強(qiáng)免疫原性的氨基酸殘基，如賴氨酸、精氨酸等。這些氨基酸殘基能夠與免疫細(xì)胞表面的受體發(fā)生特異性相互作用，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)重組片段的識(shí)別和攝取，從而促進(jìn)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。這些片段中氨基酸的排列順序也可能影響其空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響免疫原性。合理的氨基酸排列順序能夠使重組片段形成穩(wěn)定且有利于免疫細(xì)胞識(shí)別的空間構(gòu)象，提高免疫原性。而PMT1-391aa片段中，這些關(guān)鍵氨基酸的含量相對(duì)較低，或者其排列順序不利于形成有效的免疫原性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其免疫原性較差。綜上所述，產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素的不同重組片段免疫原性存在顯著差異，片段結(jié)構(gòu)和氨基酸組成是影響免疫原性的關(guān)鍵因素。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)高效的產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌疫苗提供了重要的理論依據(jù)，在疫苗研發(fā)過(guò)程中，可以針對(duì)這些影響因素，對(duì)重組片段進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，以提高疫苗的免疫效果。六、影響免疫原性的因素探討6.1重組片段結(jié)構(gòu)因素重組片段的長(zhǎng)度對(duì)免疫原性有著顯著的影響。一般來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)度適中的片段可能具有更好的免疫原性。PMT1-506aa片段相較于PMT1-391aa片段，長(zhǎng)度更長(zhǎng)，包含了更多的氨基酸序列。這使得PMT1-506aa片段可能擁有更完整的抗原表位，從而能夠更有效地刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)。抗原表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，它是免疫系統(tǒng)識(shí)別抗原的關(guān)鍵部位。較長(zhǎng)的片段有更大的概率包含多個(gè)不同的抗原表位，這些表位可以與不同的免疫細(xì)胞表面受體結(jié)合，引發(fā)更廣泛和強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。如果片段過(guò)短，可能無(wú)法包含足夠的抗原表位，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)難以識(shí)別，免疫原性降低。而片段過(guò)長(zhǎng)，也可能會(huì)增加其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，影響其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和免疫細(xì)胞的攝取，同樣不利于免疫原性的發(fā)揮。空間構(gòu)象是影響重組片段免疫原性的另一重要因素。蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象決定了其抗原表位的暴露程度和與免疫細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力。通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，免疫原性較強(qiáng)的PMT1-506aa和PMT505-1285aa片段具有相對(duì)穩(wěn)定且有利于免疫識(shí)別的空間構(gòu)象。這些片段可能形成了特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使得抗原表位能夠充分暴露在外，便于免疫細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合。在二級(jí)結(jié)構(gòu)方面，它們可能含有較多的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有助于維持抗原表位的完整性。在三級(jí)結(jié)構(gòu)上，它們的氨基酸殘基之間通過(guò)氫鍵、離子鍵等相互作用，形成了緊密且有序的折疊狀態(tài)，進(jìn)一步增強(qiáng)了抗原表位的穩(wěn)定性和免疫原性。而免疫原性較弱的PMT1-391aa片段，其空間構(gòu)象可能不夠穩(wěn)定，抗原表位的暴露程度較低，導(dǎo)致免疫細(xì)胞難以有效識(shí)別和結(jié)合，從而影響了免疫原性。抗原表位的分布在重組片段免疫原性中也起著關(guān)鍵作用。免疫原性強(qiáng)的重組片段往往具有合理分布的抗原表位。PMT1-506aa片段包含了N端的部分關(guān)鍵區(qū)域，這些區(qū)域可能含有與PMT受體結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的抗原表位。當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)接觸到該片段時(shí)，能夠產(chǎn)生針對(duì)這些抗原表位的抗體，這些抗體可以特異性地結(jié)合PMT，阻斷其與靶細(xì)胞的結(jié)合，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。PMT505-1285aa片段涵蓋了C端的催化活性關(guān)鍵區(qū)域，含有能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和其催化活性免疫應(yīng)答的抗原表位。通過(guò)識(shí)別和結(jié)合這些抗原表位，免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生相應(yīng)的免疫效應(yīng)物質(zhì)，中和PMT的毒性。如果抗原表位分布不合理，如過(guò)于集中在片段的某一區(qū)域，可能會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞對(duì)片段的識(shí)別不充分，無(wú)法全面激活免疫系統(tǒng)，進(jìn)而降低免疫原性。6.2宿主因素不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類對(duì)重組片段免疫原性的影響較為顯著。以小鼠和兔子為例，小鼠因其繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、遺傳背景清晰等優(yōu)勢(shì)，在免疫學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。然而，小鼠的免疫系統(tǒng)相對(duì)較小且簡(jiǎn)單，與人類或大型動(dòng)物的免疫系統(tǒng)存在一定差異。當(dāng)使用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)研究產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素重組片段的免疫原性時(shí)，其免疫系統(tǒng)對(duì)重組片段的識(shí)別和應(yīng)答模式可能與其他動(dòng)物不同。研究發(fā)現(xiàn)，某些在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好免疫原性的重組片段，在兔子體內(nèi)的免疫原性卻較弱。兔子的免疫系統(tǒng)相對(duì)更為復(fù)雜，其免疫細(xì)胞的組成和功能與小鼠有所不同。兔子的淋巴細(xì)胞亞群比例、細(xì)胞因子的分泌模式等都可能影響其對(duì)重組片段的免疫應(yīng)答。兔子的免疫系統(tǒng)可能對(duì)某些特定結(jié)構(gòu)的重組片段更為敏感，能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。而小鼠可能對(duì)其他類型的重組片段有更好的免疫應(yīng)答。這表明不同動(dòng)物種類的免疫系統(tǒng)具有特異性，在研究重組片段免疫原性時(shí)，需要充分考慮動(dòng)物種類的差異。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡也是影響重組片段免疫原性的重要因素。一般來(lái)說(shuō)，幼齡動(dòng)物的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，其免疫細(xì)胞的功能和數(shù)量都相對(duì)較少。以幼齡小鼠為例，其T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程還在進(jìn)行中，免疫細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別和應(yīng)答能力較弱。當(dāng)幼齡小鼠接種產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素重組片段時(shí)，其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可能較弱，抗體產(chǎn)生水平較低，細(xì)胞免疫反應(yīng)也不明顯。隨著年齡的增長(zhǎng)，動(dòng)物的免疫系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟，免疫細(xì)胞的功能和數(shù)量都有所增加。成年小鼠的免疫系統(tǒng)能夠更有效地識(shí)別和處理重組片段，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。成年小鼠在接種相同的重組片段后，抗體效價(jià)明顯高于幼齡小鼠，淋巴細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞因子的分泌水平也更高。然而，當(dāng)動(dòng)物進(jìn)入老齡階段，免疫系統(tǒng)又會(huì)出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。老齡小鼠的免疫細(xì)胞功能下降，免疫細(xì)胞的增殖能力和活性降低，細(xì)胞因子的分泌也發(fā)生改變。這使得老齡小鼠對(duì)重組片段的免疫應(yīng)答能力減弱，免疫原性降低。老齡小鼠接種重組片段后，抗體產(chǎn)生的速度和水平都明顯低于成年小鼠，細(xì)胞免疫反應(yīng)也較為微弱。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別對(duì)重組片段免疫原性的影響也不容忽視。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠在接種產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素重組片段后，產(chǎn)生的抗體水平往往高于雄性小鼠。這可能與雌性小鼠的激素水平和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。雌性小鼠體內(nèi)的雌激素等激素能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化和抗體的產(chǎn)生。雌激素可以增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞表面受體的表達(dá)，提高其對(duì)抗原的識(shí)別和結(jié)合能力，從而促進(jìn)抗體的分泌。雌性小鼠的免疫系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)病原體感染時(shí)，可能具有更強(qiáng)的免疫應(yīng)答能力。雄性小鼠體內(nèi)的雄激素等激素則可能對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。雄激素可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活性，降低細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。在某些情況下，雄激素還可能影響B(tài)淋巴細(xì)胞的功能，減少抗體的產(chǎn)生。除了激素水平的影響外，性別差異還可能體現(xiàn)在免疫細(xì)胞的組成和分布上。雌性和雄性小鼠的免疫細(xì)胞亞群比例可能存在差異，這也會(huì)對(duì)重組片段的免疫原性產(chǎn)生影響。6.3免疫佐劑的作用免疫佐劑是一類能夠非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答強(qiáng)度或改變免疫應(yīng)答類型，但自身無(wú)抗原性的物質(zhì)。常見的免疫佐劑種類繁多，弗氏佐劑是較為經(jīng)典的一類，分為弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FIA）。FCA由石蠟油、羊毛脂和卡介苗組成，能夠誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)，激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫；FIA則不含卡介苗，主要誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)，激發(fā)機(jī)體的體液免疫。鋁佐劑也是常用的佐劑之一，如氫氧化鋁、磷酸鋁等，其作用機(jī)制主要是在注射位點(diǎn)存儲(chǔ)抗原并緩慢釋放，延長(zhǎng)抗原與免疫細(xì)胞的作用時(shí)間。當(dāng)鋁佐劑與抗原混合注入機(jī)體后，會(huì)形成一種不溶性凝膠狀顆粒，吸附并分散抗原物質(zhì)，使抗原在注射部位形成一個(gè)肉芽腫，其中的抗原會(huì)緩慢滲透入機(jī)體，持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)。此外，細(xì)胞因子佐劑，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，可直接作用于免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。IL-2能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。免疫佐劑的作用原理主要包括以下幾個(gè)方面。從抗原存儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)來(lái)看，許多佐劑能夠在注射位點(diǎn)存儲(chǔ)抗原并緩慢釋放，達(dá)到對(duì)免疫系統(tǒng)持續(xù)刺激的目的。以鋁佐劑為例，它將抗原與佐劑成分混合成凝膠狀態(tài)，注入機(jī)體后形成“存儲(chǔ)庫(kù)”，使原本僅能在注射部位短暫停留的抗原保存數(shù)周之久。在本研究中，當(dāng)重組片段與鋁佐劑聯(lián)合使用時(shí)，鋁佐劑的抗原存儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)使得重組片段能夠在體內(nèi)持續(xù)釋放，延長(zhǎng)了其與免疫細(xì)胞的接觸時(shí)間。這為免疫細(xì)胞提供了更持久的抗原刺激，從而增強(qiáng)了免疫細(xì)胞對(duì)重組片段的識(shí)別和應(yīng)答，提高了抗體產(chǎn)生的水平和細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。佐劑能夠激活抗原呈遞細(xì)胞，增強(qiáng)抗原攝取和呈遞。例如，弗氏佐劑可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞（DCs）的活化與成熟，增強(qiáng)其對(duì)抗原的攝取和呈遞能力。DCs是體內(nèi)最重要的抗原呈遞細(xì)胞之一，它能夠攝取、加工和呈遞抗原給T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。當(dāng)重組片段與弗氏佐劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，弗氏佐劑促進(jìn)了DCs的活化，使其表面的共刺激分子CD80與CD86的表達(dá)增加，同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子。這些變化使得DCs能夠更有效地?cái)z取重組片段，并將其加工處理成抗原肽，呈遞給T淋巴細(xì)胞，從而增強(qiáng)了T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，提高了細(xì)胞免疫反應(yīng)。佐劑還能增強(qiáng)多種細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞向注射位點(diǎn)募集。MF59等佐劑可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、DCs等免疫細(xì)胞向疫苗注射位點(diǎn)募集，產(chǎn)生局部免疫活性環(huán)境。在本研究中，當(dāng)重組片段與MF59佐劑聯(lián)合使用時(shí)，MF59佐劑上調(diào)了趨化因子、黏附分子等相關(guān)基因的表達(dá)，吸引了大量免疫細(xì)胞向注射位點(diǎn)聚集。這些免疫細(xì)胞在局部形成了一個(gè)活躍的免疫微環(huán)境，它們相互協(xié)作，共同對(duì)抗原進(jìn)行識(shí)別和應(yīng)答。免疫細(xì)胞之間通過(guò)分泌細(xì)胞因子進(jìn)行信號(hào)傳遞，進(jìn)一步激活了其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)了免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。免疫佐劑與重組片段聯(lián)合使用對(duì)免疫原性的增強(qiáng)效果顯著。在本研究中，實(shí)驗(yàn)組在接種重組片段時(shí)同時(shí)加入弗氏佐劑，與未加佐劑的對(duì)照組相比，抗體效價(jià)明顯提高。以PMT1-506aa片段免疫組為例，加入弗氏佐劑后，二免后14天血清抗體OD450值比未加佐劑組提高了約50%