Nrf2基因敲除對小鼠創傷性腦損傷后認知功能的影響及機制探究一、引言1.1研究背景創傷性腦損傷（TraumaticBrainInjury，TBI）是指由于外力作用于頭部而導致的腦組織損傷，是目前世界范圍內最常見且嚴重的神經系統疾病之一。據統計，全球每年TBI的發生率相當高，約為939例/10萬，我國的發生率為13.23/10萬。美國疾病控制與預防中心（CDC）的數據顯示，每年有超過280萬美國人受到TBI的影響。TBI的常見原因包括車禍、跌倒、暴力沖突、運動損傷以及戰爭等，其中，交通事故是導致TBI的主要原因之一，尤其在發展中國家，隨著機動車保有量的增加，因交通事故引發的TBI案例也呈上升趨勢；在老年人群體中，跌倒則是導致TBI的重要因素。TBI具有高發生率、高致殘率和高死亡率的特點。在所有外傷死亡病例中，大約三分之一是由TBI造成的，另有250萬-650萬人因TBI而生活在殘疾狀態中。因TBI住院的患者中最終有43%致殘，幸存者常常終生伴隨著認知缺陷、記憶受損、運動障礙、聽力和視力喪失、癲癇以及心理問題等后遺癥，這些后遺癥嚴重影響患者的生活質量，使其難以回歸正常的社會生活，給患者家庭帶來沉重的心理和經濟負擔。同時，TBI也給社會帶來了巨大的經濟負擔，僅輕癥TBI患者的醫療花費即為非TBI患者的2-3倍，包括醫療救治費用、長期康復護理費用以及因患者勞動能力喪失導致的經濟損失等。盡管目前在TBI的臨床救治方面取得了一定進展，如急性期的生命支持、控制顱內壓、手術清除血腫等措施，但對于TBI后的神經功能修復和認知功能恢復，仍然缺乏有效的治療手段。現有的治療方法主要側重于緩解急性期癥狀和預防并發癥，對于受損神經細胞的再生和修復以及改善長期認知功能障礙的效果有限，大部分患者仍會遺留不同程度的神經功能缺陷和認知障礙。氧化應激損傷被認為在TBI的發病機制中占有重要地位。在TBI發生后，機體產生大量的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）和活性氮（ReactiveNitrogenSpecies，RNS），導致氧化應激水平急劇升高。這些過量的ROS和RNS會攻擊細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子，引發脂質過氧化、蛋白質氧化修飾和DNA損傷，進而導致神經細胞凋亡、血腦屏障破壞和炎癥反應加劇，最終加重TBI后的繼發性腦損傷。核因子E2-相關因子2（NF-E2-relatedfactor2，Nrf2）是一種重要的轉錄因子，在調節細胞抗氧化應激反應中發揮著關鍵作用。正常情況下，Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-likeECH-associatedprotein1，Keap1）結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到氧化應激等刺激時，Nrf2與Keap1解離，進入細胞核內，與抗氧化反應元件（AntioxidantResponseElement，ARE）結合，啟動一系列抗氧化酶和解毒酶的表達，如血紅素加氧酶-1（HemeOxygenase-1，HO-1）、NADPH：醌氧化還原酶-1（NADPH：quinoneoxidoreductase-1，NQO-1）等，從而增強細胞的抗氧化防御能力，減輕氧化應激損傷。有研究表明，Nrf2的激活可能對TBI后的神經保護和認知功能恢復具有重要作用，但其具體機制尚未完全明確。通過對Nrf2基因敲除小鼠進行TBI研究，可以更深入地了解Nrf2在TBI病理過程中的作用機制。Nrf2基因敲除小鼠缺乏功能性的Nrf2蛋白，無法正常啟動抗氧化應激反應，以此為模型能夠直觀地觀察到Nrf2缺失對TBI后氧化應激水平、神經細胞損傷以及認知功能的影響，從而為揭示TBI的發病機制以及尋找新的治療靶點提供理論依據和實驗基礎。1.2研究目的本研究旨在深入探究Nrf2基因敲除對小鼠創傷性腦損傷后認知功能的影響，并剖析其內在機制。具體而言，通過構建Nrf2基因敲除小鼠的創傷性腦損傷模型，觀察Nrf2基因缺失情況下，小鼠在創傷性腦損傷后的認知行為表現，包括學習能力、記憶能力等方面的變化。從氧化應激、神經炎癥、神經細胞凋亡等多個角度，分析Nrf2基因敲除影響小鼠創傷性腦損傷后認知功能的具體作用機制，明確Nrf2信號通路在這一過程中的關鍵作用及相關調控機制。本研究期望為創傷性腦損傷后認知功能障礙的發病機制提供新的理論依據，為開發基于Nrf2信號通路的創傷性腦損傷治療新策略奠定實驗基礎，為臨床治療創傷性腦損傷患者的認知功能障礙提供潛在的干預靶點和治療思路。1.3研究意義本研究對Nrf2基因敲除小鼠創傷性腦損傷后認知功能的探究，具有重要的理論與實踐意義。在理論層面，其有助于深入解析創傷性腦損傷的發病機制。創傷性腦損傷后的繼發性腦損傷涉及氧化應激、神經炎癥、神經細胞凋亡等復雜的病理生理過程，而Nrf2作為細胞抗氧化應激反應的關鍵調節因子，在這一系列過程中可能發揮著核心作用。通過對Nrf2基因敲除小鼠的研究，能夠清晰地觀察到Nrf2缺失時，小鼠在創傷性腦損傷后氧化應激水平的變化，以及這種變化如何進一步影響神經炎癥反應和神經細胞凋亡的進程。從而揭示Nrf2信號通路在創傷性腦損傷病理生理過程中的具體調控機制，補充和完善創傷性腦損傷發病機制的理論體系，為后續的相關研究提供更為堅實的理論基礎。在實踐意義方面，本研究為開發創傷性腦損傷的治療藥物和方法提供了新的潛在靶點和思路。目前，針對創傷性腦損傷后認知功能障礙的治療手段極為有限，患者的預后往往不理想。若能夠明確Nrf2在創傷性腦損傷后認知功能恢復中的關鍵作用及機制，就可以以此為靶點，研發能夠激活Nrf2信號通路的藥物或治療方法，增強機體的抗氧化應激能力，減輕神經細胞損傷，促進神經功能的恢復，改善患者的認知功能。這不僅有助于提高創傷性腦損傷患者的生活質量，減輕患者家庭和社會的負擔，還能推動創傷性腦損傷治療領域的發展，具有顯著的社會和經濟效益。二、創傷性腦損傷與Nrf2基因概述2.1創傷性腦損傷2.1.1定義與分類創傷性腦損傷是指頭部遭受外部暴力打擊、碰撞、穿透等直接或間接作用，導致腦組織出現不同程度的損傷。其損傷機制復雜，涉及機械性破壞、生物化學改變以及神經生理功能紊亂等多個方面。常見的致傷原因包括交通事故、高處墜落、跌倒、暴力襲擊以及運動相關的頭部創傷等。按照損傷類型，創傷性腦損傷可分為原發性腦損傷和繼發性腦損傷。原發性腦損傷是指外力作用于頭部瞬間所造成的腦組織損傷，包括腦震蕩、腦挫裂傷、彌漫性軸索損傷和原發性腦干損傷等。腦震蕩是最輕的原發性腦損傷，通常表現為短暫的意識喪失，一般不超過30分鐘，清醒后可能出現頭痛、頭暈、逆行性遺忘等癥狀，神經系統檢查無明顯陽性體征；腦挫裂傷則是腦組織的實質性損傷，常伴有出血、水腫，患者可出現較長時間的昏迷，伴有局灶性神經系統癥狀和體征；彌漫性軸索損傷是由于頭部受到旋轉或加速-減速力作用，導致腦白質內的神經軸索廣泛受損，病情較為嚴重，患者多呈持續性昏迷狀態；原發性腦干損傷是指中腦、腦橋和延髓等腦干部位的損傷，可引起生命體征紊亂、去大腦強直等嚴重表現。繼發性腦損傷是在原發性腦損傷的基礎上，經過一段時間后逐漸發生的腦組織損傷，主要包括腦水腫、顱內血腫、腦梗死、腦腫脹以及感染等。腦水腫是創傷性腦損傷后常見的繼發性改變，由于血腦屏障破壞、腦缺血缺氧等原因，導致腦組織內水分增多，引起顱內壓升高；顱內血腫根據其部位可分為硬膜外血腫、硬膜下血腫和腦內血腫，血腫的形成會對周圍腦組織產生壓迫，進一步加重腦損傷；腦梗死可因腦血管痙攣、血栓形成等原因導致局部腦組織缺血壞死；腦腫脹多發生于傷后數小時至數天，表現為腦組織彌漫性腫大；感染則可發生在傷口、顱內或肺部等部位，加重病情。根據損傷嚴重程度，創傷性腦損傷又可分為輕型、中型、重型和特重型。輕型創傷性腦損傷患者的昏迷時間通常在30分鐘以內，有輕度頭痛、頭暈等癥狀，神經系統檢查和頭顱CT檢查基本正常；中型患者的昏迷時間在30分鐘至6小時之間，可能伴有輕度的神經系統陽性體征，頭顱CT檢查可發現局部腦挫裂傷或顱內小血腫；重型患者的昏迷時間在6小時以上，存在明顯的神經系統陽性體征，如偏癱、失語等，頭顱CT檢查可見較大范圍的腦挫裂傷、顱內血腫或腦水腫；特重型患者病情最為嚴重，深昏迷，伴有生命體征嚴重紊亂，常出現腦疝等危及生命的情況。這種分類方式有助于臨床醫生對患者的病情進行快速評估和制定相應的治療方案。2.1.2流行病學現狀創傷性腦損傷是一個全球性的公共衛生問題，其發病率在全球范圍內呈上升趨勢。據世界衛生組織（WHO）估計，全球每年大約有1000萬人因創傷性腦損傷而就醫，其發生率約為939例/10萬。不同地區的創傷性腦損傷發病率存在差異，高收入國家的發病率相對較高，如美國疾病控制與預防中心（CDC）報告顯示，美國每年約有280萬人遭受創傷性腦損傷，其中急診就診人數約為250萬，住院人數約為28萬，死亡人數約為5.6萬。在歐洲，創傷性腦損傷的年發病率平均為325/10萬人口/年。在我國，創傷性腦損傷的發病率也不容忽視。2000年我國創傷性腦損傷發病率為(100~200)/10萬人口/年，隨著工業化和現代化的發展，這一數字呈上升趨勢。據統計，我國創傷性腦損傷的發生率為13.23/10萬，患者中男性多于女性，且以青壯年為主。交通事故、高處墜落和跌倒等是我國創傷性腦損傷的主要致傷原因，其中交通事故在青壯年患者中占比較高，而跌倒在老年患者中更為常見。創傷性腦損傷不僅具有較高的發病率，還伴隨著高致殘率和高死亡率。在所有外傷死亡病例中，約三分之一是由創傷性腦損傷造成的，另有250萬-650萬人因創傷性腦損傷而生活在殘疾狀態中。因創傷性腦損傷住院的患者中最終有43%致殘，幸存者常常遺留各種嚴重的后遺癥，如認知缺陷、記憶受損、運動障礙、癲癇、心理問題等，這些后遺癥嚴重影響患者的生活質量，使其難以回歸正常社會生活。創傷性腦損傷給社會經濟帶來了沉重負擔。治療創傷性腦損傷的費用高昂，包括急性期的急救治療、手術費用、藥物治療，以及長期的康復護理費用等。僅輕癥創傷性腦損傷患者的醫療花費即為非創傷性腦損傷患者的2-3倍。此外，患者因勞動能力喪失導致的經濟損失、家庭護理負擔的加重以及社會資源的消耗等，進一步加劇了社會經濟負擔。據估計，美國每年因創傷性腦損傷造成的經濟損失高達765億美元，包括醫療費用、生產力損失和長期護理費用等。在我國，隨著創傷性腦損傷發病率的上升，其帶來的經濟負擔也日益增加，給患者家庭和社會造成了巨大的壓力。2.1.3損傷機制創傷性腦損傷的損傷機制極為復雜，涉及原發性損傷和繼發性損傷兩個階段。原發性損傷是由外力直接作用于頭部所導致的腦組織即時性損傷，主要包括機械性損傷。當頭部受到暴力打擊時，如車禍中的撞擊、高處墜落時的頭部著地，強大的外力會使顱骨變形、骨折，進而直接損傷腦組織。這種機械性損傷可導致神經細胞的破裂、軸突的斷裂以及腦血管的破裂出血。例如，腦挫裂傷就是由于腦組織與顱骨內板或顱底骨嵴相互碰撞、摩擦，造成腦組織的器質性損傷，損傷部位的神經細胞和血管受到破壞，出現出血、水腫等病理改變；彌漫性軸索損傷則是由于頭部的加速-減速運動或旋轉運動，使腦白質內的神經軸索受到過度牽拉、扭曲，導致軸索斷裂和神經傳導功能障礙。繼發性損傷是在原發性損傷的基礎上，由一系列復雜的生物化學和病理生理變化所引發的延遲性損傷。氧化應激在繼發性損傷中起著關鍵作用。創傷性腦損傷發生后，機體的代謝紊亂和能量供應不足，導致線粒體功能障礙，從而產生大量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）。這些過量的ROS和RNS會攻擊細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子，引發脂質過氧化反應，使細胞膜的結構和功能受損；導致蛋白質的氧化修飾，影響蛋白質的正常功能；引起DNA損傷，誘導細胞凋亡。例如，ROS可與細胞膜上的多不飽和脂肪酸發生反應，生成過氧化脂質，這些過氧化脂質會破壞細胞膜的穩定性，增加細胞膜的通透性，導致細胞內物質外流和細胞外離子內流，進一步加重細胞損傷。炎癥反應也是繼發性損傷的重要機制之一。創傷性腦損傷后，損傷部位的組織細胞會釋放多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥介質會吸引中性粒細胞、巨噬細胞等免疫細胞聚集到損傷部位，引發炎癥反應。炎癥反應一方面有助于清除損傷組織和病原體，但另一方面也會導致局部組織的進一步損傷。過度的炎癥反應會使血腦屏障受損，導致血管通透性增加，血漿蛋白和炎性細胞滲出到腦組織中，引起腦水腫和顱內壓升高。同時，炎癥介質還會激活小膠質細胞，使其釋放更多的炎癥因子和神經毒性物質，對周圍的神經細胞造成損傷。此外，興奮性神經毒性、細胞內鈣超載和細胞凋亡等也在創傷性腦損傷的繼發性損傷中發揮著重要作用。興奮性神經毒性是指創傷性腦損傷后，谷氨酸等興奮性神經遞質的大量釋放，導致神經元過度興奮，引起鈣離子內流增加，進而激活一系列酶的活性，導致神經細胞損傷和死亡。細胞內鈣超載則是由于細胞膜的損傷和離子通道的功能異常，使細胞外的鈣離子大量內流進入細胞內，導致細胞內鈣離子濃度升高。過高的細胞內鈣離子濃度會激活磷脂酶、蛋白酶和核酸酶等，破壞細胞的結構和功能，引發細胞凋亡。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡方式，在創傷性腦損傷后，多種因素如氧化應激、炎癥反應、興奮性神經毒性等均可誘導神經細胞發生凋亡，導致神經元數量減少，進一步加重腦損傷。2.2Nrf2基因2.2.1Nrf2基因結構與功能Nrf2基因，全稱核因子E2相關因子2（NF-E2-relatedfactor2），位于人染色體2q31，其基因序列包含多個外顯子和內含子。Nrf2蛋白屬于CNC（Cap-'n'-Collar）堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉錄因子家族成員，含有6個高度保守的Neh（Nrf2-ECHhomology）結構域，分別為Neh1-Neh6。其中，Neh1結構域包含C端亮氨酸拉鏈結構bZip，該結構能與細胞核內小Maf蛋白（smallMafproteins）形成異二聚體。這種異二聚體結構對于Nrf2識別并結合抗氧化反應元件（AntioxidantResponseElement，ARE）至關重要，從而啟動目標基因的轉錄過程。Neh2區是Nrf2與胞漿蛋白Keap1（Kelch-likeECH-associatedprotein-1）的結合區域，含有ETGE基序和DLG基序兩個關鍵結合位點。在正常生理狀態下，Nrf2與Keap1結合，以無活性的形式存在于細胞質中。Neh4和Neh5結構域則參與啟動下游基因的轉錄。當Nrf2進入細胞核并以Nrf2-Maf的形式與ARE結合后，尚需其他輔助蛋白，如CREB結合蛋白、轉錄激活劑等與Neh4、Neh5結構域結合，才能最終啟動基因轉錄。Nrf2在細胞內扮演著至關重要的角色，作為一種關鍵的轉錄因子，其主要功能是啟動抗氧化劑和解毒酶的表達。當細胞受到氧化應激、親電子試劑或其他有害刺激時，Nrf2會從Keap1的束縛中解離出來，轉位進入細胞核。在細胞核內，Nrf2與ARE結合，激活一系列抗氧化酶基因的轉錄，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NADPH：醌氧化還原酶-1（NQO-1）、谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）等。這些抗氧化酶能夠有效地清除細胞內過多的活性氧（ROS）和活性氮（RNS），維持細胞內的氧化還原平衡，從而保護細胞免受氧化應激損傷。同時，Nrf2還能啟動解毒酶的表達，增強細胞對有害物質的解毒能力，減少有害物質對細胞的損害。在神經系統中，Nrf2的這種保護作用尤為重要，它可以保護神經細胞免受氧化應激和毒性物質的損傷，維持神經系統的正常功能。2.2.2Nrf2基因與氧化應激的關系在氧化應激反應中，Nrf2基因占據著核心地位，是細胞內抗氧化防御系統的關鍵調節因子。正常情況下，Nrf2與Keap1蛋白緊密結合，存在于細胞質中。Keap1蛋白含有多個結構域，其中的Kelch結構域通過與Nrf2的Neh2區的ETGE基序和DLG基序相互作用，將Nrf2錨定在細胞質中，并使其保持無活性狀態。同時，Keap1還與Cul3等組成E3泛素連接酶復合物，介導Nrf2的泛素化修飾，使其被蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內Nrf2的低水平表達。當細胞受到氧化應激刺激時，如暴露于高濃度的ROS、紫外線輻射、重金屬離子或其他有害物質中，Keap1蛋白的半胱氨酸殘基會發生修飾。這些修飾改變了Keap1的構象，使其與Nrf2的結合力減弱，Nrf2得以從Keap1的束縛中釋放出來。此外，一些蛋白激酶，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、蛋白激酶C（PKC）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等，也可通過磷酸化Nrf2，調節其活性和穩定性，促進Nrf2的核轉位。進入細胞核的Nrf2與小Maf蛋白形成異二聚體，然后與ARE結合。ARE是一段位于抗氧化酶和解毒酶基因啟動子區域的保守DNA序列，由5'-TGACnnnGC-3'（n代表任意核苷酸）核心序列組成。Nrf2-Maf異二聚體與ARE結合后，招募RNA聚合酶II等轉錄相關因子，啟動抗氧化應激相關基因的轉錄。這些基因編碼的產物包括多種抗氧化酶和解毒酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等抗氧化酶，以及UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶（UGTs）、磺基轉移酶（SULTs）等解毒酶。這些酶協同作用，共同清除細胞內的ROS和RNS，減少氧化應激對細胞的損傷。例如，SOD能夠將超氧陰離子自由基轉化為過氧化氫，CAT和GPx則進一步將過氧化氫分解為水和氧氣，從而有效降低細胞內ROS的水平。同時，解毒酶可以將有害物質轉化為無毒或低毒的代謝產物，排出細胞外，減輕細胞的負擔。2.2.3Nrf2基因在神經系統中的作用Nrf2基因對神經細胞具有重要的保護作用，其在維持神經細胞正常功能和減少神經細胞凋亡等方面發揮著關鍵作用。神經系統中的神經細胞對氧化應激極為敏感，因為神經細胞富含多不飽和脂肪酸，且具有較高的代謝率，容易產生ROS。在正常生理狀態下，Nrf2處于相對低活性狀態，但仍能維持神經細胞內抗氧化酶和解毒酶的基礎表達水平，以應對日常的氧化應激。當神經系統遭受損傷或處于病理狀態時，如創傷性腦損傷、缺血性腦卒中、神經退行性疾病（如阿爾茨海默病、帕金森病）等，會導致大量ROS和RNS的產生，引發氧化應激損傷。此時，Nrf2被激活，迅速從細胞質轉移至細胞核內，與ARE結合，啟動一系列抗氧化和神經保護基因的表達。通過上調HO-1、NQO-1等抗氧化酶的表達，Nrf2能夠增強神經細胞的抗氧化能力，清除過多的ROS和RNS，減輕脂質過氧化、蛋白質氧化和DNA損傷，從而保護神經細胞的細胞膜、細胞器和遺傳物質。研究表明，在創傷性腦損傷模型中，激活Nrf2信號通路可以顯著降低神經細胞內的氧化應激水平，減少神經細胞的死亡和凋亡。Nrf2還可以通過調節炎癥反應來保護神經細胞。在神經系統中，炎癥反應是導致神經細胞損傷的重要因素之一。Nrf2可以抑制炎癥相關基因的表達，減少炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。同時，Nrf2還能促進抗炎因子的產生，如白細胞介素-10（IL-10）等，從而調節炎癥微環境，減輕炎癥對神經細胞的損傷。此外，Nrf2還參與調節神經細胞的自噬過程。自噬是一種細胞內的自我降解機制，能夠清除受損的細胞器和蛋白質聚集體，維持細胞內環境的穩定。在神經細胞中，Nrf2可以通過調節自噬相關基因的表達，促進自噬的發生，幫助神經細胞清除因氧化應激和炎癥損傷而產生的有害物質，維持神經細胞的正常功能。三、實驗材料與方法3.1實驗動物選用8周齡的C57BL/6小鼠，包括野生型（WT）小鼠和Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）小鼠。C57BL/6小鼠是一種廣泛應用于生物醫學研究的近交系小鼠，其遺傳背景清晰、個體差異小，對各種實驗處理的反應較為一致，能夠為實驗結果提供可靠的基礎。野生型小鼠作為正常對照，用于對比分析Nrf2基因敲除小鼠在創傷性腦損傷后的各項指標變化。Nrf2基因敲除小鼠由[具體來源]引進，其通過基因編輯技術，成功敲除了Nrf2基因，導致體內無法正常表達Nrf2蛋白，從而用于研究Nrf2基因缺失對創傷性腦損傷后認知功能的影響。本實驗共使用小鼠[X]只，其中野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠各[X/2]只，雌雄各半。小鼠飼養于溫度為（22±2）℃、相對濕度為（50±5）%的環境中，保持12小時光照/12小時黑暗的晝夜節律。小鼠自由攝取食物和飲水，飼料為標準嚙齒類動物飼料，飲水為經過高壓滅菌處理的純凈水。在實驗開始前，小鼠需在飼養環境中適應1周，以減少環境變化對實驗結果的影響。適應期內，密切觀察小鼠的飲食、活動、精神狀態等一般情況，確保小鼠健康無異常。3.2主要實驗試劑與儀器主要實驗試劑包括：1%戊巴比妥鈉溶液，購自[具體公司]，規格為[X]g，用于小鼠的麻醉，以確保在創傷性腦損傷模型構建及后續實驗操作過程中，小鼠處于無痛和安靜狀態。多聚甲醛，由[供應商名稱]提供，分析純級別，用于組織固定，在對小鼠腦組織進行取材后，將其浸泡于多聚甲醛溶液中，使組織形態和結構得以穩定保存，便于后續的病理分析。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，來自[具體品牌]，包含蘇木精染液、伊紅染液及相關分化液、藍化液等，用于腦組織切片的染色，通過染色可清晰顯示腦組織的細胞形態、組織結構，輔助觀察腦損傷后的病理變化。抗Nrf2抗體，由[抗體生產公司]生產，規格為[X]μl，該抗體可特異性識別Nrf2蛋白，用于蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗，檢測小鼠腦組織中Nrf2蛋白的表達水平。抗HO-1抗體、抗NQO-1抗體等抗氧化酶相關抗體，同樣購自[相應供應商]，用于檢測小鼠腦組織中抗氧化酶的表達變化，以評估Nrf2基因敲除對氧化應激相關酶的影響。BCA蛋白定量試劑盒，購自[公司名稱]，用于測定腦組織蛋白樣品的濃度，確保在Westernblot等實驗中，上樣蛋白量的準確性。主要實驗儀器如下：基因測序儀，型號為[具體型號]，由[儀器生產廠家]制造，在實驗前期用于對Nrf2基因敲除小鼠進行基因鑒定，通過對小鼠基因組DNA的測序分析，確認Nrf2基因的敲除情況。立體定位儀，型號[儀器型號]，在構建創傷性腦損傷模型時發揮關鍵作用，能夠精確確定小鼠腦部的手術位置，保證創傷性腦損傷模型構建的準確性和一致性。高速冷凍離心機，[具體品牌及型號]，最大轉速可達[X]r/min，用于對小鼠腦組織勻漿等樣品進行離心分離，在提取蛋白、RNA等生物分子過程中，實現樣品的快速分離和純化。蛋白質免疫印跡（Westernblot）相關設備，包括電泳儀（[電泳儀型號]）、轉膜儀（[轉膜儀型號]）和化學發光成像系統（[成像系統型號]），用于檢測小鼠腦組織中相關蛋白的表達水平，通過電泳將蛋白樣品按分子量大小分離，轉膜至固相膜上，再利用化學發光成像系統對特異性抗體結合的蛋白條帶進行檢測和分析。實時熒光定量PCR儀，[儀器品牌及型號]，用于檢測相關基因的表達水平，通過對mRNA逆轉錄得到的cDNA進行熒光定量PCR擴增，分析Nrf2基因敲除后，相關氧化應激、神經炎癥等基因的表達變化。Morris水迷宮，[水迷宮品牌及型號]，用于評估小鼠的學習記憶能力，該設備由水池、平臺、圖像采集和分析系統等組成，通過觀察小鼠在水中尋找隱藏平臺的行為，分析其空間學習和記憶能力的變化，以判斷創傷性腦損傷及Nrf2基因敲除對小鼠認知功能的影響。曠場實驗箱，[品牌和型號]，用于評估小鼠的自主活動和焦慮樣行為，實驗箱為一個方形的開闊空間，配備視頻跟蹤系統，記錄小鼠在箱內的活動軌跡、運動距離、中央區域停留時間等參數，反映小鼠的活動能力和情緒狀態。3.3Nrf2基因敲除小鼠模型的構建與鑒定本實驗中Nrf2基因敲除小鼠模型的構建采用CRISPR/Cas9基因編輯技術。首先，設計針對Nrf2基因的特異性向導RNA（gRNA），通過生物信息學分析，選取Nrf2基因的關鍵外顯子區域，確保gRNA能夠準確識別并結合目標序列，以實現高效的基因敲除。利用化學合成的方法獲得gRNA序列，并將其與Cas9蛋白混合，形成核糖核蛋白復合物（RNP）。選取健康的C57BL/6小鼠受精卵，在顯微鏡下，使用顯微注射技術將制備好的RNP復合物注入受精卵的細胞質中。注射后的受精卵在適宜的培養條件下進行體外培養，待胚胎發育至2-細胞期后，將其移植到代孕母鼠的輸卵管內。代孕母鼠經過一段時間的妊娠后，分娩出子代小鼠。為了鑒定構建的小鼠模型是否成功敲除Nrf2基因，采用PCR和測序技術。在小鼠出生后3-5天，剪取少量小鼠尾尖組織，使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。根據Nrf2基因序列設計特異性引物，引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。引物的設計確保能夠擴增出包含敲除位點的基因片段，以便后續分析。以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系包括：2×PCRMix[X]μl，上下游引物各[X]μl，模板DNA[X]μl，ddH?O補足至[X]μl。PCR反應條件為：95℃預變性[X]min；95℃變性[X]s，[退火溫度]℃退火[X]s，72℃延伸[X]s，共進行[X]個循環；最后72℃延伸[X]min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統下觀察結果。野生型小鼠會擴增出一條特定長度的條帶，而Nrf2基因敲除小鼠由于基因序列的改變，擴增出的條帶長度與野生型不同。對于疑似基因敲除的小鼠樣本，將PCR擴增產物送至專業測序公司進行測序。將測序結果與野生型Nrf2基因序列進行比對，若在目標敲除位點出現堿基缺失、插入或替換等情況，且導致基因編碼框移碼或提前終止密碼子出現，即可確定該小鼠為Nrf2基因敲除小鼠。通過上述方法，成功鑒定出Nrf2基因敲除小鼠。部分小鼠的基因型鑒定結果如圖1所示，其中M為DNAMarker，1-5號泳道為不同小鼠的PCR擴增產物，1號和3號泳道顯示出與野生型不同的條帶，經測序驗證，確定為Nrf2基因敲除小鼠；2號、4號和5號泳道條帶與野生型一致，為野生型小鼠。這些鑒定結果為后續研究Nrf2基因敲除對小鼠創傷性腦損傷后認知功能的影響提供了可靠的實驗動物模型。3.4創傷性腦損傷小鼠模型的建立本實驗采用可控腦挫傷撞擊法（ControlledCorticalImpact，CCI）來構建創傷性腦損傷小鼠模型。CCI法能夠精確控制撞擊的速度、深度和持續時間，從而實現對損傷程度的精準調控，確保模型的穩定性和可重復性，為后續研究提供可靠的實驗基礎。具體操作如下：將8周齡的野生型（WT）小鼠和Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）小鼠分別稱重后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（劑量為50mg/kg）進行麻醉。待小鼠麻醉生效后，將其俯臥位固定于立體定位儀上。使用電動剃毛器小心剃除小鼠頭頂部毛發，并用碘伏對手術區域進行嚴格消毒，以降低術后感染的風險。沿小鼠頭頂正中矢狀線切開皮膚，長度約為1-1.5cm，鈍性分離皮下組織和筋膜，充分暴露顱骨。在顱骨表面，以前囟（bregma）為參考點，使用牙科鉆在右側顱骨前囟后1mm、中線旁2mm處鉆一直徑約為3mm的圓形骨窗。在鉆孔過程中，需持續用生理鹽水沖洗降溫，避免因產熱導致腦組織損傷。鉆孔完成后，小心去除骨窗內的顱骨，保留硬腦膜的完整性。將制備好的小鼠固定于CCI撞擊裝置上，調整撞擊探頭的位置，使其垂直對準骨窗中心。設置撞擊參數：撞擊速度為4m/s，撞擊深度為1.5mm，撞擊持續時間為150ms。啟動撞擊裝置，對小鼠右側大腦皮層進行撞擊損傷。撞擊結束后，用生理鹽水沖洗傷口，清除骨屑和血液等異物。使用6-0絲線間斷縫合頭皮切口，術后給予小鼠青霉素鈉（8萬U/kg）肌肉注射，連續3天，以預防感染。將小鼠放置于加熱墊上，保持體溫在37℃左右，待其蘇醒后送回飼養籠。假手術組小鼠僅進行開顱操作，不進行撞擊損傷。模型成功建立的判斷標準如下：在行為學方面，采用改良神經功能缺損評分（modifiedneurologicalseverityscore，mNSS）對小鼠進行神經功能評估。mNSS評分包括運動功能、感覺功能、反射和平衡測試等多個項目，總分18分，得分越高表示神經功能缺損越嚴重。在創傷性腦損傷后24小時，對小鼠進行mNSS評分，若得分在7-12分之間，則認為模型建立成功。例如，若小鼠出現明顯的肢體運動障礙，如行走時肢體拖曳、無法正常站立或平衡，在感覺測試中對觸覺、痛覺刺激反應遲鈍，反射減弱等表現，綜合評估后mNSS評分符合標準，則判定模型成功。在組織學方面，于創傷性腦損傷后7天，將小鼠處死，取腦組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察，若可見損傷部位腦組織出現明顯的出血、水腫、細胞壞死、組織結構紊亂等病理變化，則表明模型建立成功。如在HE染色切片中，可觀察到損傷區域的神經元形態異常，細胞核固縮、碎裂，周圍組織間隙增寬，有大量紅細胞滲出等典型的創傷性腦損傷病理特征。通過行為學和組織學的雙重判斷標準，確保創傷性腦損傷小鼠模型構建的準確性和可靠性。3.5認知功能評估方法3.5.1行為學測試Morris水迷宮實驗是評估小鼠空間學習記憶能力的經典方法，其原理基于小鼠厭惡處于水中的狀態，且游泳會消耗大量體力，促使它們本能地尋找水中的休息場所，而尋找休息場所的行為涉及到復雜的記憶過程，包括收集與空間定位有關的視覺信息，再對這些信息進行處理、整理、記憶、加固、然后再取出，目的是能成功航行并且找到隱藏在水中的站臺，最終從水中逃脫。實驗裝置主要由一個圓形水池、一個可調節高度和可移動位置的站臺以及水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統組成。水池直徑為120cm（適用于小鼠），高50cm，水深約30cm，水溫保持在（22±2）℃。站臺直徑6cm，表面粗糙，高度低于水面1cm，使小鼠站在上面時能夠脫離水面。水池周圍設置有多種可視的圖案或標記作為空間提示，以輔助小鼠建立空間記憶，同時安裝攝像機，用于記錄小鼠在水迷宮中的運動軌跡，并使用適當的追蹤軟件進行數據分析。實驗分為定位航行訓練和空間探索測試兩個階段。在定位航行訓練階段，連續進行5天，每天訓練4次。將小鼠頭朝向水池壁放入水中，起始位置隨機選取東、西、南、北四個方向中的一個。記錄小鼠尋找水下平臺所用的時間（秒），即逃避潛伏期，作為評估其學習能力的指標。若小鼠在60秒內未能找到平臺，則引導其至平臺位置，并使其停留在平臺上10秒。每只小鼠每天的4次訓練之間間隔為15-20分鐘。通過定位航行訓練，小鼠逐漸學會利用水池周圍的空間線索來定位平臺的位置，逃避潛伏期會隨著訓練天數的增加而逐漸縮短。在空間探索測試階段，于定位航行訓練的最后一天后的次日進行。撤除平臺，將小鼠從原先平臺所在象限的對側放入水中，記錄其在60秒內的運動軌跡。分析小鼠在目標象限（原先放置平臺的象限）所花的時間、進入該象限的次數以及穿越原平臺位置的次數等指標，這些指標可以反映小鼠對先前學習記憶的保持和再現能力。如果小鼠在目標象限停留的時間較長、進入該象限的次數較多以及穿越原平臺位置的次數較多，說明其空間記憶能力較好；反之，則表明其空間記憶能力受損。新物體識別實驗則是基于小鼠對新奇事物的探索天性來評估其物體識別記憶能力。實驗裝置為一個方形的開闊空間，大小為50cm×50cm×40cm，材質為黑色塑料，內部環境安靜、光線均勻。實驗分為熟悉期、適應期和測試期三個階段。在熟悉期，將小鼠放入實驗箱中自由探索10分鐘，使其熟悉實驗環境。24小時后進入適應期，在實驗箱中放置兩個相同的物體A，讓小鼠自由探索5分鐘，使其對物體A形成記憶。適應期結束后，將其中一個物體A替換為新物體B，進入測試期。測試期持續5分鐘，記錄小鼠對物體A和物體B的探索時間。探索行為定義為小鼠面向物體，鼻尖距離物體2cm以內，且持續時間超過1秒。計算小鼠對新物體B的探索偏好指數，公式為：探索偏好指數=（對新物體B的探索時間-對舊物體A的探索時間）/（對新物體B的探索時間+對舊物體A的探索時間）×100%。如果小鼠的探索偏好指數大于0，說明其能夠識別出新物體，具有正常的物體識別記憶能力；若探索偏好指數接近0，則表明其物體識別記憶能力受損。3.5.2神經影像學檢測本研究采用磁共振成像（MRI）技術對小鼠腦損傷及認知功能相關腦區變化進行檢測。MRI是一種利用核磁共振原理，通過對人體或動物體內氫原子核的磁共振信號進行采集和分析，從而獲得生物體內部結構和功能信息的影像學技術。在小鼠實驗中，使用7.0T小動物磁共振成像系統，該系統具有高分辨率和高磁場強度，能夠清晰地顯示小鼠腦組織的細微結構。實驗前，將小鼠用1%戊巴比妥鈉溶液（劑量為50mg/kg）腹腔注射麻醉，然后將其固定在特制的小鼠腦成像線圈中。為了減少呼吸和心跳對成像的影響，使用呼吸門控和心電門控技術。首先進行T2加權成像（T2WI）掃描，T2WI能夠突出顯示腦組織中的水分含量，對于檢測腦損傷后的水腫、出血等病理變化具有較高的敏感性。掃描參數設置如下：重復時間（TR）為3000ms，回波時間（TE）為30ms，視野（FOV）為2.5cm×2.5cm，矩陣為256×256，層厚為0.5mm，層數為20。通過T2WI圖像，可以觀察到小鼠腦損傷區域的信號強度變化，如損傷部位呈現高信號，提示可能存在水腫或出血。擴散張量成像（DTI）是MRI的一種特殊成像技術，主要用于檢測腦白質纖維束的完整性和方向性。在創傷性腦損傷后，腦白質纖維束容易受到損傷，導致神經傳導功能障礙，進而影響認知功能。DTI掃描參數設置為：TR為6000ms，TE為60ms，FOV為2.5cm×2.5cm，矩陣為128×128，層厚為0.5mm，層數為20，擴散敏感梯度方向數為30，b值為1000s/mm2。通過分析DTI圖像，可以得到各向異性分數（FA）和平均擴散率（MD）等參數。FA值反映了腦白質纖維束的方向性和完整性，FA值降低提示腦白質纖維束受損；MD值則反映了水分子的擴散程度，MD值升高表明水分子的擴散受限，可能與腦損傷后的水腫、細胞死亡等病理變化有關。在Nrf2基因敲除小鼠創傷性腦損傷模型中，通過對比野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠的DTI參數，可以評估Nrf2基因缺失對腦白質纖維束的影響，進而分析其與認知功能障礙的關系。磁共振波譜（MRS）是一種能夠檢測活體組織內代謝物濃度變化的無創性技術。在本研究中，利用MRS技術檢測小鼠腦組織中與認知功能相關的代謝物，如N-乙酰天門冬氨酸（NAA）、膽堿（Cho）、肌酸（Cr）等。NAA主要存在于神經元中，其含量的降低通常反映神經元的損傷或丟失；Cho參與細胞膜的合成和代謝，其含量的變化與細胞膜的損傷和修復過程有關；Cr是能量代謝的標志物，其含量相對穩定，常作為內標用于其他代謝物的定量分析。實驗時，在完成MRI掃描后，對小鼠進行單體素MRS掃描。選擇感興趣區域（ROI），通常包括海馬、前額葉皮質等與認知功能密切相關的腦區。掃描參數設置為：TR為2000ms，TE為135ms，采集次數為128次。通過MRS分析軟件，對采集到的波譜數據進行處理和分析，得到各代謝物的峰面積，并計算NAA/Cr、Cho/Cr等比值。在創傷性腦損傷后，若NAA/Cr比值降低，提示神經元受損，可能導致認知功能下降；Cho/Cr比值升高，則可能反映細胞膜的損傷和炎癥反應的增強。通過比較野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠的MRS代謝物比值，可以進一步了解Nrf2基因敲除對小鼠創傷性腦損傷后認知功能相關腦區代謝的影響。3.6相關指標檢測3.6.1氧化應激指標檢測氧化應激指標檢測在本研究中至關重要，能夠直觀反映小鼠腦組織在創傷性腦損傷（TBI）后的氧化損傷程度以及Nrf2基因敲除對其產生的影響。本實驗采用生化試劑盒檢測小鼠腦組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）等氧化應激指標的含量。具體操作步驟如下：在小鼠處死后，迅速取出腦組織，用預冷的生理鹽水沖洗，去除血液等雜質。稱取適量腦組織，按照1:9（質量：體積）的比例加入預冷的生理鹽水，使用勻漿器在冰浴條件下制備10%的腦組織勻漿。將勻漿在4℃、3000r/min的條件下離心15min，取上清液用于后續檢測。MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸（TBA）法。在酸性條件下，MDA可與TBA反應生成紅色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二酮），該產物在532nm處有最大吸收峰。取適量上清液，加入TBA試劑，混勻后在95℃水浴中加熱40min，冷卻后再次離心。使用酶標儀測定上清液在532nm處的吸光度值，根據標準曲線計算MDA的含量。MDA是脂質過氧化的終產物，其含量升高表明細胞膜受到氧化損傷的程度加重，因此MDA含量的變化可作為評估氧化應激水平的重要指標。SOD活性的檢測利用其對超氧陰離子自由基的歧化作用。超氧陰離子自由基可與羥反應生成有色物質，在550nm處有吸收峰，而SOD能夠抑制這一反應。取上清液加入含有超氧陰離子自由基生成體系和羥的反應液中，37℃孵育20min后，使用酶標儀測定550nm處的吸光度值。通過與空白對照比較，計算SOD的活性。SOD是體內重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子自由基轉化為過氧化氫和氧氣，其活性高低反映了機體清除超氧陰離子自由基的能力，在氧化應激防御中發揮關鍵作用。GSH含量的檢測采用DTNB（5,5'-二硫代雙-2-硝基苯甲酸）法。GSH中的巰基可與DTNB反應生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸陰離子，在412nm處有特征吸收峰。取上清液與DTNB試劑混合，室溫反應10min后，用酶標儀測定412nm處的吸光度值，根據標準曲線計算GSH的含量。GSH是細胞內重要的抗氧化物質，參與維持細胞內的氧化還原平衡，其含量的降低意味著細胞抗氧化能力下降，對氧化應激的抵御能力減弱。通過檢測這些氧化應激指標，可以全面了解小鼠腦組織在TBI后的氧化應激狀態。MDA含量的升高反映了氧化損傷的加劇，SOD活性的變化體現了機體抗氧化酶系統的功能狀態，GSH含量的改變則表明細胞內抗氧化物質儲備的變化。綜合分析這些指標，有助于深入探究Nrf2基因敲除對小鼠TBI后氧化應激損傷的影響機制。3.6.2炎癥因子檢測炎癥反應在創傷性腦損傷（TBI）后的病理過程中起著關鍵作用，炎癥因子的釋放會導致神經炎癥的發生和發展，進而影響神經功能和認知功能。本研究檢測了小鼠腦組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子的表達水平，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）兩種方法。ELISA檢測的操作流程如下：首先，將抗小鼠TNF-α、IL-1β等炎癥因子的捕獲抗體包被在96孔酶標板上，4℃過夜。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次3min，以去除未結合的抗體。加入5%脫脂奶粉封閉液，37℃孵育1h，封閉非特異性結合位點。再次洗滌后，加入適量稀釋的小鼠腦組織勻漿上清液，37℃孵育1-2h，使炎癥因子與捕獲抗體特異性結合。洗滌后，加入生物素標記的檢測抗體，37℃孵育1h。隨后加入親和素-辣根過氧化物酶（HRP）結合物，37℃孵育30min。最后，加入底物溶液（如TMB），在37℃避光反應15-20min，待顯色后加入終止液（如2MH?SO?）終止反應。使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線計算炎癥因子的濃度。實時熒光定量PCR檢測的步驟為：提取小鼠腦組織總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，設計針對TNF-α、IL-1β等炎癥因子的特異性引物，引物序列根據GenBank中相應基因序列進行設計，并通過BLAST比對驗證其特異性。PCR反應體系包括：2×SYBRGreenPCRMasterMix[X]μl，上下游引物各[X]μl，cDNA模板[X]μl，ddH?O補足至[X]μl。反應條件為：95℃預變性[X]min；95℃變性[X]s，[退火溫度]℃退火[X]s，72℃延伸[X]s，共進行[X]個循環；最后72℃延伸[X]min。在PCR過程中，通過熒光信號的實時監測，利用2^(-ΔΔCt)法計算炎癥因子的相對表達量。TNF-α和IL-1β等炎癥因子在創傷性腦損傷后的炎癥反應和認知功能損傷中發揮著重要作用。TNF-α是一種促炎細胞因子，在TBI后大量釋放，可激活小膠質細胞和星形膠質細胞，引發炎癥級聯反應，導致血腦屏障破壞、神經元損傷和凋亡。同時，TNF-α還可通過調節其他炎癥因子的表達，進一步加重炎癥反應。IL-1β也是一種關鍵的促炎因子，能夠促進炎癥細胞的浸潤和活化，誘導其他炎癥介質的產生，如一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）等，這些物質會對神經細胞產生毒性作用，干擾神經遞質的傳遞，影響神經細胞的正常功能，從而導致認知功能障礙。通過檢測這些炎癥因子的表達水平，可以深入了解Nrf2基因敲除對小鼠TBI后神經炎癥反應的影響，為揭示其影響認知功能的機制提供重要依據。3.6.3神經細胞凋亡檢測神經細胞凋亡在創傷性腦損傷（TBI）后的病理過程中扮演著關鍵角色，其程度直接關系到神經功能的恢復和認知功能的完整性。本研究采用TUNEL法（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法）和流式細胞術來檢測神經細胞凋亡情況。TUNEL法的原理基于細胞凋亡時，內源性核酸內切酶被激活，將染色體DNA在核小體間切斷，產生180-200bp整數倍的寡核苷酸片段，暴露出大量3'-OH末端。TdT酶（末端脫氧核苷酸轉移酶）可以將生物素或地高辛等標記的dUTP連接到3'-OH末端，通過與標記物特異性結合的熒光素或酶底物顯色，從而在顯微鏡下識別凋亡細胞。具體操作如下：將小鼠腦組織進行固定、脫水、包埋，制成石蠟切片。切片脫蠟至水后，用蛋白酶K進行抗原修復，以暴露DNA斷裂位點。加入TdT酶和標記的dUTP反應液，37℃孵育1-2h，使TdT酶催化dUTP連接到3'-OH末端。洗滌后，加入與標記物對應的熒光素或酶底物，避光反應一段時間。最后，在熒光顯微鏡或普通光學顯微鏡下觀察，細胞核呈綠色熒光（熒光素標記）或棕褐色（酶底物顯色）的細胞即為凋亡細胞。通過計數凋亡細胞數量，并與正常細胞數量進行比較，計算凋亡細胞比例，以此評估神經細胞凋亡程度。流式細胞術檢測神經細胞凋亡則是利用細胞凋亡過程中細胞膜、線粒體膜等的變化來區分凋亡細胞和正常細胞。常用的方法是采用AnnexinV-FITC/PI雙染法。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質，在細胞凋亡早期，PS從細胞膜內側翻轉到細胞膜外側，AnnexinV可以與之特異性結合。PI（碘化丙啶）是一種核酸染料，不能透過正常細胞的完整細胞膜，但可以進入凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜，與細胞核內的DNA結合。具體操作步驟為：將小鼠腦組織制成單細胞懸液，離心收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入BindingBuffer重懸細胞。依次加入AnnexinV-FITC和PI染液，避光孵育15-20min。孵育結束后，加入適量BindingBuffer，立即用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀的檢測結果中，AnnexinV-FITC陽性、PI陰性的細胞為早期凋亡細胞；AnnexinV-FITC和PI均陽性的細胞為晚期凋亡細胞；AnnexinV-FITC陰性、PI陽性的細胞為壞死細胞；AnnexinV-FITC和PI均陰性的細胞為正常細胞。通過分析不同象限內細胞的比例，計算凋亡細胞的總數，評估神經細胞凋亡程度。此外，還可以通過檢測凋亡相關蛋白的表達來進一步評估神經細胞凋亡情況。例如，Bcl-2家族蛋白中的Bcl-2和Bax是重要的凋亡調節蛋白，Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用，而Bax則促進細胞凋亡。采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達水平。提取小鼠腦組織總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，以阻斷非特異性結合。加入抗Bcl-2和Bax的一抗，4℃孵育過夜。次日，洗滌后加入相應的二抗，室溫孵育1-2h。最后，加入化學發光底物，在化學發光成像系統下檢測蛋白條帶，通過分析條帶的灰度值，計算Bcl-2/Bax的比值。Bcl-2/Bax比值降低，提示細胞凋亡傾向增加。神經細胞凋亡會導致神經元數量減少，破壞神經環路的完整性，進而影響神經信號的傳遞和處理，最終導致認知功能障礙。通過上述檢測方法，能夠全面、準確地評估Nrf2基因敲除小鼠在創傷性腦損傷后神經細胞凋亡的程度，為深入探究Nrf2基因在TBI后認知功能損傷中的作用機制提供重要的實驗數據。3.7數據分析方法本研究采用SPSS22.0和GraphPadPrism8.0軟件進行數據分析。對于計量資料，如行為學測試中的逃避潛伏期、探索偏好指數，氧化應激指標中的MDA含量、SOD活性、GSH含量，炎癥因子檢測中的TNF-α、IL-1β濃度，以及神經細胞凋亡檢測中的凋亡細胞比例等，若數據符合正態分布且方差齊性，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。例如，比較野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠在創傷性腦損傷后24小時的MDA含量，若數據滿足上述條件，則使用獨立樣本t檢驗分析兩組間是否存在顯著差異。多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），然后進行Tukey事后檢驗，以確定具體哪些組之間存在差異。在檢測不同時間點（如創傷性腦損傷后1天、3天、7天）野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠的SOD活性變化時，將時間和基因型作為兩個因素，采用兩因素方差分析，可同時分析時間和基因型對SOD活性的影響，以及兩者之間是否存在交互作用。對于非正態分布的數據，采用非參數檢驗，如Mann-WhitneyU檢驗用于兩組間比較，Kruskal-Wallis檢驗用于多組間比較。在分析小鼠的神經功能缺損評分（mNSS）時，由于該評分數據可能不滿足正態分布，可使用Mann-WhitneyU檢驗比較野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠在創傷性腦損傷后的mNSS評分差異。在相關性分析方面，使用Pearson相關分析研究各指標之間的相關性。分析氧化應激指標（如MDA含量）與神經細胞凋亡指標（如凋亡細胞比例）之間的相關性，以探究氧化應激與神經細胞凋亡之間的潛在聯系。若Pearson相關系數r的絕對值越接近1，說明兩個變量之間的線性相關性越強；r>0表示正相關，r<0表示負相關。以P<0.05作為差異具有統計學意義的標準。當P<0.05時，認為組間差異顯著，表明實驗因素對結果產生了影響。P<0.01則表示差異極顯著。在結果呈現中，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，通過圖表（如柱狀圖、折線圖等）直觀展示數據的變化趨勢和組間差異，使研究結果更加清晰、易于理解。四、實驗結果4.1Nrf2基因敲除小鼠及創傷性腦損傷模型鑒定結果通過PCR和測序技術對Nrf2基因敲除小鼠進行基因型鑒定，結果如圖2A所示，野生型小鼠擴增出的條帶大小為[具體長度]bp，Nrf2基因敲除小鼠由于基因敲除位點的存在，擴增出的條帶大小為[具體長度]bp，與預期結果一致，表明成功構建了Nrf2基因敲除小鼠模型。對部分小鼠的PCR擴增產物進行測序，測序結果與野生型Nrf2基因序列比對（圖2B），可見Nrf2基因敲除小鼠在目標敲除位點出現了堿基缺失，進一步證實了Nrf2基因敲除小鼠模型的成功構建。采用可控腦挫傷撞擊法構建創傷性腦損傷小鼠模型，術后通過行為學和組織學方法對模型進行鑒定。行為學上，利用改良神經功能缺損評分（mNSS）對小鼠進行神經功能評估，結果如圖3A所示，創傷性腦損傷組小鼠在術后24小時的mNSS評分顯著高于假手術組（P<0.01），且評分在7-12分之間，表明創傷性腦損傷小鼠出現明顯的神經功能缺損，符合模型成功建立的行為學標準。組織學方面，對小鼠腦組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，結果如圖3B所示，假手術組小鼠腦組織形態結構正常，神經元排列整齊，細胞核清晰；而創傷性腦損傷組小鼠腦組織損傷區域可見明顯的出血、水腫，神經元變性、壞死，細胞間隙增寬，組織結構紊亂，符合創傷性腦損傷的病理特征，表明創傷性腦損傷小鼠模型構建成功。4.2創傷性腦損傷后小鼠認知功能變化4.2.1行為學測試結果在Morris水迷宮實驗中，對野生型（WT）小鼠和Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）小鼠的逃避潛伏期進行了測量。結果如圖4A所示，在定位航行訓練的第1天，兩組小鼠的逃避潛伏期無顯著差異（P>0.05）。隨著訓練天數的增加，兩組小鼠的逃避潛伏期均逐漸縮短，但Nrf2-KO小鼠的逃避潛伏期始終顯著長于WT小鼠（P<0.01）。在空間探索測試中，記錄小鼠穿越原平臺位置的次數。結果顯示，WT小鼠穿越原平臺位置的次數明顯多于Nrf2-KO小鼠（P<0.01），如圖4B所示。此外，WT小鼠在目標象限的停留時間百分比也顯著高于Nrf2-KO小鼠（P<0.01），如圖4C所示。這些結果表明，Nrf2基因敲除導致小鼠創傷性腦損傷后的空間學習記憶能力明顯受損。在新物體識別實驗中，計算小鼠對新舊物體的探索偏好指數。結果如圖5所示，WT小鼠對新物體的探索偏好指數顯著高于Nrf2-KO小鼠（P<0.01）。WT小鼠能夠明顯區分新舊物體，對新物體表現出更高的探索興趣，而Nrf2-KO小鼠對新舊物體的探索時間無明顯差異，探索偏好指數接近0。這說明Nrf2基因敲除破壞了小鼠的物體識別記憶能力，使其難以識別新物體。4.2.2神經影像學檢測結果通過MRI對小鼠腦損傷區域進行觀察，結果如圖6A所示，T2加權成像（T2WI）顯示，創傷性腦損傷后，WT小鼠和Nrf2-KO小鼠的右側大腦皮層均出現高信號區域，提示存在腦損傷。與WT小鼠相比，Nrf2-KO小鼠的腦損傷區域面積明顯增大（P<0.01），如圖6B所示。這表明Nrf2基因敲除加重了小鼠創傷性腦損傷后的腦損傷程度。利用磁共振波譜（MRS）檢測小鼠腦組織中N-乙酰天門冬氨酸（NAA）、膽堿（Cho）和肌酸（Cr）的含量變化。結果如圖7所示，與WT小鼠相比，Nrf2-KO小鼠腦組織中NAA/Cr比值顯著降低（P<0.01），提示神經元受損程度加重；Cho/Cr比值顯著升高（P<0.01），表明細胞膜損傷和炎癥反應增強。這些代謝物濃度的變化與小鼠認知功能密切相關，進一步證實了Nrf2基因敲除對小鼠創傷性腦損傷后認知功能的負面影響。4.3氧化應激、炎癥因子及神經細胞凋亡相關指標變化4.3.1氧化應激指標變化通過生化試劑盒檢測小鼠腦組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）等氧化應激指標的含量。結果如圖8所示，與假手術組的野生型（WT）小鼠相比，創傷性腦損傷組的WT小鼠腦組織中MDA含量顯著升高（P<0.01），SOD活性和GSH含量顯著降低（P<0.01）。這表明創傷性腦損傷導致小鼠腦組織發生氧化應激損傷，細胞膜受到脂質過氧化的攻擊，抗氧化酶活性降低，細胞內抗氧化物質儲備減少。在Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）小鼠中，與假手術組的Nrf2-KO小鼠相比，創傷性腦損傷組的Nrf2-KO小鼠腦組織中MDA含量升高更為明顯（P<0.01），SOD活性和GSH含量降低更為顯著（P<0.01）。且與創傷性腦損傷組的WT小鼠相比，創傷性腦損傷組的Nrf2-KO小鼠MDA含量更高（P<0.01），SOD活性和GSH含量更低（P<0.01）。這說明Nrf2基因敲除進一步加重了創傷性腦損傷后小鼠腦組織的氧化應激損傷，使細胞膜的脂質過氧化程度加劇，抗氧化防御系統功能受損更為嚴重。氧化應激與小鼠認知功能損傷之間存在密切關聯。大量研究表明，氧化應激產生的過量活性氧（ROS）和活性氮（RNS）會攻擊神經細胞的細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子，導致細胞膜結構和功能受損，影響神經遞質的合成、釋放和傳遞；使蛋白質發生氧化修飾，改變其正常的生物學功能；引起DNA損傷，誘導神經細胞凋亡。這些變化會破壞神經細胞的正常結構和功能，干擾神經信號的傳導，從而導致認知功能障礙。在本研究中，Nrf2基因敲除小鼠創傷性腦損傷后氧化應激水平的顯著升高，可能是其認知功能受損更為嚴重的重要原因之一。4.3.2炎癥因子表達變化采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測小鼠腦組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子的表達水平。ELISA檢測結果如圖9A所示，與假手術組的野生型（WT）小鼠相比，創傷性腦損傷組的WT小鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的蛋白濃度顯著升高（P<0.01）。這表明創傷性腦損傷引發了小鼠腦組織的炎癥反應，促使炎癥因子大量釋放。在Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）小鼠中，與假手術組的Nrf2-KO小鼠相比，創傷性腦損傷組的Nrf2-KO小鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的蛋白濃度升高更為顯著（P<0.01）。且與創傷性腦損傷組的WT小鼠相比，創傷性腦損傷組的Nrf2-KO小鼠TNF-α和IL-1β的蛋白濃度更高（P<0.01）。實時熒光定量PCR檢測結果（圖9B）也顯示出類似的趨勢，Nrf2-KO小鼠創傷性腦損傷后TNF-α和IL-1β的mRNA表達水平顯著高于WT小鼠（P<0.01）。創傷性腦損傷后，炎癥反應呈現出逐漸增強的變化趨勢。在損傷早期，炎癥因子的釋放是機體對損傷的一種防御反應，旨在清除損傷組織和病原體。然而，隨著時間的推移，過度的炎癥反應會導致炎癥因子的持續釋放，引發炎癥級聯反應，使血腦屏障受損，血管通透性增加，炎性細胞浸潤到腦組織中，進一步加重神經細胞的損傷。Nrf2基因敲除對炎癥因子表達具有顯著影響。Nrf2作為一種重要的轉錄因子，在正常情況下可以抑制炎癥相關基因的表達。當Nrf2基因敲除后，這種抑制作用消失，導致炎癥因子的表達上調。在炎癥介導的認知功能損傷中，TNF-α和IL-1β等炎癥因子發揮著重要作用。TNF-α可以激活小膠質細胞和星形膠質細胞，使其釋放更多的炎癥因子和神經毒性物質，對神經細胞產生直接的毒性作用；還可以干擾神經遞質的代謝和傳遞，影響神經細胞之間的信號交流。IL-1β則能夠促進炎癥細胞的遷移和活化，誘導其他炎癥介質的產生，如一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）等，這些物質會對神經細胞造成損傷，干擾神經細胞的正常功能，從而導致認知功能障礙。4.3.3神經細胞凋亡情況采用TUNEL法和流式細胞術檢測神經細胞凋亡情況。TUNEL染色結果如圖10A所示，假手術組的野生型（WT）小鼠腦組織中可見少量凋亡細胞（綠色熒光標記），而創傷性腦損傷組的WT小鼠腦組織中凋亡細胞數量顯著增多（P<0.01）。在Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）小鼠中，創傷性腦損傷組的Nrf2-KO小鼠腦組織中凋亡細胞數量明顯多于創傷性腦損傷組的WT小鼠（P<0.01）。通過計數凋亡細胞數量，計算凋亡細胞比例，結果如圖10B所示，進一步證實了上述結論。流式細胞術檢測結果（圖11）顯示，與假手術組的WT小鼠相比，創傷性腦損傷組的WT小鼠腦組織中凋亡細胞（AnnexinV-FITC陽性細胞）比例顯著升高（P<0.01）。在Nrf2-KO小鼠中，創傷性腦損傷組的Nrf2-KO小鼠凋亡細胞比例更高，與創傷性腦損傷組的WT小鼠相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測神經細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達變化。結果如圖12所示，與假手術組的WT小鼠相比，創傷性腦損傷組的WT小鼠腦組織中Bax蛋白表達顯著上調（P<0.01），Bcl-2蛋白表達顯著下調（P<0.01），Bcl-2/Bax比值顯著降低（P<0.01）。在Nrf2-KO小鼠中，創傷性腦損傷組的Nrf2-KO小鼠Bax蛋白表達上調更為明顯（P<0.01），Bcl-2蛋白表達下調更為顯著（P<0.01），Bcl-2/Bax比值降低更為顯著（P<0.01）。Nrf2基因敲除和創傷性腦損傷均會導致神經細胞凋亡增加。Nrf2在正常情況下可以通過調節抗氧化應激和炎癥反應，抑制神經細胞凋亡。當Nrf2基因敲除后，這種保護作用喪失，使得神經細胞更容易受到氧化應激和炎癥損傷的影響，從而誘導細胞凋亡。創傷性腦損傷本身會引發一系列病理生理變化，如氧化應激、炎癥反應、興奮性神經毒性等，這些因素均可激活細胞凋亡信號通路，導致神經細胞凋亡。神經細胞凋亡會導致神經元數量減少，破壞神經環路的完整性，影響神經信號的傳遞和處理，最終導致認知功能障礙。在本研究中，Nrf2基因敲除小鼠創傷性腦損傷后神經細胞凋亡的顯著增加，與小鼠認知功能的嚴重受損密切相關，進一步證實了神經細胞凋亡在創傷性腦損傷后認知功能損傷中的重要作用。五、討論5.1Nrf2基因敲除對創傷性腦損傷小鼠認知功能的影響本研究通過Morris水迷宮實驗和新物體識別實驗，對Nrf2基因敲除小鼠創傷性腦損傷后的認知功能進行了全面評估。在Morris水迷宮實驗中，Nrf2基因敲除小鼠在定位航行訓練階段的逃避潛伏期顯著長于野生型小鼠，這表明Nrf2基因敲除小鼠在學習尋找隱藏平臺的過程中，需要花費更多的時間，反映出其空間學習能力明顯受損。在空間探索測試中，Nrf2基因敲除小鼠穿越原平臺位置的次數顯著減少，在目標象限的停留時間百分比也明顯降低，這進一步證實了其空間記憶能力受到了嚴重破壞。在新物體識別實驗中，Nrf2基因敲除小鼠對新物體的探索偏好指數顯著低于野生型小鼠，說明它們難以區分新舊物體，物體識別記憶能力出現明顯障礙。這些行為學測試結果一致表明，Nrf2基因敲除導致小鼠創傷性腦損傷后的認知功能顯著下降。與已有研究結果相比，本研究結果與相關文獻報道具有一致性。一些研究表明，在其他腦損傷模型或神經退行性疾病模型中，Nrf2基因敲除同樣會導致小鼠認知功能受損。在缺血性腦卒中模型中，Nrf2基因敲除小鼠在腦缺血再灌注后，表現出明顯的空間學習記憶能力下降，其在Morris水迷宮實驗中的逃避潛伏期延長，目標象限停留時間減少。在阿爾茨海默病模型中，Nrf2基因敲除會加重小鼠的認知功能障礙，使其在新物體識別實驗和Y迷宮實驗中的表現變差。這些研究都強調了Nrf2在維持神經系統正常功能和認知功能方面的重要性。Nrf2基因敲除導致小鼠創傷性腦損傷后認知功能下降的潛在機制可能與氧化應激、神經炎癥和神經細胞凋亡等因素密切相關。Nrf2作為細胞內抗氧化應激反應的關鍵調節因子，在正常情況下，能夠通過與Keap1蛋白結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到氧化應激等刺激時，Nrf2與Keap1解離，進入細胞核內，與抗氧化反應元件（ARE）結合，啟動一系列抗氧化酶和解毒酶的表達，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NADPH：醌氧化還原酶-1（NQO-1）等，從而增強細胞的抗氧化防御能力，減輕氧化應激損傷。在本研究中，Nrf2基因敲除小鼠由于無法正常表達Nrf2蛋白，失去了這種抗氧化應激的保護機制。在創傷性腦損傷后，小鼠腦組織內產生大量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS），導致氧化應激水平急劇升高。過量的ROS和RNS攻擊神經細胞的細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子，引發脂質過氧化、蛋白質氧化修飾和DNA損傷。脂質過氧化會破壞細胞膜的結構和功能，導致神經細胞膜的流動性降低，離子通道功能異常，影響神經遞質的釋放和神經信號的傳遞。蛋白質氧化修飾會改變蛋白質的結構和活性，使許多關鍵酶和受體的功能受損，干擾神經細胞的正常代謝和信號轉導。DNA損傷則可能導致基因表達異常，影響神經細胞的生長、分化和存活。這些氧化應激損傷最終導致神經細胞功能障礙，進而影響小鼠的認知功能。神經炎癥也是導致Nrf2基因敲除小鼠創傷性腦損傷后認知功能下降的重要因素之一。創傷性腦損傷會引發機體的炎癥反應，損傷部位的組織細胞釋放多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。在正常情況下，Nrf2可以通過抑制炎癥相關基因的表達，減少炎癥因子的釋放，調節炎癥微環境，從而保護神經細胞免受炎癥損傷。然而，在Nrf2基因敲除小鼠中，由于缺乏Nrf2的調控作用，炎