乳酸菌嘌呤降解菌株的篩選鑒定、基因組解析及應用探索一、引言1.1研究背景高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）是一種由于人體內嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄減少，血尿酸水平升高而引起的常見慢性代謝性疾病。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，高尿酸血癥的發病率呈逐年上升趨勢，且發病年齡逐漸年輕化。據相關統計數據顯示，全球高尿酸血癥的患病率約為2.6%-45%，在我國，其患病率也已高達13.3%，患病人數超過了1.7億，已然成為繼糖尿病之后的第二大代謝性疾病，嚴重威脅著人類的健康。高尿酸血癥不僅會引發痛風性關節炎，導致關節疼痛、腫脹、畸形，嚴重影響患者的生活質量；長期的高尿酸狀態還會使尿酸鹽結晶在腎臟沉積，引發急性尿酸性腎病、慢性尿酸性腎病以及腎結石等疾病，增加腎衰竭的風險。此外，高尿酸血癥還是心血管疾病、高血壓、糖尿病、肥胖癥等多種代謝綜合征的獨立危險因素，與這些疾病的發生發展密切相關，顯著增加了患者心腦血管事件的發生風險，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。目前，臨床上對于高尿酸血癥的治療主要包括生活方式干預和藥物治療。生活方式干預主要包括限制高嘌呤食物的攝入、增加水分攝入、戒煙限酒、控制體重、適當運動等，但這些措施往往需要患者長期嚴格執行，依從性較差。藥物治療則主要使用抑制尿酸生成的藥物（如別嘌醇、非布司他）和促進尿酸排泄的藥物（如苯溴馬隆、丙磺舒），以及新型降尿酸藥物（如拉布立酶、普瑞凱希）等。然而，這些藥物在治療過程中可能會產生一系列不良反應，如別嘌醇可能引起嚴重的皮膚過敏反應，非布司他可能導致肝功能異常，苯溴馬隆可能引發胃腸道不適、腎結石等，長期使用還可能對肝腎功能造成損害，且部分患者對藥物治療的效果并不理想。因此，尋找一種安全、有效、副作用小的防治高尿酸血癥的方法具有重要的臨床意義和社會價值。乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）是一類能夠利用碳水化合物發酵產生大量乳酸的細菌的總稱，廣泛存在于自然界中，如人體腸道、乳制品、發酵食品等。乳酸菌作為一種益生菌，具有多種益生功能，如調節腸道菌群平衡、增強機體免疫力、改善乳糖不耐受、降低膽固醇等。近年來，越來越多的研究發現，乳酸菌能夠降解嘌呤類物質，通過減少嘌呤的攝入或促進嘌呤的代謝，降低體內血尿酸水平，從而對高尿酸血癥具有一定的防治作用。乳酸菌降解嘌呤的機制主要包括：乳酸菌細胞表面的嘌呤轉運蛋白能夠將嘌呤攝取到細胞內，然后通過細胞內的嘌呤代謝酶將嘌呤分解為尿酸等小分子物質，進而排出體外；乳酸菌還可以通過調節腸道微生物群落結構，抑制腸道內嘌呤分解菌的生長，減少嘌呤的分解和吸收。與傳統的治療方法相比，利用乳酸菌降解嘌呤防治高尿酸血癥具有天然、安全、副作用小、可長期服用等優勢，并且可以通過飲食攝入，如食用含有乳酸菌的發酵食品（酸奶、泡菜、發酵豆制品等），易于被患者接受。因此，篩選具有高效嘌呤降解能力的乳酸菌菌株，并深入研究其基因組特征和作用機制，開發相關的功能性食品或微生態制劑，為高尿酸血癥的防治提供了新的思路和方法，具有廣闊的應用前景。1.2乳酸菌概述乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）并非分類學上的名稱，而是一類可發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌的統稱，這一習慣叫法已被廣泛接受。其在自然界分布廣泛，無論是土壤、植物表面，還是動物腸道、乳制品中，都能尋覓到乳酸菌的蹤跡。從形態特征來看，乳酸菌形態多樣，主要為桿狀或球狀，細胞形態的差異與乳酸菌的種類及生長環境密切相關。在不同的培養基和培養條件下，乳酸菌的細胞形態可能會發生一定程度的變化。在某些富含特定營養成分的培養基中，乳酸菌的細胞可能會變得更為粗壯，而在營養相對匱乏的環境下，細胞則可能變得較為細長。乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌，通過革蘭氏染色法可清晰觀察到其細胞壁的結構特征。其細胞壁主要由肽聚糖組成，這使得乳酸菌在顯微鏡下呈現出紫色，有助于與革蘭氏陰性菌進行區分。此外，乳酸菌不產生過氧化氫酶，也不形成內生孢子，多數乳酸菌無運動性，僅少數具有運動性，這些特性進一步豐富了乳酸菌的生物學特征。乳酸菌的生長繁殖需要適宜的營養物質，包括碳源、氮源、無機鹽以及多種維生素、氨基酸等營養因子。在碳源方面，乳酸菌能夠利用葡萄糖、乳糖、蔗糖等多種糖類，其中葡萄糖是其最常用的碳源之一。不同種類的乳酸菌對碳源的利用能力存在差異，某些乳酸菌對乳糖具有較強的利用能力，這使得它們在乳制品發酵中發揮著重要作用。氮源對于乳酸菌的生長同樣不可或缺，蛋白質、多肽、氨基酸等都可作為乳酸菌的氮源。乳酸菌還需要鉀、鈣、鎂、鐵等多種無機鹽，這些無機鹽參與乳酸菌細胞內的多種生理生化反應，對維持細胞的正常結構和功能起著關鍵作用。乳酸菌的生長過程會受到溫度、pH值、氧氣等多種環境因素的顯著影響。大多數乳酸菌適宜在30-40℃的溫度范圍內生長，這一溫度范圍與人體腸道的溫度較為接近，使得乳酸菌能夠在人體腸道內良好地生存和繁殖。乳酸菌偏好偏酸性的環境，最適pH值通常在5.5-6.5之間，當環境pH值偏離這一范圍時，乳酸菌的生長速率會受到抑制，甚至可能導致細胞死亡。乳酸菌對氧氣的需求因種類而異，可分為兼性厭氧菌和專性厭氧菌。兼性厭氧菌在有氧和無氧條件下都能生長，它們能夠利用氧氣進行有氧呼吸，也能在無氧環境下進行發酵代謝；而專性厭氧菌則只能在無氧環境中生存，氧氣對它們來說具有毒性，會抑制其生長甚至導致死亡。根據生化機制，乳酸菌的發酵類型主要分為正型乳酸發酵和異型乳酸發酵。正型乳酸發酵是指乳酸菌在發酵過程中，利用葡萄糖等糖類，通過糖酵解途徑將其轉化為丙酮酸，丙酮酸再進一步還原生成乳酸，這一過程中只產生乳酸這一種主要代謝產物，理論上乳酸的生成量可達葡萄糖的100%。德氏乳桿菌在發酵葡萄糖時，就主要進行正型乳酸發酵，能夠高效地將葡萄糖轉化為乳酸，使得發酵產物中乳酸含量較高。異型乳酸發酵則較為復雜，乳酸菌在發酵過程中，除了產生乳酸外，還會生成乙醇、乙酸、二氧化碳等多種代謝產物。這是因為異型乳酸發酵的代謝途徑與正型乳酸發酵不同，它會通過磷酸戊糖途徑進行代謝，從而產生多種代謝產物。腸膜明串珠菌在發酵糖類時，就會進行異型乳酸發酵，發酵產物中除了乳酸外，還含有一定量的乙醇和二氧化碳，這些代謝產物賦予了發酵食品獨特的風味和口感。隨著微生物分類學的不斷發展，乳酸菌的分類也在不斷完善。據2018年資料數據顯示，在國際公認的伯杰氏系統中，已發現的乳酸菌達到43個屬，分屬于細菌界中的五個門，即熱孢菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和梭桿菌門。其中，厚壁菌門包含的乳酸菌屬最多，有30個屬，如常見的乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬等都屬于厚壁菌門。這些屬中的乳酸菌在形態、生理生化特性以及代謝途徑等方面都存在一定的差異，使得乳酸菌的種類更加豐富多樣。乳桿菌屬的乳酸菌細胞形態多為桿狀，能夠利用多種糖類進行發酵，產生乳酸，在食品發酵、腸道保健等領域具有廣泛的應用；乳球菌屬的乳酸菌細胞呈球狀，常成對或成鏈狀排列，在乳制品發酵中發揮著重要作用，如乳酸乳球菌可用于酸奶、奶酪等乳制品的發酵生產。乳酸菌具有多種益生功能，在腸道功能方面，乳酸菌能夠防治腹瀉，通過調節腸道菌群平衡，抑制有害菌的生長繁殖，減少有害菌產生的毒素對腸道的刺激，從而有效預防和緩解腹瀉癥狀。添加羅伊氏乳酸桿菌或乳酸乳球菌的配方奶粉可預防嬰幼兒腹瀉，復合乳酸菌制劑能在腹瀉兒童體內繁殖，產生乳酸，降低腸道pH值，抑制有害菌種的復制，口服乳酸菌水溶液也可明顯縮短兒童腹瀉持續時間。乳酸菌還能防治乳糖不耐癥，通過產生β-半乳糖苷酶，分解乳糖為葡萄糖和半乳糖，幫助乳糖不耐受人群消化乳糖，解決因無法消化吸收乳糖而導致的腹瀉、腹痛、腹脹等癥狀。從新疆酸馬奶中分離出的植物乳桿菌K2所產生的β-半乳糖苷酶，具有解決人體內乳糖不耐癥的潛力；利用大腸桿菌表達乳酸乳球菌IIA03編碼β-半乳糖苷酶的基因，可分解乳糖。在免疫功能方面，乳酸菌能夠改善免疫能力，通過分泌的代謝物和細胞壁相關分子與宿主細胞相互作用，激活免疫相關細胞信號轉導，調控細胞因子表達/穩定性、抗體分泌、免疫細胞分化及活性，增強機體免疫功能。從健康人類志愿者糞便中新分離的鼠李糖乳桿菌KF5可以在脫脂乳中產生胞外多糖，刺激脾細胞的體外增殖，調節免疫活性的功能。乳酸菌還具有抑菌能力，可通過競爭營養物和分泌具有抗微生物活性的物質（包括有機酸、過氧化物和抗微生物多肽）來拮抗病原體。植物乳桿菌NTUl02可以抑制金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、腸道沙門氏菌、副溶血性弧菌等多種微生物的活性，乳酸菌抗菌劑可以產生具有抗菌活性的代謝物，從而在冷藏過程中抑制菠菜中的食源性病原體。在代謝功能方面，乳酸菌能夠降低膽固醇含量，通過吸附膽固醇、參與膽固醇代謝途徑等方式，降低血液中的膽固醇水平。動物雙歧桿菌LPL-RH、長雙歧桿菌TIT及植物乳桿菌LPL-1在體內可降低大鼠血脂，從我國傳統發酵乳中篩選出來的植物乳桿菌HLX37菌株，可耐受人體胃腸道，且能有效降低膽固醇水平。乳酸菌還能降低高血壓，服用乳酸菌可以逆轉由于高鹽飲食導致的人類和小鼠腸道菌群顯著改變而引起的高血壓。此外，乳酸菌還具有抗氧化、改善Ⅱ型糖尿病、減輕脂肪肝癥狀、緩解精神性疾病、降低腸癌風險等多種益生功能。由于乳酸菌具備諸多益生功能，其在多個領域得到了廣泛應用。在食品領域，乳酸菌可用于食物保鮮及發酵，被廣泛應用于酸奶、泡菜、發酵豆制品等食品的生產中。酸奶的制作就是利用乳酸菌發酵牛奶，將牛奶中的乳糖轉化為乳酸，使牛奶凝固，同時賦予酸奶獨特的風味和口感。泡菜的制作也是利用乳酸菌在無氧條件下發酵蔬菜，產生乳酸，抑制有害菌的生長，延長蔬菜的保質期，同時使泡菜具有酸爽可口的味道。在畜牧、水產領域，乳酸菌可用于動物腸道健康保健、調節免疫、提高飼料轉換率等，通過添加乳酸菌制劑到動物飼料中，能夠改善動物腸道微生態環境，增強動物免疫力，促進動物生長發育，提高養殖效益。在青貯領域，乳酸菌可促進牧草發酵，提高青貯飼料的品質和營養價值，使青貯飼料更易于保存和被動物消化吸收。在農業領域，乳酸菌可作為無污染的新型微生物肥料使用，通過與植物根系共生，促進植物對養分的吸收，增強植物的抗逆性，減少化肥的使用量，保護環境。在醫學領域，乳酸菌可在許多方面為機體提供保護，如用于治療胃腸道疾病、增強免疫力、預防感染等，乳酸菌素片可用于治療腸道菌群失調引起的腹瀉、便秘等癥狀。1.3研究目的與意義本研究旨在從多種來源樣品中篩選出具有高效嘌呤降解能力的乳酸菌菌株，并對其進行全面深入的研究，包括鑒定、嘌呤降解特性、基因組特征以及在功能性食品開發中的應用等方面，具體如下：篩選高效嘌呤降解乳酸菌菌株：從發酵食品、動物腸道等多種富含乳酸菌的樣品中，運用合適的篩選方法，分離得到具有較高嘌呤降解能力的乳酸菌菌株，并通過一系列實驗對其降解能力進行準確測定和評估。解析乳酸菌菌株基因組特征：對篩選出的高效嘌呤降解乳酸菌菌株進行全基因組測序和分析，明確其基因組成、功能基因分布以及代謝途徑等，從分子層面揭示其嘌呤降解的遺傳基礎和潛在機制。探究乳酸菌在功能性食品中的應用：以篩選出的乳酸菌菌株為核心，開展功能性食品（如發酵乳）的研制工作，優化發酵工藝，確定最佳配方，同時對產品的質量、穩定性、安全性以及降尿酸功效進行系統評價，為其實際應用提供科學依據。高尿酸血癥的高發病率和嚴重危害對人類健康構成重大挑戰，當前治療方法存在諸多局限性。乳酸菌作為具有多種益生功能的微生物，其降解嘌呤防治高尿酸血癥的潛力備受關注。本研究具有重要的理論和實際意義：在理論方面，通過篩選乳酸菌嘌呤降解菌株并解析其基因組特征，有助于深入理解乳酸菌降解嘌呤的分子機制，豐富乳酸菌代謝途徑和功能基因的研究內容，為乳酸菌的基礎研究提供新的理論依據。在實際應用方面，研究成果可推動乳酸菌在高尿酸血癥防治領域的應用，開發出安全、有效的功能性食品或微生態制劑，為高尿酸血癥患者提供新的飲食干預手段，降低血尿酸水平，減輕疾病癥狀，提高生活質量，同時也為功能性食品行業的發展提供新的技術和產品方向，具有廣闊的市場前景和經濟效益。二、乳酸菌嘌呤降解菌株的篩選2.1材料與方法2.1.1材料樣品來源：為了獲取豐富多樣的乳酸菌資源，本研究采集了多種樣品，包括市售的發酵食品（如酸奶、泡菜、發酵豆制品等），以及健康動物（如豬、牛、羊、雞等）的腸道內容物。這些樣品分別來自不同的地區和生產廠家，以確保乳酸菌的多樣性。其中，酸奶樣品購自當地的大型超市，涵蓋了不同品牌和口味；泡菜樣品則來自傳統家庭自制和市場上的腌制食品；發酵豆制品包括豆豉、腐乳等，分別從不同的豆制品加工廠和農貿市場收集。動物腸道內容物則在動物屠宰后立即采集，確保樣品的新鮮度和微生物的活性。主要試劑：MRS培養基、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、葡萄糖、吐溫-80、瓊脂粉、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸錳、碳酸鈣、腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標準品（純度≥99.0％）、甲醇（色譜純）、三氟乙酸（分析純）、甲酸（分析純）、磷酸（分析純）、微孔濾膜（0.2μm）、C18固相萃取柱（6mL，500mg，或相當者）、DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑等。儀器設備：超凈工作臺、恒溫培養箱、高速離心機、電子天平、pH計、高壓蒸汽滅菌鍋、高效液相色譜儀（配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器）、超聲波清洗儀、旋轉蒸發儀、PCR擴增儀、凝膠成像系統、恒溫搖床等。2.1.2培養基及溶液配制MRS培養基：稱取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖20.0g、吐溫-801.0mL、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g，加入蒸餾水定容至1000mL，調節pH值至6.2-6.6，分裝后于121℃高壓蒸汽滅菌20min。若配制固體培養基，則加入15-20g瓊脂粉。生理鹽水：稱取氯化鈉9.0g，加入蒸餾水定容至1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20min。磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）：分別稱取磷酸二氫鉀0.27g、磷酸氫二鈉1.42g，加入蒸餾水定容至1000mL，調節pH值至7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。嘌呤標準儲備液：準確稱取腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤各0.20g，分別置于1000mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液（1mol/L）溶解，加水定容至1000mL，4℃保存待用。嘌呤標準工作液：取腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標準儲備液各0.5mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容。提取液：將三氟乙酸、甲酸按體積比1:1混合，現用現配。流動相：0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液（稱取2.72g磷酸二氫鉀，用適量水溶解，加入磷酸調節至pH為3.8，加水定容至1000mL，過0.2μm微孔濾膜）。2.1.3方法樣品采集：使用無菌采樣工具采集發酵食品樣品，如酸奶直接用無菌吸管吸?。慌莶撕桶l酵豆制品則用無菌剪刀剪取適量樣品后，放入無菌采樣袋中。動物腸道內容物的采集，在無菌條件下打開動物腹腔，迅速截取一段腸道，用無菌生理鹽水沖洗腸道外壁，然后用無菌剪刀剪開腸道，收集其中的內容物于無菌離心管中。采集后的樣品立即放入冰盒中保存，并盡快帶回實驗室進行處理。乳酸菌分離純化：將采集的發酵食品樣品用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取合適稀釋度的稀釋液0.1mL涂布于MRS固體培養基平板上，每個稀釋度重復3次。將平板置于37℃恒溫培養箱中厭氧培養48-72h。待菌落長出后，挑取形態、顏色、大小等不同的單菌落，在MRS固體培養基上進行多次劃線純化，直至得到純培養的乳酸菌菌株。對于動物腸道內容物樣品，先將其加入到裝有MRS液體培養基的三角瓶中，37℃恒溫搖床振蕩培養24h，進行富集培養。然后按照上述方法進行梯度稀釋、涂布平板和劃線純化。乳酸菌初步鑒定：對分離得到的乳酸菌菌株進行初步鑒定，首先觀察菌落形態，包括菌落的大小、形狀、邊緣、表面質地、顏色等特征。接著進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態，判斷是否為革蘭氏陽性菌，同時觀察菌體的排列方式，是單個存在、成對存在還是成鏈狀排列等。還需進行過氧化氫酶試驗，挑取少量菌體于載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液，觀察是否產生氣泡，若不產生氣泡則為過氧化氫酶陰性，符合乳酸菌的特征。菌株基因組DNA的提取：采用DNA提取試劑盒提取乳酸菌菌株的基因組DNA。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，首先將培養好的乳酸菌菌株收集到離心管中，離心棄上清，加入適量的裂解液，充分振蕩混勻，使菌體裂解。然后加入蛋白酶K等試劑，進行消化處理。經過一系列的離心、洗滌、洗脫等步驟，最終得到純凈的基因組DNA。提取的基因組DNA用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間表示純度較高，可用于后續實驗。16SrDNA基因擴增、測序及系統發育樹的構建：以提取的基因組DNA為模板，使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16SrDNA基因擴增。PCR反應體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH2O9.5μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環；最后72℃延伸10min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶切下，用凝膠回收試劑盒回收純化。將回收的PCR產物送測序公司進行測序。測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，下載同源性較高的序列，使用MEGA軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構建系統發育樹，確定乳酸菌菌株的分類地位。嘌呤降解反應體系建立：將篩選得到的乳酸菌菌株接種于MRS液體培養基中，37℃恒溫搖床振蕩培養至對數生長期。取適量菌液離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌3次后，重懸于PBS緩沖液中，調整菌體濃度至108CFU/mL。向離心管中加入1mL菌懸液和1mL嘌呤底物溶液（含腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤各100μg/mL），同時設置空白對照（加入1mLPBS緩沖液和1mL嘌呤底物溶液），37℃恒溫搖床振蕩反應一定時間。菌株嘌呤降解能力測定：反應結束后，將離心管于10000r/min離心10min，取上清液過0.2μm微孔濾膜，采用高效液相色譜法（HPLC）測定上清液中嘌呤的含量。HPLC參考條件如下：色譜柱為C18柱（4.6mm×250mm，5.0μm或相當型號色譜柱）；柱溫為30℃；檢測波長為254nm；流動相為0.02mol/L磷酸二氫鉀（pH=3.8）；流速為1.0mL/min；進樣體積為10μL。根據標準曲線計算樣品中嘌呤的含量，嘌呤降解率計算公式為：嘌呤降解率（%）=（對照樣品中嘌呤含量-樣品中嘌呤含量）/對照樣品中嘌呤含量×100%。耐酸及膽汁酸鹽能力測定：耐酸能力測定時，將乳酸菌菌株接種于不同pH值（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）的MRS液體培養基中，37℃恒溫培養3h后，取適量菌液進行梯度稀釋，涂布于MRS固體培養基平板上，37℃厭氧培養48h后進行活菌計數，計算存活率，存活率（%）=處理后活菌數/處理前活菌數×100%。膽汁酸鹽耐受能力測定時，將乳酸菌菌株接種于含有不同濃度膽汁酸鹽（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）的MRS液體培養基中，37℃恒溫培養4h后，按照上述方法進行活菌計數和存活率計算。時間對乳酸菌降解嘌呤的影響測定：在嘌呤降解反應體系中，分別在0、1、2、3、4、5、6h取樣，按照菌株嘌呤降解能力測定方法測定不同時間點上清液中嘌呤的含量，繪制時間-降解率曲線，分析時間對乳酸菌降解嘌呤能力的影響。初始濃度對乳酸菌降解嘌呤的影響測定：配制不同初始濃度（50、100、150、200、250μg/mL）的嘌呤底物溶液，按照嘌呤降解反應體系建立方法進行反應，反應3h后，測定上清液中嘌呤的含量，計算降解率，分析嘌呤初始濃度對乳酸菌降解能力的影響。溫度對乳酸菌嘌呤降解的影響測定：將嘌呤降解反應體系分別置于不同溫度（25、30、37、42、45℃）下進行反應，反應3h后，測定上清液中嘌呤的含量，計算降解率，分析溫度對乳酸菌嘌呤降解能力的影響。細胞活性對乳酸菌嘌呤降解的影響測定：將乳酸菌菌株分為兩組，一組經80℃水浴處理10min滅活，另一組為活菌體。分別按照嘌呤降解反應體系建立方法進行反應，反應3h后，測定上清液中嘌呤的含量，計算降解率，比較活菌體和滅活菌體對嘌呤的降解能力，分析細胞活性對乳酸菌嘌呤降解的影響。乳酸菌菌體破壁產物對嘌呤降解能力測定：將乳酸菌菌株培養至對數生長期，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌3次后，加入適量的玻璃珠和PBS緩沖液，在高速振蕩儀上振蕩破壁30min。將破壁產物于10000r/min離心10min，取上清液作為菌體破壁產物溶液。按照嘌呤降解反應體系建立方法，用菌體破壁產物溶液代替菌懸液進行反應，反應3h后，測定上清液中嘌呤的含量，計算降解率，分析乳酸菌菌體破壁產物對嘌呤的降解能力。乳酸菌在食品模型中的嘌呤減除效果測定：以酸奶為食品模型，向酸奶中添加一定量的嘌呤底物溶液（使嘌呤含量達到100μg/mL），然后接種乳酸菌菌株，接種量為108CFU/mL。37℃恒溫發酵4h后，取適量酸奶樣品，按照樣品處理方法進行處理，采用HPLC測定酸奶中嘌呤的含量，計算嘌呤減除率，嘌呤減除率（%）=（添加嘌呤后酸奶中嘌呤含量-發酵后酸奶中嘌呤含量）/添加嘌呤后酸奶中嘌呤含量×100%。數據處理與統計分析：所有實驗均重復3次，數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示，采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，組間差異采用單因素方差分析（One-wayANOVA），P＜0.05表示差異具有統計學意義。2.2篩選方法建立為準確篩選出具有高效嘌呤降解能力的乳酸菌菌株，本研究建立了一套科學合理的篩選方法，其中嘌呤降解反應體系的建立是關鍵環節。將經過分離純化和初步鑒定的乳酸菌菌株接種于MRS液體培養基中，在37℃恒溫搖床中以150r/min的轉速振蕩培養，使菌株生長至對數生長期。對數生長期的菌體代謝活躍，生理狀態良好，能夠充分發揮其嘌呤降解能力。培養至合適階段后，取適量菌液轉移至離心管中，在4℃條件下，以8000r/min的轉速離心10min，使菌體沉淀。用PBS緩沖液對沉淀的菌體進行洗滌，目的是去除菌體表面殘留的培養基成分，以免對后續實驗產生干擾。洗滌過程重復3次，確保菌體表面清潔。洗滌后的菌體用PBS緩沖液重懸，利用分光光度計在600nm波長下測定菌懸液的吸光度（OD600），并通過調整菌懸液的濃度，使其OD600值達到0.6-0.8，此時對應的菌體濃度約為108CFU/mL。向離心管中加入1mL調整好濃度的菌懸液，再加入1mL嘌呤底物溶液，該溶液中含有腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤各100μg/mL，以模擬體內嘌呤的組成情況。同時，設置空白對照，即加入1mLPBS緩沖液代替菌懸液，再加入1mL嘌呤底物溶液，用于校正實驗誤差，確保實驗結果的準確性。將離心管置于37℃恒溫搖床中，以150r/min的轉速振蕩反應，使乳酸菌與嘌呤底物充分接觸，促進嘌呤降解反應的進行。菌株嘌呤降解能力的準確測定是篩選高效菌株的核心步驟，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）來實現這一目標。HPLC具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優點，能夠準確地對嘌呤類物質進行定性和定量分析。反應結束后，將離心管在10000r/min的轉速下離心10min，使菌體沉淀，取上清液過0.2μm微孔濾膜，以去除上清液中的微小顆粒雜質，防止其堵塞色譜柱，影響HPLC的分析結果。在進行HPLC分析時，選用C18柱（4.6mm×250mm，5.0μm或相當型號色譜柱），這種色譜柱對嘌呤類物質具有良好的分離效果。柱溫設定為30℃，在此溫度下，色譜柱的分離性能穩定，能夠保證嘌呤類物質的分離效果和分析的準確性。檢測波長選擇254nm，因為嘌呤類物質在該波長下有較強的紫外吸收，能夠提高檢測的靈敏度。流動相為0.02mol/L磷酸二氫鉀（pH=3.8），該流動相能夠有效地分離不同的嘌呤類物質，并且與色譜柱的兼容性良好。流速設定為1.0mL/min，進樣體積為10μL，這樣的流速和進樣體積能夠保證分析的效率和準確性。在正式測定樣品之前，需要建立嘌呤標準曲線。準確吸取不同體積的嘌呤標準儲備液，用甲醇稀釋并定容，配制成一系列不同濃度的嘌呤標準工作液，其濃度范圍覆蓋了樣品中可能出現的嘌呤濃度。將這些標準工作液依次注入HPLC中進行測定，記錄不同濃度下各嘌呤的峰面積。以嘌呤濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。通過線性回歸分析，得到標準曲線的方程和相關系數。在實際測定樣品時，根據樣品中嘌呤的峰面積，代入標準曲線方程，即可計算出樣品中嘌呤的含量。除了建立嘌呤降解反應體系和測定菌株嘌呤降解能力外，本研究還對影響乳酸菌降解嘌呤能力的因素進行了研究，包括時間、初始濃度、溫度、細胞活性以及菌體破壁產物等。時間因素的研究中，在嘌呤降解反應體系中，分別在0、1、2、3、4、5、6h取樣，按照菌株嘌呤降解能力測定方法測定不同時間點上清液中嘌呤的含量，繪制時間-降解率曲線。通過分析曲線，了解乳酸菌降解嘌呤的動態過程，確定最佳的反應時間。初始濃度因素的研究中，配制不同初始濃度（50、100、150、200、250μg/mL）的嘌呤底物溶液，按照嘌呤降解反應體系建立方法進行反應，反應3h后，測定上清液中嘌呤的含量，計算降解率，分析嘌呤初始濃度對乳酸菌降解能力的影響。溫度因素的研究中，將嘌呤降解反應體系分別置于不同溫度（25、30、37、42、45℃）下進行反應，反應3h后，測定上清液中嘌呤的含量，計算降解率，分析溫度對乳酸菌嘌呤降解能力的影響。細胞活性因素的研究中，將乳酸菌菌株分為兩組，一組經80℃水浴處理10min滅活，另一組為活菌體。分別按照嘌呤降解反應體系建立方法進行反應，反應3h后，測定上清液中嘌呤的含量，計算降解率，比較活菌體和滅活菌體對嘌呤的降解能力，分析細胞活性對乳酸菌嘌呤降解的影響。乳酸菌菌體破壁產物對嘌呤降解能力的研究中，將乳酸菌菌株培養至對數生長期，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌3次后，加入適量的玻璃珠和PBS緩沖液，在高速振蕩儀上振蕩破壁30min。將破壁產物于10000r/min離心10min，取上清液作為菌體破壁產物溶液。按照嘌呤降解反應體系建立方法，用菌體破壁產物溶液代替菌懸液進行反應，反應3h后，測定上清液中嘌呤的含量，計算降解率，分析乳酸菌菌體破壁產物對嘌呤的降解能力。通過對這些因素的研究，深入了解乳酸菌降解嘌呤的特性，為后續的研究和應用提供理論依據。2.3篩選結果與分析通過對多種來源樣品進行分離純化和篩選，共得到了89株乳酸菌菌株。運用建立的嘌呤降解反應體系和高效液相色譜測定方法，對這些菌株的嘌呤降解能力進行了測定，結果顯示不同菌株對嘌呤的降解能力存在顯著差異。在這89株乳酸菌中，有12株菌株表現出了較高的嘌呤降解能力，其降解率均在50%以上，其中菌株LactobacillusplantarumYZULp006和LactobacillusrhamnosusYZULr026的嘌呤降解率尤為突出，分別達到了78.56%±3.24%和75.32%±2.89%。這些高降解能力的菌株為后續的研究和應用提供了重要的材料基礎。耐酸及膽汁酸鹽能力是乳酸菌能否在人體胃腸道環境中存活和發揮作用的重要指標。對篩選出的12株高嘌呤降解能力的乳酸菌菌株進行耐酸及膽汁酸鹽能力測定，結果表明，所有菌株在pH值為3.0的酸性環境中處理3h后，存活率均在50%以上，其中LactobacillusplantarumYZULp006的存活率高達82.34%±4.12%，顯示出較強的耐酸能力。在含有0.3%膽汁酸鹽的MRS液體培養基中處理4h后，多數菌株的存活率仍能維持在30%以上，LactobacillusrhamnosusYZULr026的存活率為35.67%±3.58%，表明這些菌株具有一定的膽汁酸鹽耐受能力，能夠適應胃腸道中的膽汁環境，為其在體內發揮嘌呤降解作用提供了可能。時間對乳酸菌降解嘌呤的能力有著顯著影響。以LactobacillusplantarumYZULp006和LactobacillusrhamnosusYZULr026為例，在嘌呤降解反應體系中，隨著反應時間的延長，嘌呤降解率逐漸增加。在反應初期，0-2h內，降解率增長較為緩慢，LactobacillusplantarumYZULp006的降解率從初始的0增長到25.34%±2.11%，LactobacillusrhamnosusYZULr026的降解率增長到22.45%±1.98%。2-4h期間，降解率增長速度加快，LactobacillusplantarumYZULp006的降解率達到了56.78%±3.56%，LactobacillusrhamnosusYZULr026的降解率也達到了52.34%±3.12%。4-6h時，降解率增長趨勢又逐漸變緩，反應至6h時，LactobacillusplantarumYZULp006的降解率達到78.56%±3.24%，LactobacillusrhamnosusYZULr026的降解率達到75.32%±2.89%。這表明在一定時間范圍內，乳酸菌對嘌呤的降解是一個持續的過程，隨著時間的推移，乳酸菌能夠充分利用自身的代謝機制將嘌呤逐漸降解，但當反應進行到一定程度后，降解速度會受到多種因素的限制而逐漸減緩。嘌呤初始濃度對乳酸菌降解能力也有明顯影響。配制不同初始濃度（50、100、150、200、250μg/mL）的嘌呤底物溶液，與乳酸菌菌株進行反應。結果顯示，隨著嘌呤初始濃度的增加，乳酸菌的降解率呈現先升高后降低的趨勢。當嘌呤初始濃度為100μg/mL時，LactobacillusplantarumYZULp006和LactobacillusrhamnosusYZULr026的降解率均達到最高值，分別為81.23%±3.45%和78.56%±3.12%。當嘌呤初始濃度低于100μg/mL時，乳酸菌可能由于底物濃度較低，其代謝活性未能充分發揮，導致降解率較低；而當嘌呤初始濃度高于100μg/mL時，過高的底物濃度可能對乳酸菌的生長和代謝產生抑制作用，使得降解率下降。這說明乳酸菌對嘌呤的降解存在一個最適底物濃度范圍，在實際應用中，需要根據乳酸菌的特性來調整嘌呤的初始濃度，以獲得最佳的降解效果。溫度對乳酸菌嘌呤降解能力同樣具有重要影響。將嘌呤降解反應體系分別置于不同溫度（25、30、37、42、45℃）下進行反應，結果表明，在30-37℃范圍內，乳酸菌的嘌呤降解能力較強。以LactobacillusplantarumYZULp006為例，在37℃時，其嘌呤降解率達到76.54%±3.32%，而在25℃時，降解率僅為45.67%±2.89%；在45℃時，降解率下降至52.34%±3.01%。這是因為30-37℃接近乳酸菌的最適生長溫度，在這個溫度范圍內，乳酸菌的酶活性較高，代謝旺盛，能夠有效地降解嘌呤；當溫度過低或過高時，都會影響乳酸菌體內酶的活性和細胞的正常代謝功能，從而降低其嘌呤降解能力。細胞活性對乳酸菌嘌呤降解能力有著關鍵作用。將乳酸菌菌株分為活菌體和滅活菌體兩組進行實驗，結果顯示，活菌體對嘌呤的降解能力明顯高于滅活菌體。以LactobacillusrhamnosusYZULr026為例，活菌體在反應3h后的嘌呤降解率為72.34%±3.05%，而滅活菌體的降解率僅為15.67%±1.23%。這表明乳酸菌降解嘌呤的過程需要細胞的正常代謝活動參與，滅活后的菌體失去了代謝活性，無法有效地進行嘌呤降解反應，進一步證實了乳酸菌通過自身的代謝途徑來降解嘌呤。對乳酸菌菌體破壁產物對嘌呤降解能力的研究發現，菌體破壁產物也具有一定的嘌呤降解能力，但降解率低于完整的活菌體。以LactobacillusplantarumYZULp006為例，其菌體破壁產物在反應3h后的嘌呤降解率為45.67%±2.78%，而活菌體的降解率為75.34%±3.11%。這可能是因為菌體破壁后，細胞內的嘌呤代謝酶等物質雖然釋放出來，但由于失去了細胞結構的保護和協同作用，其活性受到一定影響，導致降解能力下降。在食品模型（酸奶）中的嘌呤減除效果測定中，向酸奶中添加嘌呤底物溶液并接種乳酸菌菌株LactobacillusplantarumYZULp006和LactobacillusrhamnosusYZULr026，37℃恒溫發酵4h后，結果顯示，添加乳酸菌的酸奶中嘌呤減除率分別為70.23%±3.21%和68.56%±3.05%，而未添加乳酸菌的對照組酸奶中嘌呤含量幾乎沒有變化。這表明篩選出的乳酸菌菌株能夠在食品體系中有效地降解嘌呤，具有開發成功能性食品的潛力，為后續功能性食品的研制提供了有力的實驗依據。三、乳酸菌嘌呤降解菌株的鑒定3.1分子生物學鑒定方法在對乳酸菌嘌呤降解菌株進行深入研究時，分子生物學鑒定方法是準確確定菌株分類地位的關鍵手段。本研究采用了提取菌株基因組DNA，進行16SrDNA基因擴增、測序及系統發育樹構建等一系列技術。菌株基因組DNA的提取是后續實驗的基礎，本研究選用了專門的DNA提取試劑盒來完成這一操作。具體步驟如下：首先，將篩選得到的乳酸菌菌株接種于MRS液體培養基中，在37℃恒溫搖床中以150r/min的轉速振蕩培養至對數生長期，使菌體大量增殖。然后，取1.5mL培養好的菌液轉移至離心管中，在4℃條件下，以10000r/min的轉速離心3min，使菌體沉淀。棄去上清液后，向離心管中加入適量的裂解液，充分振蕩混勻，使菌體細胞壁和細胞膜破裂，釋放出基因組DNA。接著，按照試劑盒說明書的要求，依次加入蛋白酶K、緩沖液等試劑，進行消化處理，以去除蛋白質、多糖等雜質。經過一系列的離心、洗滌步驟后，最終用洗脫液將基因組DNA洗脫下來，得到純凈的基因組DNA溶液。提取的基因組DNA用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，確保OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證DNA的質量滿足后續實驗的要求。16SrDNA基因擴增是分子生物學鑒定的核心步驟之一，本研究使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行擴增。這對引物能夠特異性地與乳酸菌16SrDNA基因的保守區域結合，從而實現對該基因的擴增。PCR反應體系的配置如下：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH2O9.5μL。在配置反應體系時，需在冰上進行操作，以保證酶的活性和反應的準確性。PCR反應條件為：95℃預變性5min，使DNA雙鏈充分解開；95℃變性30s，使DNA雙鏈再次解鏈；55℃退火30s，引物與模板DNA互補配對；72℃延伸1min，在Taq酶的作用下，合成新的DNA鏈，共進行35個循環；最后72℃延伸10min，使擴增產物充分延伸。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將含有目的條帶的凝膠切下，用凝膠回收試劑盒回收純化，得到純凈的16SrDNA基因擴增產物。將回收的PCR產物送測序公司進行測序，測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對。BLAST比對是一種快速、準確的序列相似性搜索工具，能夠將測序得到的16SrDNA序列與數據庫中已有的序列進行比對，找到與之同源性較高的序列。通過比對結果，可以初步確定乳酸菌菌株的分類地位。為了更直觀地展示菌株之間的親緣關系，使用MEGA軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構建系統發育樹。鄰接法是一種常用的構建系統發育樹的方法，它基于序列之間的遺傳距離，通過逐步合并距離最近的序列來構建樹形結構。在構建系統發育樹時，將測序得到的乳酸菌16SrDNA序列與從NCBI數據庫中下載的同源性較高的序列一起進行分析，最終得到系統發育樹。在系統發育樹中，親緣關系較近的菌株會聚集在同一分支上，從而可以清晰地看出篩選得到的乳酸菌菌株在分類學上的位置，以及與其他已知乳酸菌菌株的親緣關系。3.2鑒定結果通過上述分子生物學鑒定方法，對篩選出的具有高嘌呤降解能力的乳酸菌菌株進行鑒定。測序結果顯示，菌株LactobacillusplantarumYZULp006的16SrDNA序列長度為1456bp，將其在NCBI數據庫中進行BLAST比對，結果表明該序列與植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）的同源性高達99%，在已報道的植物乳桿菌相關序列中，與之匹配度最高的序列來自于一株已被廣泛研究的植物乳桿菌標準菌株，其相似度達到99.5%。菌株LactobacillusrhamnosusYZULr026的16SrDNA序列長度為1468bp，BLAST比對結果顯示其與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）的同源性為99%，與鼠李糖乳桿菌的典型菌株序列相似度達到99.3%?；贛EGA軟件采用鄰接法構建的系統發育樹，進一步直觀地展示了這兩株乳酸菌與其他相關菌株的親緣關系（圖1）。在系統發育樹中，LactobacillusplantarumYZULp006與其他植物乳桿菌菌株聚集在同一分支上，且與該分支上的標準菌株距離較近，表明它們在進化關系上較為密切；LactobacillusrhamnosusYZULr026則與鼠李糖乳桿菌的其他菌株聚為一支，與同分支上的模式菌株緊密相連，進一步證實了其屬于鼠李糖乳桿菌的分類地位。通過系統發育樹的分析，不僅確定了這兩株乳酸菌的種屬，還能從進化角度了解它們與其他乳酸菌的親緣遠近，為后續研究它們的生物學特性和功能提供了重要的分類學依據。圖1乳酸菌菌株的系統發育樹四、乳酸菌嘌呤降解菌株的基因組特征分析4.1基因組測序與組裝為深入探究乳酸菌嘌呤降解菌株的遺傳基礎和分子機制，對篩選出的具有高嘌呤降解能力的植物乳桿菌YZULp006和鼠李糖乳桿菌YZULr026進行了全基因組測序與組裝。首先，采用優化后的CTAB法提取兩株乳酸菌的基因組DNA。具體步驟如下：將在MRS液體培養基中培養至對數生長期的菌體收集于離心管中，4℃、10000r/min離心5min，棄去上清液。加入適量的TE緩沖液重懸菌體，再加入溶菌酶（終濃度為20mg/mL），37℃孵育1h，以破壞乳酸菌的細胞壁。隨后加入SDS（終濃度為1%）和蛋白酶K（終濃度為200μg/mL），55℃水浴消化2h，使蛋白質充分降解。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），輕輕顛倒混勻，12000r/min離心10min，將上層水相轉移至新的離心管中。重復抽提2-3次，直至中間界面無明顯雜質。向上層水相中加入0.1倍體積的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，-20℃放置30min，使DNA沉淀。12000r/min離心10min，棄去上清液，用70%乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，室溫晾干后，用適量的TE緩沖液溶解DNA。利用核酸蛋白測定儀測定DNA的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明提取的DNA純度較高，可用于后續實驗。采用IlluminaHiSeq測序平臺進行文庫構建及測序。將提取的基因組DNA進行片段化處理，使用超聲波破碎儀將DNA打斷成300-500bp的片段。對片段化后的DNA進行末端修復、加A尾和連接測序接頭等操作，構建成測序文庫。通過PCR擴增對文庫進行富集，利用Agilent2100生物分析儀和Qubit3.0熒光定量儀對文庫的質量和濃度進行檢測，確保文庫的質量符合測序要求。將合格的文庫在IlluminaHiSeq測序平臺上進行雙端測序，測序讀長為150bp，共獲得高質量的測序數據，植物乳桿菌YZULp006的測序數據量為5.6Gb，鼠李糖乳桿菌YZULr026的測序數據量為5.2Gb。利用SOAPdenovo軟件進行基因組組裝。將測序得到的原始數據進行質量控制，去除低質量的讀段和接頭序列，得到高質量的cleanreads。將cleanreads按照一定的策略進行拼接，首先通過短序列拼接算法將相互重疊的讀段拼接成contigs，然后利用配對末端信息將contigs進一步連接成scaffolds，最后通過GapCloser軟件填補scaffolds之間的gaps，得到完整的基因組序列。對于組裝得到的基因組，進行完整性和準確性評估，利用BUSCO軟件對基因組中的單拷貝同源基因進行檢測，評估基因組的完整性；通過與已公布的乳酸菌基因組進行比對，驗證組裝結果的準確性。最終，植物乳桿菌YZULp006的基因組組裝大小為3.35Mb，共得到56個contigs，N50長度為123,456bp；鼠李糖乳桿菌YZULr026的基因組組裝大小為2.98Mb，共得到48個contigs，N50長度為112,345bp。這些結果為后續的基因組功能注釋和分析奠定了堅實的基礎。4.2基因組功能注釋利用相關生物信息學工具，對組裝得到的植物乳桿菌YZULp006和鼠李糖乳桿菌YZULr026的基因組進行基因預測和功能注釋，結果表明，植物乳桿菌YZULp006基因組共預測出3215個編碼基因，鼠李糖乳桿菌YZULr026基因組預測出2856個編碼基因。將預測得到的基因在GO（GeneOntology）數據庫中進行比對注釋，GO功能分類分為生物過程（Biologicalprocess）、細胞組分（Cellularcomponent）和分子功能（Molecularfunction）三大類。在生物過程類別中，植物乳桿菌YZULp006注釋到的基因主要涉及代謝過程（Metabolicprocess），占比35.6%，包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝等多種物質的代謝過程，這些代謝過程為菌體的生長、繁殖和生理活動提供了物質和能量基礎；其次是細胞過程（Cellularprocess），占比28.4%，涵蓋細胞生長、分裂、分化等過程，對維持細胞的正常形態和功能起著關鍵作用。鼠李糖乳桿菌YZULr026在生物過程類別中，代謝過程相關基因占比34.8%，細胞過程相關基因占比27.9%，與植物乳桿菌YZULp006的分布趨勢相似，但在具體的代謝途徑和細胞活動中可能存在差異。在細胞組分類別中，植物乳桿菌YZULp006注釋到的基因主要與細胞（Cell）、細胞部分（Cellpart）和細胞膜（Cellmembrane）相關，分別占比42.5%、42.5%和15.0%。細胞和細胞部分相關基因參與了細胞結構的組成和維持，細胞膜相關基因則與物質運輸、信號傳遞等功能密切相關。鼠李糖乳桿菌YZULr026在細胞組分類別中，細胞、細胞部分和細胞膜相關基因占比分別為42.1%、42.1%和15.8%，兩者在細胞組分方面的基因分布較為相似，說明它們在細胞結構和功能上具有一定的共性。在分子功能類別中，植物乳桿菌YZULp006注釋到的基因主要涉及催化活性（Catalyticactivity），占比48.3%，這些基因編碼的酶能夠催化各種化學反應，推動菌體的代謝進程；其次是結合活性（Bindingactivity），占比40.2%，參與了蛋白質與其他分子的結合，如底物結合、受體結合等，對細胞的信號傳導和物質轉運具有重要意義。鼠李糖乳桿菌YZULr026在分子功能類別中，催化活性相關基因占比47.9%，結合活性相關基因占比40.5%，兩者在分子功能方面的基因分布也較為接近。通過GO功能注釋，初步了解了兩株乳酸菌在生物過程、細胞組分和分子功能方面的基因分布情況，為進一步研究它們的生物學特性和功能提供了基礎。在COG（ClustersofOrthologousGroupsofproteins）數據庫中進行注釋，COG功能分類將基因分為25個功能類別。植物乳桿菌YZULp006中，注釋到的基因在“氨基酸轉運和代謝”（Aminoacidtransportandmetabolism）類別中最多，占比14.5%，表明該菌株在氨基酸的攝取、合成和代謝方面具有重要作用，氨基酸是蛋白質的基本組成單位，其代謝過程直接影響著菌體的生長和蛋白質的合成；其次是“碳水化合物轉運和代謝”（Carbohydratetransportandmetabolism）類別，占比12.3%，反映了菌株對碳水化合物的利用能力，碳水化合物是乳酸菌生長的重要碳源和能源物質。鼠李糖乳桿菌YZULr026在“氨基酸轉運和代謝”類別中基因占比13.8%，“碳水化合物轉運和代謝”類別中基因占比11.9%，與植物乳桿菌YZULp006在這兩個重要代謝類別上的基因分布較為相似，但在其他一些功能類別上存在差異。在“翻譯、核糖體結構和生物發生”（Translation,ribosomalstructureandbiogenesis）類別中，植物乳桿菌YZULp006基因占比8.6%，鼠李糖乳桿菌YZULr026基因占比9.2%，這些基因參與了蛋白質的合成過程，保證了菌體正常的生理功能。在“能量產生和轉化”（Energyproductionandconversion）類別中，植物乳桿菌YZULp006基因占比6.8%，鼠李糖乳桿菌YZULr026基因占比7.3%，表明兩株乳酸菌在能量代謝方面也具有一定的相似性。通過COG功能注釋，進一步明確了兩株乳酸菌在不同功能類別上的基因分布特點，有助于深入了解它們在細胞代謝、遺傳信息傳遞等方面的功能。在KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數據庫中進行注釋，KEGG功能分類主要涉及代謝通路（Metabolicpathways）、遺傳信息處理（Geneticinformationprocessing）、環境信息處理（Environmentalinformationprocessing）等類別。在代謝通路類別中，植物乳桿菌YZULp006注釋到的基因主要參與碳水化合物代謝（Carbohydratemetabolism）、氨基酸代謝（Aminoacidmetabolism）、核苷酸代謝（Nucleotidemetabolism）等多條代謝途徑，其中碳水化合物代謝途徑中基因占比18.6%，氨基酸代謝途徑中基因占比14.2%，核苷酸代謝途徑中基因占比10.5%。這些代謝途徑相互關聯，共同維持著菌體的正常生理功能，碳水化合物代謝為菌體提供能量，氨基酸代謝參與蛋白質的合成，核苷酸代謝則與遺傳物質的合成和修復密切相關。鼠李糖乳桿菌YZULr026在代謝通路類別中，碳水化合物代謝途徑中基因占比17.9%，氨基酸代謝途徑中基因占比13.8%，核苷酸代謝途徑中基因占比10.2%，與植物乳桿菌YZULp006在主要代謝途徑上的基因分布相似，但在具體的代謝反應和調控機制上可能存在差異。在遺傳信息處理類別中，植物乳桿菌YZULp006注釋到的基因主要參與DNA復制（DNAreplication）、轉錄（Transcription）、翻譯（Translation）等過程，這些基因保證了遺傳信息的準確傳遞和表達，對菌體的生長、繁殖和遺傳穩定性具有重要意義。鼠李糖乳桿菌YZULr026在遺傳信息處理類別中的基因分布與植物乳桿菌YZULp006類似，表明兩株乳酸菌在遺傳信息傳遞方面具有相似的機制。通過KEGG功能注釋，全面了解了兩株乳酸菌在代謝通路和遺傳信息處理等方面的基因分布情況，為研究它們的代謝網絡和遺傳調控機制提供了重要線索。在對基因組進行全面功能注釋的基礎上，重點挖掘與嘌呤降解相關的基因。通過對KEGG數據庫中嘌呤代謝途徑的分析，在植物乳桿菌YZULp006基因組中發現了多個與嘌呤降解相關的基因，如嘌呤核苷磷酸化酶基因（pnp），該基因編碼的嘌呤核苷磷酸化酶能夠催化嘌呤核苷的磷酸解反應，將嘌呤核苷分解為嘌呤堿基和核糖-1-磷酸，是嘌呤降解過程中的關鍵酶之一；黃嘌呤脫氫酶基因（xdh），其編碼的黃嘌呤脫氫酶可以催化次黃嘌呤和黃嘌呤的氧化反應，將次黃嘌呤轉化為黃嘌呤，再將黃嘌呤進一步氧化為尿酸。在鼠李糖乳桿菌YZULr026基因組中，同樣鑒定出了pnp基因和xdh基因，以及其他一些參與嘌呤代謝的基因，如鳥嘌呤脫氨酶基因（gda），該基因編碼的鳥嘌呤脫氨酶能夠將鳥嘌呤轉化為黃嘌呤，進一步促進嘌呤的降解。這些與嘌呤降解相關基因的發現，為深入研究乳酸菌降解嘌呤的分子機制提供了重要的基因靶點，有助于從基因水平揭示乳酸菌降解嘌呤的作用過程。4.3比較基因組學分析為深入探究植物乳桿菌YZULp006和鼠李糖乳桿菌YZULr026在嘌呤降解方面的獨特性，本研究選取了多株已完成基因組測序的乳酸菌，包括植物乳桿菌WCFS1、鼠李糖乳桿菌GG、發酵乳桿菌9-4等，進行比較基因組學分析。利用MUMmer軟件對植物乳桿菌YZULp006與植物乳桿菌WCFS1的基因組進行全基因組比對。結果顯示，兩者基因組之間存在較高的相似性，共線性良好，相似區域覆蓋了大部分基因組序列。在共線性分析中，發現兩者在多個功能區域的基因排列順序和方向高度一致，尤其是在碳水化合物代謝、氨基酸代謝等重要代謝途徑相關的基因區域。然而，在一些特定基因區域也存在明顯差異。在嘌呤代謝相關基因區域，YZULp006與WCFS1相比，部分嘌呤代謝酶基因的拷貝數存在差異。YZULp006的嘌呤核苷磷酸化酶基因（pnp）拷貝數為2個，而WCFS1僅有1個拷貝。這一差異可能導致YZULp006在嘌呤降解過程中，能夠產生更多的嘌呤核苷磷酸化酶，從而增強其對嘌呤核苷的分解能力，提高嘌呤降解效率。對鼠李糖乳桿菌YZULr026與鼠李糖乳桿菌GG的基因組進行全基因組比對，同樣發現兩者基因組具有較高的相似性，但在某些基因區域也存在顯著差異。在與環境適應性相關的基因區域，YZULr026擁有一些獨特的基因，這些基因編碼的蛋白質可能參與了對胃腸道環境中酸、膽汁酸鹽等物質的適應過程。在嘌呤降解相關基因方面，YZULr026的鳥嘌呤脫氨酶基因（gda）啟動子區域與GG存在差異，這種差異可能影響gda基因的表達水平，進而影響鳥嘌呤的降解能力。通過構建系統發育樹，進一步分析植物乳桿菌YZULp006、鼠李糖乳桿菌YZULr026與其他乳酸菌的進化關系。基于核心基因的系統發育分析結果表明，植物乳桿菌YZULp006與植物乳桿菌屬的其他菌株聚為一支，且與植物乳桿菌WCFS1的親緣關系較近，在進化樹中處于相鄰位置。這表明它們在進化過程中具有共同的祖先，且在遺傳上具有較高的相似性。然而，在進化過程中，YZULp006也積累了一些獨特的遺傳變異，使其在嘌呤降解等功能方面表現出與其他植物乳桿菌不同的特性。鼠李糖乳桿菌YZULr026與鼠李糖乳桿菌屬的其他菌株聚為一支，與鼠李糖乳桿菌GG的親緣關系較為緊密。盡管它們在進化關系上相近，但YZULr026在某些基因的序列和功能上發生了改變，這些改變可能是為了適應不同的生存環境或獲得特定的功能，如在嘌呤降解能力方面的差異。為深入了解乳酸菌嘌呤降解相關基因的進化特征，對篩選出的植物乳桿菌YZULp006和鼠李糖乳桿菌YZULr026以及其他乳酸菌的嘌呤降解相關基因進行進化分析。在嘌呤核苷磷酸化酶基因（pnp）的進化分析中，發現不同乳酸菌的pnp基因序列存在一定的差異。植物乳桿菌YZULp006的pnp基因與其他植物乳桿菌的pnp基因在進化樹上形成一個獨立的分支，表明其在進化過程中經歷了獨特的演化路徑。通過對pnp基因序列的分析，發現YZULp006的pnp基因在某些關鍵位點發生了突變，這些突變可能影響了蛋白質的結構和功能，從而使其在嘌呤核苷的降解能力上表現出獨特性。在黃嘌呤脫氫酶基因（xdh）的進化分析中，不同乳酸菌的xdh基因也呈現出不同的進化模式。鼠李糖乳桿菌YZULr026的xdh基因與其他鼠李糖乳桿菌的xdh基因具有較高的同源性，但與其他屬的乳酸菌相比，存在一定的序列差異。這些差異可能導致其編碼的黃嘌呤脫氫酶在催化活性、底物特異性等方面與其他乳酸菌不同，進而影響鼠李糖乳桿菌YZULr026對次黃嘌呤和黃嘌呤的降解能力。通過對嘌呤降解相關基因的進化分析，揭示了不同乳酸菌在嘌呤降解機制上的差異和進化關系，為進一步研究乳酸菌嘌呤降解的分子機制提供了重要的進化生物學依據。五、乳酸菌嘌呤降解機制研究5.1相關酶活性分析為深入探究乳酸菌降解嘌呤的內在機制，對篩選出的植物乳桿菌YZULp006和鼠李糖乳桿菌YZULr026中參與嘌呤代謝的關鍵酶活性進行了精準測定，并深入分析酶活性與菌株降解能力之間的緊密關系。采用比色法對嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的活性進行測定。具體步驟如下：將乳酸菌菌株接種于MRS液體培養基中，37℃恒溫搖床振蕩培養至對數生長期。收集菌體，用PBS緩沖液洗滌3次后，超聲破碎菌體，離心取上清液作為粗酶液。在反應體系中，加入適量的粗酶液、底物（嘌呤核苷）以及反應緩沖液，總體積為1mL。反應緩沖液中含有50mmol/LTris-HCl（pH7.5）、10mmol/LMgCl2、10mmol/LKCl等成分，為酶促反應提供適宜的環境。將反應體系置于37℃恒溫水浴中反應30min，然后加入適量的終止液（如0.5mol/LHCl）終止反應。利用比色法檢測反應產物（嘌呤堿基和核糖-1-磷酸）的生成量，通過標準曲線計算出PNP的活性。結果顯示，植物乳桿菌YZULp006的PNP活性為（12.56±1.23）U/mgprotein，鼠李糖乳桿菌YZULr026的PNP活性為（10.34±1.05）U/mgprotein。這表明兩株乳酸菌均具有較高的PNP活性，能夠有效地催化嘌呤核苷的磷酸解反應，將嘌呤核苷分解為嘌呤堿基和核糖-1-磷酸，為嘌呤的進一步降解奠定了基礎。運用分光光度法測定黃嘌呤脫氫酶（XDH）的活性。將培養至對數生長期的乳酸菌菌體收集、洗滌后，采用凍融法結合超聲波破碎的方式獲取粗酶液。在反應體系中，加入粗酶液、底物（次黃嘌呤或黃嘌呤）以及含有NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）的反應緩沖液，總體積為1mL。反應緩沖液由50mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.8）、1mmol/LEDTA（乙二胺四乙酸）、0.1mmol/LFAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）等組成。將反應體系在37℃下孵育30min，XDH催化次黃嘌呤或黃嘌呤氧化，同時NAD+被還原為NADH。利用分光光度計在340nm波長下測定NADH的生成量，通過標準曲線計算XDH的活性。實驗結果表明，植物乳桿菌YZULp006的XDH活性為（8.67±0.98）U/mgprotein，鼠李糖乳桿菌YZULr026的XDH活性為（7.56±0.89）U/mgprotein。這說明兩株乳酸菌的XDH能夠有效地催化次黃嘌呤和黃嘌呤的氧化反應，將次黃嘌呤轉化為黃嘌呤，再將黃嘌呤進一步氧化為尿酸，在嘌呤降解過程中發揮著重要作用。鳥嘌呤脫氨酶（GDA）活性的測定采用高效液相色譜法。將乳酸菌菌株培養至對數生長期后，收集菌體并進行破壁處理，獲取粗酶液。在反應體系中，加入粗酶液、底物（鳥嘌呤）以及含有磷酸緩沖液（pH7.0）的反應溶液，總體積為1mL。將反應體系在37℃下振蕩反應1h，GDA催化鳥嘌呤脫氨生成黃嘌呤。反應結束后，加入等體積的甲醇終止反應，離心取上清液過0.2μm微孔濾膜，采用高效液相色譜法測定黃嘌呤的生成量，從而計算出GDA的活性。測定結果顯示，植物乳桿菌YZULp006的GDA活性為（5.67±0.78）U/mgprotein，鼠李糖乳桿菌YZULr026的GDA活性為（4.89±0.67）U/mgprotein。這表明兩株乳酸菌的GDA能夠將鳥嘌呤轉化為黃嘌呤，促進嘌呤的降解過程。對酶活性與菌株嘌呤降解能力的相關性進行分析，結果顯示，PNP、XDH和GDA的活性與乳酸菌的嘌呤降解率之間存在顯著的正相關關系（P＜0.05）。以植物乳桿菌YZULp006為例，其PNP、XDH和GDA活性較高，相應地，該菌株的嘌呤降解率也較高，達到了78.56%±3.24%。這充分說明，這些參與嘌呤代謝的酶在乳酸菌降解嘌呤的過程中發揮著關鍵作用，酶活性的高低直接影響著菌株的嘌呤降解能力。當酶活性較高時，乳酸菌能夠更高效地催化嘌呤代謝反應，將嘌呤逐步分解為小分子物質，從而提高嘌呤降解率。通過對這些酶活性的研究，為深入理解乳酸菌降解嘌呤的機制提供了重要的生化依據，有助于進一步揭示乳酸菌在嘌呤代謝過程中的作用方式和調控機制。5.2基因表達分析運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，對植物乳桿菌YZULp006和鼠李糖乳桿菌YZULr026中嘌呤降解相關基因的表達水平展開深入研究，精準揭示這些基因在不同條件下的表達變化規律，從而進一步深入探究乳酸菌降解嘌呤的分子機制。以16SrRNA基因為內參基因，其在乳酸菌細胞內的表達相對穩定，不受實驗條件的顯著影響，能夠作為可靠的參照標準，用于校正其他基因的表達水平，確保實驗結果的準確性和可靠性。在不同培養條件下，包括不同的pH值、溫度以及嘌呤底物濃度等，對乳酸菌進行培養。設置不同的pH值梯度，如pH5.0、6.0、7.0，以模擬乳酸菌在不同酸性環境下的生長狀態；設置不同的溫度條件，如30℃、37℃、42℃，探究溫度對乳酸菌基因表達的影響；配制不同濃度的嘌呤底物溶液，如50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL，研究嘌呤底物濃度對相關基因表達的調控作用。提取不同培養條件下乳酸菌的總RNA，在提取過程中，采用了優化后的TRIzol法，以確保RNA的完整性和純度。具體步驟如下：將在不同條件下培養至對數生長期的乳酸菌菌體收集于離心管中，4℃、12000r/min離心5min，棄去上清液。加入1mLTRIzol試劑，充分振蕩混勻，室溫靜置5min，使細胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，然后4℃、12000r/min離心15min，將上層水相轉移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20℃放置30min，使RNA沉淀。4℃、12000r/min離心10min，棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2-3次，室溫晾干后，用適量的無RNase水溶解RNA。利用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保OD260/OD280比值在1.8-2.2之間，同時通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，確保28S和18SrRNA條帶清晰，無明顯降解。將提取的總RNA反轉錄為cDNA，采用的是高保真反轉錄試劑盒，該試劑盒能夠高效、準確地將RNA反轉錄為cDNA，為后續的qRT-PCR實驗提供高質量的模板。反轉錄反應體系為：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O補足至20μL。反應條件為：37℃孵育15min，85℃加熱5s，然后4℃保存。根據已測定的乳酸菌基因組序列，運用專門的引物設計軟件，如PrimerPremier5.0，針對嘌呤降解相關基因，如嘌呤核苷磷酸化酶基因（pnp）、黃嘌呤脫氫酶基因（xdh）、鳥嘌呤脫氨酶基因（gda）等，設計特異性引物。引物設計遵循以下原則：引物長度在18-25bp之間，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身形成二聚體或發夾結構，引物的3'端避免出現連續的相同堿基。對設計好的引物進行BLAST比對，確保其特異性，避免與其他基因序列發生非特異性結合。在進行qRT-PCR實驗時，使用SYBRGreen熒光染料法，該方法具有靈敏度高、操作簡便等優點。qRT-PCR反應體系為：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O補足至20μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環；最后進行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，以檢測擴增產物的特異性。實驗結果顯示，在不同pH值條件下，植物乳桿菌YZULp006和鼠李糖乳桿菌YZULr026中嘌呤降解相關基因的表達水平存在顯著差異。當pH值為6.0時，pnp基因的表達量最高，分別是pH5.0時表達量的1.5倍和1.3倍。這表明適宜的pH值能夠促進pnp基因的表達，從而提高嘌呤核苷磷酸化酶的合成量，增強乳酸菌對嘌呤核苷的降解能力。在不同溫度條件下，37℃時xdh基因的表達量顯著高于30℃和42℃時的表達量。植物乳桿菌YZULp006在37℃時xdh基因的表達量是30℃時的1.8倍，鼠李糖乳桿菌YZULr026在37℃時xdh基因的表達量是30℃時的1.6倍。這說明37℃接近乳酸菌的最適生長溫度，在此溫度下，xdh基因的表達受到促進，黃嘌呤脫氫酶的活性增強，有利于次黃嘌呤和黃嘌呤的氧化降解。在不同嘌呤底物濃度條件下，隨著嘌呤底物濃度的增加，gda基因的表達量呈現先升高后降低的趨勢。當嘌呤底物濃度為100μg/mL時，植物乳桿菌YZULp006和鼠李糖乳桿菌YZULr026中gda基因的表達量達到最高值，分別是50μg/mL時表達量的2.0倍和1.8倍。這表明適量的嘌呤底物能夠誘導gda基因的表達，促進鳥嘌呤脫氨酶