第4節

蛋白質工程的原理和應用賀老師第3章基因工程對胰島素的改造從動物體內提取胰島素的量十分有限，每100kg豬或牛的胰腺只能提取4～5g胰島素，提取效率低且成本高昂。問題1：結合必修2所學中心法則的有關知識，寫出胰島素的合成過程。【資料1】1978年，科學家們利用基因工程技術，生產出首個與人胰島素序列完全相同的胰島素產品。1982年，第1種重組人胰島素產品獲得批準。人胰島素逐漸取代動物胰島素被應用于臨床。胰島素的三維結構胰島素只有形成特定的空間結構，才能具有降血糖的功能。結構與功能相適應翻譯行使生物功能特定氨基酸序列的多肽鏈折疊具有高級結構的蛋白質胰島素基因轉錄mRNA對胰島素的改造動物胰島素人胰島素（基因工程）將一種生物的基因轉移到另一種生物體內，后者可以產生它本不能產生的

，進而表現出新性狀。2、基因工程的不足：在原則上只能生產自然界

。已存在的蛋白質1、基因工程的實質：（教材P93）對胰島素的改造動物胰島素人胰島素（基因工程）蛋白質【資料2】天然胰島素見效慢，是因為天然胰島素制劑往往以二聚體或六聚體的形式存在，需要經歷長時間才能解離為單體，發揮作用。3、天然蛋白質的不足：天然蛋白質的

符合

生存的需要，卻不一定完全符合

的需要。結構和功能對胰島素的改造特定物種人類生產和生活六聚體二聚體單體【資料3】科學家通過研究胰島素的三維結構發現，胰島素B鏈第20~29位的氨基酸是胰島素分子形成多聚體的關鍵區域，若將第28位的脯氨酸替換為天冬氨酸，或者將它與第29位的賴氨酸交換位置，可以有效抑制胰島素的聚合，從而獲得胰島素單體。胰島素的分子結構示意圖脯氨酸天冬氨酸問題2：胰島素為什么會發生聚合？

如何有效抑制胰島素的聚合，使胰島素以單體的形式存在?對胰島素的改造六聚體單體方案1：直接改造胰島素上的氨基酸脯氨酸天冬氨酸①蛋白質的空間結構十分復雜，直接改造難度大，DNA為雙螺旋結構；②蛋白質是由基因編碼的，改造了基因可以間接改造蛋白質；③基因可以遺傳，蛋白質無法遺傳；問題3：如何將第28位的脯氨酸替換為天冬氨酸?

你能想到幾種方案？對胰島素的改造選方案2方案2：改造胰島素基因

如果你是科學家，這兩種方案你會選擇哪種？為什么？對胰島素的改造問題4：如何改造胰島素基因，使其編碼蛋白的第28位氨基酸由脯氨酸變為天冬氨酸？六聚體單體脯氨酸天冬氨酸GGGCCCCCCCTGGACGAC基因mRNA氨基酸速效胰島素胰島素脯氨酸天冬氨酸改造蛋白質的思路：逆中心法則，與天然蛋白質合成的過程相反①預期蛋白質的功能②設計預期的蛋白質結構③推測應有的氨基酸序列④找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因⑤獲得所需蛋白質天然胰島素B鏈部分氨基酸序列：酪氨酸蘇氨酸脯氨酸賴氨酸蘇氨酸設計后胰島素B鏈部分氨基酸序列：B28B29酪氨酸蘇氨酸賴氨酸脯氨酸蘇氨酸B28B29mRNAmRNA由于人胰島素B鏈基因較短，按照設計好的編碼序列進行化學合成，是獲取這種突變型目的基因的首選方法。翻譯翻譯轉錄天然胰島素對應的部分基因：改造后應得到的基因序列：轉錄對胰島素的改造問題5：確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因？GGGCCCCTGGAC基因①定點突變技術利用重疊延伸PCR技術進行定點突變：②人工合成定點突變——環狀質粒定點突變技術引物突變DNA聚合酶DNA連接酶受體細胞轉錄突變項目內容條件原料酶引物操作方法先通過

擴增已獲得定點突變的基因，再通過基因工程將突變基因導入受體細胞，經過

和

合成所需的蛋白質。結果后代中

為誘變的DNA分子適用范圍空間結構完全清楚的蛋白質，對其基因進行堿基的

等特點4種脫氧核苷酸DNA聚合酶和DNA連接酶含突變位點的DNA分子片段有目的性和針對性PCR轉錄翻譯一半替換對胰島素的改造的基本思路氨基酸序列新胰島素基因改造降低胰島素的聚合作用預期功能三維結構推測B28位脯氨酸替換為天冬氨酸預期結構轉錄mRNA折疊行使翻譯多肽鏈有效抑制胰島素的聚合設計功能①定點突變技術②人工合成六聚體單體3.水蛭素是一種蛋白質，可用于預防和治療血栓，但在治療過程中發現其抗凝血活性低。研究人員欲提高水蛭素抗凝血活性，正確的操作步驟是(

)①確定影響活性的氨基酸序列②分析水蛭素的空間結構，找到影響其活性的結構域③推測需要替換的氨基酸序列④構建表達載體，使其在受體細胞中表達⑤PCR技術獲得改造后的水蛭素基因⑥確定基因中的堿基序列A.②①③⑤⑥④

B.②③⑥①⑤④C.②①③⑥⑤④

D.①②③④⑤⑥大本p76①預期蛋白質的功能②設計預期的蛋白質結構③推測應有的氨基酸序列④找到并改造相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因⑤獲得所需蛋白質C蛋白質工程

蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類生產和生活的需求。（p93）①基礎：_______________________________________________②途經：___________________③操作對象：______④目的：_______________________________________________________________⑤理論和技術：蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系改造或合成基因改造現有蛋白質或制造一種新的蛋白質，以滿足人類生產和生活的需求基因(易錯點)借助計算機通過X射線衍射技術基因的定點突變技術晶體學技術又稱第二代基因工程獲得蛋白質晶體：分析晶體的結構：構建蛋白質三維結構圖:堿基的替換：由計算機建立的血紅蛋白三維結構模型利用X射線晶體衍射等，充分了解胰島素的空間結構。討論1.怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列？請把相應的堿基序列寫出來。某多肽鏈的一段氨基酸序列是：思考·討論p94GCUGCCGCAGCG

UGGAAAAAG丙氨酸…色氨酸賴氨酸谷氨酸苯丙氨酸…UUUUUCGAAGAG查密碼子表mRNA序列脫氧核苷酸序列---蛋白質工程基本思路的應用某多肽鏈的一段氨基酸序列是：思考·討論討論：1.怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列？請把相應的堿基序列寫出來。2.確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因？GCUGCCGCAGCGUGGAAAAAG丙氨酸…色氨酸賴氨酸谷氨酸苯丙氨酸…UUUUUCGAAGAG由于密碼子具有簡并性，一個氨基酸由一個或多個密碼子決定。①人工合成目的基因。②從基因文庫中獲取目的基因后利用定點突變技術對基因進行改造。4×1×2×2×2=32種mRNA的序列：脫氧核苷酸（基因）的序列：有32種思考：基因工程和蛋白質工程的操作對象都是基因，如何辨別一個操作是基因工程還是蛋白質工程？是否形成新的基因蛋白質工程是否對原有基因進行改造是否是否蛋白質工程基因工程看蛋白質看基因是否為天然蛋白質是否蛋白質工程基因工程蛋白質工程是在基因工程基礎上延伸出來的第二代基因工程。天然干擾素不易保存預期結構一個半胱氨酸變成絲氨酸新干擾素基因mRNA延長保存時間氨基酸替換改造轉錄折疊預期功能行使功能設計結構推測序列翻譯多肽鏈在-70℃下可以保存半年蛋白質工程的應用1醫藥工業方面自然蛋白質的不足：干擾素是一種具有干擾病毒復制作用的糖蛋白，在臨床上被廣泛用于治療病毒感染性疾病，但在體外保存卻相當困難。實例1：通過改造

，延長干擾素體外保存時間干擾素基因蛋白質工程的應用自然蛋白質的不足：小鼠單克隆抗體會使人體產生免疫反應，從而導致治療效果大大降低。1醫藥工業方面實例2：制備人鼠嵌合抗體【蛋白質工程】通過改造_____，將小鼠抗體上結合抗原的區域（即可變區）“嫁接”到人的抗體（即恒定區）上，經過這樣改造的抗體誘發

的強度就會降低很多。思考：該過程能通過基因定點突變技術改造基因實現嗎？不能；需要通過基因拼接完成。負責識別和結合抗原在同一種動物中，恒定區較為相似。免疫反應基因蛋白質工程被廣泛用于

或

。蛋白質工程的應用【資料】枯草桿菌蛋白酶具有水解蛋白質的作用，因此常被用于洗滌劑工業、絲綢工業等。利用蛋白質工程獲得的該酶的突變體已有上百種，從中可能篩選出一些符合工業化生產需求的突變體，從而提高這種酶的使用價值。改進酶的性能開發新的工業用酶2在其他工業方面水解蛋白質，常被用于洗滌劑工業、絲綢工業等。賴氨酸合成調控達到一定濃度兩種酶的活性352位的蘇氨酸變成異亮氨酸二氫吡啶二羧酸合成酶天冬氨酸激酶+104位的天冬酰胺變成異亮氨酸賴氨酸含量抑制提高提高限制提高提高5倍提高2倍蛋白質工程的應用3在農業方面②改造微生物

；【資料】科學家利用蛋白質工程的思路來設計優良微生物農藥,通過改造微生物蛋白質的結構，增強微生物防治病蟲害的效果。①改造某些

；【資料】科學家正在嘗試改造某些參與調控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加糧食的產量。參與調控光合作用的酶蛋白質結構蛋白質工程的應用3在農業方面伊維菌素伊維菌素是新型的廣譜、高效、低毒抗生素類抗寄生蟲藥蛋白質工程是一項難度很大的工程。由計算機建立的血紅蛋白三維結構模型科學家要設計出更加符合人類需要的蛋白質，還需要不斷地攻堅克難。隨著科技的深入發展，蛋白質工程將會給人類帶來更多的福祉。1.主要原因蛋白質發揮功能必須依賴正確的高級結構，而蛋白質的高級結構是十分復雜、難度很大的工程。2.前景展望蛋白質工程的應用4蛋白質工程的難點利用重疊延伸PCR技術進行定點突變：利用大引物PCR技術進行定點突變：異想天開

p95

能不能根據人類需要的蛋白質的結構，設計相應的基因，導入合適的宿主細胞中，讓宿主細胞生產人類所需要的蛋白質食品呢？理論上講可以，但目前還沒有真正成功的例子。主要原因是蛋白質的高級結構非常復雜，人類對大多數蛋白質的高級結構和蛋白質在生物體內如何行使功能了解得還不夠，很難設計出一個全新的而又具有功能的蛋白質。即使設計并獲得了一個全新的蛋白質，它的生理生化特性、用它生產的蛋白質食品的安全性等都需要長期深入的研究。蛋白質食品的工廠化生產想象圖1.蛋白質工程可以說是基因工程的延伸，判斷：(1)基因工程需要在分子水平對基因進行操作，蛋白質工程不需要對基因進行操作。（

）(2)蛋白質工程需要改變蛋白質分子的所有氨基酸序列。（

）(3)蛋白質工程可以改造酶，提高酶的熱穩定性。（

）√××一、概念檢測2.

蛋白質工程是在深入了解蛋白質分子的結構與功能關系的基礎上進行的，它最終要達到的目的是（

）

A.分析蛋白質的三維結構

B.研究蛋白質的氨基酸組成

C.獲取編碼蛋白質的基因序列信息

D.改造現有蛋白質或制造新的蛋白質，滿足人類的需求3.水蛭素是一種蛋白質，可用于預防和治療血栓。研究人員發現，用賴氨酸替換水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在這項替換研究中，目前可行的直接操作對象是（

）

A.基因

B.氨基酸C.多肽鏈

D.蛋白質DA一、概念檢測T4溶菌酶是一種重要的工業用酶，但是它在溫度較高時容易失去活性。為了提高T4溶菌酶的耐熱性，科學家首先對影響T4溶菌酶耐熱性的一些重要結構進行了研究。然后以此為依據對相關基因進行改造，使T4溶菌酶的第3位異亮氨酸變為半胱氨酸。于是，在該半胱氨酸與第97位的半胱氨酸之間形成了一個二硫鍵，T4溶菌酶的耐熱性得到了提高。1.這項工作屬于什么工程的范疇？2.在該實例中引起T4溶菌酶空間結構發生改變的根本原因是什么？3.如果要將該研究成果應用到生產實踐，還需要做哪些方面的工作？

蛋白質工程

二、拓展應用p96還需重新明確：該酶的耐受溫度范圍、催化反應的最適溫度、酶活力的大小等;需要建立規模化生產該酶的技術體系,評估生產成本等。根本原因：基因的堿基序列發生了變化。第3位上的異亮氨酸半胱氨酸與第97位的半胱氨酸形成-s-s-定點突變二、拓展應用④將連接產物導入大腸桿菌重組質粒空質粒導入空質粒導入了質粒的大腸桿菌才能存活也有其他連接產物導入重組質粒1.某動物體內含有研究者感興趣的目的基因，研究者欲將該基因導入大腸桿菌的質粒中保存。該質粒含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位點，其結構和簡單的操作步驟如下圖所示。

挑選白色菌落復習與提高p98請根據以上信息回答下列問題。（1）在第②步中,應怎樣選擇限制酶？（2）在第③步中，為了使質粒DNA與目的基因能連接，還需要在混合物中加入哪種物質？（3）選用含有AmpR和LacZ基因的質粒進行實驗有哪些優勢？（4）含有重組質粒的大腸桿菌菌落將呈現什么顏色？

為什么？相同的限制酶或切割能產生相同末端的限制酶DNA連接酶便于進行雙重篩選。AmpR

基因可用于檢測質粒是否導入了大腸桿菌，LacZ基因可以檢測導入的是否為空質粒。目的基因的插入破壞了LacZ基因，使其不能表達出B-半乳糖苷酶，底物X-gal不能被分解，因此菌落為白色。白色2.科學家將Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因通過逆轉錄病毒轉入小鼠成纖維細胞中，然后在培養ES細胞的培養基上培養這些細胞。2?3周后，這些細胞顯示出ES細胞的形態、具有活躍的分裂能力，它們就是iPS細胞。請回答下列問題。⑴在這個實驗過程中，逆轉錄病毒的作用是什么？載體，將外源基因（Oct3/4、Sox2、c-Myc和KIf4）送入小鼠成纖維細胞。①將轉入外源基因和沒有轉入外源基因的成纖維細