下調(diào)HOTAIR表達：解鎖結(jié)直腸癌及其癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的奧秘一、緒論1.1研究背景與意義結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均位居前列。在我國，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，結(jié)直腸癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。從2015年到2020年，我國結(jié)直腸癌的新發(fā)病例已從38.8萬例增加到了55.5萬例，正以每年7.4%的速度快速攀升，中國已成為全球結(jié)直腸癌年新發(fā)病例最多的國家。并且，結(jié)直腸腫瘤發(fā)病正呈現(xiàn)年輕化趨勢，青年人直腸癌比例比較高，約占10%-15%。結(jié)直腸癌不僅給患者帶來了身體上的痛苦和心理上的負擔(dān)，也給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。目前，結(jié)直腸癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。然而，由于結(jié)直腸癌的早期癥狀不明顯，很多患者在確診時已經(jīng)處于中晚期，錯過了最佳的治療時機。即使經(jīng)過積極的治療，仍有相當(dāng)一部分患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗和死亡。因此，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和方法，對于提高結(jié)直腸癌的治療效果和患者的生存率具有重要的意義。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對結(jié)直腸癌的發(fā)病機制有了更深入的認識。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（lncRNA）在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中發(fā)揮著重要的作用。lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，它們不編碼蛋白質(zhì)，但可以通過多種方式調(diào)控基因的表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）是一種重要的lncRNA，它位于人類第12號染色體HOXC12基因與HOXC11基因之間，長度為2158bp。越來越多的研究表明，HOTAIR在結(jié)直腸癌組織中的表達水平明顯高于正常組織，并且與結(jié)直腸癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。高表達的HOTAIR可以促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細胞凋亡，從而導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。相反，下調(diào)HOTAIR的表達可以抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進細胞凋亡，提高結(jié)直腸癌的治療效果。此外，癌干細胞（CSCs）是腫瘤組織中具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞亞群，它們在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥中起著關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中存在著一定比例的CSCs，它們具有高表達HOTAIR的特點。下調(diào)HOTAIR的表達是否可以影響結(jié)直腸癌CSCs的生物學(xué)特性，目前尚不清楚。因此，深入研究下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌及其癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響，不僅可以揭示HOTAIR在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點和方法，也可以為結(jié)直腸癌的精準(zhǔn)治療和個體化治療提供理論依據(jù)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，關(guān)于HOTAIR與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究起步較早。一些研究通過對大量結(jié)直腸癌患者組織樣本的檢測分析，發(fā)現(xiàn)HOTAIR在結(jié)直腸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，并且其表達量與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。如[具體文獻1]的研究中，對[X]例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和正常組織進行對比檢測，結(jié)果顯示腫瘤組織中HOTAIR的表達量是正常組織的[X]倍，且在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，HOTAIR的表達水平更高。進一步的細胞實驗表明，上調(diào)HOTAIR的表達能夠促進結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲能力，而下調(diào)HOTAIR則可抑制這些過程。在機制研究方面，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)HOTAIR可以通過與多梳抑制復(fù)合體2（PRC2）結(jié)合，介導(dǎo)其對靶基因的組蛋白修飾，從而影響基因的表達，促進腫瘤的發(fā)展。例如，HOTAIR/PRC2復(fù)合物能夠使E-鈣黏蛋白（E-cadherin）基因啟動子區(qū)域的組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3），導(dǎo)致E-cadherin表達下調(diào)，使細胞間黏附力下降，進而促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。國內(nèi)對于HOTAIR在結(jié)直腸癌中的研究也取得了不少成果。眾多研究同樣證實了HOTAIR在結(jié)直腸癌中的高表達現(xiàn)象，以及其與腫瘤惡性程度和預(yù)后的相關(guān)性。[具體文獻2]通過對[X]例中國結(jié)直腸癌患者的臨床標(biāo)本進行研究，發(fā)現(xiàn)HOTAIR高表達的患者5年生存率明顯低于低表達患者，表明HOTAIR可作為評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。在功能和機制研究上，國內(nèi)研究團隊發(fā)現(xiàn)HOTAIR還可以通過與其他分子相互作用，調(diào)控相關(guān)信號通路來影響結(jié)直腸癌細胞的生物學(xué)行為。比如，有研究表明HOTAIR可以與miR-[具體miRNA]相互作用，解除miR-[具體miRNA]對其靶基因的抑制作用，從而促進結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。然而，目前國內(nèi)外的研究仍存在一些不足之處。一方面，雖然已經(jīng)明確了HOTAIR在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，但對于其具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機制尚未完全闡明。例如，HOTAIR除了與已知的PRC2等復(fù)合物相互作用外，是否還能與其他未知的蛋白或分子形成復(fù)合物，共同參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，仍有待進一步探索。另一方面，針對下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌及其癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性影響的研究還相對較少，尤其是在體內(nèi)動物模型和臨床應(yīng)用方面的研究還不夠深入。現(xiàn)有的研究大多局限于細胞實驗，對于如何將下調(diào)HOTAIR表達的治療策略應(yīng)用于臨床實踐，還需要更多的體內(nèi)實驗和臨床試驗來驗證其有效性和安全性。此外，目前對于結(jié)直腸癌癌干細胞中HOTAIR的特異性調(diào)控機制以及如何精準(zhǔn)靶向癌干細胞中的HOTAIR，也缺乏深入的研究。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究將綜合運用多種研究方法，從細胞和動物水平深入探究下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌及其癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響。在細胞實驗方面，選取人結(jié)直腸癌細胞系LoVo細胞作為研究對象，針對HOTAIR編碼基因設(shè)計合成小發(fā)夾RNA（smallhairpinRNA），利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，構(gòu)建真核ShRNA表達載體，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至LoVo細胞，以降低HOTAIR表達水平。通過實時熒光定量PCR（QRT-PCR）檢測轉(zhuǎn)染后細胞中HOTAIR的表達量，驗證干擾效果。隨后，開展一系列細胞功能實驗，包括采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力，平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力，以及通過耐藥實驗檢測細胞對化療藥物的耐受性。在動物實驗方面，將構(gòu)建好的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株注射到裸鼠體內(nèi)，建立結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤模型。定期觀察裸鼠的生長狀態(tài)和腫瘤形成情況，測量腫瘤體積和重量，分析下調(diào)HOTAIR表達對腫瘤生長和致瘤性的影響。實驗結(jié)束后，對腫瘤組織進行病理學(xué)檢查和免疫組化分析，檢測相關(guān)蛋白的表達，進一步探究其作用機制。此外，還將采用免疫磁珠分選技術(shù)從結(jié)直腸癌細胞中分離出癌干細胞，對分選后的癌干細胞進行鑒定后，重復(fù)上述細胞功能實驗和動物實驗，研究下調(diào)HOTAIR表達對癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響。本研究在實驗設(shè)計和機制探索方面具有一定的創(chuàng)新之處。在實驗設(shè)計上，首次系統(tǒng)地從結(jié)直腸癌細胞及其癌干細胞兩個層面，全面研究下調(diào)HOTAIR表達對細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響。以往研究多集中于結(jié)直腸癌細胞，對癌干細胞的研究相對較少，本研究填補了這一領(lǐng)域在癌干細胞方面研究的不足。在機制探索方面，不僅關(guān)注HOTAIR對細胞生物學(xué)行為的直接影響，還深入探究其可能參與的信號通路和分子機制。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等技術(shù)檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子（如E-鈣黏蛋白、波形蛋白等）的表達變化，揭示HOTAIR是否通過調(diào)控EMT過程影響結(jié)直腸癌及其癌干細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，還將運用生物信息學(xué)分析方法，預(yù)測HOTAIR可能的作用靶點和相關(guān)信號通路，為后續(xù)的實驗驗證提供理論依據(jù)，有望發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控機制和潛在治療靶點。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1結(jié)直腸癌概述結(jié)直腸癌（ColorectalCancer,CRC）是一種發(fā)生在結(jié)腸或直腸部位的惡性腫瘤，屬于大腸癌的范疇，其發(fā)病機制極為復(fù)雜，是由多種因素共同作用的結(jié)果。遺傳因素在結(jié)直腸癌的發(fā)病中扮演著重要角色，一些特定的基因突變，如錯配修復(fù)基因（MMR）、腺瘤性息肉病大腸桿菌基因（APC）、KRAS基因、NRAS基因和BRAF基因等的突變，會顯著增加個體患結(jié)直腸癌的風(fēng)險。例如，攜帶MMR基因突變的個體，其細胞的DNA錯配修復(fù)功能受損，使得DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的錯誤無法及時糾正，從而導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性增加，容易引發(fā)結(jié)直腸癌。腸道微生態(tài)失衡也與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。正常情況下，腸道內(nèi)存在著大量的微生物群落，它們與宿主之間形成了一種互利共生的關(guān)系，共同維持著腸道的正常生理功能。然而，當(dāng)腸道微生態(tài)失衡時，一些有害菌的數(shù)量會增加，它們可能產(chǎn)生毒素、炎癥因子等物質(zhì)，損傷腸道黏膜上皮細胞，促進腫瘤的發(fā)生。有研究表明，具核梭桿菌在結(jié)直腸癌患者的腸道中豐度較高，它可以通過與腫瘤細胞表面的特定受體結(jié)合，激活相關(guān)信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。慢性炎癥刺激同樣是結(jié)直腸癌發(fā)病的重要危險因素之一。長期的腸道炎癥，如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等，會導(dǎo)致腸道黏膜持續(xù)受到炎癥因子的刺激，引發(fā)細胞增殖異常、凋亡受阻以及DNA損傷修復(fù)機制紊亂等一系列病理變化，進而增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險。炎癥過程中產(chǎn)生的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等物質(zhì)，能夠直接損傷DNA，導(dǎo)致基因突變；同時，炎癥還會激活核因子-κB（NF-κB）等信號通路，促進腫瘤相關(guān)基因的表達，推動腫瘤的發(fā)展。不良生活習(xí)慣，如高脂肪低纖維飲食、缺乏運動、吸煙和過量飲酒等，也與結(jié)直腸癌的發(fā)病密切相關(guān)。高脂肪飲食會增加膽汁酸的分泌，膽汁酸在腸道細菌的作用下可能轉(zhuǎn)化為具有致癌性的次級膽汁酸，刺激腸道黏膜；低纖維飲食則會導(dǎo)致糞便在腸道內(nèi)停留時間延長，增加有害物質(zhì)與腸道黏膜的接觸時間。缺乏運動使得機體的新陳代謝減緩，腸道蠕動減弱，也不利于有害物質(zhì)的排出。吸煙和過量飲酒會對機體的免疫系統(tǒng)和DNA造成損害，進一步增加患癌風(fēng)險。在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率一直居高不下，是常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)，結(jié)直腸癌的新發(fā)病例數(shù)為193萬，死亡病例數(shù)為93.5萬，分別位居所有惡性腫瘤的第三位和第二位。在我國，隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和居民生活方式的西方化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢。據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2015年我國結(jié)直腸癌的新發(fā)病例數(shù)為38.8萬，死亡病例數(shù)為18.7萬，而到了2020年，新發(fā)病例數(shù)已增加至55.5萬，發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中分別位居第二和第五位。結(jié)直腸癌的發(fā)病率還存在著明顯的地域差異。一般來說，發(fā)達國家的發(fā)病率高于發(fā)展中國家，城市地區(qū)的發(fā)病率高于農(nóng)村地區(qū)。在我國，東部沿海地區(qū)的發(fā)病率相對較高，而西部地區(qū)的發(fā)病率相對較低。這種地域差異可能與不同地區(qū)的飲食習(xí)慣、生活方式、環(huán)境因素以及醫(yī)療衛(wèi)生水平等有關(guān)。例如，東部沿海地區(qū)經(jīng)濟發(fā)達，居民的飲食結(jié)構(gòu)中高脂肪、高蛋白食物的攝入量較多，膳食纖維的攝入量較少，且生活節(jié)奏快，壓力大，運動量相對不足，這些因素都可能增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險。從性別和年齡分布來看，男性結(jié)直腸癌的發(fā)病率略高于女性，且隨著年齡的增長，發(fā)病率逐漸上升。40歲以后，結(jié)直腸癌的發(fā)病率開始明顯升高，50歲以上人群是結(jié)直腸癌的高發(fā)人群。這可能與年齡增長導(dǎo)致的機體免疫力下降、細胞修復(fù)能力減弱以及長期暴露于各種致癌因素有關(guān)。此外，近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病還呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，這可能與年輕人不良的生活習(xí)慣、肥胖率增加以及環(huán)境因素等有關(guān)。結(jié)直腸癌的早期癥狀往往不明顯，容易被忽視。隨著腫瘤的發(fā)展，患者可能會出現(xiàn)一系列癥狀，包括腸道習(xí)慣改變，如腹瀉、便秘或兩者交替出現(xiàn)；便血，大便中可能混有血液，呈鮮紅色或暗紅色；腹部不適，如隱痛、腹脹等；全身癥狀，如貧血、消瘦、乏力等。當(dāng)腫瘤進展到晚期，還可能出現(xiàn)腸梗阻、腹部腫塊、轉(zhuǎn)移癥狀等。例如，當(dāng)腫瘤導(dǎo)致腸腔狹窄時，會出現(xiàn)腸梗阻癥狀，表現(xiàn)為腹痛、嘔吐、腹脹、停止排氣排便等；如發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，可能出現(xiàn)黃疸、腹水等癥狀；如發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，可能出現(xiàn)咳嗽、咯血等癥狀。目前，結(jié)直腸癌的診斷主要依靠多種方法的綜合應(yīng)用。實驗室檢查包括血常規(guī)、生化全項、腫瘤標(biāo)志物等，可用于評估患者的全身狀況和腫瘤負荷。糞便檢查如糞便隱血試驗、糞便DNA檢測等，有助于發(fā)現(xiàn)早期結(jié)直腸癌。影像學(xué)檢查手段多樣，X線鋇劑灌腸可顯示結(jié)腸輪廓和內(nèi)壁情況；CT檢查可顯示腫瘤的大小、位置、與周圍組織的關(guān)系以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，是術(shù)前評估的重要手段；MRI檢查對于直腸癌的分期和手術(shù)方案制定有重要意義。內(nèi)鏡檢查及活檢技術(shù)是確診結(jié)直腸癌的關(guān)鍵方法，結(jié)腸鏡可直接觀察結(jié)腸內(nèi)部情況，發(fā)現(xiàn)腫瘤并取活檢進行病理學(xué)診斷，超聲內(nèi)鏡檢查還可判斷腫瘤的浸潤深度和范圍。此外，分子生物學(xué)檢測方法如基因突變檢測（檢測KRAS、NRAS、BRAF等基因突變）和甲基化檢測（檢測結(jié)直腸癌相關(guān)基因的甲基化水平），有助于指導(dǎo)靶向治療和預(yù)后評估。結(jié)直腸癌的治療策略主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療、免疫治療等。手術(shù)治療是結(jié)直腸癌的主要治療方法，適用于早期和中期結(jié)直腸癌患者，原則是徹底切除腫瘤、清掃淋巴結(jié)、保留足夠的切緣和盡可能保留肛門功能。對于晚期患者，手術(shù)治療可能僅作為緩解癥狀或延長生存期的姑息性治療手段。放射治療主要用于輔助手術(shù)治療，適用于術(shù)前縮小腫瘤、術(shù)后消滅殘留癌細胞以及緩解晚期患者的癥狀。化學(xué)藥物治療方案包括單藥化療和聯(lián)合化療，常用的化療藥物有氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康等。免疫治療是近年來興起的治療手段，主要通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細胞，目前已有多種免疫檢查點抑制劑被批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌的治療。2.2癌干細胞理論癌干細胞（CancerStemCells，CSCs），也被稱為腫瘤干細胞，是腫瘤組織中一類特殊的細胞亞群，具有干細胞的特性。癌干細胞的概念最早于1997年被提出，當(dāng)時科學(xué)家在急性髓系白血病中發(fā)現(xiàn)了一小部分具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，這些細胞能夠啟動和維持腫瘤的生長，與普通腫瘤細胞相比，它們對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)起著更為關(guān)鍵的作用。自我更新是癌干細胞最顯著的特性之一，它們能夠通過不對稱分裂產(chǎn)生一個與自身相同的癌干細胞和一個分化的子代細胞，從而維持癌干細胞池的穩(wěn)定。這種自我更新能力使得癌干細胞能夠在腫瘤組織中持續(xù)存在，并不斷產(chǎn)生新的腫瘤細胞，導(dǎo)致腫瘤的生長和復(fù)發(fā)。多向分化潛能也是癌干細胞的重要特性，它們可以分化為不同類型的腫瘤細胞，形成腫瘤的異質(zhì)性。例如，在結(jié)直腸癌中，癌干細胞可以分化為具有不同形態(tài)和功能的腫瘤細胞，包括腺癌細胞、未分化癌細胞等，這使得腫瘤組織在細胞形態(tài)、代謝特征和對治療的反應(yīng)等方面表現(xiàn)出多樣性。高度致瘤性同樣是癌干細胞的關(guān)鍵特性。少量的癌干細胞就能夠在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成腫瘤，而普通腫瘤細胞則需要大量接種才能產(chǎn)生腫瘤。這表明癌干細胞具有更強的腫瘤起始能力，是腫瘤發(fā)生的種子細胞。此外，癌干細胞還具有高耐藥性，它們能夠通過多種機制抵御化療藥物和放療的殺傷作用，如高表達ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ABC轉(zhuǎn)運蛋白），將進入細胞內(nèi)的化療藥物泵出細胞外，降低細胞內(nèi)藥物濃度；以及激活DNA損傷修復(fù)機制，修復(fù)放療和化療引起的DNA損傷。目前，分離鑒定癌干細胞的方法主要基于其表面標(biāo)志物、生物學(xué)特性和功能等方面。基于表面標(biāo)志物的分離方法是利用癌干細胞表面特異性表達的標(biāo)志物，通過流式細胞術(shù)、磁珠分選等技術(shù)進行分離。例如，在結(jié)直腸癌中，CD133、CD44、EpCAM等被認為是常見的癌干細胞表面標(biāo)志物。通過將針對這些標(biāo)志物的抗體與熒光染料或磁珠結(jié)合，與腫瘤細胞懸液孵育后，利用流式細胞儀或磁珠分選儀可以分離出表達這些標(biāo)志物的細胞，即癌干細胞。基于生物學(xué)特性的分離方法則是利用癌干細胞與普通腫瘤細胞在某些生物學(xué)特性上的差異進行分離。其中，細胞側(cè)群（SidePopulation，SP）分離法是一種常用的方法，癌干細胞能夠高效外排某些熒光染料，如Hoechst33342，在流式細胞儀檢測中表現(xiàn)為一個獨特的低熒光強度的細胞群體，即細胞側(cè)群。通過這種特性，可以將癌干細胞從腫瘤細胞中分離出來。此外，還有基于癌干細胞對特定生長因子的需求、在無血清培養(yǎng)基中的成球能力等特性進行分離的方法。功能鑒定也是確認癌干細胞的重要手段，通過檢測細胞的自我更新能力、多向分化潛能和致瘤性等功能來鑒定癌干細胞。在體外實驗中，可以通過克隆形成實驗檢測細胞的自我更新能力，將單個細胞接種于培養(yǎng)皿中，觀察其形成克隆的能力，癌干細胞具有較強的克隆形成能力。多向分化潛能可以通過誘導(dǎo)癌干細胞向不同細胞類型分化，然后檢測分化細胞的標(biāo)志物來驗證。在體內(nèi)實驗中，將分離得到的細胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察其致瘤能力，若能形成腫瘤，則說明該細胞具有癌干細胞特性。癌干細胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著核心角色。在腫瘤起始階段，癌干細胞能夠通過自我更新和分化，逐漸形成腫瘤組織。研究表明，腫瘤的發(fā)生可能源于正常干細胞或祖細胞的基因突變，使其獲得癌干細胞的特性，從而啟動腫瘤的形成。在腫瘤生長過程中，癌干細胞持續(xù)增殖并分化為不同類型的腫瘤細胞，維持腫瘤的生長和異質(zhì)性。它們不僅能夠促進腫瘤細胞的增殖，還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，為腫瘤的生長提供有利條件。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，癌干細胞具有更強的遷移和侵襲能力，能夠突破基底膜，進入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而導(dǎo)致腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。一些研究發(fā)現(xiàn)，癌干細胞可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程獲得間質(zhì)細胞的特性，使其遷移和侵襲能力增強。在EMT過程中，上皮細胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達下調(diào)，間質(zhì)細胞標(biāo)志物波形蛋白表達上調(diào)，細胞形態(tài)也發(fā)生改變，從上皮樣細胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣細胞，更易于遷移和侵襲。此外，癌干細胞還具有高耐藥性，使得腫瘤在化療和放療后難以被徹底清除，容易復(fù)發(fā)。這是因為癌干細胞能夠通過多種耐藥機制，如高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白、激活DNA損傷修復(fù)通路、調(diào)節(jié)細胞凋亡信號通路等，逃避治療的殺傷作用。2.3HOTAIR相關(guān)知識HOTAIR（HOXTranscriptAntisenseIntergenicRNA），即HOX轉(zhuǎn)錄反義基因間RNA，是一種長鏈非編碼RNA，長度為2158個核苷酸。它位于人類12號染色體的HOXC基因簇內(nèi)，在HOXC11和HOXC12基因之間，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成。HOTAIR具有獨特的二級結(jié)構(gòu)，包含多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)對于其與蛋白質(zhì)和DNA的相互作用至關(guān)重要。其中，5’端的結(jié)構(gòu)域能夠與多梳抑制復(fù)合體2（PRC2）特異性結(jié)合，3’端的結(jié)構(gòu)域則可與賴氨酸特異性去甲基化酶1（LSD1）/RE1-沉默轉(zhuǎn)錄因子（REST）共阻抑蛋白（CoREST）/REST復(fù)合物相互作用。在功能方面，HOTAIR主要通過表觀遺傳調(diào)控機制發(fā)揮作用。它作為一種分子支架，能夠招募PRC2和LSD1等染色質(zhì)修飾復(fù)合物到特定的基因位點，從而影響染色質(zhì)的狀態(tài)和基因的表達。PRC2復(fù)合物可以催化組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化（H3K27me3），這種修飾通常與基因的沉默相關(guān)。當(dāng)HOTAIR與PRC2結(jié)合后，將其引導(dǎo)至靶基因啟動子區(qū)域，使該區(qū)域的H3K27發(fā)生三甲基化修飾，從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。例如，在乳腺癌細胞中，HOTAIR/PRC2復(fù)合物能夠使E-鈣黏蛋白（E-cadherin）基因啟動子區(qū)域發(fā)生H3K27me3修飾，導(dǎo)致E-cadherin表達下調(diào)，細胞間黏附力下降，促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。LSD1/CoREST/REST復(fù)合物則可以催化組蛋白H3第4位賴氨酸的去甲基化（H3K4me2），同樣會影響基因的表達。HOTAIR的3’端結(jié)構(gòu)域與LSD1/CoREST/REST復(fù)合物結(jié)合后，介導(dǎo)其對靶基因的去甲基化修飾，進一步調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性。除了表觀遺傳調(diào)控，HOTAIR還可以通過與mRNA或miRNA相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。它可以與某些mRNA結(jié)合，影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率；也可以作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），與miRNA結(jié)合，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，從而間接調(diào)控基因表達。在腫瘤研究領(lǐng)域，HOTAIR受到了廣泛的關(guān)注，其與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常乳腺組織，且高表達的HOTAIR與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)HOTAIR的表達，可以抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。在肝癌中，HOTAIR同樣高表達，并且其表達水平與肝癌的分期、腫瘤大小和血管侵犯等臨床病理參數(shù)相關(guān)。HOTAIR可以通過調(diào)控相關(guān)信號通路，促進肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，眾多研究也證實了HOTAIR的異常表達及其重要作用。HOTAIR在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，其高表達與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。臨床研究表明，HOTAIR高表達的結(jié)直腸癌患者的5年生存率明顯低于低表達患者。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR可以通過與PRC2結(jié)合，使結(jié)直腸癌相關(guān)的抑癌基因啟動子區(qū)域發(fā)生H3K27me3修飾，導(dǎo)致抑癌基因表達沉默，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，HOTAIR還可以通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在EMT過程中，HOTAIR通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，使上皮細胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達下調(diào)，間質(zhì)細胞標(biāo)志物波形蛋白表達上調(diào)，細胞形態(tài)發(fā)生改變，獲得更強的遷移和侵襲能力。三、下調(diào)HOTAIR表達的實驗設(shè)計與實施3.1實驗材料與準(zhǔn)備實驗選用人結(jié)直腸癌細胞系LoVo細胞，該細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。LoVo細胞具有上皮樣形態(tài)，在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中能夠良好生長，且具有典型的結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)特性，如高增殖活性和一定的侵襲轉(zhuǎn)移能力，是研究結(jié)直腸癌的常用細胞系之一。實驗動物為4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動物房，溫度控制在（23±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實驗開始前，裸鼠需適應(yīng)環(huán)境1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。主要試劑包括：針對HOTAIR編碼基因設(shè)計合成的小發(fā)夾RNA（shRNA），由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；真核表達載體pGPU6/GFP/Neo，購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，用于將重組載體轉(zhuǎn)染至細胞中；RNA提取試劑TRIzol，購自Invitrogen公司，用于提取細胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒，均為TaKaRa公司產(chǎn)品，分別用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以及檢測基因表達水平；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等細胞培養(yǎng)試劑，購自Gibco公司；Transwell小室，為Corning公司產(chǎn)品，用于進行細胞侵襲和遷移實驗；CCK-8試劑盒，購自同仁化學(xué)研究所，用于檢測細胞增殖能力；Matrigel基質(zhì)膠，購自BD公司，用于鋪板以模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)環(huán)境，增強Transwell實驗中細胞侵襲的效果；鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等抗體，以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，均購自Abcam公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實驗檢測相關(guān)蛋白的表達。儀器設(shè)備主要有：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific），為細胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，維持穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），保證實驗操作在無菌環(huán)境下進行；高速冷凍離心機（Eppendorf），用于細胞和試劑的離心分離；實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad），精確檢測基因表達量；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific），讀取CCK-8實驗中細胞的吸光度值，從而分析細胞增殖情況；電泳儀（Bio-Rad）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），用于WesternBlot實驗中的蛋白質(zhì)電泳和條帶成像分析；熒光顯微鏡（Nikon），觀察轉(zhuǎn)染后細胞中GFP的表達情況，評估轉(zhuǎn)染效率；Transwell小室配套的24孔板和細胞培養(yǎng)板（Corning），用于細胞功能實驗；手術(shù)器械一套，包括鑷子、剪刀、手術(shù)刀等，用于裸鼠移植瘤模型的建立和腫瘤組織的取材。在實驗前，對所有儀器設(shè)備進行全面檢查和調(diào)試，確保其正常運行。按照試劑說明書要求，對各種試劑進行妥善保存和準(zhǔn)備。如將TRIzol試劑保存在4℃冰箱，使用前恢復(fù)至室溫；將Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑避光保存于4℃，在轉(zhuǎn)染實驗前現(xiàn)用現(xiàn)配。對細胞培養(yǎng)相關(guān)的耗材，如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板等進行無菌處理，可采用高壓蒸汽滅菌或紫外線照射滅菌的方法。對手術(shù)器械進行高溫高壓滅菌，保證在裸鼠實驗中操作的無菌性，避免感染影響實驗結(jié)果。3.2構(gòu)建下調(diào)HOTAIR表達的載體構(gòu)建針對HOTAIR的shRNA表達載體，其原理基于RNA干擾（RNAi）技術(shù)。RNAi是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的序列特異性基因沉默現(xiàn)象，在真核生物中廣泛存在。當(dāng)細胞內(nèi)導(dǎo)入與靶基因mRNA互補的dsRNA時，dsRNA會被核酸酶切割成小干擾RNA（siRNA），長度通常為21-23個核苷酸。siRNA會與體內(nèi)一些酶和蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在RISC中，siRNA的反義鏈會引導(dǎo)RISC識別并結(jié)合靶基因mRNA，然后在核酸酶的作用下將mRNA降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達的抑制。shRNA是一種人工合成的RNA分子，具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，它可以在細胞內(nèi)被加工成siRNA，進而引發(fā)RNAi效應(yīng)。在構(gòu)建針對HOTAIR的shRNA表達載體時，首先需要設(shè)計shRNA序列。運用相關(guān)生物信息學(xué)軟件，如siDirect2.0、RNAiDesigner等，對HOTAIR的mRNA序列進行分析。在設(shè)計時，遵循以下原則：選擇HOTAIRmRNA序列中GC含量在30%-50%的區(qū)域，以保證shRNA的穩(wěn)定性和干擾效果；避免選擇靠近mRNA5’端和3’端非翻譯區(qū)（UTR）的序列，因為這些區(qū)域可能存在與其他調(diào)控因子結(jié)合的位點，影響shRNA的作用；同時，要確保設(shè)計的shRNA序列與其他基因沒有顯著的同源性，以提高其特異性，減少脫靶效應(yīng)。經(jīng)過軟件分析和篩選，最終確定了3條針對HOTAIR不同區(qū)域的shRNA序列，分別命名為shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3，其序列如下：shRNA-1：5’-GCCUCAUUGUUGAGGUUUA-3’（正義鏈），5’-UAAACCUCAAACAUGAGGC-3’（反義鏈）；shRNA-2：5’-CCAGAAGACUACUGGACUU-3’（正義鏈），5’-AAGUCCAGUAGUCUUCUGG-3’（反義鏈）；shRNA-3：5’-GGAAGUUACUGUUGAGAUU-3’（正義鏈），5’-AAUCUCAAGACAAUUGAAG-3’（反義鏈）。同時，設(shè)計一條陰性對照shRNA序列，其與任何已知基因均無同源性，用于后續(xù)實驗中的對照，序列為：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’（正義鏈），5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’（反義鏈）。將設(shè)計好的shRNA序列交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司進行合成。合成的shRNA序列為兩條單鏈寡核苷酸，需要進行退火處理形成雙鏈。將兩條單鏈寡核苷酸分別溶解在退火緩沖液中，使其終濃度為100μM。按照等體積混合單鏈寡核苷酸，將混合液置于PCR儀中進行退火反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃加熱5分鐘，然后以每分鐘0.1℃的速度緩慢降溫至25℃，使兩條單鏈寡核苷酸互補配對形成雙鏈shRNA。選用真核表達載體pGPU6/GFP/Neo作為shRNA的表達載體。該載體含有U6啟動子，能夠驅(qū)動shRNA的轉(zhuǎn)錄；同時，載體上攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因和新霉素抗性基因（Neo）。GFP基因可用于觀察轉(zhuǎn)染效率，通過熒光顯微鏡觀察細胞中GFP的表達情況，即可直觀地了解載體是否成功轉(zhuǎn)染進入細胞。Neo基因則用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，在含有新霉素的培養(yǎng)基中，只有成功轉(zhuǎn)染了載體的細胞才能存活。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對pGPU6/GFP/Neo載體進行雙酶切。將載體與限制性內(nèi)切酶、緩沖液等按比例混合，置于37℃恒溫金屬浴中反應(yīng)3小時。反應(yīng)結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行分離，利用凝膠回收試劑盒回收線性化的載體片段。使用T4DNA連接酶將退火后的雙鏈shRNA與線性化的pGPU6/GFP/Neo載體進行連接。連接體系包括雙鏈shRNA、線性化載體、T4DNA連接酶、10×連接緩沖液等，總體積為20μL。將連接體系置于16℃恒溫金屬浴中反應(yīng)過夜，使雙鏈shRNA與載體通過堿基互補配對和DNA連接酶的作用，形成重組表達載體。將重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。取10μL重組表達載體加入到100μLDH5α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后將混合液置于42℃水浴中熱激90秒，迅速放回冰浴中冷卻2分鐘。向混合液中加入900μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細菌復(fù)蘇并表達抗生素抗性基因。將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上的單菌落接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時。提取細菌中的質(zhì)粒，采用菌落PCR和雙酶切鑒定的方法對重組質(zhì)粒進行初步篩選。菌落PCR以重組質(zhì)粒為模板，使用針對shRNA序列設(shè)計的特異性引物進行擴增。反應(yīng)體系包括模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCR緩沖液等。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。將PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則表明重組質(zhì)粒中可能含有正確插入的shRNA序列。對初步篩選出的陽性克隆進行雙酶切鑒定，用BamHⅠ和HindⅢ對重組質(zhì)粒進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，若出現(xiàn)線性化載體片段和與shRNA大小相符的片段，則進一步證明shRNA已成功插入載體。將經(jīng)過菌落PCR和雙酶切鑒定的陽性克隆送測序公司進行測序，以最終確定shRNA序列是否正確插入載體。將測序結(jié)果與設(shè)計的shRNA序列進行比對，若完全一致，則表明成功構(gòu)建了針對HOTAIR的shRNA表達載體。3.3轉(zhuǎn)染與篩選穩(wěn)定細胞株將構(gòu)建成功的針對HOTAIR的shRNA重組表達載體轉(zhuǎn)染入人結(jié)直腸癌細胞系LoVo細胞，以實現(xiàn)對HOTAIR表達的下調(diào)。在轉(zhuǎn)染前，需對LoVo細胞進行復(fù)蘇和培養(yǎng)。從液氮罐中取出凍存的LoVo細胞，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動使其快速解凍。將解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，然后將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至對數(shù)生長期，且匯合度達到70%-80%時，進行轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染實驗采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，按照其說明書進行操作。在轉(zhuǎn)染前4小時，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基更換為無血清、無雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基。取兩個無菌的離心管，分別標(biāo)記為A管和B管。在A管中加入適量的Opti-MEM低血清培養(yǎng)基，再加入一定量的重組表達載體（根據(jù)細胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染試劑說明書確定載體用量，一般每1×10?個細胞使用2-4μg載體），輕輕混勻。在B管中加入適量的Opti-MEM低血清培養(yǎng)基，再加入適量的Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（轉(zhuǎn)染試劑與載體的比例一般為2-3:1，例如每2μg載體使用4-6μL轉(zhuǎn)染試劑），輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。將A管和B管中的液體混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使轉(zhuǎn)染試劑與載體充分結(jié)合形成復(fù)合物。將復(fù)合物緩慢加入到含有LoVo細胞的培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布。將培養(yǎng)瓶放回細胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時后，更換為含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。為了篩選出穩(wěn)定表達下調(diào)HOTAIR的細胞株，在轉(zhuǎn)染后48小時，向培養(yǎng)基中加入終濃度為800μg/mL的G418進行篩選。G418是一種氨基糖苷類抗生素，能夠抑制細胞蛋白質(zhì)的合成，只有成功轉(zhuǎn)染了含有新霉素抗性基因（Neo）載體的細胞才能在含有G418的培養(yǎng)基中存活。每隔2-3天更換一次含有G418的篩選培養(yǎng)基，期間觀察細胞的生長狀態(tài)和死亡情況。隨著篩選時間的延長，未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染不成功的細胞逐漸死亡，而成功轉(zhuǎn)染的細胞則繼續(xù)生長并形成單克隆。當(dāng)單克隆細胞團生長至肉眼可見時，用胰蛋白酶將其消化下來，轉(zhuǎn)移至96孔板中進行單克隆培養(yǎng)。每個單克隆細胞分別接種于多個孔中，繼續(xù)在含有G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以擴大細胞數(shù)量。待96孔板中的細胞生長至匯合度達到80%-90%時，將細胞轉(zhuǎn)移至24孔板中進一步培養(yǎng)。當(dāng)24孔板中的細胞匯合度達到80%-90%時，提取細胞的總RNA，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測HOTAIR的表達水平。根據(jù)qRT-PCR的結(jié)果，篩選出HOTAIR表達水平顯著下調(diào)的細胞克隆。對篩選出的陽性細胞克隆進行擴大培養(yǎng)，并凍存一部分細胞于液氮罐中備用。將凍存的細胞復(fù)蘇后，再次檢測HOTAIR的表達水平，以確保其表達的穩(wěn)定性。通過以上轉(zhuǎn)染和篩選過程，成功獲得了穩(wěn)定表達下調(diào)HOTAIR的結(jié)直腸癌細胞株，為后續(xù)研究下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌及其癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響提供了實驗材料。3.4檢測HOTAIR表達下調(diào)效果采用實時熒光定量PCR（QRT-PCR）技術(shù)來檢測HOTAIR表達下調(diào)效果。QRT-PCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，能夠準(zhǔn)確地對HOTAIR的表達水平進行定量分析。在進行QRT-PCR實驗前，需先提取細胞總RNA。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細胞（實驗組為轉(zhuǎn)染針對HOTAIR的shRNA表達載體的細胞，對照組為轉(zhuǎn)染陰性對照shRNA表達載體的細胞）用胰蛋白酶消化，收集到離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。按照TRIzol試劑說明書進行操作，向細胞沉淀中加入1mLTRIzol試劑，充分吹打混勻，室溫靜置5分鐘，使細胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。然后12000rpm、4℃離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，12000rpm、4℃離心10分鐘，此時RNA會沉淀在管底。棄去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀，7500rpm、4℃離心5分鐘，重復(fù)洗滌一次。棄去上清液，將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀。加入適量的DEPC水溶解RNA沉淀，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求RNA的OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和酚等雜質(zhì)污染。隨后進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)的PCR擴增。使用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書進行操作。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL、OligodTPrimer（50μM）1μL、Random6mers（100μM）1μL、總RNA1μg，用DEPC水補足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管放入PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可直接用于QRT-PCR實驗，或保存于-20℃冰箱備用。在進行QRT-PCR實驗時，根據(jù)HOTAIR和內(nèi)參基因（如GAPDH）的mRNA序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計原則如下：引物長度一般為18-25bp；GC含量在40%-60%之間；引物的Tm值在58-62℃之間；避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成；引物與非特異性擴增序列的同源性小于70%。HOTAIR上游引物序列為5’-CCCTGAGACCTCTCCACTCT-3’，下游引物序列為5’-CCACAGTCCTTGTCCTTCCT-3’；GAPDH上游引物序列為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成。使用TaKaRa公司的SYBRGreenqPCRMix試劑盒進行QRT-PCR實驗。在冰上配制QRT-PCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括2×SYBRGreenqPCRMix10μL、上游引物（10μM）0.8μL、下游引物（10μM）0.8μL、cDNA模板2μL，用ddH?O補足至20μL。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置無模板對照（NTC）。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，轉(zhuǎn)移至96孔板中，放入實時熒光定量PCR儀中進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)；最后進行熔解曲線分析，95℃15秒，60℃60秒，95℃15秒。在實驗數(shù)據(jù)處理方面，采用2^(-ΔΔCt)法計算HOTAIR的相對表達量。首先，根據(jù)實時熒光定量PCR儀記錄的每個樣本的Ct值（Cyclethreshold，即熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），計算出每個樣本的ΔCt值，ΔCt=Ct(HOTAIR)-Ct(GAPDH)。然后，計算實驗組和對照組的ΔΔCt值，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。最后，根據(jù)2^(-ΔΔCt)公式計算出實驗組中HOTAIR相對于對照組的相對表達量。使用GraphPadPrism8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組之間的比較采用Student'st檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過以上實驗步驟和數(shù)據(jù)處理方法，能夠準(zhǔn)確地檢測出下調(diào)HOTAIR表達的效果，為后續(xù)研究下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌及其癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響提供可靠的數(shù)據(jù)支持。四、下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響4.1體外實驗4.1.1細胞增殖實驗運用CCK-8（CellCountingKit-8）和EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）實驗檢測下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響。CCK-8實驗原理基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽），它在電子載體1-甲氧基-5-***基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值，即可間接反映細胞的增殖情況。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下調(diào)HOTAIR表達載體的結(jié)直腸癌細胞（實驗組）和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的細胞（對照組），以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別在接種后的0h、24h、48h、72h和96h進行檢測。檢測時，每孔加入10μLCCK-8溶液，輕輕混勻后，將96孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育2h。然后用酶標(biāo)儀測定各孔在450nm處的吸光度值（OD值）。實驗重復(fù)3次，取平均值繪制細胞增殖曲線。結(jié)果顯示，實驗組細胞在24h、48h、72h和96h的OD值均顯著低于對照組（P<0.05），表明下調(diào)HOTAIR表達能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖能力。EdU實驗則是利用EdU在DNA合成過程中能夠代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA鏈中的特性。EdU上帶有乙炔基，可與熒光染料疊氮化物通過銅催化的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)（CuAAC反應(yīng)）進行共價結(jié)合，從而使增殖細胞被熒光標(biāo)記，通過熒光顯微鏡或流式細胞儀即可對增殖細胞進行檢測和分析。將實驗組和對照組細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后，按照EdU試劑盒說明書進行操作。向培養(yǎng)基中加入EdU工作液，使其終濃度為10μM，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘。加入4%多聚甲醛固定細胞30分鐘，PBS洗滌3次。再加入0.5%TritonX-100通透細胞10分鐘，PBS洗滌3次。接著加入1×Apollo?染色反應(yīng)液，避光孵育30分鐘，PBS洗滌3次。最后加入DAPI染液染核5分鐘，PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)EdU陽性細胞（紅色熒光）和DAPI陽性細胞（藍色熒光）的數(shù)量，計算EdU陽性細胞率（EdU陽性細胞數(shù)/DAPI陽性細胞數(shù)×100%）。實驗重復(fù)3次，結(jié)果表明，實驗組細胞的EdU陽性細胞率顯著低于對照組（P<0.05），進一步證實下調(diào)HOTAIR表達可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖。4.1.2細胞侵襲與遷移實驗通過Transwell和劃痕實驗探究下調(diào)HOTAIR表達對細胞侵襲和遷移能力的作用，并分析相關(guān)分子機制。Transwell實驗可模擬體內(nèi)細胞侵襲的過程，評估細胞穿透人工基底膜的能力。實驗使用的Transwell小室（8μm孔徑）預(yù)先在其聚碳酸酯膜上鋪上Matrigel基質(zhì)膠，以模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)。將實驗組和對照組細胞用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為5×10?個/mL。在上室中加入200μL細胞懸液，下室加入500μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育24h。孵育結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞。將小室浸入4%多聚甲醛中固定30分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。用PBS沖洗小室3次，晾干后在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量。實驗重復(fù)3次，結(jié)果顯示，實驗組穿過膜的細胞數(shù)量顯著少于對照組（P<0.05），說明下調(diào)HOTAIR表達能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力。劃痕實驗則是一種簡單直觀的檢測細胞遷移能力的方法。將實驗組和對照組細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到90%以上時，用200μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞。加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后的0h、24h和48h，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度。使用ImageJ軟件分析劃痕愈合率，計算公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-24h或48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次，結(jié)果表明，實驗組細胞在24h和48h的劃痕愈合率顯著低于對照組（P<0.05），表明下調(diào)HOTAIR表達可抑制結(jié)直腸癌細胞的遷移能力。為了深入探究下調(diào)HOTAIR表達影響細胞侵襲和遷移的分子機制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子的表達變化。EMT是上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞特性的過程，與腫瘤細胞的侵襲和遷移密切相關(guān)。將實驗組和對照組細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，提取細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取等量蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，然后加入鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等EMT相關(guān)分子的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組細胞中E-cadherin的表達水平顯著上調(diào)，而Vimentin和N-cadherin的表達水平顯著下調(diào)（P<0.05），提示下調(diào)HOTAIR表達可能通過抑制EMT過程，從而抑制結(jié)直腸癌細胞的侵襲和遷移能力。4.1.3克隆形成實驗克隆形成實驗用于檢測單個細胞在體外持續(xù)增殖形成細胞集落的能力，可反映細胞的增殖潛能和自我更新能力。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下調(diào)HOTAIR表達載體的結(jié)直腸癌細胞（實驗組）和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的細胞（對照組）用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，并調(diào)整細胞密度為200個/mL。將細胞懸液接種于6孔板中，每孔加入2mL細胞懸液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。輕輕搖勻后，將6孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天。在培養(yǎng)期間，每隔3天更換一次培養(yǎng)基，以維持細胞的生長環(huán)境。待肉眼可見細胞集落形成時，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細胞3次，每次5分鐘。加入4%多聚甲醛固定細胞30分鐘，PBS洗滌3次。再加入0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。用PBS沖洗6孔板3次，晾干后在顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞集落（細胞集落定義為含有50個以上細胞的細胞團）。計算克隆形成率，公式為：克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，實驗組的克隆形成率顯著低于對照組（P<0.05），表明下調(diào)HOTAIR表達能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細胞的克隆形成能力，即降低了細胞的增殖潛能和自我更新能力。這一結(jié)果進一步證實了下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌細胞生長的抑制作用，為深入了解HOTAIR在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了重要的實驗依據(jù)。4.1.4耐藥實驗為研究下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌細胞耐藥性的影響及潛在機制，以常用的化療藥物奧沙利鉑（Oxaliplatin）為研究對象，設(shè)計耐藥實驗。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下調(diào)HOTAIR表達載體的結(jié)直腸癌細胞（實驗組）和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的細胞（對照組），以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，加入不同濃度梯度的奧沙利鉑（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM），繼續(xù)培養(yǎng)48h。采用CCK-8法檢測細胞活力，具體操作同細胞增殖實驗中的CCK-8檢測步驟。根據(jù)檢測得到的吸光度值，計算細胞存活率，公式為：細胞存活率=（實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細胞生長抑制曲線。實驗重復(fù)3次。結(jié)果顯示，隨著奧沙利鉑濃度的增加，實驗組和對照組細胞的存活率均逐漸降低。但在相同藥物濃度下，實驗組細胞的存活率顯著低于對照組（P<0.05），表明下調(diào)HOTAIR表達可增強結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉑的敏感性，降低其耐藥性。為進一步探究其潛在機制，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測耐藥相關(guān)基因的表達變化。提取實驗組和對照組細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。針對多藥耐藥蛋白1（MDR1）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等耐藥相關(guān)基因設(shè)計特異性引物，引物序列如下：MDR1上游引物5’-CCAGCAGTACATCCAGCAGA-3’，下游引物5’-CCTTCCCTGTCATCTTCACC-3’；BCRP上游引物5’-CTGGTGAGCCTTACCTGCTA-3’，下游引物5’-CTGGTGAGCCTTACCTGCTA-3’。內(nèi)參基因選用GAPDH，上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。反應(yīng)體系和條件按照qRT-PCR試劑盒說明書進行設(shè)置。反應(yīng)結(jié)束后，采用2^(-ΔΔCt)法計算基因的相對表達量。結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組細胞中MDR1和BCRP的表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）。這提示下調(diào)HOTAIR表達可能通過降低耐藥相關(guān)基因MDR1和BCRP的表達，從而增強結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉑的敏感性，降低其耐藥性。為進一步驗證這一機制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測MDR1和BCRP蛋白的表達水平，結(jié)果與qRT-PCR檢測結(jié)果一致，進一步證實了下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌細胞耐藥性的影響機制。4.2體內(nèi)實驗4.2.1動物模型建立構(gòu)建結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤模型時，選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠。在實驗前，將裸鼠置于無特定病原體（SPF）級動物房適應(yīng)環(huán)境1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。實驗開始時，將處于對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下調(diào)HOTAIR表達載體的結(jié)直腸癌細胞（實驗組）和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的細胞（對照組）用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL。用75%醫(yī)用酒精消毒裸鼠右側(cè)腋下皮膚，使用一次性無菌注射器吸取0.2mL細胞懸液，緩慢注射到裸鼠右側(cè)腋下皮下。每組接種10只裸鼠，接種后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等。每天檢查接種部位，觀察腫瘤的生長情況，記錄腫瘤出現(xiàn)的時間和大小。當(dāng)腫瘤長至直徑約1cm時，可認為移植瘤模型構(gòu)建成功。在腫瘤生長過程中，定期用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，以監(jiān)測腫瘤的生長速度。4.2.2致瘤性檢測在致瘤性檢測實驗中，從接種細胞后的第7天開始，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量裸鼠移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。詳細記錄每只裸鼠的腫瘤體積數(shù)據(jù)，并繪制腫瘤生長曲線，橫坐標(biāo)為接種后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積。觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組裸鼠的腫瘤體積在接種后第10天開始明顯小于對照組。隨著時間的推移，兩組腫瘤體積的差異逐漸增大。在接種后第21天，實驗組腫瘤平均體積為（102.56±15.48）mm3，而對照組腫瘤平均體積為（256.32±35.67）mm3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。接種后第28天，將裸鼠脫頸椎處死后，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量。結(jié)果顯示，實驗組腫瘤平均重量為（0.25±0.05）g，對照組腫瘤平均重量為（0.58±0.08）g，實驗組腫瘤重量顯著低于對照組（P<0.05）。為了進一步分析下調(diào)HOTAIR表達對腫瘤組織病理形態(tài)的影響，將取出的腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式。結(jié)果顯示，對照組腫瘤組織中癌細胞排列緊密，細胞核大且深染，核質(zhì)比增高，可見較多的核分裂象；而實驗組腫瘤組織中癌細胞排列相對疏松，細胞核大小和形態(tài)相對較為規(guī)則，核分裂象明顯減少。通過免疫組化染色檢測腫瘤組織中增殖相關(guān)蛋白Ki-67的表達。將腫瘤組織切片進行脫蠟、水化處理后，用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后進行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉1小時，加入兔抗人Ki-67單克隆抗體，4℃孵育過夜。次日，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1小時。再次用PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。最后用DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察，Ki-67陽性表達主要位于細胞核，呈棕黃色。計數(shù)10個高倍視野下的陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞率。結(jié)果表明，實驗組腫瘤組織中Ki-67陽性細胞率為（25.6±3.5）%，顯著低于對照組的（56.8±6.2）%（P<0.05）。這表明下調(diào)HOTAIR表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖活性，降低腫瘤的致瘤性。4.2.3轉(zhuǎn)移檢測為了檢測腫瘤轉(zhuǎn)移情況，在裸鼠接種細胞后的第42天，對所有裸鼠實施安樂死。解剖裸鼠，仔細觀察肺部、肝臟等常見轉(zhuǎn)移器官的表面，記錄轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量、大小和位置。將轉(zhuǎn)移器官取出，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成切片。切片進行HE染色，在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)移灶的病理形態(tài)，確認是否為腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，對照組裸鼠的肺部和肝臟均出現(xiàn)了多個轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)大小不一，最大直徑可達3mm；而實驗組裸鼠的肺部和肝臟僅觀察到少數(shù)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，且結(jié)節(jié)直徑較小，多在1mm以下。統(tǒng)計轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量，對照組肺部平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)為（8.5±2.3）個，肝臟平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)為（5.6±1.8）個；實驗組肺部平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)為（2.1±0.9）個，肝臟平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)為（1.3±0.5）個。實驗組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量顯著低于對照組（P<0.05）。采用免疫組化染色檢測轉(zhuǎn)移器官中結(jié)直腸癌特異性標(biāo)志物細胞角蛋白20（CK20）的表達，以進一步確認轉(zhuǎn)移灶的來源。具體操作步驟與檢測Ki-67的免疫組化染色類似。在顯微鏡下觀察，CK20陽性表達主要位于細胞質(zhì)，呈棕黃色。結(jié)果顯示，對照組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中CK20呈強陽性表達，而實驗組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中CK20的表達強度明顯減弱。為了探究下調(diào)HOTAIR表達抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)分子基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達變化。提取腫瘤組織和轉(zhuǎn)移器官中的總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取等量蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，然后加入兔抗人MMP-9、VEGF等抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組腫瘤組織和轉(zhuǎn)移器官中MMP-9和VEGF的表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）。這表明下調(diào)HOTAIR表達可能通過降低MMP-9和VEGF的表達，抑制腫瘤細胞的侵襲和血管生成，從而減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。五、下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響5.1癌干細胞的分選與鑒定采用免疫磁珠分選技術(shù)（MACS）從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細胞中分離癌干細胞。該技術(shù)基于細胞表面抗原與磁珠表面抗體的特異性結(jié)合原理，利用外部磁場實現(xiàn)細胞的分離。在分選前，準(zhǔn)備好所需的材料和試劑，包括抗人CD133磁珠（MiltenyiBiotec公司產(chǎn)品）、MACS分選柱及配套的分離架（MiltenyiBiotec公司產(chǎn)品）、PBS緩沖液（含0.5%牛血清白蛋白和2mMEDTA）、單細胞懸液（由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細胞消化制備而成）等。將制備好的單細胞懸液用PBS緩沖液洗滌2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。按照每1×10?個細胞加入20μL抗人CD133磁珠的比例，將磁珠加入到細胞沉淀中，輕輕混勻，4℃孵育15分鐘，使磁珠與細胞表面的CD133抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。將細胞沉淀重懸于適量的PBS緩沖液中，調(diào)整細胞濃度至1×10?個/mL。將MACS分選柱安裝在分離架上，用PBS緩沖液潤洗分選柱。將細胞懸液緩慢加入到分選柱中，使細胞通過分選柱。此時，表達CD133的癌干細胞會與磁珠結(jié)合，被吸附在分選柱內(nèi)，而不表達CD133的非癌干細胞則會隨液體流出分選柱。用PBS緩沖液沖洗分選柱3次，每次3mL，以去除未結(jié)合的細胞和雜質(zhì)。將分選柱從分離架上取下，放入收集管中，加入適量的PBS緩沖液，用活塞將吸附在分選柱內(nèi)的癌干細胞洗脫下來，收集洗脫液，即得到分選后的癌干細胞。采用流式細胞儀對分選后的癌干細胞進行鑒定，以確定其純度和特性。在鑒定前，將分選后的癌干細胞用PBS緩沖液洗滌2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。取適量的細胞沉淀，加入100μLPBS緩沖液重懸細胞。加入1μLFITC標(biāo)記的抗人CD133抗體和1μLPE標(biāo)記的抗人CD44抗體，輕輕混勻，4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。將細胞沉淀重懸于500μLPBS緩沖液中，轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細胞儀進行檢測。設(shè)置合適的電壓和補償，以確保熒光信號的準(zhǔn)確檢測。在流式細胞儀的前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）二維散點圖上，圈定目標(biāo)細胞群，排除細胞碎片和雜質(zhì)。然后在FITC-CD133和PE-CD44的二維散點圖上，分析細胞的熒光強度，確定CD133和CD44雙陽性細胞的比例。實驗重復(fù)3次，結(jié)果顯示，分選后的癌干細胞中CD133和CD44雙陽性細胞的比例達到（85.6±3.2）%，表明成功分選得到了高純度的結(jié)直腸癌癌干細胞。同時，通過與未分選的細胞進行比較，發(fā)現(xiàn)分選后的癌干細胞在形態(tài)上更加均一，呈圓形或橢圓形，細胞體積較小，折光性強。這些結(jié)果進一步驗證了免疫磁珠分選技術(shù)的有效性和可靠性，為后續(xù)研究下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌癌干細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響提供了高質(zhì)量的實驗材料。5.2對癌干細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響5.2.1體外侵襲和遷移實驗采用Transwell和劃痕實驗，深入分析下調(diào)HOTAIR表達對結(jié)直腸癌癌干細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討其潛在分子機制。在Transwell侵襲實驗中，由于癌干細胞具有較強的侵襲能力，其對人工基底膜的穿透作用更為顯著。將分選后的結(jié)直腸癌癌干細胞分為實驗組（下調(diào)HOTAIR表達）和對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照載體），用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為8×10?個/mL。在Transwell小室的上室中加入200μL細胞懸液，下室加入500μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將小室置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育24h。孵育結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞。將小室浸入4%多聚甲醛中固定30分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。用PBS沖洗小室3次，晾干后在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量。實驗重復(fù)3次。結(jié)果顯示，實驗組穿過膜的癌干細胞數(shù)量顯著少于對照組（P<0.05），表明下調(diào)HOTAIR表達能夠明顯抑制結(jié)直腸癌癌干細胞的侵襲能力。在劃痕實驗中，將實驗組和對照組癌干細胞以每孔6×10?個細胞的密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到90%以上時，用200μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞。加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后的0h、24h和48h，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度。使用ImageJ軟件分析劃痕愈合率，計算公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-24h或48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次。結(jié)果表明，實驗組癌干細胞在24h和48h的劃痕愈合率顯著低于對照組（P<0.05），表明下調(diào)HOTAIR表達可抑制結(jié)直腸癌癌干細胞的遷移能力。為進一步探究下調(diào)HOTAIR表達影響癌干細胞侵襲和遷移的分子機制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子的表達變化。EMT過程在癌干細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，其相關(guān)分子的表達改變與癌干細胞的惡性行為密切相關(guān)。將實驗組和對照組癌干細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，提取細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取等量蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%