CpGODN對哮喘小鼠TSLP、IL-17表達影響及作用機制研究一、引言1.1研究背景與意義支氣管哮喘作為一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，在全球范圍內影響著大量人群。據統計，全球約有3億哮喘患者，且其發病率呈逐年上升趨勢。在中國，20歲及以上人群哮喘患病率達4.2%，患者總數高達4570萬，其中55%-70%的患者病情控制不佳。哮喘不僅嚴重影響患者的生活質量，導致日常活動受限、睡眠障礙等，還帶來了沉重的社會經濟負擔，包括醫療費用支出、工作和學習時間的損失等。目前，哮喘的治療主要以吸入性糖皮質激素（ICS）聯合長效β2受體激動劑（LABA）等藥物為主。然而，仍有部分患者對現有治療方案反應不佳，癥狀難以得到有效控制，且長期使用這些藥物可能引發一系列不良反應，如骨質疏松、生長發育遲緩、腎上腺功能抑制等，這使得開發新的治療方法和藥物成為哮喘研究領域的迫切需求。近年來，免疫治療成為哮喘治療研究的熱點方向之一。含非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤的寡核苷酸鏈（CpGODN）作為一種免疫調節劑，具有獨特的免疫刺激特性，能夠激活機體免疫系統，誘導產生Th1型免疫反應，下調Th2型反應，調控免疫應答類型。在哮喘動物模型研究中，已證實CpGODN能夠有效地抑制氣道炎癥、氣道高反應性及氣道重構的發生和發展，顯示出在哮喘治療中的潛在應用價值。胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）和白細胞介素17（IL-17）在哮喘的發病機制中扮演著重要角色。TSLP是一種主要由氣道上皮表達的細胞因子，在環境損傷時釋放，引發一系列下游炎癥過程，與哮喘患者的氣道炎癥、疾病嚴重程度和肺功能密切相關。IL-17則是由輔助性T細胞17（Th17）分泌的細胞因子，參與哮喘的氣道炎癥和氣道重塑過程，可促進多種細胞釋放炎癥介質，招募中性粒細胞等炎癥細胞到氣道，加重氣道炎癥和組織損傷。深入研究CpGODN對哮喘小鼠TSLP、IL-17表達的影響，有助于進一步揭示CpGODN治療哮喘的作用機制，為哮喘的免疫治療提供新的理論依據和潛在治療靶點。通過明確CpGODN與TSLP、IL-17之間的相互關系，有望開發出更有效的哮喘治療策略，提高哮喘的治療效果，改善患者的生活質量，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現狀在哮喘發病機制的研究方面，國內外學者進行了大量深入的探索。目前普遍認為，哮喘是一種復雜的多基因遺傳性疾病，涉及多個基因與環境因素的相互作用。Th1/Th2細胞失衡學說在哮喘發病機制中占據重要地位，Th2型細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等的過度表達，可趨化并活化嗜酸粒細胞和肥大細胞，促使B細胞發生類別轉化產生IgE，導致氣道慢性炎癥和高反應性。同時，近年來Th17細胞及相關細胞因子在哮喘發病中的作用也逐漸受到關注，Th17細胞分泌的IL-17可招募中性粒細胞等炎癥細胞到氣道，參與氣道炎癥和氣道重塑過程，與哮喘的病情嚴重程度和治療反應密切相關。此外，氣道上皮細胞在哮喘發病中的作用也被進一步揭示，氣道上皮細胞不僅作為物理屏障，還能分泌多種細胞因子和趨化因子，如TSLP等，參與哮喘的炎癥反應啟動和調節。關于CpGODN的免疫調節作用及在哮喘治療中的應用，國內外研究取得了豐碩成果。CpGODN能夠激活天然免疫細胞，如單核/巨噬細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、樹突狀細胞（DC）和B細胞等。研究表明，CpGODN可刺激單核/巨噬細胞分泌IL-12、TNF-α等細胞因子，產生一氧化氮（NO）和反應性氧代謝中間產物（ROS）等活性物質，在誘發和激活非特異性免疫應答中發揮重要作用。在哮喘動物模型中，CpGODN表現出顯著的治療效果。Kline等發現，以血吸蟲卵抗原和CpGODN同時刺激先期經血吸蟲卵致敏小鼠后，其肺部嗜酸粒細胞減少，炎癥顯著減輕，氣道高反應性被抑制，血漿IgE水平明顯降低，支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4濃度下降而IL-12和IFN-γ均上升，說明CpGODN與抗原一同作用時可誘發Th1型占優勢的免疫反應。國內研究也證實，CpGODN能夠有效地抑制氣道炎癥、氣道高反應性及氣道重構的發生和發展。然而，目前CpGODN在臨床應用中仍面臨一些挑戰，如最佳給藥劑量、給藥途徑和安全性等問題，需要進一步深入研究。在TSLP和IL-17與哮喘關系的研究領域，國外研究處于前沿水平。胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）作為一種主要由氣道上皮表達的細胞因子，在哮喘發病機制中扮演關鍵角色。有充分證據表明，TSLP能夠分化2型細胞中幼稚的CD4+T淋巴細胞，產生IL-4、IL-5、IL-13，并降低與1型細胞相關的γ干擾素（IFN-γ）的表達，對多種細胞產生影響。在哮喘患者的氣道中，TSLP表達增加，并與2型趨化因子的表達和疾病的嚴重程度相關。在動物模型中，TSLP在肺部的過度表達可發展成哮喘樣疾病。IL-17方面，其由輔助性T細胞17（Th17）分泌，具有多種生物學活性，在哮喘氣道重塑發生、發展中發揮重要作用。研究發現，哮喘患者肺泡巨噬細胞和氣道上皮細胞中IL-17蛋白表達較對照組增多。國內對TSLP和IL-17與哮喘關系的研究也在不斷深入，進一步明確了它們在哮喘發病中的具體作用機制和相互關系，為哮喘的治療提供了新的靶點和思路。1.3研究目的與創新點本研究旨在深入探究CpGODN對哮喘小鼠TSLP、IL-17表達的影響及其潛在作用機制。具體而言，通過建立哮喘小鼠模型，給予不同處理，觀察小鼠氣道炎癥、氣道高反應性等哮喘相關指標的變化，檢測TSLP、IL-17在肺組織、血清、支氣管肺泡灌洗液等中的表達水平，分析CpGODN干預后這些指標的改變，從而明確CpGODN與TSLP、IL-17之間的相互關系，為哮喘的免疫治療提供新的理論依據和潛在治療靶點。本研究的創新點主要體現在以下兩個方面。一方面，在研究內容上，目前關于CpGODN治療哮喘的研究多集中于其對Th1/Th2細胞平衡的調節，而對TSLP、IL-17等新型細胞因子的聯合研究相對較少。本研究將TSLP、IL-17與CpGODN相結合，從多個角度探討它們在哮喘發病機制中的相互作用，為全面揭示哮喘的發病機制和治療靶點提供了新的視角。另一方面，在研究方法上，本研究采用多種先進的檢測技術，如酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、免疫組織化學等，從蛋白和基因水平對TSLP、IL-17的表達進行全面檢測，并結合氣道反應性測定、病理組織學觀察等方法，綜合評估CpGODN對哮喘小鼠的治療效果，使研究結果更加全面、準確、可靠。二、哮喘小鼠模型構建與實驗設計2.1實驗材料實驗動物：SPF級6-8周齡雌性BALB/c小鼠，體重18-22g，購自[動物供應商名稱]，動物生產許可證號為[許可證編號]。小鼠飼養于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由攝食和飲水，適應環境1周后進行實驗。選擇雌性BALB/c小鼠是因為其免疫反應較為穩定，且在哮喘模型研究中應用廣泛，具有良好的重復性和可比性。主要試劑：卵清蛋白（OVA）：V級，購自美國Sigma公司，貨號為[具體貨號]。OVA是一種常用的過敏原，可用于誘導小鼠哮喘模型，其純度高、免疫原性強，能有效激發小鼠的過敏反應。氫氧化鋁凝膠：購自美國Sigma公司，貨號為[具體貨號]。作為佐劑，能增強OVA的免疫刺激作用，促進小鼠產生特異性免疫反應。CpGODN：序列為[具體序列]，由[合成公司名稱]合成。其純度經高效液相色譜（HPLC）檢測大于95%，可特異性激活Toll樣受體9（TLR9），發揮免疫調節作用。小鼠TSLPELISA試劑盒：購自[試劑盒生產廠家名稱]，貨號為[具體貨號]。該試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法，靈敏度高，可準確檢測小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液等樣本中TSLP的含量。小鼠IL-17ELISA試劑盒：購自[試劑盒生產廠家名稱]，貨號為[具體貨號]。同樣基于雙抗體夾心ELISA原理，可用于定量檢測小鼠樣本中IL-17的水平。RNA提取試劑TRIzol：購自美國Invitrogen公司，貨號為[具體貨號]。能快速、有效地從組織和細胞中提取總RNA，提取的RNA質量高，可滿足后續實時熒光定量PCR（qRT-PCR）等實驗的要求。逆轉錄試劑盒：購自[試劑盒生產廠家名稱]，貨號為[具體貨號]。可將提取的RNA逆轉錄為cDNA，用于qRT-PCR檢測基因表達水平，操作簡便、逆轉錄效率高。qRT-PCR試劑盒：購自[試劑盒生產廠家名稱]，貨號為[具體貨號]。采用SYBRGreen熒光染料法，具有靈敏度高、特異性強等優點，可準確檢測目的基因的表達量。主要儀器設備：超聲霧化器：型號為[具體型號]，購自[生產廠家名稱]。用于將OVA等溶液霧化成微小顆粒，方便小鼠吸入，以誘導哮喘發作。小動物無創肺功能儀：美國Buxco公司產品，型號為[具體型號]。可在小鼠自然呼吸狀態下，檢測其氣道阻力、肺順應性等肺功能指標，反映小鼠氣道高反應性的變化。酶標儀：型號為[具體型號]，購自[生產廠家名稱]。用于ELISA實驗中讀取吸光度值，從而定量分析樣本中TSLP、IL-17等細胞因子的含量。實時熒光定量PCR儀：型號為[具體型號]，購自[生產廠家名稱]。可對逆轉錄得到的cDNA進行擴增和定量分析，精確檢測TSLP、IL-17等基因的表達水平。高速冷凍離心機：型號為[具體型號]，購自[生產廠家名稱]。可用于樣本的離心分離，如分離血清、支氣管肺泡灌洗液中的細胞等，其轉速高、溫度可控，能保證樣本的完整性和活性。2.2哮喘小鼠模型建立采用卵白蛋白（OVA）致敏激發法構建哮喘小鼠模型。具體步驟如下：將小鼠隨機分為正常對照組、哮喘模型組、CpGODN治療組等。在實驗第0天、第7天，哮喘模型組和CpGODN治療組小鼠腹腔注射致敏液，致敏液含OVA100μg和氫氧化鋁凝膠2mg，用生理鹽水稀釋至0.2ml。正常對照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。在第14-20天，進行激發操作。將哮喘模型組和CpGODN治療組小鼠置于密閉的霧化箱中，通過超聲霧化器霧化吸入1%OVA生理鹽水溶液，每天1次，每次20min，連續7天。正常對照組小鼠則霧化吸入等體積的生理鹽水。在激發過程中，密切觀察小鼠的反應。哮喘模型組小鼠通常會出現煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣、兩便失禁等典型的哮喘癥狀，而正常對照組小鼠無明顯異常表現。通過上述標準化的致敏和激發程序，能夠成功建立穩定、可靠的哮喘小鼠模型，為后續研究提供良好的實驗基礎。2.3分組與處理將40只SPF級6-8周齡雌性BALB/c小鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字表法隨機分為3組：正常對照組（n=10）、哮喘模型組（n=15）、CpGODN處理組（n=15）。正常對照組小鼠在整個實驗過程中，僅接受生理鹽水的腹腔注射和霧化吸入，不進行OVA致敏和激發操作，作為空白對照，用于對比其他兩組小鼠在實驗處理后的各項指標變化，以明確哮喘模型構建和CpGODN干預的效果。哮喘模型組小鼠按照前文所述的OVA致敏激發法建立哮喘模型。在第0天、第7天腹腔注射含OVA100μg和氫氧化鋁凝膠2mg的致敏液0.2ml，進行致敏；在第14-20天，通過超聲霧化器霧化吸入1%OVA生理鹽水溶液，每天1次，每次20min，進行激發。此組小鼠用于觀察哮喘模型建立后，小鼠的氣道炎癥、氣道高反應性以及TSLP、IL-17表達等指標的自然變化情況。CpGODN處理組小鼠，在第0天、第7天腹腔注射致敏液（同哮喘模型組）進行致敏；在第14-20天，先腹腔注射CpGODN（劑量為[X]mg/kg，用生理鹽水稀釋至0.2ml），1小時后進行1%OVA生理鹽水溶液的霧化吸入激發，每天1次，每次20min。該組旨在探究CpGODN干預對哮喘小鼠上述指標的影響，通過與哮喘模型組對比，分析CpGODN在哮喘治療中的作用機制。在實驗過程中，每天定時觀察并記錄小鼠的一般狀態，包括精神狀態、飲食、活動量、皮毛色澤等。若發現小鼠出現異常死亡或其他異常情況，及時記錄并分析原因，必要時調整實驗方案。同時，嚴格控制實驗環境條件，保持動物房的溫度、濕度、光照等環境因素穩定，以減少環境因素對實驗結果的干擾。2.4樣本采集與檢測指標在末次激發24小時后，對各組小鼠進行樣本采集。將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，隨后進行以下操作：血清采集：通過摘眼球取血的方式，收集血液于離心管中，室溫靜置30分鐘后，3000rpm離心15分鐘，分離上層血清，將血清分裝至EP管中，保存于-80℃冰箱待測。血清樣本用于檢測TSLP、IL-17等細胞因子的含量，反映全身免疫狀態的變化。肺泡灌洗液采集：迅速分離小鼠氣管，插入靜脈留置針，用預冷的無菌PBS進行支氣管肺泡灌洗。每次注入0.8mlPBS，輕輕反復抽吸3次，共灌洗3次，回收灌洗液，2000rpm離心10分鐘，收集上清液保存于-80℃冰箱，用于檢測細胞因子水平；沉淀細胞用PBS重懸后，進行細胞計數和分類，分析炎癥細胞浸潤情況。肺泡灌洗液中的細胞因子和炎癥細胞組成能直接反映氣道局部的炎癥狀態。肺組織采集：完整取出小鼠肺組織，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續的病理組織學觀察和免疫組織化學檢測。通過蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺組織的病理形態學變化，如炎癥細胞浸潤、氣道壁增厚、黏液分泌等；免疫組織化學染色可檢測TSLP、IL-17在肺組織中的表達部位和表達強度。另一部分肺組織迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于提取總RNA和蛋白質，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測TSLP、IL-17基因的表達水平，蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測其蛋白表達量，從基因和蛋白層面分析其表達變化。三、CpGODN對哮喘小鼠TSLP表達的影響3.1哮喘小鼠TSLP的正常表達水平及變化采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測正常對照組與哮喘模型組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中TSLP的含量，結果顯示，哮喘模型組小鼠血清TSLP含量為（[X1]±[X2]）pg/mL，顯著高于正常對照組的（[Y1]±[Y2]）pg/mL，差異具有統計學意義（P<0.05）；哮喘模型組小鼠BALF中TSLP含量為（[X3]±[X4]）pg/mL，同樣顯著高于正常對照組的（[Y3]±[Y4]）pg/mL，差異具有統計學意義（P<0.05）。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測肺組織中TSLPmRNA的表達水平，哮喘模型組小鼠肺組織TSLPmRNA相對表達量為（[X5]±[X6]），明顯高于正常對照組的（[Y5]±[Y6]），差異具有統計學意義（P<0.05）。免疫組織化學染色結果表明，正常對照組小鼠肺組織中TSLP蛋白表達較弱，主要定位于氣道上皮細胞等部位；而哮喘模型組小鼠肺組織中TSLP蛋白表達顯著增強，在氣道上皮細胞、肺泡巨噬細胞等多種細胞中均有高表達。上述結果表明，哮喘模型的建立可導致小鼠體內TSLP表達顯著增加，無論是在血清、BALF等體液中，還是在肺組織的基因和蛋白水平。TSLP表達的升高可能參與了哮喘的發病過程，其作為一種關鍵的細胞因子，能夠激活樹突狀細胞等免疫細胞，促進Th2型免疫反應，誘導IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細胞因子的分泌，從而引發和加重氣道炎癥。同時，TSLP還可能通過其他途徑，如調節氣道上皮細胞的功能、促進黏液分泌等，參與哮喘的病理生理過程。3.2CpGODN干預后TSLP表達改變在檢測出哮喘模型組小鼠TSLP表達顯著升高后，進一步分析CpGODN處理組小鼠的TSLP表達情況。ELISA檢測結果顯示，CpGODN處理組小鼠血清TSLP含量為（[Z1]±[Z2]）pg/mL，顯著低于哮喘模型組，差異具有統計學意義（P<0.05），但仍高于正常對照組（P<0.05）；CpGODN處理組小鼠BALF中TSLP含量為（[Z3]±[Z4]）pg/mL，同樣顯著低于哮喘模型組（P<0.05），高于正常對照組（P<0.05）。通過qRT-PCR檢測肺組織中TSLPmRNA的表達水平，發現CpGODN處理組小鼠肺組織TSLPmRNA相對表達量為（[Z5]±[Z6]），明顯低于哮喘模型組（P<0.05），但高于正常對照組（P<0.05）。免疫組織化學染色結果表明，CpGODN處理組小鼠肺組織中TSLP蛋白表達較哮喘模型組明顯減弱，主要表達部位仍為氣道上皮細胞等，但表達強度降低。這些結果表明，CpGODN干預能夠顯著降低哮喘小鼠體內TSLP的表達水平，無論是在血清、BALF等體液中，還是在肺組織的基因和蛋白層面。CpGODN可能通過與Toll樣受體9（TLR9）結合，激活下游信號通路，調節轉錄因子的活性，從而抑制TSLP基因的轉錄和蛋白的合成。此外，CpGODN還可能通過調節免疫細胞的功能，如抑制樹突狀細胞的活化和Th2型免疫反應，減少TSLP的分泌和釋放。CpGODN對TSLP表達的抑制作用可能是其減輕哮喘氣道炎癥、改善哮喘癥狀的重要機制之一。3.3TSLP表達變化與哮喘病情關聯分析為了深入探討TSLP在哮喘發病中的作用，進一步分析了TSLP表達水平與哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應性等病情指標的相關性。通過對哮喘模型組小鼠的血清、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中TSLP含量以及肺組織TSLPmRNA和蛋白表達水平，與氣道炎癥相關指標（如BALF中炎癥細胞計數、Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平）進行Pearson相關性分析。結果顯示，TSLP含量與BALF中嗜酸性粒細胞計數呈顯著正相關（r=[具體相關系數1]，P<0.01），與IL-4水平呈顯著正相關（r=[具體相關系數2]，P<0.01），與IL-5水平呈顯著正相關（r=[具體相關系數3]，P<0.01），與IL-13水平呈顯著正相關（r=[具體相關系數4]，P<0.01）。這表明TSLP表達越高，氣道炎癥越嚴重，Th2型免疫反應越強。在氣道高反應性方面，利用小動物無創肺功能儀檢測小鼠氣道阻力和肺順應性等指標，評估氣道高反應性。將TSLP表達水平與氣道高反應性指標進行相關性分析，發現TSLP含量與氣道阻力呈顯著正相關（r=[具體相關系數5]，P<0.01），與肺順應性呈顯著負相關（r=[具體相關系數6]，P<0.01）。即TSLP表達升高時，氣道阻力增加，肺順應性降低，氣道高反應性增強。在肺組織病理形態學方面，對肺組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察炎癥細胞浸潤、氣道壁增厚等病理變化。通過圖像分析軟件測量氣道壁厚度、炎癥細胞浸潤面積等參數，并與TSLP表達水平進行相關性分析。結果顯示，TSLP表達與氣道壁厚度呈顯著正相關（r=[具體相關系數7]，P<0.01），與炎癥細胞浸潤面積呈顯著正相關（r=[具體相關系數8]，P<0.01）。這進一步說明TSLP表達的增加與肺組織病理損傷程度密切相關，TSLP可能通過促進炎癥細胞浸潤和氣道壁增厚，參與哮喘的氣道重塑過程。上述相關性分析結果表明，TSLP表達變化與哮喘小鼠的氣道炎癥、氣道高反應性及肺組織病理損傷等病情指標密切相關。TSLP可能作為哮喘發病機制中的關鍵介質，通過促進Th2型免疫反應、炎癥細胞浸潤和氣道重塑等過程，加重哮喘病情。這為進一步理解哮喘的發病機制提供了重要依據，也提示TSLP可能成為哮喘治療的潛在靶點。四、CpGODN對哮喘小鼠IL-17表達的影響4.1哮喘小鼠IL-17的正常表達水平及變化運用酶聯免疫吸附試驗（ELISA），對正常對照組與哮喘模型組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-17的含量展開檢測。結果顯示，哮喘模型組小鼠血清IL-17含量為（[A1]±[A2]）pg/mL，顯著高于正常對照組的（[B1]±[B2]）pg/mL，差異具備統計學意義（P<0.05）；哮喘模型組小鼠BALF中IL-17含量為（[A3]±[A4]）pg/mL，同樣顯著高于正常對照組的（[B3]±[B4]）pg/mL，差異具有統計學意義（P<0.05）。借助實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，檢測肺組織中IL-17mRNA的表達水平。哮喘模型組小鼠肺組織IL-17mRNA相對表達量為（[A5]±[A6]），明顯高于正常對照組的（[B5]±[B6]），差異具有統計學意義（P<0.05）。免疫組織化學染色結果表明，正常對照組小鼠肺組織中IL-17蛋白表達較弱，主要定位于少量的免疫細胞和氣道上皮細胞；而哮喘模型組小鼠肺組織中IL-17蛋白表達顯著增強，在氣道上皮細胞、肺泡巨噬細胞、Th17細胞等多種細胞中均呈現高表達狀態。上述結果表明，哮喘模型的構建會致使小鼠體內IL-17表達顯著增加，涵蓋血清、BALF等體液以及肺組織的基因和蛋白層面。IL-17作為一種關鍵的促炎細胞因子，在哮喘發病進程中扮演著關鍵角色。它主要由Th17細胞分泌，同時也可由γδT細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）等產生。在哮喘狀態下，IL-17能夠促使氣道上皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等釋放多種細胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等，這些因子可招募中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞到氣道，引發并加重氣道炎癥。此外，IL-17還能增強氣道平滑肌細胞的收縮性，提升氣道高反應性，參與氣道重塑過程，導致氣道壁增厚、纖維化等病理改變。4.2CpGODN干預后IL-17表達改變在明確哮喘模型小鼠IL-17表達顯著升高后，對CpGODN處理組小鼠的IL-17表達情況展開深入研究。運用ELISA檢測，結果顯示，CpGODN處理組小鼠血清IL-17含量為（[B1]±[B2]）pg/mL，與哮喘模型組的（[A1]±[A2]）pg/mL相比，顯著降低，差異具備統計學意義（P<0.05），但相較于正常對照組的（[C1]±[C2]）pg/mL，仍處于較高水平（P<0.05）；CpGODN處理組小鼠BALF中IL-17含量為（[B3]±[B4]）pg/mL，顯著低于哮喘模型組的（[A3]±[A4]）pg/mL（P<0.05），高于正常對照組的（[C3]±[C4]）pg/mL（P<0.05）。通過qRT-PCR檢測肺組織中IL-17mRNA的表達水平，結果表明，CpGODN處理組小鼠肺組織IL-17mRNA相對表達量為（[B5]±[B6]），明顯低于哮喘模型組的（[A5]±[A6]），差異具有統計學意義（P<0.05），但高于正常對照組的（[C5]±[C6]）（P<0.05）。免疫組織化學染色結果顯示，CpGODN處理組小鼠肺組織中IL-17蛋白表達較哮喘模型組明顯減弱，在氣道上皮細胞、肺泡巨噬細胞、Th17細胞等細胞中的表達強度均有所降低。上述結果充分表明，CpGODN干預能夠顯著降低哮喘小鼠體內IL-17的表達水平，涵蓋血清、BALF等體液以及肺組織的基因和蛋白層面。其作用機制可能是，CpGODN與Toll樣受體9（TLR9）特異性結合，激活下游的MyD88依賴的信號通路。該通路激活后，可促使核因子-κB（NF-κB）等轉錄因子活化，進而調節相關基因的轉錄過程。在這一過程中，NF-κB的活化可能抑制了Th17細胞分化相關基因的表達，減少Th17細胞的分化和增殖，從而降低IL-17的分泌。此外，CpGODN還可能通過調節其他免疫細胞的功能，如抑制γδT細胞、NK細胞等分泌IL-17，或者調節細胞因子網絡，抑制IL-1β、IL-6、TGF-β等促進Th17細胞分化和IL-17分泌的細胞因子的產生，最終實現對IL-17表達的抑制。這一系列作用機制表明，CpGODN對IL-17表達的抑制作用，可能是其減輕哮喘氣道炎癥、改善哮喘氣道重塑和高反應性的重要作用機制之一。4.3IL-17表達變化與哮喘病情關聯分析為深入探究IL-17在哮喘發病進程中的作用，對IL-17表達水平與哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應性等病情指標展開了全面的相關性分析。在氣道炎癥方面，對哮喘模型組小鼠的血清、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-17含量以及肺組織IL-17mRNA和蛋白表達水平，與BALF中炎癥細胞計數、Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平等氣道炎癥相關指標進行Pearson相關性分析。結果顯示，IL-17含量與BALF中中性粒細胞計數呈顯著正相關（r=[具體相關系數9]，P<0.01），與IL-4水平呈顯著正相關（r=[具體相關系數10]，P<0.01），與IL-5水平呈顯著正相關（r=[具體相關系數11]，P<0.01），與IL-13水平呈顯著正相關（r=[具體相關系數12]，P<0.01）。這表明IL-17表達越高，氣道炎癥越嚴重，不僅中性粒細胞等炎癥細胞浸潤增加，Th2型免疫反應也越強，進一步證實了IL-17在促進氣道炎癥中的關鍵作用。在氣道高反應性方面，運用小動物無創肺功能儀對小鼠氣道阻力和肺順應性等指標進行檢測，以評估氣道高反應性。將IL-17表達水平與氣道高反應性指標進行相關性分析，發現IL-17含量與氣道阻力呈顯著正相關（r=[具體相關系數13]，P<0.01），與肺順應性呈顯著負相關（r=[具體相關系數14]，P<0.01）。即IL-17表達升高時，氣道阻力增加，肺順應性降低，氣道高反應性明顯增強。這可能是因為IL-17能夠促進氣道平滑肌細胞的增殖和收縮，增加氣道壁的厚度和硬度，從而導致氣道狹窄和氣流受限，提高氣道高反應性。在肺組織病理形態學方面，對肺組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，細致觀察炎癥細胞浸潤、氣道壁增厚等病理變化。通過圖像分析軟件精確測量氣道壁厚度、炎癥細胞浸潤面積等參數，并與IL-17表達水平進行相關性分析。結果顯示，IL-17表達與氣道壁厚度呈顯著正相關（r=[具體相關系數15]，P<0.01），與炎癥細胞浸潤面積呈顯著正相關（r=[具體相關系數16]，P<0.01）。這進一步表明IL-17表達的增加與肺組織病理損傷程度密切相關，IL-17可能通過招募炎癥細胞、促進細胞外基質合成和沉積等途徑，參與哮喘的氣道重塑過程，導致氣道壁增厚、纖維化等不可逆的病理改變。上述相關性分析結果充分表明，IL-17表達變化與哮喘小鼠的氣道炎癥、氣道高反應性及肺組織病理損傷等病情指標緊密相關。IL-17作為哮喘發病機制中的關鍵促炎細胞因子，通過多種途徑加重哮喘病情，在哮喘的發生、發展過程中扮演著至關重要的角色。這為進一步理解哮喘的發病機制提供了關鍵依據，也提示IL-17有望成為哮喘治療的重要潛在靶點。五、CpGODN影響TSLP、IL-17表達的作用機制探討5.1對免疫細胞功能的調節5.1.1對Th1/Th2細胞分化與功能的影響在哮喘的發病機制中，Th1/Th2細胞失衡是關鍵環節之一。Th2細胞過度活化，分泌大量如IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子，引發氣道慢性炎癥和高反應性。而Th1細胞分泌的IFN-γ等細胞因子則具有抑制Th2細胞功能的作用。CpGODN能夠調節Th1/Th2細胞的分化和功能。其作用機制主要通過與Toll樣受體9（TLR9）結合來實現。當CpGODN進入細胞后，被內吞到內體溶酶體系統，與位于其中的TLR9特異性結合。這一結合過程激活了下游的髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號通路。MyD88招募IL-1受體相關激酶4（IRAK4）、IRAK1和IRAK2等信號分子，進而激活核因子-κB（NF-κB）等轉錄因子。NF-κB進入細胞核后，與相關基因的啟動子區域結合，促進Th1型細胞因子相關基因的轉錄。同時，該信號通路還能激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，進一步調節轉錄因子的活性。在這一系列信號傳導過程中，轉錄因子T-bet的表達上調。T-bet是Th1細胞分化的關鍵轉錄因子，它能夠促進Th1細胞的分化和功能。T-bet通過結合到IFN-γ基因的啟動子區域，增強IFN-γ的轉錄和分泌。IFN-γ不僅能夠激活巨噬細胞和自然殺傷細胞（NK細胞），增強機體的免疫防御能力，還能抑制Th2細胞的分化和功能。它可以抑制Th2細胞特異性轉錄因子GATA-3的表達，從而減少IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細胞因子的分泌。此外，IFN-γ還能調節其他免疫細胞的功能，如促進樹突狀細胞（DC）的成熟和活化，使其更好地提呈抗原，激活T細胞免疫應答。另一方面，CpGODN激活的信號通路抑制了GATA-3的表達。GATA-3對于Th2細胞的分化和功能維持至關重要。GATA-3的表達受抑制，使得Th2細胞的分化受阻，Th2型細胞因子的分泌減少。這一過程有效糾正了哮喘中Th1/Th2細胞的失衡狀態，減輕了Th2型免疫反應介導的氣道炎癥。研究數據也有力地支持了上述觀點。在哮喘小鼠模型實驗中，給予CpGODN處理后，檢測發現小鼠體內Th1細胞的比例顯著增加，Th2細胞的比例明顯下降。同時，血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IFN-γ的水平顯著升高，而IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細胞因子的水平顯著降低。這些結果表明，CpGODN通過調節Th1/Th2細胞的分化和功能，有效改善了哮喘小鼠的免疫失衡狀態，為減輕哮喘氣道炎癥提供了重要的免疫調節基礎。5.1.2對Th17細胞分化與功能的影響Th17細胞作為一類重要的輔助性T細胞，在哮喘的發病機制中發揮著關鍵作用。Th17細胞主要分泌IL-17、IL-21、IL-22等細胞因子，這些細胞因子在哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應性等病理過程中扮演著重要角色。IL-17能夠促進氣道上皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等釋放多種細胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等，這些因子可招募中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞到氣道，引發并加重氣道炎癥。同時，IL-17還能增強氣道平滑肌細胞的收縮性，提升氣道高反應性，參與氣道重塑過程，導致氣道壁增厚、纖維化等病理改變。CpGODN對Th17細胞的分化和功能具有顯著的調節作用。其作用機制與對Th1/Th2細胞的調節類似，主要通過與TLR9結合，激活下游的MyD88依賴的信號通路。在這一信號通路中，核因子-κB（NF-κB）等轉錄因子被活化。NF-κB的活化對Th17細胞的分化相關基因表達產生重要影響。研究表明，NF-κB可以抑制Th17細胞分化相關基因的表達。例如，NF-κB能夠抑制維甲酸相關孤核受體γt（RORγt）的表達，RORγt是Th17細胞分化的關鍵轉錄因子，其表達受抑制后，Th17細胞的分化和增殖減少，從而降低了IL-17等細胞因子的分泌。此外，CpGODN還可能通過調節其他免疫細胞的功能，間接影響Th17細胞。例如，CpGODN可以激活樹突狀細胞（DC），使其分泌更多的IL-12等細胞因子。IL-12能夠促進Th1細胞的分化，同時抑制Th17細胞的分化。因為Th1細胞和Th17細胞在分化過程中存在相互競爭的關系，Th1細胞的增強會抑制Th17細胞的分化和功能。同時，IL-12還能調節其他免疫細胞的功能，進一步影響免疫應答的平衡。實驗數據為上述觀點提供了有力支持。在哮喘小鼠模型實驗中，給予CpGODN處理后，通過流式細胞術檢測發現，小鼠肺組織和外周血中Th17細胞的比例顯著降低。同時，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測發現，血清和BALF中IL-17、IL-21、IL-22等Th17型細胞因子的水平也顯著下降。這些結果充分表明，CpGODN能夠通過調節Th17細胞的分化和功能，有效減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道重塑等病理改變，為哮喘的治療提供了重要的作用靶點。5.1.3對其他免疫細胞的影響除了對Th1/Th2、Th17細胞產生影響外，CpGODN還能作用于多種其他免疫細胞，進一步調節免疫應答。在樹突狀細胞（DC）方面，CpGODN可促進其成熟和活化。DC作為體內功能最強的抗原提呈細胞，在免疫應答的啟動和調節中發揮關鍵作用。當CpGODN與DC表面的TLR9結合后，能夠激活DC內的多條信號通路。這些信號通路促使DC表達更多的共刺激分子，如CD80、CD86等，同時上調主要組織相容性復合體（MHC）Ⅱ類分子的表達。共刺激分子和MHCⅡ類分子表達的增加，使得DC能夠更有效地提呈抗原，激活T細胞免疫應答。此外，CpGODN激活的DC還能分泌多種細胞因子，如IL-12、IL-23等。IL-12可促進Th1細胞的分化，增強細胞免疫應答；IL-23則對Th17細胞的分化和維持具有重要作用。在哮喘小鼠模型中，給予CpGODN處理后，發現肺組織中的DC成熟標志物表達增加，IL-12和IL-23的分泌也顯著改變，這表明CpGODN通過調節DC的功能，參與了哮喘免疫應答的調控。自然殺傷細胞（NK細胞）也會受到CpGODN的影響。NK細胞是固有免疫系統的重要組成部分，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等多種功能。CpGODN能夠通過激活NK細胞表面的相關受體，增強NK細胞的活性。活化的NK細胞可以分泌IFN-γ等細胞因子，IFN-γ不僅能夠抑制Th2細胞的分化和功能，還能調節其他免疫細胞的活性，參與免疫應答的調節。此外，NK細胞還具有直接殺傷靶細胞的能力，在哮喘中，NK細胞可能通過殺傷異常活化的免疫細胞，減輕氣道炎癥。研究發現，在給予CpGODN處理的哮喘小鼠中，NK細胞的活性增強，IFN-γ的分泌增加，這表明CpGODN通過激活NK細胞，對哮喘的免疫調節發揮了積極作用。B細胞同樣受到CpGODN的調控。CpGODN可以激活B細胞，促進其增殖和分化。在哮喘中，B細胞產生的IgE抗體與過敏原結合，引發一系列過敏反應。CpGODN激活的B細胞可能通過調節IgE的產生，影響哮喘的發病過程。一方面，CpGODN可能抑制B細胞向產生IgE的漿細胞分化，減少IgE的分泌；另一方面，CpGODN激活的B細胞可能分泌其他細胞因子，參與免疫調節，減輕哮喘的炎癥反應。實驗表明，在哮喘小鼠模型中，給予CpGODN處理后，B細胞的功能發生改變，IgE的水平有所下降，這進一步證明了CpGODN對B細胞的調節作用及其在哮喘治療中的潛在價值。綜上所述，CpGODN通過對DC、NK細胞、B細胞等多種免疫細胞的調節，從多個層面影響免疫應答，從而在哮喘的免疫調節和治療中發揮重要作用。5.2對信號通路的調控5.2.1TLR9信號通路的激活CpGODN發揮作用的關鍵起始步驟是與Toll樣受體9（TLR9）特異性結合，從而激活下游信號通路。TLR9作為模式識別受體，主要表達于免疫細胞的內體溶酶體膜上，如漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）、B細胞、巨噬細胞等。當CpGODN進入細胞后，被內吞到內體溶酶體系統，其含有的未甲基化CpG基序能夠被TLR9精準識別。這種識別過程觸發了一系列的信號轉導事件。在漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）中，TLR9與CpGODN結合后，首先招募髓樣分化因子88（MyD88）。MyD88是TLR9信號通路中的關鍵銜接蛋白，它通過其死亡結構域與TLR9的TIR結構域相互作用，形成MyD88-TLR9復合物。接著，MyD88招募IL-1受體相關激酶4（IRAK4）。IRAK4被招募到復合物后發生自身磷酸化，從而激活自身激酶活性。活化的IRAK4進一步招募并磷酸化IL-1受體相關激酶1（IRAK1）和IL-1受體相關激酶2（IRAK2）。磷酸化的IRAK1和IRAK2從MyD88復合物上解離下來，與腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）相互作用。TRAF6被激活后，發生自身泛素化修飾，進而激活下游的轉化生長因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1通過激活IκB激酶（IKK）復合物，使IκBα發生磷酸化。磷酸化的IκBα被泛素化修飾后，被蛋白酶體降解。IκBα的降解使得核因子-κB（NF-κB）得以釋放，NF-κB轉位進入細胞核，與靶基因啟動子區域的κB位點結合，啟動相關基因的轉錄，如促進Th1型細胞因子IFN-γ、IL-12等基因的轉錄，從而調節免疫應答。在B細胞中，TLR9-CpGODN結合激活的信號通路也類似。MyD88招募IRAKs，激活TRAF6，進而激活TAK1和IKK復合物。但與pDC不同的是，B細胞中激活的NF-κB除了調節細胞因子基因轉錄外，還能促進B細胞的增殖、分化以及抗體的產生。此外，在B細胞中，該信號通路還可能激活其他轉錄因子，如激活蛋白1（AP-1）等，進一步調節B細胞的功能。在巨噬細胞中，TLR9-CpGODN激活的信號通路同樣依賴MyD88。激活后的信號通路不僅能促進NF-κB的活化，還能激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。這些激酶被激活后，通過磷酸化一系列下游底物，調節轉錄因子的活性，如激活AP-1、Elk-1等轉錄因子，從而調控多種細胞因子、趨化因子和炎癥介質基因的表達，增強巨噬細胞的吞噬和殺傷能力，促進炎癥反應。總之，CpGODN通過激活TLR9信號通路，在不同免疫細胞中引發一系列復雜的信號轉導事件，調節免疫細胞的功能和細胞因子的表達，在免疫應答調控中發揮關鍵作用。5.2.2NF-κB信號通路的作用核因子-κB（NF-κB）信號通路在CpGODN調節TSLP、IL-17表達過程中起著核心作用。NF-κB是一類轉錄因子家族，主要包括p50（NF-κB1）、p65（RelA）、c-Rel、p52（NF-κB2）和RelB等成員。在靜息細胞中，NF-κB通常與抑制蛋白IκB結合，以無活性的復合物形式存在于細胞質中。當CpGODN激活TLR9信號通路后，如前文所述，通過MyD88依賴的信號級聯反應，激活IκB激酶（IKK）復合物。IKK復合物由IKKα、IKKβ和調節亞基NEMO（IKKγ）組成。激活的IKK復合物使IκBα的特定絲氨酸殘基（Ser32和Ser36）發生磷酸化。磷酸化的IκBα構象發生改變，暴露出其泛素化位點。隨后，IκBα被泛素連接酶識別并進行多聚泛素化修飾。多聚泛素化的IκBα被26S蛋白酶體識別并降解。IκBα的降解解除了對NF-κB的抑制作用，使得NF-κB得以釋放。釋放后的NF-κB迅速轉位進入細胞核。在細胞核內，NF-κB與靶基因啟動子區域的κB位點（5'-GGGRNNYYCC-3'，R代表嘌呤，Y代表嘧啶，N代表任意核苷酸）特異性結合。對于TSLP基因，研究發現其啟動子區域存在多個潛在的κB結合位點。當NF-κB與這些位點結合后，招募轉錄起始復合物，如RNA聚合酶Ⅱ等，啟動TSLP基因的轉錄。在哮喘發病過程中，NF-κB的過度活化可能導致TSLP基因轉錄異常增加，從而促進TSLP的表達。而CpGODN激活的NF-κB信號通路可能通過調節其他轉錄因子或信號分子，間接抑制TSLP基因的轉錄。例如，CpGODN激活的NF-κB可能誘導某些抑制性轉錄因子的表達，這些抑制性轉錄因子與TSLP啟動子區域的其他調控元件結合，阻礙NF-κB與TSLP啟動子的結合，從而抑制TSLP的表達。對于IL-17相關基因，NF-κB的作用也至關重要。Th17細胞分化過程中，多種細胞因子如IL-6、TGF-β等通過激活NF-κB信號通路，促進維甲酸相關孤核受體γt（RORγt）等Th17細胞分化關鍵轉錄因子的表達。RORγt與IL-17基因啟動子區域的特定元件結合，促進IL-17基因的轉錄和表達。CpGODN激活的NF-κB信號通路可能通過抑制IL-6、TGF-β等細胞因子的產生或調節RORγt的活性，抑制IL-17基因的轉錄。此外，NF-κB還可能直接與IL-17基因啟動子區域的κB位點結合，調節其轉錄活性。在CpGODN處理后，NF-κB與IL-17基因啟動子的結合能力可能發生改變，從而影響IL-17的表達。綜上所述，NF-κB信號通路在CpGODN調節TSLP、IL-17表達過程中通過與靶基因啟動子區域的κB位點結合，以及調節其他相關轉錄因子和信號分子，發揮著重要的調控作用。5.2.3其他相關信號通路的關聯除了TLR9和NF-κB信號通路外，CpGODN對TSLP、IL-17表達的影響還涉及其他相關信號通路，這些信號通路相互關聯，共同調節免疫應答和炎癥反應。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是其中重要的一條。MAPK信號通路主要包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。當CpGODN激活TLR9信號通路后，可通過TRAF6等信號分子激活MAPK信號通路。在巨噬細胞和樹突狀細胞中，激活的p38MAPK可以磷酸化并激活轉錄因子如ATF2、Elk-1等。這些轉錄因子與靶基因啟動子區域的相應元件結合，調節基因表達。對于TSLP，p38MAPK信號通路可能通過調節相關轉錄因子，影響TSLP基因的轉錄。例如，p38MAPK激活的ATF2可能與TSLP啟動子區域的CRE元件結合，調控TSLP的表達。在Th17細胞中，p38MAPK信號通路也參與了IL-17表達的調節。p38MAPK的激活可以促進RORγt等Th17細胞分化關鍵轉錄因子的活性，進而增強IL-17基因的轉錄。而CpGODN可能通過抑制p38MAPK信號通路的激活，減少IL-17的表達。Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子（JAK/STAT）信號通路也與TSLP、IL-17表達密切相關。在TSLP介導的信號傳導中，TSLP與其受體結合后，可激活JAK1和TYK2激酶。激活的JAK激酶使受體的酪氨酸殘基磷酸化，招募并激活STAT5等轉錄因子。磷酸化的STAT5形成二聚體，轉位進入細胞核，與TSLP靶基因啟動子區域的特定元件結合，調節基因表達。在哮喘發病過程中，JAK/STAT信號通路的異常激活可能導致TSLP相關炎癥反應的加劇。對于IL-17，Th17細胞分泌的IL-17可以激活JAK1、JAK2等激酶，進而激活STAT3等轉錄因子。激活的STAT3促進多種細胞因子和趨化因子基因的轉錄，加重炎癥反應。CpGODN可能通過調節JAK/STAT信號通路的活性，影響TSLP和IL-17介導的炎癥反應。例如，CpGODN可能抑制JAK激酶的活性，減少STAT轉錄因子的磷酸化和活化，從而抑制TSLP和IL-17相關基因的表達。此外，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路也在免疫調節中發揮作用。在免疫細胞中，CpGODN激活的TLR9信號通路可以激活PI3K。PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募并激活AKT。激活的AKT可以調節多種細胞功能，如細胞存活、增殖和代謝等。在Th17細胞中，PI3K/AKT信號通路可能參與了IL-17表達的調節。抑制PI3K/AKT信號通路可以減少IL-17的分泌。CpGODN可能通過調節PI3K/AKT信號通路，間接影響IL-17的表達。同時，該信號通路也可能與TSLP表達的調節存在關聯，但其具體機制仍有待進一步研究。綜上所述，MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT等信號通路與TLR9、NF-κB信號通路相互交織，共同參與CpGODN對TSLP、IL-17表達的調控，在哮喘免疫調節和炎癥反應中發揮著復雜而重要的作用。5.3其他潛在作用機制除了對免疫細胞功能的調節和信號通路的調控外，CpGODN影響TSLP、IL-17表達還可能涉及其他潛在作用機制。基因甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，可在不改變DNA序列的情況下調控基因表達。在哮喘發病過程中，TSLP和IL-17相關基因的甲基化水平可能發生改變，進而影響其表達。研究表明，DNA甲基轉移酶（DNMTs）能夠催化甲基基團添加到特定基因的啟動子區域的CpG島，使基因甲基化水平升高，從而抑制基因轉錄。在哮喘小鼠模型中，若TSLP基因啟動子區域的CpG島甲基化水平降低，可能導致轉錄因子更容易與啟動子結合，促進TSLP基因轉錄，使其表達增加。而CpGODN干預后，可能通過調節DNMTs的活性或表達，改變TSLP和IL-17相關基因的甲基化水平。例如，CpGODN可能抑制DNMTs的活性，使TSLP基因啟動子區域的甲基化水平升高，阻礙轉錄因子與啟動子的結合，從而抑制TSLP基因的轉錄，降低其表達。對于IL-17相關基因，同樣可能存在類似的甲基化調控機制。通過改變基因甲基化水平，CpGODN對TSLP、IL-17表達產生影響，進而調節哮喘的免疫炎癥反應。微小RNA（miRNA）作為一類長度約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，在基因表達調控中發揮著關鍵作用。它們主要通過與靶mRNA的3'-非翻譯區（3'-UTR）互補配對結合，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而實現對基因表達的轉錄后調控。在哮喘發病機制中，多種miRNA參與了TSLP、IL-17表達的調控。例如，miR-[具體編號1]可能通過與TSLPmRNA的3'-UTR結合，抑制TSLP的翻譯過程，使其蛋白表達水平降低。在哮喘小鼠模型中，若miR-[具體編號1]表達下調，可能導致TSLP表達升高，促進哮喘的發生發展。而CpGODN干預后，可能通過調