項目一

細胞培養基礎任務二細胞培養前的準備食品藥品系

王家利細胞培

養細胞培養前的準備細胞培養復習提問：動物細胞體外培養需要哪些生長條件？動物細胞體外培養的要求非常苛刻，因此在正式進行體外培養實驗之前，要做好充分、細致的實驗準備工作。其中，培養用品和培養用液是直接與所培養細胞接觸的，對培養細胞的繁殖生長至關重要，是準備工作的重點。細胞培

養培養器材的準備自主查閱（課后）細胞培養（1）常用的培養用品可分為哪幾大類？主要有哪些？（2）不同類型的培養用品如何進行清洗？需注意哪些問題？（3）培養用品包裝時應注意哪些問題？（4）正壓除菌濾器的包裝和滅菌應注意哪些問題？（5）常用的消毒和滅菌方法有哪些？細胞培養技術從生物體內取出組織或細胞，在體外(invitro)模擬體內生理環境，在無菌、適當溫度和一定營養條件下，對這些組織或細胞進行孵育培養，使之保持一定的結構和功能，以便于我們觀察研究，這種方法就是細胞培養（cellculture）。有時細胞培養也稱為組織培養（tissueculture)。細胞培養目的和用途1、科學研究

（1）藥物研究開發，如新藥篩選，疫苗、基因工程藥物、細胞工程、藥物研究與開發、單克隆抗體制備等（2）基礎研究，如藥物作用機理、基因功能、疾病發生機理等研究2、生物制藥（1）疫苗生產：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫苗（腫瘤疫苗)等（2）基因工程藥物生產：如EPO等（3）抗體藥物、基因治療藥物生產（4）細胞工程藥物生產：生物細胞內的一些生物活性多肽，生物活性物質等（5）利用細胞法體外測定生物活性物質的活性；并預測其在體內的藥效和替代體內法檢測其成品的生物活性初代培養（primaryculture）

又稱原代培養，即直接從體內取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養物，一般持續1-4周。一旦已進行傳代培養（Subculture）的細胞，便不再稱為初代培養，而改稱為細胞系。傳代培養（subculture/passage）

細胞在培養器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養器皿中,一般情況下可傳代10-50次。也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。克隆（clone）從一個細胞靠有絲分裂獲得的一個細胞群體（population）從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株（strain）再由原細胞株進一步分離培養出與原株性狀不同的細胞群，稱為亞株（Substrain）細胞株cellstrain:

由原代培養中，用選擇或克隆，選出具有特征標記的細胞，經傳代形成細胞株。如果不能繼續傳代或傳代數有限，稱為有限細胞株（finitecellstrain）如果可以連續傳代，稱為連續細胞株（continuouscellstrain）。國內外相關細胞庫

國內細胞庫

武漢細胞庫

/fzlbc/cell.doc

上海細胞庫

/xibao/catalogue.html

昆明細胞庫

/CELL.HTM

成都基因治療腫瘤藥物工程技術研究中心細胞及載體服務

/cell_catalog.asp

南京中醫藥大學新藥及海洋藥物研究中心藥理毒理研究室細胞庫目錄

/web/keyanziyuan/haiyangcell1.htm

湖南遠泰生物技術有限公司生物資源庫

/Source.asp

上海午立生物技術有限公司細胞株

/cpjs-4.htm

中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心保藏細胞目錄

/cellhouse.doc

上海華大天源生物科技有限公司提供高表達GPCR細胞株和報告基因分析細胞系：

/03chanpin.htm

中國工業微生物菌種保藏中心

/inl%20col/introduction.htm

臺灣快興科技股份有限公司Cambrex產品

.tw/Cambrex.htm

臺灣國家衛生研究院

.tw/index/home2.htm

美國和歐洲細胞庫

ATCC（細胞株及胚胎干細胞庫）

1）下載細胞庫目錄：/pdf/tcl.pdf2）查詢細胞株：/SearchCatalogs/CellBiology.cfm3）胚胎干細胞庫：/products/cells.cfm

CABRI(包括ECACC、DSMZ)

/HyperCat/cells/all.htm

CAMBREX

/Content/General/CatalogMap.asp

意大利I.A.Z.

http://www.i-a-z-zellkultur.de/haupt_en/cell.html

歐洲細胞實驗室列表（大全）

http://www.biotech.ist.unige.it/cldb/labs.html

意大利IZSLER細胞庫

http://www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/

ABi病毒

/products/viruses/default.htm

德國PromoCell原代細胞

/en/Navigate/product0.php3?target1=11lang=US

細胞庫ATCC:AmericanTypeCultureCollection(美國標準培養物收集所)ECACC:EuropeanCollectionofCellCultures(歐洲動物細胞庫)JCRB:JapaneseCollectionofResearchBioresources(日本細胞庫)CCTCC:ChinaCenterforTypeCultureCollection(中國典型培養物保藏中心)要求1、無污染環境：保證細胞生存的首要條件

2、恒定的溫度：36.5℃±0.5℃

3、氣體環境：95%空氣，5%二氧化碳混合氣體4、細胞培養基：基礎物質、生存環境(pH7.2-7.4、滲透壓)

培養細胞生存條件培養細胞的生存條件培養皿或培養瓶

溫度、濕度和氣體由CO2恒溫孵育箱提供

生長培養液10～20％血清

維持培養液2～5％血清

營養物質糖、氨基酸、維生素、無機離子、微量元素等

常用的培養用品細胞培養玻璃器皿：主要有平皿、細胞培養瓶、試管、燒杯、三角瓶、容量瓶、血清瓶、青霉素瓶、吸管、量筒等。金屬器械：包括解剖剪、眼科剪(直頭和彎頭)、鑷子(中號)、眼科鑷

(直頭和彎頭)等。橡膠制品：主要是密閉某些器皿的膠塞。塑料制品：包括一次性塑料培養皿、細胞瓶、多孔培養板、移液槍的槍頭和塑料濾器等。布類制品：醫用紗布，用于原代培養的取材、實驗臺面的常規擦拭和清洗。培養用品清洗和消毒程序細胞培養清洗玻璃器皿的清洗浸泡（自來水或2%鹽酸過夜）→ 刷洗（洗衣粉液） →酸泡（10%硝酸過夜） →沖洗（自來水→蒸餾水潤洗5次→三蒸水潤洗5次） → 50℃烘干細胞培養→蒸餾水、三蒸水橡膠、塑料制品的清洗清水浸泡8h→流水沖洗（8－10遍）浸洗5次→晾干或37℃烘干備用。金屬器械的清洗清水浸泡10min→放到含洗滌劑的水中刷洗干凈→自來水沖洗干凈→甩干→用75％酒精棉球擦拭→自來水沖洗干凈→最后三蒸水浸洗3次，晾干或50℃烘干備用。正壓除菌濾器的清洗含稀洗滌劑的水中，反復刷洗后→流水沖洗15min→漓水→蒸餾水浸泡過夜→三蒸水浸泡過夜→晾干或50℃烘干備用。清洗細胞培養清洗時應注意：浸泡、酸泡的器皿內要充滿液體，不得有氣泡。沖洗時要流水振蕩沖洗，方法是：每瓶灌2/3容積的自來水，振蕩后倒掉，重復8-10次。清洗細胞培養局部包裝：較大瓶皿如細胞培養瓶、燒杯、血清瓶、三角瓶等以及體積較小，但瓶口包裝方便的容器如青霉素瓶等的包裝。全包裝：體積較小的培養瓶皿、膠塞、瓶蓋及不便局部包裝的用具如金屬器械等，需采用全包裝，現多采用直接裝入鋁飯盒的方法（金屬器械一般要用3～4層紗布包裹再送入鋁飯盒）。培養瓶的局部包裝包裝細胞培養包裝時應注意：手指與器材接觸面積要小，手指不能觸及器材的使用端；封閉器材使用端，標記器材手持端；小包裝；玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端等）加棉花。包裝細胞培養包裝細胞培養正壓除菌濾器的包裝在包裝前應將正壓除菌濾器濾膜裝好，注意濾膜在使用前需經三蒸水浸泡過夜。為保證過濾效果，可安裝兩層0.22μm濾膜。然后用鋁箔或牛皮紙包好正壓除菌濾器的出液口和進氣口，再用棉布將整個正壓除菌濾器團團裹住，并捆好。清潔是清除物品上的一切污跡,如塵埃,

油消毒上的病原微生物滅菌清清除除或或殺殺滅滅物物品品上的一脂切等微生物,以殺滅芽孢為準消毒和滅菌細胞培養消毒——相對的，不一定達到無菌的要求滅菌——絕對的，一定達到無菌的要求。常用消毒滅菌的方法物理法化學法熏蒸法浸 噴 擦泡 霧 拭法 法 法熱力消毒法過濾除菌輻射消毒法燃 烘燒 箱法 法煮 高沸 壓法

蒸汽滅菌法干熱法濕熱法紫 日外 光線 曝燈 曬照 法射法電子滅菌燈法射線消毒法細胞培養常用的化學消毒劑細胞培養5％來蘇兒：常用于培養室地面的消毒。1%的新潔爾滅：器械、皮膚和操作表面都可用它浸泡和擦試消毒。75％酒精：用于器械的浸泡消毒和皮膚消毒。乳酸蒸氣：常用于空氣消毒。0.5％過氧乙酸：用作各種物品的表面消毒。細胞培

養培養用液的配制復習提問：動物細胞培養準備的重點工作有哪些？培養用品和培養用液是直接與所培養細胞接觸的，對培養細胞的繁殖生長至關重要，是準備工作的重點。細胞培養自主查閱（課后）（1）體外培養的細胞有哪些營養需求？（2）動物細胞培養用液有哪些類型？各有何作用？（3）血清在細胞培養中有何作用？如何使用和貯存血清？（4）血清培養基的基本配方？（5）動物細胞培養基的發展趨勢如何？細胞培養體外培養細胞的營養需求細胞培養1.氨基酸：細胞合成蛋白質的原料需添加12種必須氨基酸

、谷氨酰胺2.碳水化合物：是細胞生長主要能量來源培養液中一般都以葡萄糖作為必含的能源物質3.無機鹽：幫助細胞維持滲透壓平衡和調節細胞膜功能等2- 3- -需要Na+

、Mg2+

、Ca2+

、Cl-

、SO4 、PO4 和HCO3

等無機離子4.維生素：參與輔酶、輔基的構成添加生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素等5.促生長因子：促使細胞生長和分裂通過在培養基中來添加5%-20%的小牛血清來滿足6.其它成分微量元素、促細胞貼附物質如：鼠尾膠原動物細胞培養用液的類型細胞培養平衡鹽溶液（BSS）消化液培養基（液）組成：主要是由無機鹽、葡萄糖組成

，含少量酚紅。種類：常用的有Hanks液 、D-Hanks液 和PBS。后兩者為無Ca2+、Mg2+和葡萄糖的緩沖液。作用：維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡單的營養。

Hanks液 常用于洗滌組織細胞；D-Hanks液 和PBS常用于配制分離細胞的消化液。一、平衡鹽溶液細胞培養除菌方式： Hanks液 因含葡萄糖（在高壓下易分解）需過濾除菌。 D-Hanks液和PBS可高壓滅菌。配方：一、平衡鹽溶液細胞培養二、消化液消化液指的是在細胞原代、傳代培養過程中，用來分散組織或細胞團的溶液。1、胰蛋白酶液作用原理：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，從而使細胞分離。常用濃度：0.25％

和0.125％

。用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液 或PBS液配制除菌方式：用濾器過濾除菌。含血清培養液終止其對細胞的消化作用細胞培養作用原理：從細胞生存環境中奪取有利于維持組織完整性的Ca2+、Mg2+

。適用對象：只用于消化傳代細胞；對于一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。常用濃度： 0.02%，配制時應加堿助溶除菌方式：配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。其對細胞的消化作用不受血清抑止，故消化后應徹底除去。細胞培養2、EDTA溶液三、培養基細胞培養培養基（培養液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，提供細胞生長所需的各種營養和因子。培養基的種類：天然培養基合成培養基天然培養基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優點：營養成分豐富，培養效果好缺點：來源受限； 成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析；易污染，保存期至多一年。因此逐漸為合成培養基所替代。細胞培養1、天然培養基血清血清中含有：激素、生長因子 、結合蛋白 、貼壁因子等，所以能促進細胞的生長和增殖。常用血清為牛血清（包括胎牛血清、小牛血清，其中以胎牛血清質量最好）。優質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。優質胎牛血清細胞培養血清血清的使用：儲存于－20℃ → 4℃冰箱溶解，1d →室溫至全部溶解→初次使用，56℃ 、30分鐘滅活，消除補體活性→無菌分裝成小瓶→使用，使用濃度一般為5－20％，最常用是10％。血清的儲存：血清一般儲存于－20℃，同時應避免反復凍融。血清的消毒：過濾除菌細胞培養合成培養基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。合成培養基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。目前已設計出許多種培養基，如DMEM、RPMI-1640等。細胞培養2、合成培養基優點：標準化生產，組分和含量相對固定；成本低

。缺點：

缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要，只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養基（如血清）。所以合成培養基又稱為基礎培養基。細胞培養2、合成培養基合成培養基的配制（以1L培養基為例）：干粉培養基溶于800ml三蒸水→補加2.0gNaHCO3→調pH至7.1，補水至1000ml→過濾除菌并分裝。細胞培養2、合成培養基基礎培養基除需補充血清外，為防止污染培養液中還要添加一定量的抗菌素，有的細胞（如上皮細胞、內皮細胞、神經細胞）還要添加谷氨酰胺。基礎培養基添加血清、谷氨酰胺和抗菌素等物質后，叫（血清）細胞培養基也叫完全培養基。細胞培養3、完全培養基基礎培養基滅活小牛血清碳酸氫鈉Hepes青、鏈霉素80％一95％5％