分派系數m:

〃?=q/q

式中,cs和cm分別為組份在固定相和流動相中的濃度。

m類型:A.B型曲線是一條典型的吸附等溫線，吸附色譜法屬于這類曲線。C和D型吸附等溫線很少碰到。

C曲線為線性分派等溫線。

線性色譜：溶質濃度低時,m為常數時的色譜

意義：容易理解，溶質流過色譜柱時,m大的組份通過色譜柱所需要的時間長,m小的組份需要的時間短;

當樣品中各組份在兩相的m不同時，就能實現差速遷移，達成分離的目的。

按原理分類（P122掌握）

旗掾牖涌趟分醐懈

麻能般質都邠劃涮靴

?刪艷誥法

施解法桶m

觸作胭崎蛹樵鞅幃融鼾郎

，撇解法惴懿分積寸

物秣爆法寐枷的域將邳植糊無酬靴

吸附等溫線

當吸附劑與溶液中的溶質達成平衡時，其吸附量q*同溶液中溶質的平衡應與溫度有關。

當溫度一定期，吸附量只和濃度有關,q*=f（c）—吸附等溫線。

幾種常見的吸防等溫線

1-Henrv型i2—Freundlich型；

3-Langmuir型:4一矩形

A）、Henrytype

在一定溫度下，平衡時吸附劑吸附溶質濃度q*與液相溶質濃度c之間的關系為線性函數:

q=me

m為分派系數。

適應條件：在低濃度范圍之內成立。當濃度較高時，上式無效。

B)、Freundlichtype

其經驗公式為

夕'=kc"

其中,k和B為常數，B一般在0.1/之間。當吸附劑對溶質的吸附作用非常大的時候，B也許小于0.1,

此時游離濃度對吸附濃度的影響很小。

Freundlich等溫線可以描述大多數抗生素、類固醇、的類激素等在溶液中的吸附過程。

C)^Langmuirtype

1+，

當吸附劑對溶質的吸附作用非常大時，這時存在3<0.1,或用前式表達Kb非常大，這時游離的溶質濃度

對吸附濃度影響極小，接近不可逆吸附。

D)、Rectangletype

如在固定化單克隆抗體的免疫親和吸附中，一般存在B<0.1。

1.塔板理論(platetheory)

塔板理論的假設：

(1)在每一個平衡過程間隔內.平衡可以迅速達成；

(2)將載氣看作成脈動(間歇)過程；

(3)試樣沿色譜柱方向的擴散可忽略；

(4)每次分派的分派系數相同，

n稱為理論塔板數(iheoreticalplalenumber)。與精播塔同樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數n的增長而增長，隨

塔板高H的增大而減小。

n=L/H

n與半峰寬及峰底的關系式為：

?式中U?（或Y1/2）應采用同一單位（時間或距離）。上式示：在IR一定期，假如色譜峰越窄，則說明n越

大,H越小，柱效能越高。

在實際工作中，按上式計算出來的n和H值有時并不能充足地反映色譜柱的分離效能，由于采用IR計算時,

沒有扣除死時間tM,所以，常用有效塔板數n有效表達柱效：

%=U%

有效塔板高為:

例2已知一根1米長的色譜柱的有效塔板數為1600塊，組份A在該柱上的調整保存時間為100秒，試求

A峰的半峰寬及有效塔塔板高度。

解圖卜"偌=1°°儒=5%器

塔板理論的特點和局限性

（1）當色譜柱長度一定期，塔板數n越大（塔板高度H越小），被測組分在柱內被分派的次數越多，柱效能

則越高，所得色譜峰越窄。

（2）不同物質在同一色譜柱上的分派系數不同，用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應

指明測定物質。

?（3）柱效不能表達被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分派系數K相同時，無論該色譜柱的塔板數

多大，都無法分離。

?（4）塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣（流動相）流速下柱效不同的實驗結果，也無法指出影響

柱效的因素及提高柱效的途徑。

?速率方程（也稱范.弟姆特力程式）…影響杜效的因素

他們吸取了塔板理論中塔板高的概念，并同時考慮影響塔板高的動力學因素，指出：譜峰擴寬受三個動力

學因素的控制，即渦流擴散，分子擴散項，傳質阻力項。這樣，二述塔板高方程表達

H=A+B/u+Cu

H:理論塔板高度,

a：載氣的線速度3川$）

?、一渦流擴散項

A=2人dp

dp:固定相的平均顆粒直徑

心固定相的填充不均勻因子

?固定相顆粒越小dpi,填充的越均勻,AI,HI,柱效nt。表現在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現象

減輕，色譜峰較窄。

?B/。一分子擴散項

B=2vDg

y：浮曲因子,填充柱色譜,v<io

Dg:試樣組分分子在氣相中的擴散系數(cm2?$-/)

(1)存在著濃度差，產生縱向擴散；

(2)擴散導致色譜峰變寬,Ht(nI),分離變差；

13)分子擴散項與流速有關，流速I,滯留時間t,擴散t;

?(4)擴散系數：Dga(M載氣)-1/2；M載氣f,B值I。

?Cu一傳質阻力項

傳質阻力涉及氣相傳質阻力Cg和液相傳質阻力CL即：

C=(Cg+CL)

我氣流速高時：

傳質阻力項是影響柱效的重要因素，流速，柱效。

我氣流速低時：

?分子擴散項成為影響柱效的重要因素，流速，柱效。

?速率理論的要點

I)組分分子在柱內運營的多途徑與渦流擴散、濃度梯度所導致的分子擴散及傳質阻力使氣液兩相間的分派

平衡不能瞬間達成等因素是導致色譜峰擴展柱效卜降的重要因素。

(2)通過選擇適當的固定相粒度、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。

(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。

(4)各種因素互相制約，如載氣流速增大，分了?擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質阻力項的影響

增大，又使柱效下降；柱溫升高，有助于傳質，但又加劇了分子擴散的影響，選擇最佳條件，才干使柱效達

成最高。

分離度也稱分辨度。它是指相鄰兩色譜保存值之差與兩峰底寬平均值之比，即

n

一般來說，當Rsv1時，兩峰總有部分重疊；當Rs=1時，兩峰能明顯分離；Rs>1.5時，兩峰才干完全分

離，當然，更大的Rs值，分度效果會更好，但會延長分析時間。

運用上式，可以直接從色譜圖上計算分離度。但該式沒有體現影響分離度的諸因素。而下式清楚地指出了,

分離度受柱效<1、選擇性a和容量因子k三個參數的控制：

R=應"1力_

4a1+品

意義：

第一，增長塔板數，可以增長分離度，若通過增長柱長來增長塔板數，就會延長分析時間。所以，設法減少

塔板高H,才是增大分離度的最佳方法。

第二，加大容量因子可以增長分離度，但是會延長分析時間，至導致譜帶檢測困難.一般來說，當k,10時,

分離度的提高并不明顯；而當k<2時，洗脫時間會出現極小值。因此，在色譜分離中，通常將k控制在2

7之間。

第三，選擇性參數的微小增大，都會使分離度得到較大的改善。當>2時，即使在很短的時間內，組份

也會完全分離。當1時，要完畢分離，必須增長柱長，延長分析時間。例如，為了達成同樣的分離度,

當=1.01時，所需的時間是=1.1時的84倍。顯然，當=1時，無論如何提高柱效，加大容量因子

等.Rs均為零。在這種情況下，兩組份的分離是不也許的。

液相色譜

?凝膠色譜

?排阻極限(exclusionlimit)

凝膠過濾介質的排阻極限是指不能擴散到凝膠網絡內部的最小分子的相對分子質量。

例如SephadexG50的排阻極限是30kD,即相對分子質量大于該數值的分子不能送入到凝膠網

絡中，其洗脫體積為V0。

sephadex葡聚糖凝膠G-25（50,75,100,100）的粒度的選擇：

?組別分離時，選用孔徑小的顆粒，雖然分辯率低，但由于組分的Kd值差異大，也能得到較好的分離。

?分級分離時，以孔徑大的凝膠為主，并且規定顆粒大小均勻，以保證較高的分辯率。

?分子篩操作中的注意點

-上樣體積要足夠的小（一般為整個柱體積的1%?5%）,樣品中可以具有一定的鹽成分（一脫鹽

柱），柱子要有合適的長度。

■洗脫一般為無梯度的洗脫。

?針對分離的目的和樣品的特性要選用不同特性的色譜柱（各個廠家會有說明其合用的分子量范圍）,

以達成最佳的分離效果。

?分子篩也常用來測定蛋白的亞基裝配方式及全分子量的測定。

缺陷優點

操作簡便選擇性低，料液解決量低

回收率高產品被稀釋

分離條件溫和②脫鹽

應用廣泛合用十生物大分子的初級分離，脫鹽生物大分子溶液的脫鹽，以及

應用廣泛合用于生物大分子的初級分離，脫鹽除去其中的低相對分子質量物質。

樹指類：

Sephadex:交聯葡聚糖

Sepharose:瓊脂糖凝膠

BioGelA;BioGelP:聚丙烯醋胺凝膠分子篩

Sephacryl:JIJN,N-亞甲雙丙烯酰胺交聯的葡聚糖凝膠

離子互換色譜（1EC）

定義：運用離子互換劑為固定相，根據荷電溶質與離子互換劑之間靜電互相作用力的差別進行溶質分離的

洗脫色譜法。荷電溶質在離子互換劑上的分派系數：

m(I)=A/IB+m0°

I:流動相的離子強度;

m-：為離子強度無限大時溶質的分派系數，是靜電互相作用以外的非特異性吸附引起的溶質在離子

互換劑上的分派；

常數A和B為pH的函數：

?B:溶質的靜電荷數與離子互換基的離子價數之比。蛋白質為多價電解質，在pH偏離等電點的溶液中

停電荷數常為兩位數以上，故B值比較大。

IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用線性梯度洗脫法、逐次洗脫法。

離子取代順序

電荷高者

離子大者

(largerion)?

濃度大者會以垓＞

(higherconcentration)/

1.離子互換層析的基本環節：平衡、上樣吸附、洗脫、再生

2.層析柱平衡

緩沖液的用量至少為柱體積的2倍

平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速

平衡終點以流出液的離子濃度、導電性、pH值與緩沖液一致為準，其中pH值最重要

3.樣品進柱

為了達成滿意的分離效果，進樣量一般為介質互換容量的10-20%

?為了避免進樣溶液中的離子強度過高，樣品濃度不宜太高

?樣品總量不應超過柱的結合容量，上萍洋積一般元壽券的旗制。

缺陷優點

IEC的操作變量遠多于GFC,影響分解決量大，濃縮，高速；選擇高，所需柱長較短；

離特性的因素非常復雜。回收率高；離子互換劑種類多，價格也遠低于親和吸附劑。

回收率高；離了?互換劑種類多，價格也遠低于親和吸附劑。

疏水性互相作用層析（HIC）

?定義：是運用表面偶聯弱疏水性基團（疏水性配基）的疏水性吸附劑為固定相，根據蛋白質與疏水性吸

附劑之間的弱疏水性互相作用的差別進行蛋白質類生物大分子分離純化的洗脫層析法。

?配基修飾密度過小則疏水性吸附作用局限性，密度過大則洗脫困難。

?疏水性互相作用層析的應用及特點

1.互補工具：HIC重要用于蛋白質類分離純化，雖然HIC不如IEC的應用廣泛，但可以作為IEC的

互補工具。如方法得當,HIC與IEC的分離效率相稱。

2.與鹽析銜接：由于在高濃度鹽溶液中疏水性較大，因此HIC可直接分離鹽析后的蛋白質溶液。

可以通過調節疏水性配基鏈長和密度來控制吸附性能的大小，因此可根據目的產物的性質選擇適當的

吸附劑。

疏水性吸附的種類多，選擇余地大，價格與離子互換劑相稱。

反相層析（RPC）

?定義：運用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據溶質極性（疏水性）的

差別進行溶質分離純化的洗脫層析法。

?前述HIC同樣,RPC中溶質乜通過疏水性互相作用分派于固定相表面，但是RPC固定相表面完全被非

極性基團所覆蓋，表現強烈的疏水性。因此，必須采用極性有機溶劑（如甲醉、乙虱等）或其水溶液

進行溶質的洗脫分離。

?RPC重要用于相對分子質量低于500（）,特別是1000以下的非極性小分子物質的分析和純化，也可用于

蛋白質等生物大分子的分析卻純化。由于反相介質表面為強烈疏水性，并且流動相為低極性有機溶劑,

生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活。所以，以回收生物活性蛋白質為目的時，應注意選

用適宜的反相介質.

?因此RPC多采用減少流動相極性（水含量）的線性梯度洗脫法。

分離能力：SEC<HIC-IEC<RPC

1.使樣品變性的趨勢:SEC<IEC~HIC〈RPC

2.液相色譜按分離機制分為那幾大類？

3.簡述柱層析系統的工藝流程。

4.何謂保存值、分派容量K、分離度？

5.何為理論塔板高度和理論塔板數？如何計算？

6.簡述IEC的工作原理？

簡述凝膠色譜的工作原理？

IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用線性梯度洗脫法(lineargradien【elution逐次洗脫法(stepwise

elution),為什么?

思考題

1.液相色譜按分離機制分為那幾大類？

2.簡述柱層析系統的工藝流程。

3.何謂保存值、分派容量K、分離度？

4.何為理論塔板高度和理論塔板數？如何計算？

5.簡述IEC的工作原理？

簡述凝膠色譜的工作原理？

IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用線性梯度洗脫法(lineargradientelution)＞逐次洗脫法(stepwise

elution),為什么？

第二章發酵液預解決

?發酵液預解決目的

1.便于固液分離

黏度大的懸浮液，不宜過游

目的產物在發酵液中的濃度通常較低

2.成分復雜，固體粒子可壓縮性人，懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不人

3.除去部分雜質和改變發酵液的過濾性能

1.發酵液預解決的內容：

2.發酵液雜質的去除，涉及除去蛋白質、無機離子、色素、熱原、毒性物質等；

改善培養液的解決性能.重要是通過減少黏度、調節適宜的pH值和溫度、絮凝和凝聚等操作來實現。

無機離子的去除

1.高價無機離子，如Ca2+、Mg2+、Fe3+等的存在，會影響離子互換樹脂對生物活性物質的互換容量。

2.鈣離子的去除

?加入草酸，生成草酸鈣，沉淀去除。

?草酸與鎂離子結合生成草酸鎂，去除Mg2+

?草酸酸化發酵液，改變其狡體狀態，有助于目的產物轉入液相。

3.在用量大時，可用其可溶性鹽。

4.反映生成的草酸鈣還能促使蛋白質凝固，提高濾液質量。

5.鎂離子的去除

?可加入三聚磷酸鈉，形成絡合物。

?還可用磷酸鹽解決，大大戒少鈣和鎂離子。

?3.鐵離子的去除

一股用黃血鹽去除，形成普魯士藍沉淀。

可溶性蛋白質的去除

-雜蛋白的存在，對分離純化會產生三種影響

-減少離子互換法和大網格樹脂吸附法的樹脂吸附能力

-在用有機溶劑或雙水相萃取會產生乳化現象；

?常規過濾及膜過濾，會污染灌膜。

去除方法重要有：鹽析法、等電點沉淀法、加熱法、有機溶劑沉淀法、吸附法、其他沉淀法。

鹽析法

水溶性蛋白質溶液是親水膠體體系，其分子與水有很大的親和力。

水化層和雙電層是膠體體系穩定的必要條件。

離子半徑小而帶電荷較多的陰離子鹽析效果比較好，含高價離子的鹽比1-1價型鹽的鹽析效果好。

硫酸錢是使用最普遍的鹽，硫酸鈉和氯化鈉也常用于鹽析。

等電點沉淀法

在等電點狀態時，所帶電荷為（）。處在等電點時，蛋白質分子之間的靜電排斥力最小，使它失去了

作為膠體體系穩定的基本因素;迅速結合成聚集體，極易沉淀析出。

等電點沉淀一般在低離子強度和pH值約為等電點的條件下進行。

等電點沉淀法一般多用于疏水性較大的蛋白質。

與鹽析沉淀法相比，等電點沉淀省去了后續的脫鹽操作。

有機溶劑沉淀法

?有機溶劑的加入，使蛋白質分子表面荷電基團或親水基團的水化限度減少，即破壞蛋白質膠體的

水化膜，同時也可減少溶液的介電常數，導致蛋白質分子間的靜電引力增大，產生凝聚和沉淀。

?在低離子強度和等電點附近，較易生成沉淀，所需有機溶劑用量較少

?蛋白質分子量越大，有機溶劑沉淀越易進行，所需有機溶劑用量越少

由于有機溶劑易引起目的蛋白變性，沉淀必須在低溫下.進行。只合用于解決量較少的情況。

吸附法

-雜蛋白可以被某些吸附劑或沉淀劑吸附除去。

運用黃血鹽和硫酸鋅的協同作用，生成亞鐵第化鋅鉀膠狀沉淀來吸附蛋白質，應用于四環素類抗生素的生

產中。

發酵液解決性能的改善

1.減少發酵液的黏度

?減少液體黏度可提高過濾速率。

?常用方法有加熱法和加水稀釋法。

?2.調節pH值

pH值直接影響發酵液中某些物質的電離度和電荷性質，通過調節pH值可改善其過濾特性。

3.絮凝

采用細胞絮凝技術，可增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速率，再結合其他的萌解決方法減少發

酵液黏度，就能采用普通過濾方法，簡樸有效地實現固液分離。

絮凝和凝聚的區別

絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團的過程，是一種以物

理的集合為主的過程。凝聚是指在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的減少（或由于微粒所帶電荷被加

入的帶有相反電荷的高價離子中和），而使膠體體系不穩定，微粒互相黏著在一起的現象。

細抱絮凝的種類

按是否添加絮凝劑分為兩類：

（1）自身絮凝

酵母細胞產生絮凝，由細胞表面蛋白和酵母細胞外壁的甘露聚糖結合所引起。

（2）絮凝劑絮凝：

?從化學結構看，重要分為三類：高聚物、無機鹽、有機溶劑和表面活性劑。

?根據活性基團在水中解離情況，可分為非離子型、陰離子型（含段基）和陽離子型（含胺基）。

?高聚物絮凝劑具有長鏈狀的結構，運用長鏈上的活性基團，通過靜電引力，形成橋架連接，從而生成

菌團沉淀。

微生物絮凝劑：微生物在代謝過程中所分泌的特殊的高分子產物，能使液體中不易沉降的固體顆粒、菌體

細抱及膠體粒子等凝集沉降。重要成分是多糖、糖蛋白、蛋白質和核酸。殼聚糖就是其中一種。

蛋白質為主的絮凝劑對溫度變化敏感，多糖組成的絮凝劑則熱穩定好。

絮凝機理與動力學

絮凝機理：（1）膠體理論（2）高聚物架橋理論（3）雙電層理論

絮凝動力學

?絮凝初期，顆粒聚并快，此時攪拌應劇烈些：絮凝后期，顆粒聚并速度變慢，攪拌速率應減少。

增氏顆粒（細胞）的濃度，有助于聚并絮凝。

加大攪拌，增長速率梯度，有助于顆粒聚并；但攪拌速率過大時，剪切力會導致絮凝體破裂。

絮凝的優化

1）影響絮凝效果的因素：

2）絮凝劑濃度：濃度增長有助于架橋充足，但是過多的加量會引起吸附飽和，絮凝劑爭奪膠粒而使

絮凝團的粒徑變小

3）絮凝劑分子量：分子量提高、鏈增長，可使架橋效果明顯，但分子量不能超過一定的限度，由于隨

分子量提高，高分子絮凝劑的水溶性減少，因此，分子量的選擇應適當。

4）絮凝劑類型：

5）溶液的pH：溶液pH的變化會影響絮凝劑功能團的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態。電離度

增大，鏈節上相鄰離子基團間的電排斥作用，使分子鏈從卷曲狀態變為伸展狀態，架橋能力提高。

6）攪拌速度和時間

7）助凝劑

思考題

?為什么要進行發酵液預解決？解決的目的及內容分別是什么？

?發酵液金屬離子的去除方法分別有哪曲？雜蛋白去除的方法和機理分別是什么？

?發酵液解決性能的改善有哪些方法？

?有哪些絮凝劑可以使用？

影響絮凝效果的因素？

第三章固液分離技術

固液分離的方法

有分離篩、懸浮分離、重力沉降以及離心和過濾等。用于發酵液固液分離的重要是離心和過濾

-L過漉：運用多孔性介質（如濾布）截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實現固液分離的方法。

?深層過濾

?深層過濾所用的過濾介質為硅藻土、砂、顆粒活性炭和塑料顆粒等，過濾介質填充于過濾器內形

成過濾層。過濾介質起重要作用。合用于固體含量少于lg/L、顆粒直徑在5?100um的懸浮液。

?濾餅過濾

濾餅過濾的過濾介質是濾布。懸浮液通過濾布時，固體顆粒被阻攔形成濾餅，濾餅起重要過濾作用。合用

于固體含量大于lg/L的懸浮液。

按過濾推動力的不同，濾餅過濾又分為常壓過濾、加壓過濾和真空過濾三類。

過濾理論

（I）過漉速率：單位時間內通過過濾面積的漉液體積，又稱漉液的透過速率。

（2）濾餅阻力

?發酵液過濾的謔餅比阻與一般的可壓縮濾餅不同。當濾餅中所含固形物濃度達成一定的界線時，比

阻會忽然升高，過濾速率會迅速下降，甚至不能過濾。

對于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數。但對于可壓縮性濾餅濾餅的比阻值是a,是操作壓力差的函數，隨操

作壓力差的提高而增大的。因此開始過濾時應注意不能不久提高壓差，通常靠液柱的自然壓差進料，并應

緩慢地逐步地升高壓力。

過濾速率的影響因素

影響過濾速率的因素重要有兩個：

(1)過程的推動力

?真空過濾最大真空度一般在85kPa以下；

?加壓過濾的壓力差一般在500kPa以下。

(2)過濾阻力

?與懸浮液的性質有關，黏度越大越不利于過濾

與過濾介質和濾餅的性質有關，濾餅阻力是由菌種和發酵條件決定。

改善過渡性能的方法

(1)絮凝

(2)加助漉劑：助漉劑是一種不可壓縮的多孔微粒。工業上常用的助濾劑有硅藻土、纖維素、白土、

炭粒、淀粉等。助濾劑可預先涂在過濾介質表面;厚2mm;也可直接加入發酵液中，用量約等于懸浮液中固

體含量，濾速最快。助濾劑的種類應根據目的產物、過漉介質夾擬定，粒度必須與懸浮液中固體粒子的尺

寸相適應。

(3)加入反映劑

?加入不影響目的產物的反映劑；

?反映劑之間能互相或能和發酵液中的雜質反映，生成不溶性沉淀，從而那你呢提高過濾速率。

假如發酵液中具有不溶性多糖，過濾前最佳用酶將其轉化為單糖。

過濾設備及選擇

常用的過濾發酵液的設備重要有板框過濾機、加壓葉濾機和鼓式真空過漉機三類。

膜過濾和微濾

?膜分離是運用品有一定選擇透過特性的過濾介質進行物質的分離純化，過程的實質是物質通過膜

傳遞速率不同而得以分離，過程近似于篩分。

經預解決的發酵液為懸浮液，可使用微濾進行固液分離

離心原理

依靠慣性離心力的作用而實現的沉降過程。合用于兩相密度差較小，顆粒粒度較細，在重力場中的沉降

效率很低的非均相體系。

區帶離心：可分為差速區帶離心和平衡區帶離心。

兩種區帶離心的共同之處是：離心之前要先用某種低分子量溶液(如蔗糖溶液)調配好密度梯度，然后將

待解決的料液加在已形成密度梯度的溶液之上，進行離心。

平衡區帶離心與差速區帶離心的不同之處：其密度梯度比差速區帶離心的密度梯度大。離心操作后，料液

中的高分子溶質在與其自身密度用等的溶劑密度處形成穩定的區帶，區帶中的溶質濃度以該處密度為中心,

呈高斯分布。

思考題

1.固液分離的方法有哪些？其原理分別是什么？

2.生物產業過濾和離心分離常用的設備是什么？

3.改善過濾過程的方法有哪些？

第四章細胞破碎和分離提取技術

?細胞破碎技術：運用外力破壞細胞壁和細胞膜，使細胞內物質涉及目的產物成分釋放出來的技術。

a)機械方法破碎：涉及珠磨法、高壓勻漿法、撞擊破碎法和超聲波法等。

b)優點：

c)解決量大，速度快，時間短，效率高，是工業規模細胞破碎的重要手段。

d)細胞受到擠壓、剪切和撞擊作用。

機械攪拌產生熱量，破碎需冷卻。

(1)珠磨法

細胞懸浮液與極小的研磨劑[如玻璃小珠、石英砂、氧化鋁(cKlmm)]一起高速攪拌，細胞與研磨

劑之間互相碰撞、剪切，使細胞達成某種限度破碎，釋放內含物。

優點：操作簡便穩定、破碎率可以控制、易放大。特別合用于有大量菌絲體的微生物和一些有質地堅

硬亞細胞器的微生物。

(2)高壓勻漿法

運用高壓迫使懸浮液通過針形閥，由于忽然減壓和高速沖撞導致細胞破裂。在高壓勻漿器中，細胞經歷

了高速導致的剪切、碰撞和從高壓到常壓的突變，從而導致細胞壁的破壞，細胞膜隨之破裂，胞內產物

得到釋放。

?優點：操作參數少，且易于穩定；操作時樣品損失量少，合用于酵母和大多數細胞。

?對?于易堵塞的團狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質地堅硬的亞細胞器一般不合用。具有包涵體的

基因工程菌也不宜該設備。

(3)超聲波破碎法

原理：運用頻率高于20kHz的超聲波在水中傳播，產生能釋放巨大能量的激化和突發，即空穴作用。

空穴作用產生的空穴泡由于受到超聲波的沖擊而閉合，從而產生一個高達數百個大氣壓的沖擊力壓力,

由此引起懸浮細胞上產生剪切力，使細胞液體產生流動而破碎細胞。

優點：解決少量樣品操作方便，液體損失量少，破碎率高。

缺陷：有效能量運用率極低，產生大量的熱，操作需在冰水中進行或通入冷卻劑，不易放大，不適于大規模

操作，實驗室小規模破碎常用。

細抱物理破碎方法

(1)滲透壓沖擊法

?先將細胞放在高滲介質中，達成平衡后，介質被忽然稀釋，或者將細胞轉入低滲溶液中。由于滲透壓的

忽然變化，水迅速通過細胞壁和細胞膜進入細胞，引起細胞壁和膜膨脹破裂，從而將產物釋放出來。

合用于破碎易破細胞或細胞壁預先經酶解決的細胞，以及合成受克制而強度減弱的細胞

(2)冷凍-融化法

通過水結晶的形成和隨后的融化而使細胞破碎的方法。

細抱化學法破碎

(1)堿解決：

pHll.5-12.5堿解決細胞20-30min可導致細胞溶解。

易破壞蛋白的活性，使蛋白失活。

(2)酸熱法

運用鹽酸對細胞壁中的某些成分(重要是多糖和蛋白)的水解作用，改變其空間結構，使本來結構緊密的

細抱壁變得疏松，同時經沸水浴解決，導致細胞膨脹并加速水解，破壞胞壁結構，使得內含物釋放。

化學試劑法

(1)EDTA

EDTA可解決革蘭氏陰性菌(E.coli),對細胞的外層膜有破壞作用。解決其它革蘭氏陰性菌，可提高通

透性。

(2盾機溶劑法

異丙醇解決酵母細胞釋放超氧化物歧化能。

(3)表面活性劑

表面活性劑或多或少地溶解膜結構中的脂蛋白，使細胞滲透作用增強。

?生物破碎法：運用酶反映分解、破壞細胞壁上特殊的化學健而達成破壁的目的，又稱酶溶法。常用的

溶酶有溶菌酶、蛋白酶、糖昔酶等

溶菌能對細菌類細胞有效，重要是革蘭氏陽性菌

超臨界細胞破碎技術

超臨界流體是指溫度和壓力處在臨界條件之上的流體，它具有類似于氣體的低黏度和類似于液體的高密度,

有按好的流動性、傳質性能和溶解性能。

選擇性釋放目的產物的一般原則

⑴僅破壞或破碎存在R的產物的位置周邊

⑵機械破碎法和化學法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目的產物釋放率條件卜;減少細胞的破碎限

度。

思考題

?L珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法分別是什么原理？常用什么設備？

?2.選擇破碎方法的原則？

3.酶溶法的原理是什么？對細菌和酵母分別常用什么酶？

革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，不久就產生溶壁現象。

但對于革蘭氏陰性菌，單獨采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。

放線菌的細胞壁結構類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為重要成分，所以也能采用溶菌酶。

酵母和真菌由于細胞壁的組分重要是纖維素、葡聚糖、兒丁質等，常用蝸牛睡、纖維素施、多糖瓶等。

植物細胞壁的重要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。

細胞破碎后，細胞碎片的分離是一個難題，以下為細胞碎片分離的有效方法。

雙水相分離技術

因兩種水溶性聚合物的水溶液，或一種水溶性聚合物水溶液與鹽溶液混合時的不相容性而形成有明顯界面

的兩相系統。

?雙水相萃取的特點：

-具有特殊的物理性質：含水量高（75%-90%）,兩相界面張力極低（10-7-10-4mN/in）,相間密度

差低，這有助手保持生物活性和強化相間的物質傳遞。

,分相時間短（5-15min）

?萃取環境和條件溫和

?生物相容性好，有時有穩定作用

?分派系數可控，容易放大

?大量雜質可以與固體物質一起去除

缺陷和局限性

?雙水相系統含較高濃度的水溶性聚合物和鹽.，會帶到產物中，去除需要輔助解決方法

,成本較高。

選擇性較低，分離純化倍數低，一般只合用于粗分離

?具體操作：

?萃取：適量的細胞勻漿液與雙水相體系（一般為PEG/鹽）混合。

上下相的分離：在萃取達成平衡后，就必須使上下相分離。有兩種方法：重力沉降和離心分離。

多聚物的分離：當目的蛋白是分派在PEG富集的上相中（細胞或細胞碎片所有分派在下相中，只有目的

產物分派在上相中），相與相分離后，在上相中加入鹽，形成新為雙水相體系，在適當的條件下，蛋白質重

新被萃取進入鹽相，而大量的PEG得到回收，鹽相中殘余的PEG可用超濾或透析除去。

膨脹床分離技術

膨脹床吸附技術（EBA或EB）,亦稱擴張床吸附。膨脹床吸附集澄清、濃縮和初步純化于一體的分離純化

技術，它兼具流化床和填充床吸附的優點，既能比較容易地讓固體顆粒通過填料層，又可以填充床的模式

來吸附FI的產物。

膨脹床的操作按順序可分為五個部分:（1）平衡、（2）吸附、（3）沖洗、（4）洗脫和⑸在位清洗。

泡載分離技術

?泡載分離又稱為泡沫分離，根據表面吸附的原理，運用通氣鼓泡在液相中形成的氣泡為載體，對■液

相中的溶質或顆粒進行分離。待分離物質自身具有表面活性（如表面活性劑）

泡沫分離的優點：1）特別適合于對低濃度的產品進行分離；2）分辨率高，可濃縮表面活性高的成分；3）

富集率高；4）運營成本低；5）操作簡便。

缺陷：表面活性劑難以回收，消耗量大，返混現象影響分離效率，穩定性差，濃度難以控制。

思考題

?1.雙水相去除細胞碎片分離目的產物的原理和一般過程？

?2.膨脹床的概念？膨脹床吸附分離的特點和原理是什么？一般的操作過程？

?3.何謂泡沫分離技術？其原理是什么？

?4.比較雙水相分離技術、膨脹床分離技術和泡沫分離技術的優缺陷。

第六章沉淀和膜分離技術

沉淀分離技術（重要涉及有機溶劑沉淀、鹽析、高聚物沉淀和聚電介質沉淀、等電點沉淀等。）

沉淀是指在溶液中加入沉淀劑使溶質溶解度減少，形成固相從溶液中析出從而達成分離的一種技術。

優點：過程簡樸，成本低，原料易得，便于小批量生產，在產物濃度越高的溶液中沉淀越有利，收率越

高

缺陷：過濾困難，對于復雜產品體系，分離度不高，產品質量較低，需重新精制。

重要涉及有機溶劑沉淀、鹽析、高聚物沉淀和聚電介質沉淀、等電點沉淀等。

沉淀法基本原理就是采用適當的措施改變溶液的理化參數，控制溶液各種成分的溶解度，根據不同物質在

溶劑中溶解度不同而達成分離的目的。

有機溶劑沉淀法的原理：有機溶劑沉淀是指在溶液中加入極性有機物（如甲醇、乙醇、丙醉等），使溶

質從溶液中沉淀析出，達成分離的目的。

有機溶劑沉淀法機理

A減少溶劑介電常數（介電常數D有機vD水），使蛋白質或酶分子間靜電引力增大，因互相吸引而

聚

合泣淀。

B破壞水化膜：由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質分子周邊的水化層中

奪走了水分子，破壞水化層，使蛋白質沉淀。

C疏水基團暴露：有機溶劑也許破壞蛋白質的某種鍵，使疏水集團暴漏。

有機溶劑沉析劑選擇依據：

水溶性要好、介電常數要小

致變性作用要小（甲醉）

毒性要小、揮發性適中、容易獲取

沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核甘酸最常用的是乙醍。乙醇是最

常用的沉淀劑

有機溶劑沉淀法的影響因素

溫度：有機溶劑沉淀一定要在低溫下進行

pH值

樣品濃度：樣品較稀時，將增長有機溶劑投入量和損耗；樣品太濃會增長共沉作用。一般認為蛋白質

的初濃度以0.5—2%為好，多糖則以1—2%較合適。

中性鹽濃度：較低濃度的中性鹽存在有助于沉淀作用，減少蛋白質變性。一般中性鹽濃度以0.01-

0.05mol/L為好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸鐵、氯化鈉等

優點在于：

I）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質等只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀：

2）沉淀不用脫鹽；

缺陷是：

I）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，

2）操作規定在低溫下進行。

3）成本高

4）易燃溶劑

鹽析沉淀法

在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質（酶）等生物大分子物質在水溶液中的溶解度減少，產生沉淀的過程。

鹽析法機理

（1）破壞水化膜：將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，于是蛋白質分子周邊的

水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質分子因熱運動碰撞聚集。

（2）中和電荷，減少靜電斥力：中性鹽加入蛋白質溶液后，蛋白質表面電荷大量被中和，靜電斥力減少,

導致蛋白溶解度減少，使蛋白質分子之間聚集而沉淀。

鹽析用鹽的選擇

在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有一定差異，一般的規律為：半徑小的高價離子的鹽

析作用較強，半徑大的低價離了?作用較弱

陰離子鹽析效果：

PO43->SO42->CH3C00->Cl->N03->SCN-

陽離子鹽析效果：

NH4+>K+>Na+

陰離子的影響人于陽離子

蛋白質溶解度與鹽濃度的關系

logS=0-KsI

B和Ks的物理意義

B-B代表截距，即當崗子強度為零，也就是純水中的假想溶解度的對數。與蛋白質種類、溫度、pH值有

關，與鹽無關：

Ks—鹽析常數，代表圖中直線的斜率；從一些實驗結果表白，Ks與溫度和pH無關，但和蛋白質與鹽的種類

有關。但這種變化不是很大，例如以硫酸鐵作為沉淀劑時，Ks值對不同的蛋白質來說，其變化不會超過1

倍，

用鹽析法分離蛋白質的二種方法

第一類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現，（固定pH,溫度，改變鹽濃度），

由于蛋白質對離子強度的變化非常敏感，易產生共沉淀現象，用于初期的粗提液；

第二種叫B分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現，（固定離子強度，改變pH及溫

度），由于溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，用于后期進一步分離純化和結晶。

鹽析的影響因素

pH值為提高鹽析效率，多將溶液PH值調到目的蛋白等電點處

溫度在低離子強度或純水中，蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度增長而增長。但在高濃度下，蛋白質、

酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降。（B隨溫度升高減小，熱促失水膜Ks不隨溫度而變）

蛋白質濃度，高濃度蛋白溶液可以節約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會發生嚴重共沉淀作用，除雜蛋白

的效果會明顯下降。在低濃度蛋白質溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會減少。

鹽析法特點：

I.成本低，不需要特別昂貴的設備。

2.操作簡樸、安全。

3.不會引起蛋白質變性，經透析去鹽后，能得

到保持生物活性的純化蛋白質,

4.分離效果不抱負，通常只是作為初步的分離

純化，還需要結合其它的純化方法。

鹽析中常用的鹽：硫酸錢、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉

高聚物沉淀（非離子性聚合物（PEG）:是一種水溶性的高分子聚合物）

機理：這些親水性高分子上有許多可結合水分子的羥基，加入后結合自由水分子，破壞蛋白質的水化膜。

優點：

I.室溫

2.顆粒大，易于收集

3.提高蛋白質的穩定性

4.PEG難回收，成本高

思考題

常用的沉淀方法涉及哪些？

?有機溶劑沉淀法的原理是什么？

?影響有機溶劑沉析的重要因素有哪些？

?何謂鹽析？其原理是什么？

?何謂“Ks”分級鹽析法？何謂“B”分級鹽析法？

?常用的鹽是什么，影響鹽析的重要因索有哪些？

?百聚物沉淀的原理是什么？常用的高聚物是什么？

第十一章電泳分離技術

電泳：指帶電顆粒在電場作用下,向著與其電荷相反的電極移動的現象。

電泳技術：運用帶電粒子在電場中移動速度不同而達成分離的技術稱。

等電聚膠電泳(IFE):分離蛋白質

以特殊的兩相電解質為載體，在外加電場的作用卜.形成PH梯度場，具有特定等電點的蛋白質在PH梯度場

中形成蛋白質區帶，從而得到蛋白質組分。分辨率高，分離效率而，但兩性電解質價格昂貴，只能一次性

使用，成本較高

一、電泳的基本原理

當帶電離子以速度v在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作

用，

物質禽子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎。

影響電泳速度的相關因素

?顆粒性質帶電顆粒在電場中泳動的速度與帶電顆粒的凈電荷量成正比，與顆粒的半徑成反比。

?電場強度E愈高，帶電顆粒的泳動速度愈快。

?溶液性質pH偏離分子的等電點愈遠，解離度愈大，凈電荷愈多，泳動速度越快；離子強度加A,

電流加大，泳動速度加快;泳動速度與溶液黏度成反比。

電滲(P225)是支持物自身所帶的電荷吸附溶液中性質相反的離子，在電場中移動的結果。其帶電愈高,

電滲力愈大。當顆粒的泳動方向與電滲方向一致時，加快顆粒的泳動速度；當顆粒的泳動方向與電滲方向

相反時，則減少顆粒的泳動速度。

焦耳熱電泳過程中釋放的熱量與電流強度的平方成正比,當電場強度或電極緩沖液離子強度增高,

電流強度也增長，不僅減少分辨率(即電泳譜帶的展寬和組分的熱混和)，嚴重時甚至燒斷或熔化支持介

質，

篩孔在篩孔大的凝膠中溶質顆粒的泳動速度快。

聚丙烯酰胺凝膠：

分離效果比瓊脂糖好，適宜分離鑒定低分子量蛋白質、小「Ikb的DNA片段和DNA序列分析。其裝載的

樣品量大，回收DNA純度高

由丙烯酰胺通過交聯劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺交聯形成三維網狀結構

特性：機械性能，彈性，透明度，黏著度，孔徑大小

兩個單體總百分濃度：T=(a+b)/mX10(n與總濃度有關的交聯百分濃度：C=b/(a+b)X100%

A為丙烯酰胺的質量，g：b為N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺質量，g；m為水或緩沖溶液的終體積，mL

a:b<10,則凝膠脆，硬，呈乳白色

a:b>100,T=5%,則凝膠呈糊狀

a:b在30左右，凝膠富有彈性、且完全透明

聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑取決于總濃度T,有效孔徑隨T的增長而減少。

當1X2.5%,可以篩分相對分子質量為106以上的大分子，T>30%,可以篩分相對分子質量小于2kDa的多

肽,

聚合引發劑：過硫酸鉉和核黃素等；增速劑：N,N,N',N'-四甲基乙二胺，3-二甲胺乙旗

丙烯酰胺和N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺：對中樞神經有毒

聚丙烯酰胺凝膠電泳Polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)

一、基本原理

以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的電泳方法。由于其分辨率高，不僅能分離具有各種大分子的混合物，并且

可以研究生物大分子的特性，如電荷、分子量、等電點及分子構型(P227)。

緩沖體系的選擇

?PH值的選擇：從理論上來說，聚丙烯酰胺凝膠電泳可在各種PH值中進行。但事實上在過酸或過堿的條

件下將發生某種水解反映，所以PH值應限制在制在間。為保持天然蛋白質的生物活性，PH范圍也許更

窄。有三種不連續系統可選用:高PH值系統(PH9.5,PH8.9);中PH值系統(PH8.0可低PH值系統(PH5.5,

PH4.9,PII3.6)

離了強度的選擇：一般使用較低離子強度，由于此時導電性低，產熱較少，同時可被分離的帶點顆粒對電

流的奉獻最大，從而加快電泳速度。但它必須可以緩沖被分離樣品中帶點顆粒對凝膠PII值的影響，所以不

可過低，且蛋白質在過低的磷脂啜度下凝聚。一般。01-0.Imol/L,最常用0.05mol/L

凝膠濃度選擇

凝狡濃度太大，孔徑小于樣品分子的尺寸，電泳時蛋白質分子不能進入凝膠，電泳后樣品仍在加樣位置。

?凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質分子均隨緩沖溶液流向前推動而不能得以很好地分離

濃縮膠與分離膠：

濃縮膠，又稱堆積膠。凝膠濃度較小，孔徑相對較大。能把較稀的樣品通過大孔徑凝膠的遷移作用而

使樣品在進入分離膠前被濃縮至一個狹窄的區帶中

分離膠，又稱電泳膠。孔徑較小，通過選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好地分離

?兩者重要區別在于孔徑和PH值，但常使用相同的緩沖系統。前者用PH6.8的Tris-HC1,后者用PH9.0的

Tris-HCL前者凝膠濃度常用4%,后者根據被分離樣品而定

均一股與梯度膠：

均一膠：整塊凝膠為同一濃度，或分離膠為同一濃度。雖不能給出高分辨率，但灌膠簡便，合用于簡樸組

分的樣品分離

梯度膠：分離膠部分由一定的濃度梯度組成，可以是線性梯度，也可以是指數梯度。通常從陰極到陽極，

濃度梯度逐漸增大，孔徑變小（陰極電壓相反），運用分子篩作用提高分辨率，適合于復雜樣品的分離

染色方法：蛋白染色：考馬斯亮藍；銀染色方法（靈敏100倍）

聚丙烯酰胺凝膠電泳的優點：

①孔徑大小可調節，可用于分離多種生物分子.

②機械強度好、彈性大，電滲低、分辨率高。

?③電泳分離后仍然保持生物活性，可用于生物大分子的制備。

?3.聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑和分子篩效應

?凝膠是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介質，能防止近流，把擴散減到最小，并且能影響大分子

顆粒的移動過程。

大分子在凝膠中的分離是受其電荷、大小、和形狀因素的影響。

凝皎的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力，故將此現象稱為分子篩效應。

三.不連續凝膠電泳的分離原理

（一）原理

?系統的不連續性表現在以下幾個方面：

?凝膠系統的不連續性：上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。

?緩沖液離子組成及pH的不連續性：電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.8的

Tris-HCl緩沖液，而分澳膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

?電位梯度的不連續性

在這樣一個不連續的系統里，存在三種物理效應，即樣品的濃縮效應，凝膠的分子篩效應和電荷效

應，由于這三種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高。

?1.濃縮效應

?電泳進行時，在快離子后面形成一離子濃度低的區域，該區域為低電導區。

?電導強度與電導成反比，因此，在低電導區產生較高的電場強度。

?蛋白質和慢離子在快離子后加速移動。

?當快離子和慢離子移動速度相同口、J,在快離子和慢離子之間形成一個電速移動的界面,

樣品蛋白質聚集在這個移動界面的附近，濃縮為一個狹窄的中間層（濃縮300多倍）。

濃縮膠為大孔徑（烯）TV5%,分離膠一般為小孔徑（濃）T>7.5%。樣品在濃凝膠中移動快，當

進入分離膠時受到較大阻力，移動速度減慢。因而，在2層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的不連續性，使樣

品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶，得到濃縮。然后，再依據分子量大小和電荷性質進行電泳分離。

2.分子篩效應

移動界面到達濃縮膠和分離膠界面時，凝膠的pH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增長，

遷移率超過蛋白質分子，隨之高電場強度消失。故蛋白質分子在均一的電壓梯度和pH值條件卜通過一定

孔徑的分離膠。當蛋白質分子量和構型不同時，通過度離膠所受到的阻滯限度不同，導致泳動率不同，結

果依據分子量的大小而分開。

3.電荷效應

蛋白質所帶電荷不同，泳動率也不同，故在同一電場強度中，單位時間內各分子遷移的距離存

在差異。因此，蛋白質樣品經分離膠電泳后，若樣品組分的分子量相同，則它們將按電荷順序排列，從而

導致分離。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)

?在聚丙烯酰胺凝膠中加入去污劑和還原劑(如SDS),蛋白質電泳遷移率重要取決于分子量的大小，

而蛋白質的電荷因素可以忽略

?SDS是一種陰離子表面活性劑，可與蛋白質分子結合,形成SDS-蛋白質復合物。

?在強還原劑疏基乙醉存在下，能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂,形成蛋白質亞基。

?SDS是目前用于測定蛋白質亞基分子量的一種最佳的方法。

一、基本原理(P228)

在蛋白質樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，分子被解聚成多肽鏈，它們與SDS充