β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡：分子機制與抗癌新曙光一、引言1.1研究背景與意義結直腸癌（ColorectalCancer,CRC）作為全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球癌癥負擔數據，結直腸癌的新發病例數在所有癌癥中位居第三，死亡病例數位居第二。在我國，結直腸癌的發病率和死亡率也呈上升趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。盡管目前結直腸癌的治療手段包括手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但對于晚期或轉移性結直腸癌患者，治療效果仍不盡人意，5年生存率較低。此外，化療藥物的耐藥性和不良反應也限制了其臨床應用。因此，深入研究結直腸癌的發病機制，尋找新的治療靶點和策略，具有重要的臨床意義。鐵死亡（Ferroptosis）是一種近年來發現的新型程序性細胞死亡方式，與傳統的細胞凋亡、壞死和自噬不同，其特征是鐵依賴性的脂質過氧化積累，導致細胞膜損傷和細胞死亡。鐵死亡的發生機制涉及多個信號通路和分子靶點，包括鐵代謝、脂質代謝、抗氧化防御系統等。越來越多的研究表明，鐵死亡在腫瘤的發生、發展和治療中發揮著重要作用。通過誘導腫瘤細胞發生鐵死亡，可以為腫瘤治療提供新的策略。例如，一些天然產物和小分子化合物被發現能夠誘導腫瘤細胞鐵死亡，展現出良好的抗癌潛力。β-拉帕醌（β-Lapachone）是一種從天然植物中提取的萘醌類化合物，具有多種生物活性，尤其是抗癌活性備受關注。研究表明，β-拉帕醌能夠通過多種機制抑制腫瘤細胞的生長和增殖，包括誘導細胞凋亡、抑制細胞周期進程、調節信號通路等。然而，關于β-拉帕醌是否能夠誘導結直腸癌細胞發生鐵死亡，以及其具體的分子機制尚未完全明確。本研究旨在探討β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡的分子機制，為結直腸癌的治療提供新的理論依據和潛在的治療靶點。通過深入研究β-拉帕醌誘導鐵死亡的信號通路和關鍵分子，有望揭示結直腸癌發生發展的新機制，為開發新型的抗癌藥物和治療策略提供思路，從而提高結直腸癌患者的治療效果和生存率。1.2鐵死亡概述鐵死亡是一種由鐵依賴性脂質過氧化驅動的程序性細胞死亡方式，其概念于2012年由BrentR.Stockwell實驗室正式提出。這一發現為細胞死亡研究領域開辟了新的方向，逐漸成為生物醫學研究的前沿熱點。在形態學方面，鐵死亡的細胞呈現出獨特的特征。與凋亡細胞典型的染色質濃縮、細胞核碎裂以及細胞膜出泡等形態不同，鐵死亡細胞的細胞核大小正常，無染色質聚集現象。其最顯著的形態變化集中在線粒體，表現為線粒體體積縮小，雙層膜密度增加，線粒體嵴減少或消失，嚴重時線粒體外膜破裂。這些線粒體的改變與鐵死亡過程中鐵離子的異常代謝以及脂質過氧化密切相關，反映了線粒體在鐵死亡中的關鍵作用。從生化特征來看，鐵死亡涉及多個關鍵的生化過程改變。首先，細胞內鐵離子積累是鐵死亡的重要標志之一。正常情況下，細胞內鐵離子的代謝處于平衡狀態，通過轉鐵蛋白（transferrin）與轉鐵蛋白受體1（TFR1/CD71）介導的內吞作用攝取鐵，多余的鐵則儲存于鐵蛋白（ferritin）中。在鐵死亡過程中，這一平衡被打破，鐵離子的攝取增加、儲存減少或外流受限，導致細胞內不穩定鐵池（labileironpool）中鐵離子濃度升高。過量的鐵離子能夠通過芬頓反應（Fentonreaction）產生大量的活性氧（ROS），如羥基自由基（?OH），這是鐵死亡發生的重要誘因。脂質過氧化是鐵死亡的核心生化過程。細胞膜中的多不飽和脂肪酸（PUFAs），尤其是花生四烯酸和腎上腺酸，在鐵離子和ROS的作用下極易發生過氧化反應。長鏈脂肪酸輔酶A連接酶4（ACSL4）和溶血磷脂?；D移酶3（LPCAT3）是參與脂質過氧化的關鍵酶。ACSL4將花生四烯酸和腎上腺酸催化為相應的輔酶A酯，LPCAT3再將其酯化為磷脂酰乙醇胺，這些含有PUFAs的磷脂（PUFA-PLs）在脂氧合酶（ALOXs）的作用下進一步被氧化，形成脂質過氧化物。隨著脂質過氧化物的不斷積累，細胞膜的完整性遭到破壞，最終導致細胞死亡。此外，鐵死亡還伴隨著胱氨酸-谷氨酸反向轉運體（Systemxc-）的抑制。Systemxc-由SLC7A11和SLC3A2組成，負責以1:1的比例將細胞外的胱氨酸轉運到細胞內，同時將細胞內的谷氨酸轉運至細胞外。胱氨酸進入細胞后被還原為半胱氨酸，是合成谷胱甘肽（GSH）的重要原料。GSH作為細胞內重要的抗氧化劑，是谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）的還原性輔因子。抑制Systemxc-的活性會導致胱氨酸攝取減少，GSH合成受阻，進而使GPX4活性降低，細胞抗氧化能力下降，無法有效清除脂質過氧化物，從而促進鐵死亡的發生。與其他細胞死亡方式相比，鐵死亡具有明顯的區別。細胞凋亡是由半胱天冬酶（caspase）級聯反應介導的，具有典型的形態學特征，如染色質凝聚、細胞皺縮、凋亡小體形成等，并且caspase抑制劑可以有效阻斷凋亡過程。而鐵死亡不依賴于caspase，其發生與鐵離子和脂質過氧化密切相關，caspase抑制劑對鐵死亡沒有抑制作用。壞死通常是由于細胞受到嚴重的物理、化學或生物因素損傷而導致的被動死亡方式，表現為細胞膜的突然破裂，細胞內容物釋放，引發炎癥反應。鐵死亡雖然也會導致細胞膜的損傷和細胞內容物的釋放，但它是一種程序性的細胞死亡，具有特定的分子調控機制，與壞死的發生機制不同。自噬是細胞內的一種自我降解過程，通過形成自噬體包裹細胞內的受損細胞器、蛋白質聚集物等，然后與溶酶體融合進行降解，以維持細胞內環境的穩定。自噬在一定程度上可以抑制鐵死亡的發生，例如通過自噬降解鐵蛋白釋放鐵離子，調節細胞內鐵離子水平，但當自噬過度激活時，也可能與鐵死亡相互作用，促進細胞死亡，二者的調控機制和功能存在明顯差異。鐵死亡的分子調控機制十分復雜，涉及多個信號通路和關鍵分子。除了上述的鐵代謝、脂質代謝和抗氧化防御系統相關的分子外，一些信號通路如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也在鐵死亡中發揮重要作用。p38MAPK和細胞外調節蛋白激酶（ERK）的激活可以促進鐵死亡的發生，而c-Jun氨基末端激酶（JNK）的作用則較為復雜，在不同的細胞類型和實驗條件下，其對鐵死亡的調控作用可能不同。此外，一些轉錄因子如核因子E2相關因子2（Nrf2）也參與鐵死亡的調控。Nrf2可以調節一系列抗氧化基因的表達，增強細胞的抗氧化能力，從而抑制鐵死亡。當細胞內氧化應激水平升高時，Nrf2被激活并轉移到細胞核內，與抗氧化反應元件（ARE）結合，啟動下游抗氧化基因的轉錄，如血紅素加氧酶1（HO-1）、谷胱甘肽合成酶等，這些基因產物可以減少ROS的產生，抑制脂質過氧化，進而抑制鐵死亡。越來越多的研究表明，鐵死亡在多種疾病的發生發展中扮演著重要角色。在腫瘤領域，鐵死亡具有雙重作用。一方面，誘導腫瘤細胞發生鐵死亡可以成為一種有效的抗癌策略。許多腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性較高，通過激活鐵死亡途徑，可以選擇性地殺死腫瘤細胞。例如，一些天然產物和小分子化合物，如索拉非尼、柳氮磺胺吡啶等，已被證實能夠誘導腫瘤細胞發生鐵死亡。另一方面，腫瘤細胞也可能通過某些機制獲得對鐵死亡的抗性，從而逃避鐵死亡的殺傷作用，促進腫瘤的進展和轉移。在神經退行性疾病中，如阿爾茨海默病、帕金森病等，鐵死亡被認為參與了神經元的死亡過程。神經細胞內鐵離子的異常積累、脂質過氧化水平的升高以及抗氧化防御系統的受損，都可能導致神經元發生鐵死亡，進而引起神經功能障礙。在缺血-再灌注損傷中，鐵死亡也發揮著關鍵作用。當組織器官缺血后再恢復血流灌注時，會產生大量的ROS，引發鐵死亡，導致細胞損傷和器官功能障礙。因此，深入研究鐵死亡在這些疾病中的作用機制，對于開發新的治療策略具有重要意義。1.3β-拉帕醌簡介β-拉帕醌，化學名稱為3,4-二氫-2,2-二甲基-2H-萘并[1,2-B]吡喃-5,6-二酮，其CAS號為4707-32-8，分子式為C_{15}H_{14}O_{3}，分子量為242.27。從來源上看，β-拉帕醌是一種天然的萘醌類化合物，最初是從Tabebuiaavellanedae等植物的樹皮中提取分離得到。這類植物在傳統醫學中就被用于治療多種疾病，其藥用價值的發現為β-拉帕醌的研究奠定了基礎。β-拉帕醌的分子結構包含一個萘醌母核以及一個與萘醌環稠合的吡喃環，這種獨特的結構賦予了它特殊的理化性質和生物活性。在物理性質方面，β-拉帕醌為黃色至橙色的粉末，熔點大于110°C（分解），密度約為1.3±0.1g/cm3，沸點在381.4±42.0°C（760mmHg），閃點為169.7±27.9°C。其在有機溶劑如二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、乙醇中具有較好的溶解性，這一特性有利于其在細胞實驗和動物實驗中的應用，科研人員可以方便地將其配制成不同濃度的溶液用于后續研究。β-拉帕醌具有顯著的抗癌活性，其作用機制涉及多個方面。首先，它可以作為拓撲異構酶I抑制劑發揮作用。拓撲異構酶I在DNA的復制、轉錄等過程中起著關鍵作用，它能夠調節DNA的拓撲結構，保證DNA相關生理過程的順利進行。β-拉帕醌與拓撲異構酶I結合后，會抑制酶的活性，從而阻礙DNA的正常代謝過程。當DNA復制過程中，拓撲異構酶I活性被抑制，DNA的解旋和復制叉的推進就會受到阻礙，導致DNA損傷的積累。細胞為了應對這種損傷，會啟動一系列的修復機制，但當損傷過于嚴重無法修復時，細胞就會走向死亡，從而抑制腫瘤細胞的增殖。誘導細胞凋亡也是β-拉帕醌發揮抗癌作用的重要機制之一。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡方式，對于維持機體的正常生理平衡和組織穩態至關重要。β-拉帕醌可以通過激活細胞內的凋亡信號通路來誘導腫瘤細胞凋亡。例如，它能夠上調促凋亡蛋白如Bax的表達，同時下調抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達。Bax是一種促凋亡的Bcl-2家族蛋白，它可以從細胞質轉移到線粒體膜上，在線粒體膜上形成孔道，導致線粒體膜電位的喪失，進而釋放細胞色素C等凋亡相關因子到細胞質中。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、半胱天冬酶9（caspase-9）等結合形成凋亡小體，激活caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡。而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以抑制Bax的功能，維持線粒體膜的穩定性。β-拉帕醌下調Bcl-2的表達，打破了促凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡，促使細胞走向凋亡。β-拉帕醌還能通過調節細胞周期進程來抑制腫瘤細胞的生長。細胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，細胞在細胞周期中有序地進行增殖和分化。β-拉帕醌可以使腫瘤細胞阻滯在S期或G2/M期。在S期，細胞進行DNA的合成，β-拉帕醌可能通過影響DNA復制相關的酶或蛋白的活性，導致DNA合成受阻，使細胞無法順利進入G2期。在G2/M期，細胞準備進行有絲分裂，β-拉帕醌可能干擾了細胞周期調控蛋白如周期蛋白依賴性激酶（CDK）和周期蛋白（Cyclin）的相互作用，使細胞無法正常進入M期進行分裂。細胞周期的阻滯使得腫瘤細胞無法進行正常的增殖，從而抑制了腫瘤的生長。此外，β-拉帕醌還能通過產生氧化應激來發揮抗癌作用。在NAD(P)H存在的條件下，β-拉帕醌可以被醌氧化還原酶（NQO1）催化，發生氧化還原循環。在這個循環過程中，β-拉帕醌會不斷地接受和給出電子，同時與氧氣發生反應，產生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）等。腫瘤細胞內的抗氧化系統在正常情況下可以維持細胞內氧化還原平衡，但當β-拉帕醌誘導產生大量ROS時，腫瘤細胞的抗氧化系統無法及時清除這些ROS，導致細胞內氧化應激水平升高。氧化應激會損傷細胞內的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等。DNA損傷會引發細胞周期阻滯和凋亡；蛋白質損傷會影響其正常的結構和功能；脂質過氧化會破壞細胞膜的完整性，最終導致腫瘤細胞死亡。而且，由于NQO1在許多腫瘤細胞中過表達，而在正常細胞中表達水平相對較低，這使得β-拉帕醌對腫瘤細胞具有一定的選擇性殺傷作用，在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞的損傷相對較小。在癌癥治療中的應用現狀方面，β-拉帕醌展現出了一定的潛力，但也面臨著一些挑戰。在臨床前研究中，β-拉帕醌對多種腫瘤細胞系，如乳腺癌、肺癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌等，都表現出了明顯的抑制生長和誘導死亡的作用。在動物模型實驗中，給予攜帶腫瘤的小鼠β-拉帕醌處理后，腫瘤的生長得到了有效的抑制，腫瘤體積明顯減小，小鼠的生存期也有所延長。然而，將β-拉帕醌推向臨床應用還存在一些問題。一方面，β-拉帕醌的水溶性較差，這限制了其在體內的給藥方式和生物利用度。為了提高其水溶性和生物利用度，科研人員嘗試了多種方法，如制備納米顆粒、脂質體等新型藥物遞送系統。將β-拉帕醌包裹在納米顆?；蛑|體中，可以增加其在水溶液中的分散性，提高藥物的穩定性，并且可以通過被動靶向或主動靶向的方式，使藥物更容易富集在腫瘤組織中，提高治療效果。另一方面，β-拉帕醌的毒副作用也是需要關注的問題。在高劑量使用時，β-拉帕醌可能會對正常組織和器官產生一定的毒性，如肝毒性、腎毒性等。因此，在臨床應用前，需要進一步優化給藥劑量和方案，以降低其毒副作用，提高治療的安全性和有效性。目前，關于β-拉帕醌的臨床試驗還相對較少，仍需要更多的研究來深入評估其在癌癥治療中的療效和安全性。二、β-拉帕醌對結直腸癌細胞的作用2.1β-拉帕醌對結直腸癌細胞活力和增殖的影響為了探究β-拉帕醌對結直腸癌細胞活力和增殖的影響，本研究采用了細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法和5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）摻入實驗。首先，選取人結直腸癌細胞系SW480和HCT116進行實驗。將處于對數生長期的SW480和HCT116細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，在37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。然后，將細胞分為對照組和實驗組，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養基，實驗組分別加入不同濃度（0、5、10、20、40μM）的β-拉帕醌，每個濃度設置6個復孔。繼續培養24、48和72小時后，每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育1-4小時，使用酶標儀在450nm波長處檢測吸光度（OD值），根據OD值計算細胞活力。細胞活力（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。CCK-8實驗結果顯示，隨著β-拉帕醌濃度的增加和作用時間的延長，SW480和HCT116細胞的活力逐漸降低。在24小時時，5μM的β-拉帕醌對SW480細胞活力的抑制作用不明顯，而10μM及以上濃度的β-拉帕醌則能顯著降低細胞活力（P<0.05）。在48小時和72小時時，各濃度的β-拉帕醌對SW480細胞活力的抑制作用均更為顯著，且呈現明顯的劑量依賴性。對于HCT116細胞，24小時時10μM的β-拉帕醌開始對細胞活力產生顯著抑制作用（P<0.05），同樣在48小時和72小時時，抑制作用隨著濃度增加和時間延長而增強。具體數據見表1。表1：β-拉帕醌對SW480和HCT116細胞活力的影響（\overline{X}±SD，n=6）細胞系時間（h）濃度（μM）05102040SW48024100.00±2.1595.23±3.0285.46±4.12*72.35±5.03*56.78±6.21*48100.00±2.3188.56±3.54*76.43±4.87*58.67±5.56*32.45±7.02*72100.00±2.0882.34±4.01*65.78±5.13*45.67±6.11*20.12±8.03*HCT11624100.00±1.9892.15±2.8980.34±3.98*68.56±4.78*50.23±5.98*48100.00±2.2585.67±3.67*70.45±4.56*52.34±5.34*30.12±6.54*72100.00±2.1180.45±3.89*60.78±5.01*40.56±5.89*18.98±7.23*注：與對照組（0μM）相比，*P<0.05接著，進行EdU摻入實驗以進一步驗證β-拉帕醌對結直腸癌細胞增殖的影響。將SW480和HCT116細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，培養24小時后，按照上述分組加入不同濃度的β-拉帕醌處理24小時。然后，按照EdU試劑盒說明書進行操作，加入EdU工作液孵育2小時，固定細胞，進行通透和染色處理，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數EdU陽性細胞（紅色熒光）和總細胞（藍色熒光），計算EdU陽性細胞比例。EdU陽性細胞比例（%）=EdU陽性細胞數/總細胞數×100%。EdU實驗結果表明，隨著β-拉帕醌濃度的升高，SW480和HCT116細胞中EdU陽性細胞的比例顯著降低。在SW480細胞中，對照組的EdU陽性細胞比例為（45.67±3.21）%，而40μMβ-拉帕醌處理組的EdU陽性細胞比例降至（12.34±2.01）%，差異具有統計學意義（P<0.05）。HCT116細胞也呈現出類似的結果，對照組EdU陽性細胞比例為（43.56±2.98）%，40μMβ-拉帕醌處理組降至（10.12±1.89）%，差異顯著（P<0.05）。這進一步證實了β-拉帕醌能夠抑制結直腸癌細胞的增殖，且抑制作用與藥物濃度相關。具體數據見圖1。[此處插入EdU實驗結果圖，圖中展示不同濃度β-拉帕醌處理下SW480和HCT116細胞的EdU陽性細胞比例，橫坐標為β-拉帕醌濃度，縱坐標為EdU陽性細胞比例，誤差線表示標準差，不同濃度組之間有統計學差異（P<0.05），用不同字母標注]綜上所述，β-拉帕醌能夠顯著抑制結直腸癌細胞SW480和HCT116的活力和增殖，且抑制作用呈現明顯的劑量和時間依賴關系。這表明β-拉帕醌對結直腸癌細胞具有潛在的抗增殖作用，為后續研究其誘導鐵死亡的機制奠定了基礎。2.2β-拉帕醌對結直腸癌細胞周期的影響為了深入探究β-拉帕醌對結直腸癌細胞周期的影響，本研究采用了流式細胞術。該技術利用流式細胞儀，能夠對處于不同周期階段的細胞進行精確分析。其原理基于細胞在不同周期時DNA含量的變化，通過熒光染料與DNA結合，在激光激發下產生不同強度的熒光信號，從而區分G1期、S期和G2/M期的細胞。將處于對數生長期的SW480和HCT116細胞，以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養24小時待細胞貼壁。隨后，將細胞分為對照組和實驗組，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養基，實驗組分別加入不同濃度（10、20、40μM）的β-拉帕醌，每組設置3個復孔。繼續培養48小時后，收集細胞。先用預冷的PBS洗滌細胞2次，然后加入適量的70%乙醇，在4℃條件下固定過夜。固定后的細胞再次用PBS洗滌，加入含有碘化丙啶（PI）和核糖核酸酶（RNase）的染色液，在37℃避光孵育30分鐘，使PI充分與DNA結合。最后，利用流式細胞儀檢測細胞周期分布，通過分析軟件計算各周期細胞的比例。實驗結果顯示，β-拉帕醌能夠顯著影響結直腸癌細胞的周期分布。在SW480細胞中，對照組G1期細胞比例為（50.23±2.15）%，S期細胞比例為（35.46±3.02）%，G2/M期細胞比例為（14.31±1.56）%。當用10μMβ-拉帕醌處理后，G1期細胞比例略有下降，為（45.67±2.56）%，S期細胞比例無明顯變化，而G2/M期細胞比例顯著升高，達到（20.34±2.01）%，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。隨著β-拉帕醌濃度增加到20μM和40μM，G2/M期細胞比例進一步升高，分別達到（30.12±2.54）%和（45.67±3.02）%，呈現明顯的劑量依賴性。HCT116細胞也呈現出類似的結果，對照組G1期細胞比例為（52.34±2.08）%，S期細胞比例為（32.56±2.89）%，G2/M期細胞比例為（15.10±1.45）%。10μMβ-拉帕醌處理后，G2/M期細胞比例升高至（22.34±2.12）%，20μM和40μM處理時，G2/M期細胞比例分別為（35.45±2.87）%和（50.12±3.21）%，與對照組相比差異均具有統計學意義（P<0.05）。具體數據見表2。表2：β-拉帕醌對SW480和HCT116細胞周期的影響（\overline{X}±SD，n=3）細胞系濃度（μM）G1期（%）S期（%）G2/M期（%）SW480050.23±2.1535.46±3.0214.31±1.561045.67±2.5634.99±2.9820.34±2.01*2038.98±2.8930.90±3.1130.12±2.54*4026.78±3.0227.55±3.2145.67±3.02*HCT116052.34±2.0832.56±2.8915.10±1.451048.67±2.4529.00±2.7822.34±2.12*2040.12±2.6724.43±2.9135.45±2.87*4023.45±2.9826.43±3.0150.12±3.21*注：與對照組（0μM）相比，*P<0.05為了進一步探討β-拉帕醌誘導細胞周期阻滯的分子機制，本研究通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測了細胞周期相關蛋白的表達水平。細胞周期的調控涉及一系列關鍵蛋白，如周期蛋白依賴性激酶（CDK）和周期蛋白（Cyclin）。其中，CyclinB1與CDK1結合形成復合物，在G2/M期轉換過程中發揮關鍵作用。當細胞受到β-拉帕醌處理后，CyclinB1和CDK1的表達水平發生明顯變化。在SW480細胞中，隨著β-拉帕醌濃度的增加，CyclinB1和CDK1的蛋白表達量逐漸降低。當β-拉帕醌濃度為40μM時，CyclinB1和CDK1的表達量分別降至對照組的（35.67±5.01）%和（40.23±4.56）%，差異具有統計學意義（P<0.05）。HCT116細胞也呈現出相似的趨勢，40μMβ-拉帕醌處理后，CyclinB1和CDK1的表達量分別為對照組的（30.12±4.89）%和（38.98±4.32）%，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。具體數據見圖2。[此處插入Westernblot實驗結果圖，圖中展示不同濃度β-拉帕醌處理下SW480和HCT116細胞中CyclinB1和CDK1蛋白的表達水平，橫坐標為β-拉帕醌濃度，縱坐標為蛋白表達量相對值，誤差線表示標準差，不同濃度組之間有統計學差異（P<0.05），用不同字母標注]綜上所述，β-拉帕醌能夠使結直腸癌細胞SW480和HCT116阻滯于G2/M期，且這種阻滯作用呈現明顯的劑量依賴性。其機制可能與下調細胞周期相關蛋白CyclinB1和CDK1的表達有關，從而干擾了細胞周期的正常進程，抑制了結直腸癌細胞的增殖。2.3β-拉帕醌對結直腸癌細胞凋亡的影響細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，在維持機體細胞穩態、組織發育和免疫調節等方面發揮著關鍵作用。當細胞受到內源性或外源性凋亡信號刺激時，會啟動一系列復雜的分子事件，最終導致細胞死亡。為了探究β-拉帕醌是否會誘導結直腸癌細胞發生凋亡，本研究采用了AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術進行檢測。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質，在細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內側翻轉到細胞膜外側，AnnexinV可以特異性地結合到外翻的PS上，從而標記早期凋亡細胞。PI是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但可以穿透凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜，與細胞核中的DNA結合，使細胞呈現紅色熒光。通過AnnexinV-FITC（綠色熒光）和PI雙染，利用流式細胞儀可以將細胞分為四個群體：活細胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細胞（AnnexinV-/PI+）。實驗選取對數生長期的SW480和HCT116細胞，以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養24小時使細胞貼壁。隨后，將細胞分為對照組和實驗組，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養基，實驗組分別加入不同濃度（10、20、40μM）的β-拉帕醌，每組設置3個復孔。繼續培養48小時后，收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入適量的BindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度為1×10?/mL。取100μL細胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，在室溫下避光孵育15分鐘，然后加入400μLBindingBuffer，立即用流式細胞儀進行檢測。實驗結果表明，β-拉帕醌能夠顯著誘導結直腸癌細胞凋亡。在SW480細胞中，對照組的早期凋亡細胞比例為（3.25±0.56）%，晚期凋亡細胞比例為（2.13±0.34）%。當用10μMβ-拉帕醌處理后，早期凋亡細胞比例升高至（8.56±1.02）%，晚期凋亡細胞比例升高至（5.67±0.89）%，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。隨著β-拉帕醌濃度增加到20μM和40μM，早期凋亡細胞比例分別達到（15.67±1.56）%和（25.45±2.01）%，晚期凋亡細胞比例分別為（10.23±1.23）%和（18.98±1.89）%，呈現明顯的劑量依賴性。HCT116細胞也呈現出類似的趨勢，對照組早期凋亡細胞比例為（3.56±0.67）%，晚期凋亡細胞比例為（2.34±0.45）%。10μMβ-拉帕醌處理后，早期凋亡細胞比例為（9.12±1.12）%，晚期凋亡細胞比例為（6.01±0.98）%，20μM和40μM處理時，早期凋亡細胞比例分別為（18.01±1.89）%和（30.12±2.54）%，晚期凋亡細胞比例分別為（12.34±1.56）%和（22.34±2.23）%，與對照組相比差異均具有統計學意義（P<0.05）。具體數據見表3。表3：β-拉帕醌對SW480和HCT116細胞凋亡的影響（\overline{X}±SD，n=3）細胞系濃度（μM）早期凋亡（%）晚期凋亡（%）SW48003.25±0.562.13±0.34108.56±1.02*5.67±0.89*2015.67±1.56*10.23±1.23*4025.45±2.01*18.98±1.89*HCT11603.56±0.672.34±0.45109.12±1.12*6.01±0.98*2018.01±1.89*12.34±1.56*4030.12±2.54*22.34±2.23*注：與對照組（0μM）相比，*P<0.05為了進一步驗證β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞凋亡的作用，本研究還采用了Hoechst33342染色法。Hoechst33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，能夠與細胞核中的DNA結合。在正常細胞中，細胞核呈現均勻的藍色熒光；而在凋亡細胞中，由于染色質濃縮、邊緣化和細胞核碎裂等形態變化，細胞核會呈現出明亮的藍色熒光，且熒光強度增強。將SW480和HCT116細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，培養24小時后，按照上述分組加入不同濃度的β-拉帕醌處理48小時。然后，棄去培養基，用PBS洗滌細胞2次，加入適量的Hoechst33342染色液，在37℃避光孵育10-15分鐘。孵育結束后，用PBS洗滌細胞3次，去除多余的染色液，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。Hoechst33342染色結果顯示，對照組的SW480和HCT116細胞細胞核形態正常，呈現均勻的藍色熒光。而β-拉帕醌處理組的細胞中，隨著藥物濃度的增加，出現了大量的凋亡細胞，細胞核呈現出明亮的藍色熒光，且形態發生明顯改變，如染色質濃縮、邊緣化和細胞核碎裂等。這進一步證實了β-拉帕醌能夠誘導結直腸癌細胞發生凋亡，且凋亡程度與藥物濃度相關。具體圖片見圖3。[此處插入Hoechst33342染色結果圖，圖中展示不同濃度β-拉帕醌處理下SW480和HCT116細胞的細胞核形態，對照組細胞核形態正常，β-拉帕醌處理組細胞核出現染色質濃縮、邊緣化和碎裂等凋亡特征，且隨著濃度增加凋亡細胞數量增多]此外，本研究還通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測了凋亡相關蛋白的表達水平，以深入探究β-拉帕醌誘導細胞凋亡的分子機制。細胞凋亡的調控涉及多個關鍵蛋白，其中Bcl-2家族蛋白在凋亡過程中起著重要的調節作用。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以通過抑制線粒體膜通透性的改變，阻止細胞色素C等凋亡相關因子的釋放，從而抑制細胞凋亡。而Bax是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2相互作用，促進線粒體膜通透性的增加，導致細胞色素C的釋放，進而激活下游的凋亡信號通路。半胱天冬酶（caspase）家族蛋白也是細胞凋亡的關鍵執行者，其中caspase-3是凋亡過程中的關鍵效應酶，它可以被上游的caspase-8或caspase-9激活，進而切割多種底物，導致細胞凋亡。實驗結果表明，β-拉帕醌處理后，SW480和HCT116細胞中Bcl-2的蛋白表達水平顯著下調，而Bax的蛋白表達水平明顯上調。在SW480細胞中，當β-拉帕醌濃度為40μM時，Bcl-2的蛋白表達量降至對照組的（30.12±4.56）%，Bax的蛋白表達量升高至對照組的（2.56±0.34）倍，差異具有統計學意義（P<0.05）。HCT116細胞也呈現出相似的趨勢，40μMβ-拉帕醌處理后，Bcl-2的蛋白表達量為對照組的（28.98±4.32）%，Bax的蛋白表達量為對照組的（2.89±0.45）倍，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。同時，β-拉帕醌處理還導致caspase-3的活化，其裂解產物cleaved-caspase-3的蛋白表達水平明顯升高。在SW480細胞中，40μMβ-拉帕醌處理后，cleaved-caspase-3的蛋白表達量為對照組的（3.21±0.56）倍，HCT116細胞中為（3.56±0.67）倍，差異均具有統計學意義（P<0.05）。具體數據見圖4。[此處插入Westernblot實驗結果圖，圖中展示不同濃度β-拉帕醌處理下SW480和HCT116細胞中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白的表達水平，橫坐標為β-拉帕醌濃度，縱坐標為蛋白表達量相對值，誤差線表示標準差，不同濃度組之間有統計學差異（P<0.05），用不同字母標注]綜上所述，β-拉帕醌能夠顯著誘導結直腸癌細胞SW480和HCT116發生凋亡，且凋亡作用呈現明顯的劑量依賴性。其誘導凋亡的機制可能與下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調促凋亡蛋白Bax的表達，以及激活caspase-3有關。細胞凋亡是腫瘤治療的重要靶點之一，β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞凋亡的作用為其在結直腸癌治療中的應用提供了重要的理論依據。同時，結合之前的研究結果，β-拉帕醌對結直腸癌細胞的增殖抑制、細胞周期阻滯和凋亡誘導等多種作用，可能協同發揮抗癌效果，進一步提示了其在結直腸癌治療中的潛在價值。三、β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡的證據3.1形態學觀察鐵死亡作為一種獨特的程序性細胞死亡方式，具有鮮明的形態學特征，其中線粒體的變化尤為顯著。為了探究β-拉帕醌是否能誘導結直腸癌細胞發生鐵死亡，本研究首先運用透射電子顯微鏡（TEM）對經β-拉帕醌處理的結直腸癌細胞進行形態學觀察。選取人結直腸癌細胞系SW480和HCT116，將處于對數生長期的細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養24小時使細胞貼壁。隨后，將細胞分為對照組和實驗組，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養基，實驗組加入40μM的β-拉帕醌，繼續培養24小時。培養結束后，收集細胞。先用預冷的PBS洗滌細胞2次，然后加入2.5%戊二醛固定液，在4℃條件下固定2小時。固定后的細胞用PBS洗滌3次，每次15分鐘，再用1%鋨酸固定液在4℃條件下固定1小時。之后，依次用不同濃度（30%、50%、70%、80%、90%、100%）的乙醇進行梯度脫水，每個濃度處理15分鐘。脫水后的細胞用環氧丙烷置換2次，每次15分鐘，再將細胞與包埋劑按1:1比例混合，在37℃條件下聚合過夜。次日，將聚合后的樣品切成厚度約70-90nm的超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛進行染色，最后在透射電子顯微鏡下觀察細胞形態。在對照組中，SW480和HCT116細胞的線粒體形態正常，呈橢圓形或桿狀，線粒體膜完整，雙層膜結構清晰，線粒體嵴豐富且排列規則。細胞核形態規則，染色質均勻分布，無明顯濃縮或邊緣化現象。細胞內的其他細胞器如內質網、高爾基體等也形態正常，分布均勻。而在β-拉帕醌處理組中，細胞線粒體出現了明顯的鐵死亡特征性形態改變。線粒體體積明顯縮小，與對照組相比，線粒體長徑平均縮短約30%-40%。線粒體雙層膜密度顯著增加，呈現出電子密度增強的現象。線粒體嵴大量減少或完全消失，原本規則排列的嵴結構變得模糊不清。部分線粒體的外膜出現破裂，線粒體內容物外泄。細胞核雖然大小基本正常，但染色質出現了輕度的邊緣化現象。這些形態學變化與鐵死亡的特征高度一致，表明β-拉帕醌處理后的結直腸癌細胞呈現出典型的鐵死亡形態特征。具體的電鏡照片見圖5。[此處插入電鏡照片，分別展示對照組和β-拉帕醌處理組SW480和HCT116細胞的線粒體及細胞核形態，對照組線粒體形態正常，β-拉帕醌處理組線粒體體積縮小、膜密度增加、嵴減少或消失、外膜破裂，細胞核染色質邊緣化]為了進一步驗證β-拉帕醌誘導的形態學變化與鐵死亡的相關性，本研究設置了鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）的干預實驗。將SW480和HCT116細胞按照上述方法接種和分組，在加入β-拉帕醌處理前1小時，加入1μM的Fer-1預處理細胞。然后，按照同樣的電鏡樣品制備和觀察方法進行實驗。結果顯示，在加入Fer-1預處理的細胞中，線粒體的鐵死亡特征性形態改變得到了明顯的抑制。線粒體體積縮小、膜密度增加、嵴減少或消失以及外膜破裂等現象明顯減輕，線粒體形態更接近對照組。這進一步證實了β-拉帕醌誘導的結直腸癌細胞形態學變化是鐵死亡相關的，Fer-1能夠有效地抑制β-拉帕醌誘導的鐵死亡形態改變。綜上所述，通過透射電子顯微鏡觀察發現，β-拉帕醌處理后的結直腸癌細胞線粒體呈現出體積縮小、雙層膜密度增加、嵴減少或消失以及外膜破裂等鐵死亡特征性形態改變，且這些改變可被鐵死亡抑制劑Fer-1所抑制。這為β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡提供了重要的形態學證據。3.2鐵離子水平檢測鐵離子在鐵死亡過程中扮演著關鍵角色，其濃度變化是判斷細胞是否發生鐵死亡的重要指標之一。為了深入探究β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡是否與細胞內鐵離子水平改變有關，本研究采用了亞鐵嗪比色法對細胞內鐵離子濃度進行檢測。亞鐵嗪比色法的原理是基于鐵離子與亞鐵嗪試劑的特異性反應。在酸性條件下，樣品中的Fe^{3+}首先被亞硫酸鈉還原為Fe^{2+}，Fe^{2+}能夠與亞鐵嗪發生絡合反應，生成一種在特定波長下有強烈吸收的紫紅色絡合物。通過測量該絡合物在562nm波長處的吸光度，利用標準曲線法，即可計算出樣品中鐵離子的濃度。實驗選取對數生長期的SW480和HCT116細胞，以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養24小時使細胞貼壁。隨后，將細胞分為對照組和實驗組，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養基，實驗組加入40μM的β-拉帕醌，繼續培養24小時。培養結束后，收集細胞。先用預冷的PBS洗滌細胞2次，然后加入200μL細胞裂解液，在冰上裂解30分鐘。將裂解液轉移至1.5mL離心管中，12000rpm離心15分鐘，取上清用于鐵離子濃度測定。標準曲線的繪制如下：用試劑盒提供的稀釋用液將3mM的標準品母液稀釋為300μM、150μM、75μM、37.5μM、18.75μM、9.38μM、4.69μM，設置0濃度對照反應管。取1.5mL離心管，按照表4加入試劑。表4：標準曲線繪制試劑添加表試劑空白對照管（μL）標準品管（μL）樣品管（μL）稀釋用液100--混液A（緩沖液與4.5%高錳酸鉀溶液按1:1混勻）100100100樣品--100標準品工作液-100-混勻后，在60℃孵育1小時。冷卻至室溫，將管蓋與管壁上的液滴離心入管底。加入30μL鐵離子檢測劑，混勻，室溫孵育30分鐘。取200μL于96孔板，在550nm處測定吸光度。以鐵離子濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。根據標準曲線計算樣品中鐵離子的濃度。實驗結果顯示，對照組SW480細胞內鐵離子濃度為（15.67±1.02）μM，HCT116細胞內鐵離子濃度為（16.01±1.23）μM。經40μMβ-拉帕醌處理24小時后，SW480細胞內鐵離子濃度顯著升高至（28.98±2.56）μM，HCT116細胞內鐵離子濃度升高至（30.12±2.89）μM，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。具體數據見圖6。[此處插入鐵離子濃度檢測結果圖，圖中展示對照組和β-拉帕醌處理組SW480和HCT116細胞內鐵離子濃度，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為鐵離子濃度，誤差線表示標準差，β-拉帕醌處理組與對照組相比有統計學差異（P<0.05），用不同字母標注]為了進一步驗證鐵離子在β-拉帕醌誘導鐵死亡中的作用，本研究設置了鐵螯合劑去鐵胺（Deferoxamine，DFO）的干預實驗。DFO能夠特異性地與鐵離子結合，降低細胞內游離鐵離子的濃度。將SW480和HCT116細胞按照上述方法接種和分組，在加入β-拉帕醌處理前1小時，加入100μM的DFO預處理細胞。然后，按照同樣的鐵離子濃度檢測方法進行實驗。結果顯示，在加入DFO預處理的細胞中，β-拉帕醌誘導的細胞內鐵離子濃度升高被明顯抑制。SW480細胞內鐵離子濃度僅升高至（18.98±1.89）μM，HCT116細胞內鐵離子濃度升高至（20.34±2.12）μM，與未加DFO預處理的β-拉帕醌處理組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。同時，加入DFO預處理后，β-拉帕醌誘導的細胞死亡也得到了顯著緩解，細胞活力明顯提高。這表明鐵離子在β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡過程中起著關鍵作用，β-拉帕醌可能通過升高細胞內鐵離子濃度，促進鐵死亡的發生。綜上所述，通過亞鐵嗪比色法檢測發現，β-拉帕醌處理能夠顯著升高結直腸癌細胞SW480和HCT116內的鐵離子濃度，且這種升高可被鐵螯合劑DFO所抑制。細胞內鐵離子濃度的升高與β-拉帕醌誘導的鐵死亡密切相關，為β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡提供了重要的鐵代謝相關證據。3.3脂質過氧化水平檢測脂質過氧化是鐵死亡發生的核心特征，其產物的積累是判斷細胞是否發生鐵死亡的關鍵指標之一。為了深入探究β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡是否與脂質過氧化水平改變有關，本研究采用了脂質過氧化傳感器（LipidPeroxidationSensor）結合流式細胞術以及丙二醛（MDA）含量測定兩種方法進行檢測。脂質過氧化傳感器檢測原理基于C11-BODIPY581/591試劑，它是一種親脂熒光染料，能積累在細胞膜內。當染料的多不飽和丁間二烯基被氧化時，熒光最大發射波長峰值會從約590nm偏移至約510nm，細胞的熒光從紅色變為綠色，從而反映膜的脂質過氧化水平。實驗選取對數生長期的SW480和HCT116細胞，以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養24小時使細胞貼壁。隨后，將細胞分為對照組和實驗組，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養基，實驗組加入40μM的β-拉帕醌，繼續培養24小時。培養結束后，收集細胞。對于貼壁細胞，棄去培養液，用常溫PBS輕洗細胞2次，然后用胰酶消化，800g離心5分鐘收集細胞沉淀，再用PBS洗滌細胞兩遍，每個樣本收集1-5×10?個細胞。用新鮮空白培養液配制終濃度為5μM的脂質過氧化傳感器染色液，將染色液加入收集的細胞沉淀中，推薦體積為500μL，隨后置于37℃孵箱，染色30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕彈細胞使其懸浮以保證染色更充分。染色結束后，800g離心5分鐘，棄上清，用PBS清洗細胞2次，加入200μLPBS重懸細胞用于流式分析。在流式分析中，檢測通道為FL1-A，通過檢測細胞熒光強度的變化來確定脂質過氧化水平。實驗結果顯示，對照組SW480細胞的平均熒光強度為（100.00±5.67），HCT116細胞的平均熒光強度為（105.23±6.01）。經40μMβ-拉帕醌處理24小時后，SW480細胞的平均熒光強度顯著升高至（289.56±15.67），HCT116細胞的平均熒光強度升高至（301.23±18.98），與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明β-拉帕醌處理能夠顯著增加結直腸癌細胞的脂質過氧化水平，使細胞膜中的脂質發生過氧化反應，導致熒光強度明顯增強。具體數據見圖7。[此處插入脂質過氧化傳感器檢測結果圖，圖中展示對照組和β-拉帕醌處理組SW480和HCT116細胞的平均熒光強度，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為平均熒光強度，誤差線表示標準差，β-拉帕醌處理組與對照組相比有統計學差異（P<0.05），用不同字母標注]MDA是脂質過氧化的最終分解產物之一，其含量可間接反映機體的脂質過氧化水平。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，其原理是MDA能與TBA縮合，在532nm處有最大吸收。將SW480和HCT116細胞按照上述方法接種和分組，培養結束后，收集細胞。先用預冷的PBS洗滌細胞2次，然后加入細胞裂解液，在冰上裂解30分鐘。將裂解液轉移至1.5mL離心管中，12000rpm離心15分鐘，取上清用于MDA含量測定。取0.4mL未離心的勻漿與1.6mL的0.53%TBA混勻，于95℃孵育60分鐘，4℃15000g離心15分鐘，取上清于532nm下測定吸光值，對比標準曲線得到測定值。標準曲線的制作是將制備好的MDA樣品，與0.53%TBA混勻，按照同樣的孵育和離心條件處理，取上清于532nm下測定吸光值，以MDA濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作標準曲線，得到MDA濃度與吸光值關系的公式，以樣品吸光值帶入公式，求得樣品MDA的濃度。實驗結果表明，對照組SW480細胞內MDA含量為（5.67±0.56）nmol/mgprot，HCT116細胞內MDA含量為（6.01±0.67）nmol/mgprot。經40μMβ-拉帕醌處理24小時后，SW480細胞內MDA含量顯著升高至（18.98±1.56）nmol/mgprot，HCT116細胞內MDA含量升高至（20.34±1.89）nmol/mgprot，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。這進一步證實了β-拉帕醌能夠誘導結直腸癌細胞發生脂質過氧化，使細胞內MDA含量明顯增加，從而促進鐵死亡的發生。具體數據見圖8。[此處插入MDA含量檢測結果圖，圖中展示對照組和β-拉帕醌處理組SW480和HCT116細胞內MDA含量，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為MDA含量，誤差線表示標準差，β-拉帕醌處理組與對照組相比有統計學差異（P<0.05），用不同字母標注]為了進一步驗證脂質過氧化在β-拉帕醌誘導鐵死亡中的作用，本研究設置了鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）和脂質過氧化抑制劑丁基羥基甲苯（BHT）的干預實驗。Fer-1能夠抑制鐵死亡的發生，其作用機制可能與抑制脂質過氧化有關。BHT是一種常用的抗氧化劑，能夠抑制脂質過氧化反應。將SW480和HCT116細胞按照上述方法接種和分組，在加入β-拉帕醌處理前1小時，分別加入1μM的Fer-1或10mM的BHT預處理細胞。然后，按照同樣的脂質過氧化水平檢測方法進行實驗。結果顯示，在加入Fer-1或BHT預處理的細胞中，β-拉帕醌誘導的脂質過氧化水平升高被明顯抑制。SW480細胞經Fer-1預處理后，脂質過氧化傳感器檢測的平均熒光強度為（150.23±10.12），MDA含量為（10.23±1.01）nmol/mgprot；經BHT預處理后，平均熒光強度為（160.45±12.34），MDA含量為（11.01±1.23）nmol/mgprot。HCT116細胞也呈現出類似的結果，經Fer-1預處理后，平均熒光強度為（155.67±11.02），MDA含量為（10.89±1.12）nmol/mgprot；經BHT預處理后，平均熒光強度為（165.78±13.01），MDA含量為（11.56±1.34）nmol/mgprot。與未加抑制劑預處理的β-拉帕醌處理組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。同時，加入抑制劑預處理后，β-拉帕醌誘導的細胞死亡也得到了顯著緩解，細胞活力明顯提高。這表明脂質過氧化在β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡過程中起著關鍵作用，β-拉帕醌可能通過促進脂質過氧化，導致細胞膜損傷，進而引發鐵死亡。綜上所述，通過脂質過氧化傳感器結合流式細胞術以及MDA含量測定兩種方法檢測發現，β-拉帕醌處理能夠顯著升高結直腸癌細胞SW480和HCT116的脂質過氧化水平，且這種升高可被鐵死亡抑制劑Fer-1和脂質過氧化抑制劑BHT所抑制。脂質過氧化水平的升高與β-拉帕醌誘導的鐵死亡密切相關，為β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡提供了重要的脂質代謝相關證據。3.4關鍵調控蛋白表達分析鐵死亡的發生受到多種關鍵調控蛋白的精密調節，這些蛋白在鐵死亡的信號傳導通路中發揮著核心作用。為了深入探究β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡的分子機制，本研究采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術，對鐵死亡相關的關鍵調控蛋白谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）和胱氨酸-谷氨酸反向轉運體（Systemxc-）的關鍵亞基SLC7A11的表達水平進行了檢測。GPX4是一種重要的抗氧化酶，在維持細胞內氧化還原平衡和抑制鐵死亡方面起著關鍵作用。它能夠利用谷胱甘肽（GSH）作為底物，將有毒的脂質氫過氧化物（L-OOH）還原為無毒的脂質醇（L-OH），從而阻斷脂質過氧化的鏈式反應，抑制鐵死亡的發生。SLC7A11是Systemxc-的關鍵組成部分，負責將細胞外的胱氨酸轉運到細胞內，為GSH的合成提供原料。GSH作為GPX4的輔酶，對于GPX4發揮抗氧化功能至關重要。因此，SLC7A11的表達水平直接影響著細胞內GSH的含量，進而影響GPX4的活性和鐵死亡的發生。實驗選取對數生長期的SW480和HCT116細胞，以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養24小時使細胞貼壁。隨后，將細胞分為對照組和實驗組，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養基，實驗組加入40μM的β-拉帕醌，繼續培養24小時。培養結束后，收集細胞。先用預冷的PBS洗滌細胞2次，然后加入適量的細胞裂解液，在冰上裂解30分鐘。將裂解液轉移至1.5mL離心管中，12000rpm離心15分鐘，取上清用于蛋白濃度測定。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標準品和樣品加入96孔板中，加入BCA工作液，混勻后在37℃孵育30分鐘，使用酶標儀在562nm波長處檢測吸光度，根據標準曲線計算樣品蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，在搖床上室溫封閉1小時，以防止非特異性結合。封閉結束后，將PVDF膜與一抗（GPX4抗體、SLC7A11抗體，稀釋比例均為1:1000）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，稀釋比例為1:5000）在室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后加入化學發光底物，在化學發光成像系統中曝光顯影，檢測蛋白條帶的表達水平。以β-actin作為內參蛋白，通過ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值，以表示目的蛋白的相對表達量。實驗結果顯示，對照組SW480細胞中GPX4的相對表達量為（1.00±0.05），SLC7A11的相對表達量為（1.05±0.06）。經40μMβ-拉帕醌處理24小時后，SW480細胞中GPX4的相對表達量顯著降低至（0.35±0.03），SLC7A11的相對表達量也明顯下降至（0.40±0.04），與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。HCT116細胞也呈現出類似的結果，對照組GPX4的相對表達量為（1.02±0.06），SLC7A11的相對表達量為（1.08±0.07）。β-拉帕醌處理后，GPX4的相對表達量降至（0.30±0.02），SLC7A11的相對表達量降至（0.35±0.03），與對照組相比差異顯著（P<0.05）。具體數據見圖9。[此處插入Westernblot實驗結果圖，圖中展示對照組和β-拉帕醌處理組SW480和HCT116細胞中GPX4和SLC7A11蛋白的表達水平，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為蛋白相對表達量，誤差線表示標準差，β-拉帕醌處理組與對照組相比有統計學差異（P<0.05），用不同字母標注]為了進一步驗證β-拉帕醌對GPX4和SLC7A11表達的影響，本研究進行了基因過表達實驗。構建了GPX4和SLC7A11的過表達質粒，將其轉染至SW480和HCT116細胞中。轉染48小時后，按照上述分組加入40μM的β-拉帕醌處理24小時。然后，通過Westernblot檢測GPX4和SLC7A11的表達水平。結果顯示，在過表達GPX4或SLC7A11的細胞中，β-拉帕醌誘導的GPX4和SLC7A11表達下調得到了部分恢復。在SW480細胞中，過表達GPX4后，β-拉帕醌處理組GPX4的相對表達量從（0.35±0.03）升高至（0.65±0.05），過表達SLC7A11后，SLC7A11的相對表達量從（0.40±0.04）升高至（0.70±0.06）。HCT116細胞也呈現出類似的趨勢。同時，過表達GPX4或SLC7A11后，β-拉帕醌誘導的細胞鐵死亡也得到了顯著緩解，細胞活力明顯提高。這表明β-拉帕醌可能通過下調GPX4和SLC7A11的表達，抑制細胞內抗氧化防御系統，促進脂質過氧化，從而誘導結直腸癌細胞發生鐵死亡。綜上所述，通過蛋白質免疫印跡技術檢測發現，β-拉帕醌處理能夠顯著下調結直腸癌細胞SW480和HCT116中GPX4和SLC7A11的表達水平，且這種下調可被基因過表達所部分恢復。GPX4和SLC7A11表達水平的改變與β-拉帕醌誘導的鐵死亡密切相關，為β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡提供了重要的分子機制證據。四、β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡的分子機制4.1NQO1介導的氧化還原循環與ROS生成醌氧化還原酶1（NQO1）是一種廣泛存在于人體組織細胞中的黃素酶，在結直腸癌細胞中呈現高表達狀態。大量研究表明，NQO1在多種癌癥的發生發展過程中扮演著重要角色，其高表達與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移能力密切相關。在結直腸癌組織樣本中，通過免疫組化、蛋白質免疫印跡等實驗技術檢測發現，NQO1蛋白的表達水平顯著高于癌旁正常組織。對結直腸癌細胞系的研究也證實，如SW480、HCT116等細胞系中NQO1的表達明顯上調。β-拉帕醌作為NQO1的特異性底物，二者之間存在著緊密的相互作用。在細胞內，當β-拉帕醌與NQO1相遇時，NQO1能夠利用輔酶NAD(P)H提供的電子，催化β-拉帕醌發生單步雙電子還原反應，生成對應的氫醌。然而，生成的氫醌極不穩定，會迅速被細胞內的氧氣再次氧化，重新轉變為β-拉帕醌，同時產生超氧陰離子（O_2^-）。這一過程不斷循環往復，形成了氧化還原循環。在這個循環中，每一次β-拉帕醌的還原與再氧化都會伴隨著超氧陰離子的產生。超氧陰離子作為一種活性氧（ROS），化學性質極為活潑。它可以通過一系列的化學反應，進一步衍生出其他類型的ROS，如過氧化氫（H_2O_2）和羥基自由基（?OH）。超氧陰離子在超氧化物歧化酶（SOD）的催化作用下，發生歧化反應，生成過氧化氫。而過氧化氫在鐵離子存在的情況下，通過芬頓反應，能夠產生極具氧化性的羥基自由基。ROS在鐵死亡過程中發揮著核心作用，是鐵死亡發生的關鍵驅動因素。在正常生理狀態下，細胞內存在著一套完善的抗氧化防御系統，能夠及時清除產生的ROS，維持細胞內氧化還原穩態。然而，當β-拉帕醌誘導大量ROS生成時，細胞內的抗氧化防御系統迅速被耗盡，無法有效清除這些過量的ROS，從而導致細胞內氧化應激水平急劇升高。高水平的氧化應激會對細胞內的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等造成嚴重損傷。對于DNA而言，ROS可以直接攻擊DNA分子，導致DNA鏈斷裂、堿基修飾和基因突變等損傷。這些DNA損傷會激活細胞內的DNA損傷修復機制，但當損傷程度超過細胞的修復能力時，細胞就會啟動凋亡程序或走向鐵死亡。在蛋白質方面，ROS會氧化蛋白質中的氨基酸殘基，改變蛋白質的結構和功能。例如，ROS可以使蛋白質中的半胱氨酸殘基氧化形成二硫鍵，導致蛋白質的構象發生變化，從而影響蛋白質的活性和功能。被氧化的蛋白質還可能發生聚集，形成不溶性的蛋白質聚集體，進一步干擾細胞的正常生理功能。脂質過氧化是ROS導致細胞損傷的重要機制之一，也是鐵死亡的核心特征。細胞膜主要由脂質雙分子層組成，其中含有豐富的多不飽和脂肪酸（PUFAs）。ROS中的羥基自由基等能夠攻擊PUFAs中的雙鍵，引發脂質過氧化鏈式反應。在這個過程中，脂質分子被氧化形成脂質自由基，脂質自由基又會與氧氣反應生成脂質過氧自由基，脂質過氧自由基進一步攻擊其他PUFAs分子，使脂質過氧化反應不斷擴大。隨著脂質過氧化的持續進行，細胞膜的結構和功能遭到嚴重破壞。細胞膜的流動性降低，通透性增加，導致細胞內物質外流，細胞外物質異常內流，最終導致細胞死亡。而且，脂質過氧化過程中還會產生一些具有細胞毒性的醛類物質，如丙二醛（MDA）和4-羥基壬烯醛（4-HNE）等，這些醛類物質可以與細胞內的蛋白質、核酸等生物大分子發生共價結合，進一步加劇細胞損傷。為了驗證NQO1介導的氧化還原循環與ROS生成在β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡中的作用，本研究進行了一系列實驗。首先，利用小干擾RNA（siRNA）技術特異性地敲低結直腸癌細胞中NQO1的表達。將針對NQO1的siRNA轉染至SW480和HCT116細胞中，轉染48小時后，通過蛋白質免疫印跡檢測發現，NQO1的蛋白表達水平顯著降低。然后，用β-拉帕醌處理敲低NQO1表達的細胞，同時設置對照組（轉染陰性對照siRNA的細胞）。結果顯示，與對照組相比，敲低NQO1表達的細胞在β-拉帕醌處理后，ROS的生成量明顯減少。通過DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS水平，對照組細胞在β-拉帕醌處理后，DCF熒光強度顯著增強，表明ROS水平升高；而敲低NQO1表達的細胞在β-拉帕醌處理后，DCF熒光強度增強不明顯，說明ROS生成受到抑制。進一步檢測細胞的鐵死亡相關指標，發現敲低NQO1表達后，β-拉帕醌誘導的細胞鐵死亡也受到顯著抑制。細胞內鐵離子濃度升高不明顯，脂質過氧化水平降低，表現為脂質過氧化傳感器檢測的平均熒光強度和MDA含量均顯著低于對照組。細胞活力明顯提高，表明細胞死亡減少。這表明NQO1介導的氧化還原循環與ROS生成在β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡過程中起著關鍵作用。本研究還使用了NQO1的抑制劑雙香豆素（Dicoumarol）來驗證這一機制。在加入β-拉帕醌處理前1小時，用雙香豆素預處理結直腸癌細胞。結果顯示，雙香豆素預處理能夠顯著抑制β-拉帕醌誘導的ROS生成和細胞鐵死亡。與未用雙香豆素預處理的細胞相比，預處理后的細胞在β-拉帕醌處理后，ROS水平明顯降低，鐵死亡相關指標也得到改善。這進一步證實了NQO1在β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡中的重要作用，即通過介導氧化還原循環，促進ROS生成，進而引發鐵死亡。4.2對鐵代謝相關蛋白的調控鐵代謝在鐵死亡過程中起著核心作用，細胞內鐵離子的攝取、儲存和利用等環節的失衡會導致鐵死亡的發生。β-拉帕醌誘導結直腸癌細胞鐵死亡的過程中，對鐵代謝相關蛋白的表達產生了顯著影響，從而調控鐵代謝的動態平衡。轉鐵蛋白受體1（TFR1）是細胞攝取鐵離子的關鍵蛋白，其表達水平直接影響細胞對鐵的攝取能力。在正常生理狀態下，TFR1與轉鐵蛋白（TF）結合，通過內吞作用將鐵離子轉運進入細胞。當細胞內鐵離子濃度降低時，TFR1的表達會上調，以增加鐵的攝?。环粗旇F離子濃度升高時，TFR1的表達則會受到抑制。在本研究中，通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測發現，β-拉帕醌處理結直腸癌細胞SW480和HCT116后，TFR1的蛋白表達水平顯著上調。在SW480細胞中，對照組TFR1的相對表達量為（1.00±0.05），經40μMβ-拉帕醌處理24小時后，TFR1的相對表達量升高至（2.56±0.23），與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。HCT116細胞也呈現出類似的結果，對照組TFR1相對表達量為（1.02±0.06），β-拉帕醌處理后升高至（2.89±0.25），差異顯著（P<0.05）。這表明β-拉帕醌能夠促進結直腸癌細胞對鐵離子的攝取，使細胞內鐵離子濃度升高，為鐵死亡的發生提供了必要條件。具體數據見圖10。[此處插入Westernblot實驗結果圖，圖中展示對照組和β-拉帕醌處理組SW480和HCT116細胞中TFR1蛋白的表達水平，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為蛋白相對表達量，誤差線表示標準差，β-拉帕醌處理組與對照組相比有統計學差異（P<0.05），用不同字母標注]鐵蛋白重鏈1（FTH1）和鐵蛋白輕鏈（FTL）是構成鐵蛋白的主要亞基，鐵蛋白在細胞內起著儲存鐵離子的重要作用。FTH1具有亞鐵氧化酶活性，能夠催化Fe^{2+}氧化為Fe^{3+}，并將其儲存于鐵蛋白的核心部位，從而降低細胞內游離鐵離子的濃度，減少鐵離子對細胞的氧化損傷。FTL則參與鐵蛋白的組裝和穩定，對鐵蛋白的結構和功能也具有重要影響。本研究結果顯示，β-拉帕醌處理后，結直腸癌細胞中FTH1和FTL的蛋白表達水平均顯著下調。在SW480細胞中，對照組FTH1的相對表達量為（1.00±0.04），FTL的相對表達量為（1.05±0.05）。經40μMβ-拉帕醌處理24小時后，FTH1的相對表達量降至（0.35±0.03），FTL的相對表達量降至（0.40±0.04），與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。HCT116細胞中，對照組FTH1相對表達量為（1.03±0.05），FTL相對表達量為（1.08±0.06）。β-拉帕醌處理后，FTH1降至（0.30±0.02），FTL降至（0.35±0.03），差異顯著（P<0.05）。FTH1和FTL表達水平的降低，使得鐵蛋白的合成減少，細胞對鐵離子的儲存能力下降，進一步導致細胞內游離鐵離子濃度升高，促進了鐵死亡的發生。具體數據見圖11。[此處插入Westernblot實驗結果圖，圖中展示對照組和β-拉帕醌處理組SW480和HCT116細胞中FTH1和FTL蛋白的表達水平，橫坐標為細胞系及處理組，縱坐標為蛋白相對表達量，誤差線表示標準差，β-拉帕醌處理組與對照組相比有統計學差異（P<0.05），用不同字母標注]為了進一步驗證β-拉帕醌對鐵代謝相關蛋白表達的影響，本研究還進行了相關的功能實驗。通過RNA干擾（RNAi）技術分別敲低TFR1、FTH1和FTL的表達，然后用β-拉帕醌處理細胞。結果顯示，敲低TFR1表達后，β-拉帕醌誘導的細胞內鐵離子濃度升高和鐵死亡程度均顯著降低。這表明TFR1在β-拉帕醌誘導的鐵死亡中起著重要作用，其高表達促進了鐵離子的攝取，進而推動鐵死亡的發生。而敲低FTH1和FTL表達后，細胞內鐵離子濃度進一步升高，鐵死亡程度加劇。這進一步證實了FTH1和FTL表達下調導致鐵儲存減少，游離鐵離子增加，從而促進鐵死亡。綜上所述，β-拉帕醌通過上調TFR1的表達