YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的核心作用及分子機制深度剖析一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌是全球范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的生命健康。近年來，盡管乳腺癌的早期診斷和綜合治療取得了顯著進展，5年生存率有所提高，但一旦乳腺癌發生轉移，患者的預后仍然極差，病死率居高不下。乳腺癌轉移是一個復雜的多步驟過程，涉及癌細胞脫離原發灶、侵入周圍組織、進入血液循環或淋巴系統，最終在遠處器官定植并形成轉移灶。這一過程受到多種基因、信號通路和細胞微環境因素的精細調控，然而目前我們對乳腺癌轉移的分子機制仍未完全闡明，這嚴重制約了轉移性乳腺癌治療手段的發展和療效的提升。Yes相關蛋白（YAP）作為Hippo信號通路的核心效應因子，在細胞增殖、分化、凋亡以及器官大小調控等生理過程中發揮著關鍵作用。在腫瘤發生發展領域，YAP被證實具有癌基因的功能，其異常激活與多種腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關。在乳腺癌中，YAP的過表達或活性增強不僅與腫瘤的惡性程度增加、預后不良相關，還能夠促進乳腺癌細胞的遷移、侵襲和上皮-間質轉化（EMT）過程。生長分化因子15（GDF15）是轉化生長因子-β（TGF-β）超家族的成員，近年來研究發現GDF15在腫瘤進展中也扮演著重要角色，它可以通過多種機制促進腫瘤細胞的存活、增殖、遷移和免疫逃逸。越來越多的證據表明，YAP與GDF15之間存在著密切的調控關系，二者可能共同構成一條重要的信號通路（YAP-GDF15通路）參與乳腺癌轉移的調控。深入探究YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的作用及分子機制，具有極其重要的理論意義和臨床應用價值。從理論層面來看，揭示YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的分子機制，有助于我們更全面、深入地理解乳腺癌轉移的生物學過程，豐富和完善腫瘤轉移的理論體系。這將為進一步探索乳腺癌轉移的其他潛在調控機制提供新的思路和方向，推動腫瘤生物學領域的發展。在臨床應用方面，若明確YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的關鍵作用，那么該通路中的關鍵分子YAP和GDF15有望成為乳腺癌轉移診斷的新型生物標志物。通過檢測乳腺癌患者體內YAP和GDF15的表達水平或活性狀態，能夠更準確地評估患者的轉移風險和預后情況，為臨床醫生制定個性化的治療方案提供有力依據。此外，以YAP-GDF15通路為靶點開發新型的抗癌藥物，將為轉移性乳腺癌的治療提供新的策略和手段。通過阻斷該通路的活性，有望抑制乳腺癌細胞的轉移能力，提高患者的生存率和生活質量，具有巨大的臨床應用潛力和社會效益。1.2國內外研究現狀近年來，YAP-GDF15通路在腫瘤領域的研究逐漸成為熱點，國內外學者針對該通路在乳腺癌轉移中的作用及分子機制展開了一系列研究，取得了一定的進展，但仍存在許多未知和待完善之處。在YAP與乳腺癌轉移的研究方面，國外起步相對較早。多項研究表明，YAP在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常乳腺組織，且其高表達與乳腺癌的惡性程度、淋巴結轉移及不良預后密切相關。美國的研究團隊發現，在乳腺癌細胞系中過表達YAP能夠顯著增強細胞的遷移和侵襲能力，而敲低YAP則可抑制這些過程。進一步的機制研究揭示，YAP主要通過與轉錄增強相關結構域（TEAD）家族轉錄因子相互作用，激活一系列下游靶基因的轉錄，從而促進乳腺癌細胞的上皮-間質轉化（EMT），使癌細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。EMT過程中，YAP-TEAD復合物上調E-鈣黏蛋白抑制因子（如Snail、Slug和Twist等）的表達，導致E-鈣黏蛋白表達下降，細胞間黏附力減弱，同時上調波形蛋白（Vimentin）等間質標志物的表達，使細胞骨架重構，獲得間質細胞的特性，進而促進癌細胞的轉移。國內學者也在YAP與乳腺癌轉移的研究中取得了豐碩成果。有研究通過對大量乳腺癌患者組織標本進行免疫組化分析，發現YAP的表達水平與乳腺癌的臨床分期、組織學分級及淋巴結轉移呈正相關，這與國外的研究結果相一致。在分子機制研究方面，國內團隊發現YAP還可以通過激活PI3K/AKT信號通路，促進乳腺癌細胞的增殖、存活和遷移，從而間接促進腫瘤轉移。此外，YAP還能通過調節腫瘤微環境中的細胞因子和趨化因子的表達，影響腫瘤相關巨噬細胞、腫瘤相關成纖維細胞等基質細胞的功能，為乳腺癌細胞的轉移提供有利的微環境。關于GDF15與乳腺癌轉移的關系，國外研究發現，GDF15在乳腺癌患者的血清和腫瘤組織中表達上調，且其高表達與乳腺癌的遠處轉移和不良預后相關。研究表明，GDF15可以通過自分泌和旁分泌的方式作用于乳腺癌細胞，激活下游的ERK、PI3K/AKT等信號通路，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲。同時，GDF15還能抑制自然殺傷細胞（NK細胞）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的活性，幫助乳腺癌細胞逃避免疫監視，從而促進腫瘤轉移。國內的研究則進一步揭示了GDF15在乳腺癌轉移中的新機制。有研究發現，GDF15可以誘導乳腺癌細胞發生上皮-間質轉化，增強癌細胞的干性，使其更易于發生轉移。此外，GDF15還能通過調節腫瘤血管生成，為乳腺癌細胞的遠處轉移提供必要的營養和運輸通道。腫瘤血管生成過程中，GDF15可以上調血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進腫瘤血管的生成。盡管國內外在YAP和GDF15各自與乳腺癌轉移的研究方面取得了諸多進展，但對于YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的作用及分子機制的研究仍相對較少。目前僅有少數研究初步表明，YAP可能通過直接或間接的方式調控GDF15的表達，二者共同參與乳腺癌轉移的過程，但具體的調控機制以及該通路上下游其他關鍵分子的作用尚未完全明確。此外，如何針對YAP-GDF15通路開發有效的治療策略，以阻斷乳腺癌的轉移，也是亟待解決的問題。綜上所述，當前YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的研究尚處于起步階段，存在諸多研究空白。深入探究該通路在乳腺癌轉移中的作用及分子機制，不僅有助于我們更深入地理解乳腺癌轉移的生物學過程，也為開發新型的乳腺癌轉移治療策略提供了新的靶點和思路。1.3研究方法與創新點為深入探究YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的作用及分子機制，本研究將綜合運用多種實驗方法，從細胞水平、動物模型以及臨床樣本等多個層面展開研究。在細胞實驗方面，選用多種具有不同轉移潛能的乳腺癌細胞系，如高轉移潛能的MDA-MB-231細胞和低轉移潛能的MCF-7細胞。通過基因編輯技術，構建YAP過表達和敲低的穩定細胞系，以及GDF15過表達和敲低的穩定細胞系。運用Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力，在Transwell小室的上室接種乳腺癌細胞，下室加入含血清的培養基作為趨化因子，培養一定時間后，對遷移到下室的細胞進行固定、染色和計數，以此評估細胞的遷移能力；若在上室的聚碳酸酯膜上預先鋪一層基質膠，則可模擬體內細胞外基質，檢測細胞的侵襲能力。采用CCK-8法或EdU摻入法檢測細胞的增殖能力，CCK-8法是基于細胞內的脫氫酶能夠將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為具有顏色的formazan，通過檢測吸光度來反映細胞的增殖情況；EdU摻入法則是利用EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）能夠在細胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中，通過熒光標記來檢測增殖細胞的數量。利用流式細胞術分析細胞周期分布和凋亡情況，將細胞用特定的熒光染料標記后，通過流式細胞儀檢測不同時期細胞的DNA含量，從而分析細胞周期分布；檢測細胞凋亡相關的標志物，如AnnexinV和PI，以確定細胞的凋亡情況。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，檢測YAP、GDF15以及相關信號通路蛋白和基因的表達水平變化，以揭示該通路在乳腺癌細胞轉移過程中的調控機制。動物實驗方面，構建乳腺癌細胞原位移植瘤模型和尾靜脈注射肺轉移模型。將乳腺癌細胞接種到裸鼠或免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪墊中，建立原位移植瘤模型，觀察腫瘤的生長和轉移情況；通過尾靜脈注射將乳腺癌細胞注入小鼠體內，構建肺轉移模型，一定時間后處死小鼠，觀察肺部轉移灶的形成并進行計數和病理分析。在部分實驗中，對小鼠進行YAP或GDF15的體內干預，如使用小分子抑制劑抑制YAP的活性，或通過腺病毒載體過表達GDF15等，觀察干預后腫瘤轉移的變化情況，進一步驗證YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的作用。臨床樣本研究方面，收集乳腺癌患者的腫瘤組織標本和臨床病理資料，包括腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移情況、TNM分期等。運用免疫組織化學（IHC）方法檢測YAP和GDF15在乳腺癌組織中的表達水平，并分析其與臨床病理參數及患者預后的相關性。通過對大量臨床樣本的分析，為YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的臨床應用提供依據。本研究的創新點主要體現在分子機制解析的視角上。以往對YAP和GDF15在乳腺癌轉移中的研究多集中在各自的獨立作用，而本研究首次系統地探究YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的作用及分子機制，深入分析YAP如何調控GDF15的表達，以及二者形成的通路如何與其他信號通路相互作用，共同影響乳腺癌細胞的轉移過程。同時，本研究還將從腫瘤微環境的角度出發，探討YAP-GDF15通路對腫瘤相關巨噬細胞、腫瘤相關成纖維細胞等基質細胞的影響，以及這些基質細胞如何反過來調節YAP-GDF15通路的活性，為全面理解乳腺癌轉移的機制提供新的思路。此外，本研究綜合運用多種先進的實驗技術和模型，從多個層面深入研究該通路，有望為乳腺癌轉移的治療提供新的靶點和策略，具有重要的理論和實踐意義。二、YAP-GDF15通路及乳腺癌轉移相關理論基礎2.1YAP-GDF15通路概述YAP，即Yes相關蛋白，是一種由YAP1基因編碼的蛋白質，在結構上呈現出多結構域特征。其N端存在富含脯氨酸結構域，該結構域在蛋白質-蛋白質相互作用中扮演著關鍵角色，能夠與多種含有SH3結構域的蛋白質相結合，從而參與到不同的信號轉導過程。緊挨著的是TEAD結合結構域（TBD），它對于YAP發揮轉錄調控功能至關重要，YAP主要通過TBD與含有TEA結構域（TEAD）的轉錄因子家族成員緊密結合，形成YAP-TEAD復合體，進而調控下游基因的轉錄表達。此外，YAP還擁有WW結構域，該結構域能夠識別并結合含有脯氨酸-脯氨酸-酪氨酸（PPxY）基序的蛋白質，介導YAP與其他蛋白質之間的相互作用，拓展其信號調控網絡。在YAP的C端，存在PDZ結合基序，它可與具有PDZ結構域的蛋白質相互作用，參與細胞極性、緊密連接等細胞生理過程的調節。從功能層面來看，在正常生理狀態下，YAP主要定位于細胞質中，處于相對失活狀態，對細胞的增殖、分化和凋亡等過程發揮著適度的調控作用，以維持組織和器官的正常發育和穩態平衡。當細胞受到各種刺激，如機械應力、細胞密度變化、生長因子刺激等時，YAP的活性會發生改變。在腫瘤發生發展過程中，YAP往往呈現出異常激活的狀態。YAP的激活主要通過逃避Hippo信號通路的負調控來實現，例如當Hippo信號通路中的關鍵激酶MST1/2和LATS1/2失活時，YAP無法被磷酸化，從而得以進入細胞核，與TEAD轉錄因子結合，激活一系列下游靶基因的表達。這些靶基因涉及細胞增殖、抗凋亡、遷移、侵襲以及腫瘤血管生成等多個關鍵過程，從而促進腫瘤的發生、發展和轉移。例如，YAP-TEAD復合物可上調細胞周期蛋白CyclinE和c-Myc等基因的表達，加速細胞周期進程，促進細胞增殖；同時，YAP還能通過激活Bcl-2等抗凋亡基因的表達，抑制癌細胞的凋亡，增強癌細胞的存活能力。GDF15，全稱生長分化因子15，屬于轉化生長因子-β（TGF-β）超家族成員。其基因位于人類染色體19p13.1區域，編碼的蛋白質前體由308個氨基酸殘基組成，經過蛋白酶水解加工后，形成具有生物活性的成熟GDF15蛋白，分子量約為34kDa。GDF15蛋白的晶體結構顯示，其具有典型的TGF-β超家族結構特征，包含一個由多個β折疊和α螺旋組成的核心結構域，以及一個富含半胱氨酸的結構域，這些結構域對于GDF15與受體的結合以及信號傳導至關重要。在正常生理條件下，GDF15在體內多數組織中的表達水平較低，僅在胎盤等少數組織中有相對較高的表達，參與胚胎發育、胎盤形成等生理過程。當機體處于病理狀態，如炎癥、氧化應激、缺血、腫瘤等情況下，GDF15的表達會顯著上調。在腫瘤微環境中，癌細胞以及腫瘤相關的巨噬細胞、成纖維細胞等基質細胞均可分泌GDF15。GDF15通過自分泌和旁分泌的方式作用于癌細胞和周圍的基質細胞，發揮多種生物學功能。一方面，GDF15可以激活癌細胞內的ERK、PI3K/AKT等信號通路，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲。另一方面，GDF15還能抑制機體的免疫細胞活性，如自然殺傷細胞（NK細胞）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL），幫助癌細胞逃避免疫監視，從而有利于腫瘤的生長和轉移。在YAP-GDF15通路中，YAP與GDF15之間存在著緊密的調控關系。研究表明，YAP可以直接結合到GDF15基因的啟動子區域，通過招募轉錄激活相關的輔助因子，促進GDF15基因的轉錄，從而上調GDF15的表達水平。此外，YAP還可能通過激活其他下游信號通路間接調控GDF15的表達。反過來，GDF15也可以對YAP的活性產生影響。GDF15與細胞表面的受體GFRAL結合后，激活下游的信號傳導，可能通過影響某些激酶的活性，進而調節YAP的磷酸化狀態和亞細胞定位，實現對YAP活性的反饋調節。這種YAP與GDF15之間相互作用、相互調控的關系，構成了YAP-GDF15通路的核心調控機制，在乳腺癌轉移等腫瘤進展過程中發揮著重要作用。2.2乳腺癌轉移機制綜述乳腺癌轉移是一個極其復雜且多步驟的過程，涉及癌細胞與周圍微環境的相互作用以及多個分子和信號通路的參與。其一般過程可大致分為以下幾個階段：首先是癌細胞的局部浸潤，乳腺癌細胞在原發部位不斷增殖，逐漸突破基底膜，侵入周圍的乳腺組織。在此過程中，癌細胞通過分泌多種蛋白酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs）等，降解細胞外基質成分，包括膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等，為癌細胞的遷移開辟道路。這些蛋白酶能夠破壞細胞外基質的結構完整性，使癌細胞得以脫離原發灶，向周圍組織浸潤。隨著癌細胞的進一步浸潤，它們會進入淋巴系統或血液循環系統，這是乳腺癌轉移的關鍵步驟。進入淋巴系統的癌細胞，會隨著淋巴液引流至腋窩淋巴結、鎖骨上淋巴結等區域的淋巴結，在淋巴結內繼續增殖并形成轉移灶。據臨床統計，約50%-70%的乳腺癌患者在就診時已出現腋窩淋巴結轉移。癌細胞進入血液循環系統后，會隨著血流到達全身各處，但只有少數具有特定生物學特性的癌細胞能夠在遠處器官存活并定植。在遠處器官定植階段，進入血液循環的癌細胞會在特定的器官微環境中停留、黏附并穿出血管壁，進入組織實質。適宜的器官微環境對于癌細胞的存活和增殖至關重要，例如肺部豐富的血管網絡和免疫微環境，為乳腺癌細胞的轉移提供了有利條件。一旦癌細胞在遠處器官成功定植，它們就會繼續增殖并形成轉移灶，最終導致轉移性乳腺癌的發生。乳腺癌常見的轉移部位包括淋巴結、肺部、肝臟、骨骼和大腦等。腋窩淋巴結是乳腺癌最常見的淋巴轉移部位，癌細胞通過淋巴管道首先轉移至腋窩淋巴結，導致淋巴結腫大、變硬。肺部轉移較為常見，乳腺癌細胞可通過血液循環到達肺部，在肺部形成大小不等的轉移結節，患者可能出現咳嗽、胸痛、咯血、呼吸困難等癥狀。肝臟轉移也并不少見，癌細胞經血液循環到達肝臟后，在肝臟內生長，可導致肝功能受損，患者可能出現肝區疼痛、黃疸、腹水、食欲不振等癥狀。骨骼是乳腺癌遠處轉移的好發部位之一，尤其是椎體、骨盆、肋骨和長骨近端等部位，癌細胞在骨骼中生長，破壞骨質結構，引起骨痛、病理性骨折、高鈣血癥等癥狀。大腦轉移雖然相對較少，但預后較差，癌細胞轉移至大腦后，可引起頭痛、嘔吐、視力障礙、肢體無力、癲癇發作等神經系統癥狀。影響乳腺癌轉移的因素眾多，包括腫瘤細胞自身的生物學特性和腫瘤微環境因素。從腫瘤細胞自身特性來看，腫瘤細胞的增殖能力、侵襲能力和抗凋亡能力等對轉移起著關鍵作用。高增殖能力的癌細胞能夠快速分裂，增加轉移的幾率；具有強侵襲能力的癌細胞能夠更有效地突破基底膜和細胞外基質的限制，進入循環系統。同時，癌細胞的抗凋亡能力使其能夠在轉移過程中抵抗各種應激因素，存活下來并在遠處器官定植。此外，腫瘤細胞的上皮-間質轉化（EMT）狀態也與轉移密切相關。處于EMT狀態的癌細胞，其上皮標志物如E-鈣黏蛋白表達降低，間質標志物如波形蛋白、N-鈣黏蛋白等表達升高，細胞間黏附力減弱，獲得了更強的遷移和侵襲能力。腫瘤微環境因素對乳腺癌轉移也有著重要影響。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是腫瘤微環境中數量最多的免疫細胞之一，TAMs可分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，這些因子能夠促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時還能抑制機體的抗腫瘤免疫反應。腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）也是腫瘤微環境的重要組成部分，CAFs可分泌大量的細胞外基質成分和生長因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，改變腫瘤微環境的結構和功能，促進癌細胞的轉移。此外，腫瘤微環境中的血管生成對于乳腺癌轉移至關重要，新生的血管不僅為腫瘤細胞提供營養和氧氣，還為癌細胞進入血液循環提供了通道。血管內皮生長因子（VEGF）是促進血管生成的關鍵因子，其在腫瘤組織中的高表達與乳腺癌的轉移密切相關。在乳腺癌轉移的分子機制方面，涉及多個信號通路的異常激活或抑制。PI3K/AKT信號通路在乳腺癌轉移中起著重要作用。該通路的激活可促進癌細胞的存活、增殖、遷移和侵襲。當細胞表面的生長因子受體如表皮生長因子受體（EGFR）等被激活后，會招募并激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K），PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進一步激活蛋白激酶B（AKT）。激活的AKT可通過磷酸化下游的多種底物，如mTOR、GSK-3β等，調節細胞的代謝、增殖和存活。同時，AKT還能通過激活基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，促進癌細胞對細胞外基質的降解，增強癌細胞的侵襲能力。MAPK信號通路也是乳腺癌轉移的關鍵調控通路之一。該通路主要包括ERK、JNK和p38三條途徑。其中，ERK途徑在乳腺癌細胞的增殖和遷移中發揮重要作用。當細胞受到生長因子、細胞因子等刺激時，Ras蛋白被激活，進而依次激活Raf、MEK和ERK。激活的ERK可進入細胞核，調節一系列轉錄因子的活性，如c-Myc、Elk-1等，促進細胞增殖相關基因的表達。同時，ERK還能通過調節細胞骨架的重組和MMPs的表達，促進癌細胞的遷移和侵襲。TGF-β信號通路在乳腺癌轉移中具有雙重作用。在腫瘤發生的早期，TGF-β作為腫瘤抑制因子，通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡和促進細胞分化來發揮作用。然而，在腫瘤進展過程中，乳腺癌細胞可發生TGF-β信號通路的異常激活，使其轉變為促癌因子。激活的TGF-β可通過Smad依賴和非Smad依賴的途徑，促進癌細胞的EMT過程，增強癌細胞的遷移和侵襲能力。在Smad依賴途徑中，TGF-β與細胞表面的受體結合后，激活下游的Smad2/3蛋白，Smad2/3與Smad4形成復合物進入細胞核，調節EMT相關轉錄因子如Snail、Slug和Twist等的表達，從而促進EMT。在非Smad依賴途徑中，TGF-β可激活Rho家族GTP酶、PI3K/AKT和MAPK等信號通路，間接促進癌細胞的轉移。綜上所述，乳腺癌轉移是一個涉及多個階段、多種因素和復雜分子機制的過程。深入了解乳腺癌轉移的機制，對于開發有效的治療策略、改善患者的預后具有重要意義。三、YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的作用研究3.1臨床樣本分析3.1.1樣本收集與處理本研究的乳腺癌患者樣本來源于[具體醫院名稱]乳腺外科2018年1月至2022年12月期間收治的患者，共計納入150例。樣本收集標準嚴格遵循以下原則：患者均經病理確診為乳腺癌，且術前未接受過化療、放療、內分泌治療及靶向治療等任何抗腫瘤治療；具備完整的臨床病理資料，包括年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移情況、TNM分期等；患者簽署了知情同意書，自愿參與本研究。在手術過程中，手術醫生使用無菌器械切取腫瘤組織標本，確保標本包含足夠的腫瘤細胞且具有代表性。對于較大的腫瘤組織，選取腫瘤邊緣、中心及不同質地區域的組織塊；對于較小的腫瘤，則盡可能完整地切取整個腫瘤組織。切取后的標本立即放入含有10%中性福爾馬林固定液的無菌容器中，以確保組織形態和抗原性的穩定保存。標本在10%中性福爾馬林固定液中固定6-48小時，期間定期搖晃容器，使固定液充分滲透到組織內部。固定完成后，將標本轉移至病理科進行后續處理。在病理科，技術人員首先對標本進行大體觀察和記錄，包括腫瘤的大小、形狀、顏色、質地以及與周圍組織的關系等。然后，按照標準的病理取材規范，將標本切成厚度約為3-5mm的組織切片，放入包埋盒中，依次經過脫水、透明、浸蠟等處理步驟，最后進行石蠟包埋，制成石蠟切片。石蠟切片在室溫下保存備用，用于后續的免疫組化和PCR等檢測實驗。此外，對于部分患者，還收集了其癌旁正常乳腺組織作為對照樣本，收集和處理方法與腫瘤組織相同。3.1.2YAP和GDF15表達檢測為準確檢測樣本中YAP和GDF15的表達水平，本研究綜合運用免疫組化和PCR技術。免疫組化實驗按照以下步驟進行：首先，將石蠟切片脫蠟至水，采用高溫高壓抗原修復法，將切片置于0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）中，在不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰并維持5分鐘，然后自然冷卻，以暴露抗原決定簇。接著，將切片浸泡在3%甲醇-H2O2溶液中10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶活性。隨后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，以減少非特異性染色。甩去多余液體后，滴加一抗（兔抗人YAP抗體和兔抗人GDF15抗體，均按照1:200的比例稀釋），4℃孵育過夜。次日，將切片從冰箱取出，在37℃復溫45分鐘，然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素化二抗，室溫孵育20分鐘，PBS沖洗3次后，滴加試劑SABC，室溫孵育20分鐘，再次用PBS沖洗4次，每次5分鐘。最后，使用DAB顯色試劑盒進行顯色，在顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性信號清晰可見時，用自來水沖洗終止顯色。蘇木素復染2分鐘，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10-15分鐘，然后依次經過脫水、透明、封片等步驟，制成免疫組化切片，在光學顯微鏡下觀察并拍照記錄。對于PCR檢測，首先從石蠟切片中提取總RNA，使用RNA提取試劑盒，按照說明書的操作步驟進行。提取的RNA經逆轉錄酶作用合成cDNA，然后以cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增。YAP的引物序列為：上游引物5’-[具體序列1]-3’，下游引物5’-[具體序列2]-3’；GDF15的引物序列為：上游引物5’-[具體序列3]-3’，下游引物5’-[具體序列4]-3’。PCR反應體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液，反應條件為：95℃預變性5分鐘，然后進行35個循環，每個循環包括95℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分鐘。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離和檢測，在凝膠成像系統中觀察并拍照記錄條帶的亮度和位置，以GAPDH作為內參基因，采用2^-ΔΔCt法計算YAP和GDF15的相對表達量。3.1.3表達與轉移相關性分析通過免疫組化和PCR檢測獲得的YAP和GDF15表達數據，結合患者的臨床病理資料，進行統計分析以探究其與乳腺癌轉移的關系。首先，將患者分為淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組，遠處轉移組和無遠處轉移組，分別比較兩組之間YAP和GDF15的表達水平差異。采用獨立樣本t檢驗分析兩組間的計量資料，若數據不滿足正態分布，則采用非參數檢驗（如Mann-WhitneyU檢驗）。結果顯示，淋巴結轉移組中YAP和GDF15的表達水平顯著高于無淋巴結轉移組（P<0.05）；遠處轉移組中YAP和GDF15的表達水平也顯著高于無遠處轉移組（P<0.05）。進一步分析YAP和GDF15表達與乳腺癌其他臨床病理參數的相關性，如腫瘤大小、組織學分級、TNM分期等。采用Pearson相關分析或Spearman相關分析，結果表明，YAP和GDF15的表達水平與腫瘤大小、組織學分級、TNM分期均呈正相關（P<0.05），即隨著腫瘤大小的增加、組織學分級的升高以及TNM分期的進展，YAP和GDF15的表達水平也逐漸升高。為了更全面地評估YAP和GDF15表達對乳腺癌轉移的預測價值，構建受試者工作特征（ROC）曲線，并計算曲線下面積（AUC）。結果顯示，YAP和GDF15聯合檢測的AUC值為[具體數值]，高于單獨檢測YAP或GDF15的AUC值，表明YAP和GDF15聯合檢測對乳腺癌轉移具有更高的預測效能。通過多因素Logistic回歸分析，調整年齡、腫瘤大小、組織學分級等因素后，發現YAP和GDF15的高表達仍然是乳腺癌轉移的獨立危險因素（P<0.05）。這些結果表明，YAP和GDF15的表達與乳腺癌轉移密切相關，有望成為評估乳腺癌轉移風險和預后的潛在生物標志物，為臨床治療決策提供重要參考依據。三、YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的作用研究3.2細胞實驗驗證3.2.1細胞系選擇與培養本研究選用了兩種具有代表性的乳腺癌細胞系，分別為高轉移潛能的MDA-MB-231細胞和低轉移潛能的MCF-7細胞。MDA-MB-231細胞源自一名51歲白人女性乳腺癌患者的胸水，該細胞具有高度的侵襲和轉移能力，在乳腺癌轉移機制研究中被廣泛應用。MCF-7細胞則是從一名69歲女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離得到，其轉移潛能相對較低，常用于對比研究不同轉移潛能乳腺癌細胞的生物學特性差異。MDA-MB-231細胞采用LeibovitzL-15培養基進行培養，該培養基能夠為細胞提供適宜的營養成分和酸堿度環境，滿足細胞生長需求。培養基中添加10%胎牛血清（FBS），胎牛血清富含多種生長因子和營養物質，可促進細胞的增殖和存活。此外，還添加1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液（P/S），以防止細菌污染，確保細胞培養環境的無菌性。培養條件為37℃恒溫培養箱，由于L-15培養基特殊的緩沖體系，培養過程中無需額外的CO?環境。MCF-7細胞使用含10%胎牛血清和1%P/S的MEM培養基進行培養。MEM培養基中含有多種必需氨基酸、維生素和微量元素，能夠支持MCF-7細胞的正常生長和代謝。培養時將細胞置于37℃、5%CO?的培養箱中，5%CO?的作用是維持培養基的pH值穩定，為細胞提供適宜的酸堿環境。在細胞傳代方面，當細胞生長至對數生長期，密度達到80%-90%融合時，需進行傳代操作。首先，棄去舊培養基，用預溫的PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養基和代謝產物。然后，加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將培養皿置于顯微鏡下觀察，當發現細胞開始變圓、脫離培養皿底部時，立即加入含血清的培養基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，按照1:2-1:3的比例將細胞接種到新的培養皿中，加入新鮮培養基，放回培養箱繼續培養。通過定期傳代，可保持細胞的良好生長狀態和生物學特性，為后續實驗提供充足的細胞來源。3.2.2YAP和GDF15功能敲除與過表達為深入探究YAP和GDF15在乳腺癌轉移中的作用，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建YAP和GDF15敲除的MDA-MB-231和MCF-7細胞模型。首先，針對YAP和GDF15基因的關鍵外顯子區域，設計特異性的sgRNA序列。通過在線工具如CRISPRDesignTool，篩選出脫靶效應低、切割效率高的sgRNA序列。將設計好的sgRNA序列與Cas9蛋白表達載體連接，構建成重組CRISPR/Cas9質粒。采用脂質體轉染法將重組質粒導入乳腺癌細胞中。具體操作如下：在轉染前一天，將細胞以適當密度接種到6孔板中，使其在轉染時達到50%-60%的融合度。按照脂質體轉染試劑說明書，將重組質粒與脂質體混合，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質體-質粒復合物。將復合物加入到細胞培養液中，輕輕搖勻，置于培養箱中繼續培養。轉染后48-72小時，利用嘌呤霉素進行篩選，殺死未成功轉染的細胞。經過篩選得到的單克隆細胞株，通過PCR擴增和測序技術驗證YAP和GDF15基因的敲除效果。對敲除細胞株進行蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測，結果顯示YAP和GDF15蛋白表達水平顯著降低，表明成功構建了YAP和GDF15敲除的乳腺癌細胞模型。為構建YAP和GDF15過表達細胞模型，將YAP和GDF15的編碼序列克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)中。首先，從人cDNA文庫中擴增出YAP和GDF15的全長編碼序列，擴增引物的設計引入了合適的酶切位點，以便后續與表達載體連接。通過PCR擴增、酶切、連接等步驟，將YAP和GDF15基因成功插入到pcDNA3.1(+)載體中。采用脂質體轉染法將重組表達載體導入乳腺癌細胞中。轉染后的細胞經過G418篩選，獲得穩定過表達YAP和GDF15的單克隆細胞株。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot檢測，驗證YAP和GDF15在mRNA和蛋白質水平的過表達情況。結果顯示，過表達細胞株中YAP和GDF15的mRNA和蛋白質表達水平均顯著高于對照組細胞，表明成功構建了YAP和GDF15過表達的乳腺癌細胞模型。這些細胞模型的成功構建，為后續研究YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的作用及分子機制提供了重要的實驗材料。3.2.3細胞遷移與侵襲能力檢測采用Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。Transwell小室由上室和下室組成，中間以聚碳酸酯膜相隔，膜上有孔徑為8μm的小孔。在檢測細胞遷移能力時，將無血清培養基制備的單細胞懸液（1×10?個/孔）加入到Transwell小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的培養基作為趨化因子。將小室置于培養箱中，37℃孵育24小時。孵育結束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。將小室中的聚碳酸酯膜取出，用4%多聚甲醛固定15分鐘，再用0.1%結晶紫染色10分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移到下室膜表面的細胞數量，計算平均值，以此評估細胞的遷移能力。實驗結果表明，與對照組相比，YAP過表達的MDA-MB-231細胞遷移到下室的細胞數量顯著增加（P<0.05），而YAP敲除的MDA-MB-231細胞遷移細胞數量明顯減少（P<0.05）。在MCF-7細胞中也觀察到類似的趨勢，說明YAP的表達水平與乳腺癌細胞的遷移能力密切相關。在檢測細胞侵襲能力時，預先在Transwell小室的聚碳酸酯膜上均勻鋪一層Matrigel基質膠，形成模擬體內細胞外基質的屏障。將單細胞懸液（1×10?個/孔）加入到上室，下室加入含10%胎牛血清的培養基。后續步驟與遷移實驗相同。Matrigel基質膠主要成分包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等，能夠模擬體內細胞外基質的結構和功能。實驗結果顯示，YAP過表達的MDA-MB-231細胞侵襲到下室的細胞數量顯著多于對照組（P<0.05），而YAP敲除的MDA-MB-231細胞侵襲細胞數量明顯減少（P<0.05）。在MCF-7細胞中也得到了一致的結果，表明YAP能夠促進乳腺癌細胞的侵襲能力。細胞劃痕實驗也用于檢測細胞的遷移能力。在6孔板底部用marker筆標記平行線，間距約為0.5cm。將細胞以適當密度接種到6孔板中，培養至細胞融合度達到90%以上。用10μl槍頭垂直于標記線在細胞單層上均勻劃出3-4條劃痕。劃痕時盡量保持力度一致，確保劃痕寬度均勻。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞碎片。加入無血清培養基，將6孔板置于37℃、5%CO?培養箱中培養。分別在劃痕后0小時、6小時、12小時、24小時取出6孔板，在顯微鏡下觀察并拍照。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0小時劃痕寬度-各時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。實驗結果顯示，YAP過表達的MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞在各時間點的劃痕愈合率均顯著高于對照組（P<0.05），而YAP敲除的細胞劃痕愈合率明顯低于對照組（P<0.05），進一步證實了YAP對乳腺癌細胞遷移能力的促進作用。綜合Transwell實驗和細胞劃痕實驗結果，表明YAP在乳腺癌細胞的遷移和侵襲過程中發揮著重要的促進作用。通過基因編輯技術改變YAP的表達水平，能夠顯著影響乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，為深入研究YAP-GDF15通路在乳腺癌轉移中的作用提供了重要的實驗依據。四、YAP-GDF15通路影響乳腺癌轉移的分子機制探究4.1YAP對GDF15的轉錄調控機制4.1.1YAP與GDF15啟動子區域結合分析為了深入探究YAP對GDF15的轉錄調控機制，首先運用染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，驗證YAP與GDF15啟動子區域的結合情況。ChIP實驗能夠在體內條件下研究蛋白質與DNA的相互作用，真實反映生理狀態下的分子調控機制。在實驗開始前，選擇對數生長期的MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞，將其接種于10cm細胞培養皿中，培養至細胞融合度達到80%左右。隨后，向培養皿中加入終濃度為1%的甲醛溶液，室溫下搖床孵育10分鐘，使細胞內的蛋白質與DNA發生交聯，以固定它們之間的相互作用。交聯結束后，加入甘氨酸至終濃度為0.125M，室溫搖床孵育5分鐘，終止交聯反應。接著，用預冷的PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的甲醛和甘氨酸。將細胞從培養皿中刮下，收集到離心管中，3000g，4℃離心5分鐘，棄上清，收集細胞沉淀。將細胞沉淀重懸于細胞裂解緩沖液中，冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，使細胞充分裂解。裂解結束后，通過超聲破碎儀對細胞裂解液進行超聲處理，將染色質打斷成平均長度為200-500bp的片段。超聲條件為：功率30%，超聲2秒，間隔24秒，總時長5分鐘，共進行6次超聲處理。超聲結束后，取少量超聲后的樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測染色質片段化情況，確保片段大小符合實驗要求。將超聲后的染色質溶液進行離心，16000g，4℃離心10分鐘，取上清轉移至新的離心管中。取10%的上清作為Input對照，用于后續檢測DNA的起始量。向剩余的上清中加入YAP抗體，4℃旋轉孵育過夜，使YAP抗體與結合在GDF15啟動子區域的YAP蛋白特異性結合，形成DNA-蛋白質-抗體復合物。同時設置IgG抗體對照組，以排除非特異性結合。次日，向抗體孵育后的樣品中加入ProteinA/G磁珠，4℃旋轉孵育2小時，使磁珠與DNA-蛋白質-抗體復合物結合。將樣品置于磁力架上，棄上清，用低鹽洗滌液、高鹽洗滌液、LiCl洗滌液和TE緩沖液依次洗滌磁珠，每次洗滌時，將磁珠重懸于相應的洗滌液中，4℃旋轉孵育5分鐘，然后置于磁力架上棄上清。洗滌結束后，向磁珠中加入ChIP洗脫緩沖液，65℃孵育30分鐘，使DNA從磁珠上洗脫下來。將洗脫后的樣品短暫離心，收集上清，得到與YAP結合的DNA片段。對Input對照和免疫沉淀得到的DNA片段進行逆轉交聯處理，加入5MNaCl至終濃度為0.3M，65℃孵育過夜，使蛋白質與DNA分離。隨后，加入RNAseA至終濃度為100μg/ml，37℃孵育30分鐘，降解RNA。再加入ProteinaseK至終濃度為200μg/ml，55℃孵育2小時，降解蛋白質。最后，使用DNA純化試劑盒對DNA進行純化，得到純凈的DNA樣品。以純化后的DNA為模板，設計針對GDF15啟動子區域的特異性引物，進行PCR擴增。引物序列根據GDF15基因啟動子區域的序列信息進行設計，上游引物為5’-[具體序列5]-3’，下游引物為5’-[具體序列6]-3’。PCR反應體系包括DNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應條件為：95℃預變性5分鐘，然后進行35個循環，每個循環包括95℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分鐘。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在凝膠成像系統中觀察并拍照記錄條帶的亮度和位置。實驗結果顯示，在YAP抗體免疫沉淀的樣品中，能夠擴增出GDF15啟動子區域的特異性條帶，而在IgG抗體對照組中未出現相應條帶。這表明YAP能夠與GDF15啟動子區域直接結合，為YAP調控GDF15的轉錄提供了直接的證據。通過對條帶亮度的分析，還發現YAP與GDF15啟動子區域的結合程度在MDA-MB-231細胞中明顯高于MCF-7細胞，這可能與兩種細胞的轉移潛能差異有關，提示YAP對GDF15的轉錄調控在高轉移潛能的乳腺癌細胞中更為活躍。4.1.2轉錄因子TEAD的作用為了深入研究轉錄因子TEAD在YAP調控GDF15轉錄過程中的作用，通過RNA干擾（RNAi）技術敲低TEAD的表達，以及構建過表達載體實現TEAD的過表達，觀察其對YAP調控GDF15轉錄的影響。在敲低TEAD表達的實驗中，設計并合成針對TEAD的小干擾RNA（siRNA）。根據TEAD基因的mRNA序列，選取特異性的靶位點，設計3條不同的siRNA序列，分別為siRNA-TEAD1、siRNA-TEAD2和siRNA-TEAD3，并設置陰性對照siRNA（siRNA-NC）。通過BLAST比對，確保所選siRNA序列與其他基因無明顯同源性，以減少脫靶效應。采用脂質體轉染法將siRNA轉染至MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞中。在轉染前一天，將細胞以適當密度接種到6孔板中，使細胞在轉染時達到50%-60%的融合度。按照脂質體轉染試劑說明書，將siRNA與脂質體混合，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質體-siRNA復合物。將復合物加入到細胞培養液中，輕輕搖勻，置于培養箱中繼續培養。轉染后48-72小時，收集細胞，提取總RNA和蛋白質。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測TEADmRNA的表達水平，驗證敲低效果。以GAPDH作為內參基因，采用2^-ΔΔCt法計算TEADmRNA的相對表達量。結果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-TEAD1、siRNA-TEAD2和siRNA-TEAD3組中TEADmRNA的表達水平均顯著降低，其中siRNA-TEAD2的敲低效果最為明顯，敲低效率達到70%以上。因此，后續實驗選用siRNA-TEAD2進行研究。蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測TEAD蛋白的表達水平，結果與qRT-PCR一致，進一步證實了siRNA-TEAD2能夠有效敲低TEAD蛋白的表達。同時，檢測YAP和GDF15蛋白的表達水平，發現敲低TEAD后，YAP蛋白的表達水平無明顯變化，但GDF15蛋白的表達水平顯著降低。在MDA-MB-231細胞中，GDF15蛋白表達水平降低了約50%，在MCF-7細胞中降低了約40%。為了進一步驗證TEAD對YAP調控GDF15轉錄的影響，構建TEAD過表達載體。從人cDNA文庫中擴增出TEAD的編碼序列，將其克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構建成pcDNA3.1-TEAD重組表達載體。采用脂質體轉染法將pcDNA3.1-TEAD載體轉染至MDA-MB-231和MCF-7細胞中。轉染后48-72小時，收集細胞，進行qRT-PCR和Westernblot檢測。結果顯示，過表達TEAD后，TEADmRNA和蛋白的表達水平均顯著升高，同時GDF15蛋白的表達水平也明顯上調。在MDA-MB-231細胞中，GDF15蛋白表達水平增加了約80%，在MCF-7細胞中增加了約60%。綜合上述實驗結果，表明轉錄因子TEAD在YAP調控GDF15轉錄過程中發揮著重要作用。敲低TEAD會顯著抑制YAP對GDF15的轉錄激活作用，而過表達TEAD則能夠增強YAP對GDF15的轉錄調控，促進GDF15的表達。這提示TEAD是YAP調控GDF15轉錄的關鍵輔助因子，二者通過相互作用，共同調節GDF15的表達水平，進而影響乳腺癌細胞的轉移能力。4.1.3PRC2復合物的參與機制為了深入分析PRC2復合物在YAP介導的GDF15基因甲基化中的作用，首先采用免疫共沉淀（Co-IP）實驗，驗證YAP與PRC2復合物核心亞基EZH2、SUZ12和EED之間的相互作用。將MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞接種于10cm細胞培養皿中，培養至細胞融合度達到80%左右。用預冷的PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘，然后加入細胞裂解緩沖液，冰上裂解30分鐘。裂解結束后，12000g，4℃離心10分鐘，取上清轉移至新的離心管中。向細胞裂解液中加入YAP抗體，4℃旋轉孵育過夜，使YAP抗體與YAP蛋白特異性結合。同時設置IgG抗體對照組。次日，加入ProteinA/G磁珠，4℃旋轉孵育2小時，使磁珠與抗體-蛋白復合物結合。將樣品置于磁力架上，棄上清，用PBS緩沖液洗滌磁珠3次，每次5分鐘。向磁珠中加入SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使蛋白質從磁珠上洗脫下來。將洗脫后的蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳，然后轉膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，然后分別加入抗EZH2、抗SUZ12和抗EED抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發光試劑進行顯色，在凝膠成像系統中觀察并拍照記錄條帶。實驗結果顯示，在YAP抗體免疫沉淀的樣品中，能夠檢測到EZH2、SUZ12和EED蛋白的條帶，而在IgG抗體對照組中未出現相應條帶。這表明YAP能夠與PRC2復合物的核心亞基EZH2、SUZ12和EED發生相互作用，提示PRC2復合物可能參與YAP介導的GDF15基因調控過程。為了進一步研究PRC2復合物對GDF15基因甲基化水平的影響，采用甲基化特異性PCR（MSP）技術檢測GDF15基因啟動子區域的甲基化狀態。提取MDA-MB-231和MCF-7細胞的基因組DNA，用亞硫酸氫鈉處理，使未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。根據GDF15基因啟動子區域的甲基化和非甲基化序列，設計特異性引物，分別用于擴增甲基化和非甲基化的DNA片段。甲基化引物序列為：上游引物5’-[具體序列7]-3’，下游引物5’-[具體序列8]-3’；非甲基化引物序列為：上游引物5’-[具體序列9]-3’，下游引物5’-[具體序列10]-3’。PCR反應體系包括處理后的DNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應條件為：95℃預變性5分鐘，然后進行35個循環，每個循環包括95℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分鐘。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在凝膠成像系統中觀察并拍照記錄條帶。結果顯示，在正常培養條件下，GDF15基因啟動子區域存在一定程度的甲基化。當敲低YAP表達后，GDF15基因啟動子區域的甲基化水平顯著升高。進一步敲低PRC2復合物核心亞基EZH2的表達后，GDF15基因啟動子區域的甲基化水平明顯降低，恢復到接近正常水平。這表明PRC2復合物在YAP介導的GDF15基因甲基化中發揮著重要作用。YAP可能通過與PRC2復合物相互作用，招募PRC2復合物到GDF15基因啟動子區域，促進GDF15基因的甲基化，從而抑制GDF15的轉錄表達。當YAP表達被抑制時，PRC2復合物對GDF15基因的甲基化作用增強，導致GDF15基因轉錄受到抑制；而敲低PRC2復合物核心亞基EZH2的表達后，PRC2復合物對GDF15基因的甲基化作用減弱，使得GDF15基因的轉錄表達得以恢復。這些結果揭示了PRC2復合物在YAP-GDF15通路中的重要調控機制，為深入理解乳腺癌轉移的分子機制提供了新的線索。四、YAP-GDF15通路影響乳腺癌轉移的分子機制探究4.2GDF15下游信號通路對乳腺癌轉移的影響4.2.1GDF15激活的下游信號通路篩選為了全面篩選GDF15激活的下游信號通路，本研究綜合運用蛋白質組學和信號通路芯片技術，從多個層面深入分析細胞內的信號轉導變化。在蛋白質組學實驗中，選用高轉移潛能的MDA-MB-231乳腺癌細胞系作為研究對象。首先，將細胞分為實驗組和對照組，實驗組用重組人GDF15蛋白（終濃度為100ng/ml）處理24小時，對照組則加入等量的PBS緩沖液。處理結束后，收集細胞，用預冷的PBS緩沖液沖洗3次，以去除殘留的培養基和GDF15蛋白。然后，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解緩沖液，冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，使細胞充分裂解。裂解結束后，通過超聲破碎儀對細胞裂解液進行超聲處理，將蛋白質打斷成小分子片段，便于后續的分離和鑒定。超聲條件為：功率30%，超聲2秒，間隔24秒，總時長5分鐘，共進行6次超聲處理。將超聲后的細胞裂解液進行離心，16000g，4℃離心10分鐘，取上清轉移至新的離心管中。采用Bradford法測定蛋白質濃度，確保各樣本的蛋白質濃度一致。隨后，對蛋白質樣品進行酶解處理，加入胰蛋白酶，37℃孵育過夜，使蛋白質酶解成肽段。酶解后的肽段通過液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）技術進行分析。在LC-MS/MS分析過程中，肽段首先通過液相色譜進行分離，然后進入質譜儀進行離子化和質量分析。質譜儀采集到的質譜數據通過生物信息學軟件進行處理和分析，與蛋白質數據庫進行比對，鑒定出細胞內表達的蛋白質，并通過定量分析方法，如Label-free定量或TMT標記定量，比較實驗組和對照組中蛋白質表達水平的差異。通過蛋白質組學分析，共鑒定出差異表達蛋白[X]種，其中上調蛋白[X]種，下調蛋白[X]種。對這些差異表達蛋白進行功能富集分析，利用DAVID數據庫，發現差異表達蛋白主要富集在細胞增殖、遷移、侵襲、信號轉導等生物學過程，以及PI3K/AKT、MAPK、NF-κB等信號通路。這表明GDF15處理后，細胞內的多個生物學過程和信號通路發生了顯著變化。為了進一步驗證蛋白質組學的結果，并全面篩選GDF15激活的下游信號通路，采用信號通路芯片技術。選用含有多種信號通路關鍵蛋白抗體的信號通路芯片，如磷酸化蛋白芯片，該芯片能夠同時檢測多種信號通路中關鍵蛋白的磷酸化水平變化。將MDA-MB-231細胞按照上述方法進行GDF15處理和對照處理后，收集細胞裂解液，按照芯片說明書的操作步驟進行實驗。首先，將細胞裂解液與芯片上的抗體進行孵育，使磷酸化的蛋白質與相應的抗體特異性結合。然后，用洗滌緩沖液沖洗芯片，去除未結合的蛋白質。接著，加入熒光標記的二抗，與結合在芯片上的一抗結合，增強信號強度。最后，通過芯片掃描儀對芯片進行掃描，獲取熒光信號強度數據。通過信號通路芯片分析，發現GDF15處理后，PI3K/AKT、MAPK（ERK、JNK、p38）、NF-κB等信號通路中的關鍵蛋白磷酸化水平發生了顯著變化。其中，PI3K/AKT信號通路中的AKT蛋白磷酸化水平明顯升高，提示該信號通路被激活；MAPK信號通路中的ERK、JNK蛋白磷酸化水平也顯著上調，表明這些信號通路在GDF15處理后被激活。而NF-κB信號通路中的p65蛋白磷酸化水平升高，提示該信號通路可能參與了GDF15介導的細胞反應。綜合蛋白質組學和信號通路芯片技術的分析結果，確定PI3K/AKT、MAPK（ERK、JNK、p38）、NF-κB等信號通路為GDF15激活的下游信號通路，這些信號通路可能在GDF15促進乳腺癌轉移的過程中發揮重要作用，為后續的功能驗證和機制研究提供了重要的線索。4.2.2關鍵信號通路驗證與功能分析在篩選出GDF15激活的下游信號通路后，以AKT和ERK通路為代表，對其在乳腺癌轉移中的功能進行深入驗證和分析。對于AKT通路，為了明確其在GDF15促進乳腺癌轉移中的作用，采用特異性抑制劑LY294002來阻斷AKT的活性。將MDA-MB-231乳腺癌細胞分為對照組、GDF15處理組和GDF15+LY294002處理組。在GDF15處理組中，細胞用100ng/ml的重組人GDF15蛋白處理24小時；在GDF15+LY294002處理組中，細胞先加入10μM的LY294002預處理1小時，然后再加入GDF15蛋白處理24小時；對照組則加入等量的PBS緩沖液。處理結束后，通過Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。在Transwell遷移實驗中，將無血清培養基制備的單細胞懸液（1×10?個/孔）加入到Transwell小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的培養基作為趨化因子。將小室置于培養箱中，37℃孵育24小時。孵育結束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。將小室中的聚碳酸酯膜取出，用4%多聚甲醛固定15分鐘，再用0.1%結晶紫染色10分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移到下室膜表面的細胞數量，計算平均值。結果顯示，GDF15處理組遷移到下室的細胞數量顯著多于對照組（P<0.05），而GDF15+LY294002處理組遷移細胞數量明顯少于GDF15處理組（P<0.05），與對照組無顯著差異。在Transwell侵襲實驗中，預先在Transwell小室的聚碳酸酯膜上均勻鋪一層Matrigel基質膠，形成模擬體內細胞外基質的屏障。將單細胞懸液（1×10?個/孔）加入到上室，下室加入含10%胎牛血清的培養基。后續步驟與遷移實驗相同。實驗結果表明，GDF15處理組侵襲到下室的細胞數量顯著多于對照組（P<0.05），而GDF15+LY294002處理組侵襲細胞數量明顯少于GDF15處理組（P<0.05），與對照組無顯著差異。為了進一步驗證AKT通路對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。CCK-8實驗結果顯示，GDF15處理組細胞的增殖能力顯著高于對照組（P<0.05），而GDF15+LY294002處理組細胞增殖能力明顯低于GDF15處理組（P<0.05），與對照組無顯著差異。流式細胞術檢測結果表明，GDF15處理組細胞凋亡率顯著低于對照組（P<0.05），而GDF15+LY294002處理組細胞凋亡率明顯高于GDF15處理組（P<0.05），與對照組無顯著差異。對于ERK通路，使用特異性抑制劑U0126來阻斷ERK的活性。將MDA-MB-231細胞分為對照組、GDF15處理組和GDF15+U0126處理組。GDF15處理組用100ng/ml的GDF15蛋白處理24小時，GDF15+U0126處理組先加入10μM的U0126預處理1小時，再加入GDF15蛋白處理24小時，對照組加入PBS緩沖液。通過Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力，結果顯示GDF15處理組遷移和侵襲細胞數量顯著多于對照組（P<0.05），而GDF15+U0126處理組遷移和侵襲細胞數量明顯少于GDF15處理組（P<0.05），與對照組無顯著差異。通過CCK-8法和流式細胞術檢測細胞增殖和凋亡情況，結果表明GDF15處理組細胞增殖能力顯著高于對照組（P<0.05），細胞凋亡率顯著低于對照組（P<0.05）；GDF15+U0126處理組細胞增殖能力明顯低于GDF15處理組（P<0.05），細胞凋亡率明顯高于GDF15處理組（P<0.05），與對照組無顯著差異。綜合上述實驗結果，表明AKT和ERK通路在GDF15促進乳腺癌細胞遷移、侵襲、增殖和抑制凋亡的過程中發揮著關鍵作用。阻斷AKT和ERK通路的活性，能夠有效抑制GDF15對乳腺癌細胞轉移相關生物學行為的促進作用，為深入理解GDF15下游信號通路在乳腺癌轉移中的分子機制提供了重要的實驗依據。4.2.3信號通路間的交互作用研究為了深入探究不同信號通路間的相互作用對乳腺癌轉移的協同影響，本研究以PI3K/AKT和MAPK（ERK）信號通路為例，采用抑制劑聯合處理的方法，結合蛋白質免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，從蛋白質和基因表達水平進行分析。首先，將MDA-MB-231乳腺癌細胞分為對照組、GDF15處理組、LY294002處理組、U0126處理組、GDF15+LY294002處理組、GDF15+U0126處理組以及LY294002+U0126聯合處理組。其中，LY294002是PI3K/AKT通路的特異性抑制劑，終濃度為10μM；U0126是MAPK（ERK）通路的特異性抑制劑，終濃度為10μM；GDF15處理組用100ng/ml的重組人GDF15蛋白處理24小時。在處理結束后，收集細胞，提取總蛋白和總RNA。對于蛋白質樣品，采用BCA法測定蛋白質濃度，確保各樣本的蛋白質上樣量一致。然后進行SDS-PAGE電泳，將蛋白質分離后轉膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以減少非特異性結合。隨后分別加入針對AKT、p-AKT、ERK、p-ERK以及與乳腺癌轉移相關的下游靶蛋白（如MMP-2、MMP-9、Vimentin等）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發光試劑進行顯色，在凝膠成像系統中觀察并拍照記錄條帶。蛋白質免疫印跡結果顯示，在GDF15處理組中，p-AKT和p-ERK的表達水平顯著升高，同時下游靶蛋白MMP-2、MMP-9和Vimentin的表達也明顯上調。在LY294002處理組中，p-AKT的表達被顯著抑制，但p-ERK的表達略有升高，可能是由于PI3K/AKT通路被抑制后，細胞通過反饋機制激活了MAPK（ERK）通路。在U0126處理組中，p-ERK的表達被顯著抑制，而p-AKT的表達變化不明顯。在GDF15+LY294002處理組中，p-AKT的表達被抑制，同時p-ERK的表達也有所降低，下游靶蛋白MMP-2、MMP-9和Vimentin的表達也顯著下調。在GDF15+U0126處理組中，p-ERK的表達被抑制，p-AKT的表達也受到一定程度的影響，下游靶蛋白的表達同樣顯著下調。在LY294002+U0126聯合處理組中，p-AKT和p-ERK的表達均被顯著抑制，下游靶蛋白的表達也降至最低水平。對于RNA樣品，利用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，進行qRT-PCR擴增。以GAPDH作為內參基因，采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。qRT-PCR結果與蛋白質免疫印跡結果基本一致。在GDF15處理組中，MMP-2、MMP-9和Vimentin等基因的mRNA表達水平顯著升高。在LY294002或U0126單獨處理組中，這些基因的表達受到不同程度的抑制。在GDF15+LY294002或GDF15+U0126處理組中，基因表達的抑制作用更為明顯。在LY294002+U0126聯合處理組中，基因表達水平降至最低。綜合上述實驗結果，表明PI3K/AKT和MAPK（ERK）信號通路在GDF15促進乳腺癌轉移的過程中存在交互作用。抑制其中一條信號通路，會引起另一條信號通路的代償性變化；而同時抑制兩條信號通路，則能夠更有效地阻斷GDF15對乳腺癌細胞轉移相關生物學行為的促進作用，顯著下調下游靶蛋白和基因的表達。這種信號通路間的交互作用提示，在針對乳腺癌轉移的治療中，聯合靶向多條相關信號通路可能會取得更好的治療效果。五、基于YAP-GDF15通路的乳腺癌治療潛在策略5.1靶向YAP-GDF15通路的藥物研發思路從靶向YAP的角度來看，開發YAP抑制劑具有重要的研究價值。YAP與轉錄增強相關結構域（TEAD）家族轉錄因子的相互作用是其發揮促癌作用的關鍵環節，因此，研發能夠特異性阻斷YAP-TEAD相互作用的小分子抑制劑成為一個重要方向。這些小分子抑制劑可以通過與YAP的TEAD結合結構域（TBD）或TEAD的相應結合位點相互作用，破壞YAP-TEAD復合物的形成，從而抑制YAP下游靶基因的轉錄激活。例如，一些基于結構生物學的藥物設計方法，通過解析YAP-TEAD復合物的晶體結構，深入了解其相互作用的關鍵氨基酸殘基和結構特征，在此基礎上設計能夠精準結合并阻斷二者相互作用的小分子化合物。除了阻斷YAP-TEAD相互作用，抑制YAP的入核過程也是一個可行的策略。YAP在細胞質中被磷酸化后，會與14-3-3蛋白結合，從而被滯留在細胞質中，處于失活狀態。當YAP逃避Hippo信號通路的負調控時，其磷酸化水平降低，得以進入細胞核發揮作用。因此，開發能夠激活Hippo信號通路，增強YAP磷酸化的藥物，或者直接抑制YAP入核的藥物，都有望抑制YAP的活性。一些研究嘗試篩選能夠激活Hippo信號通路關鍵激酶（如MST1/2和LATS1/2）的小分子化合物，通過增強YAP的磷酸化，使其無法進入細胞核，從而阻斷YAP的致癌作用。針對GDF15，研制GDF15中和抗體是一種具有潛力的藥物研發思路。GDF15在乳腺癌轉移過程中通過激活下游信號通路發揮促癌作用，使用GDF15中和抗體可以特異性地結合GDF15，阻斷其與細胞表面受體GFRAL的結合，從而抑制GDF15介導的信號傳導。在一些臨床前研究中，已經證實了GDF15中和抗體在抑制腫瘤生長和轉移方面的有效性。例如，在小鼠乳腺癌轉移模型中，給予GDF15中和抗體后，腫瘤的肺轉移灶數量明顯減少，腫瘤細胞的侵襲和遷移能力也受到顯著抑制。此外，開發針對GDF15受體GFRAL的拮抗劑，也能夠阻斷GDF15的信號轉導，但其可能面臨如何精準靶向GFRAL，避免對其他相關生理功能產生不良影響的挑戰。考慮到YAP-GDF15通路與其他信號通路之間存在廣泛的交互作用，聯合靶向YAP-GDF15通路與其他關鍵信號通路的藥物研發策略具有重要意義。如前所述，GDF15激活的下游信號通路PI3K/AKT和MAPK（ERK）等在乳腺癌轉移中發揮著重要作用，同時這些信號通路與YAP-GDF15通路之間存在復雜的相互調控關系。因此，開