V-ATPaseV1G1亞基：肝癌研究中表達與功能的新洞察一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝癌的嚴峻現狀肝癌作為全球范圍內常見且危害嚴重的惡性腫瘤，其發病率和死亡率一直居高不下，給人類健康帶來了沉重的負擔，成為了亟待解決的重大公共衛生問題。根據世界衛生組織（WHO）發布的數據，2020年全球肝癌新發病例數約為90.5萬例，死亡病例數約為83萬例，肝癌在癌癥相關死亡原因中位列第四。在中國，肝癌的形勢更為嚴峻，是第三大常見癌癥以及第二大癌癥死亡原因，2020年新發病例數約達41.1萬例，死亡病例數約為39.1萬例。肝癌不僅發病率高，還具有早診困難、進展迅速和預后較差等特點。多數患者在確診時已處于中晚期，錯過了最佳的手術治療時機。即使接受了手術、化療、放療等綜合治療，肝癌的復發率仍然較高，5年生存率僅約12.1%。這不僅使患者承受著巨大的身體痛苦和心理壓力，也給患者家庭帶來了沉重的經濟負擔，同時對社會醫療資源造成了極大的消耗。因此，深入探究肝癌的發病機制，尋找有效的治療靶點和治療方法，對于提高肝癌患者的生存率和生活質量，減輕社會醫療負擔具有極其重要的現實意義。1.1.2V-ATPase的關鍵地位V-ATPase（Vacuolar-typeH+-ATPase），即空泡型質子泵，是一種在真核細胞中廣泛分布的重要蛋白酶。它由14個亞基組成，包括負責氫離子轉運的膜部分（V0）和負責催化ATP分解的胞質部分（V1），只有當V0和V1亞單位相結合時，才能發揮其質子泵的作用。V-ATPase通過分解ATP獲得能量，主動轉運H+，在細胞的生命活動中承擔著眾多關鍵功能。它能夠維持細胞內外pH值的平衡，這對于細胞內各種酶的活性以及細胞的正常代謝至關重要；參與受體介導的內吞作用，幫助細胞攝取營養物質和清除廢物；在細胞內靶向溶酶體酶、蛋白加工和脫粒及小分子的雙向轉運等過程中也發揮著不可或缺的作用。近年來，越來越多的研究表明，V-ATPase在腫瘤微環境中扮演著重要的調節角色。腫瘤細胞的代謝活動異常旺盛，會產生大量的酸性代謝產物，導致腫瘤微環境呈酸性。V-ATPase能夠將癌細胞內多余的H+泵出胞外或管泡中，以維持胞質和細胞器pH值的穩定，這種對腫瘤微環境pH值的調節作用為腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲和轉移創造了有利條件。抑制V-ATPase的活性可以破壞腫瘤細胞的酸性微環境，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉移，甚至誘導腫瘤細胞凋亡。這使得V-ATPase成為了腫瘤治療領域的一個潛在重要靶點。V1G1亞基作為V-ATPase的組成部分，其在肝癌中的表達情況以及對肝癌細胞生物學功能的影響尚未完全明確。深入研究V1G1亞基在肝癌中的作用機制，不僅有助于我們更深入地理解肝癌的發病機制，還可能為肝癌的診斷和治療提供新的靶點和策略，具有重要的理論和實踐意義。1.2研究目的與主要問題本研究旨在深入探究V-ATPaseV1G1亞基在肝癌中的表達情況及其對肝癌細胞生物學功能的影響，為揭示肝癌的發病機制以及開發新的治療策略提供理論依據。具體研究目的和主要問題如下：探究V1G1亞基在肝癌組織和細胞中的表達水平：通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和免疫組化等實驗技術，檢測V1G1亞基在肝癌組織及配對的癌旁組織中的mRNA和蛋白表達水平，對比分析其在肝癌組織與正常組織中的表達差異，明確V1G1亞基在肝癌組織中的表達特征。同時，檢測V1G1亞基在不同肝癌細胞株（如SMMC-7721、HCC-LM3等）以及正常肝細胞株（如L02）中的表達水平，探究其在肝癌細胞中的表達規律，為后續研究奠定基礎。分析V1G1亞基表達與肝癌臨床病理特征的關系：收集肝癌患者的臨床病理資料，包括腫瘤大小、分化程度、TNM分期、有無淋巴結轉移等，結合V1G1亞基的表達檢測結果，運用統計學方法分析V1G1亞基表達與這些臨床病理特征之間的相關性，從而判斷V1G1亞基的表達是否可作為評估肝癌患者病情進展和預后的潛在生物學指標。例如，若V1G1亞基高表達與腫瘤較大、分化程度低、TNM分期晚以及存在淋巴結轉移等不良病理特征相關，那么它可能在肝癌的發展和轉移過程中發揮重要作用。研究V1G1亞基過表達對肝癌細胞生物學功能的影響：構建V1G1亞基過表達的肝癌細胞穩轉株，利用細胞單克隆形成實驗、CCK8實驗、Transwell實驗和流式細胞周期實驗等，分別檢測過表達V1G1亞基對肝癌細胞的克隆形成能力、增殖能力、遷移和侵襲能力以及細胞周期分布的影響。通過這些實驗，明確V1G1亞基過表達是否能夠促進肝癌細胞的生長、增殖和轉移，以及對細胞周期的調控作用，進一步揭示其在肝癌發生發展過程中的功能機制。例如，若過表達V1G1亞基后，肝癌細胞的克隆形成數量增加、增殖速度加快、遷移和侵襲能力增強，且細胞周期分布發生改變，如S期縮短、G2/M期阻滯等，那么可以證明V1G1亞基在肝癌細胞的惡性生物學行為中起到促進作用。二、V-ATPase及V1G1亞基概述2.1V-ATPase的結構與功能2.1.1復雜的結構組成V-ATPase是一種在真核細胞中廣泛分布的大型膜蛋白復合物，其結構復雜，由14個不同的亞基組成，這些亞基共同協作，確保V-ATPase能夠正常發揮其質子泵的功能。從整體結構上看，V-ATPase呈現啞鈴狀，主要由兩個關鍵部分構成，即位于細胞質內的V1亞單位和包埋在溶酶體膜內的V0亞單位。只有當這兩個亞單位緊密結合在一起時，V-ATPase才能展現出完整的活性，實現其在細胞內的重要生理功能。V1亞單位是一個相對較大的復合物，主要負責結合并水解ATP，為整個V-ATPase轉運質子的過程提供必要的能量。它由8種不同的亞基組成，分別為A、B、C、D、E、F、G和H，這些亞基的數量和排列方式高度保守，共同構成了一個穩定的結構。其中，A和B亞基是V1亞單位的核心組成部分，它們相互交替排列，形成一個類似于六聚體的結構，猶如一個精巧的“能量工廠”，催化ATP的水解反應，將ATP中的化學能轉化為機械能，為質子轉運提供動力。C亞基則在V1亞單位中起到了連接和穩定的作用，它與A、B亞基緊密相連，確保整個復合物的結構穩定性，使得能量轉換過程能夠高效、有序地進行。D、E、F亞基也各自發揮著獨特的功能，它們參與調節ATP水解的速率和效率，協同A、B亞基完成能量供應任務。ATP6V1G1基因編碼的G亞基在V1部分中扮演著關鍵的角色，它不僅為復合體提供了關鍵的結構支持，還參與了調節V-ATPase的活性，確保復合體能夠穩定、高效地工作。H亞基則在V1亞單位與V0亞單位的相互作用中發揮重要作用，它就像一座“橋梁”，促進了兩者之間的緊密結合，使得能量能夠順利地從V1亞單位傳遞到V0亞單位，進而驅動質子的跨膜轉運。V0亞單位則是負責將質子從細胞質內轉運到溶酶體內的關鍵結構，它由至少6種不同的亞基組成，包括a、c、c'、c''、d和e。其中，亞基c和c'、c''形成了一個獨特的空心圓柱體結構，被稱為c-Ring。這個c-Ring結構是質子轉運的關鍵通道，它就像一個精密的“質子泵”，在V1亞單位提供的能量驅動下，能夠高效地將質子逆濃度梯度從細胞質轉運到溶酶體腔內。在c-Ring的內部，有兩個輔助亞基ATP6AP1和ATP6AP2，它們與c-Ring緊密結合，協助維持c-Ring的結構穩定性，同時也參與了質子轉運的調控過程。在c-Ring的側面，蛋白亞基a、e和RNAseK組成了一個三元復合物，緊緊貼附在c-Ring上。這個三元復合物在質子轉運過程中起到了至關重要的作用，它與c-Ring協同工作，確保質子能夠準確、高效地通過c-Ring通道，完成跨膜轉運。蛋白亞基a和c-Ring是實現質子傳遞的核心成分，它們的結構和功能的完整性直接影響著V-ATPase的質子轉運效率。V1亞單位和V0亞單位之間通過多種相互作用緊密結合在一起，形成一個完整的V-ATPase復合體。這種結合不僅依賴于亞基之間的直接相互作用，還受到多種調節因子和細胞內環境因素的影響。在細胞內，V-ATPase的組裝和拆卸是一個動態的過程，受到嚴格的調控，以適應細胞不同生理狀態下的需求。當細胞需要進行活躍的物質代謝和轉運時，V1和V0亞單位會迅速結合，形成具有完整活性的V-ATPase，高效地轉運質子，維持細胞內環境的穩定。而在某些特殊情況下，如細胞處于應激狀態或受到外界刺激時，V-ATPase可能會發生解聚，V1和V0亞單位分離，以調節細胞的生理反應。這種動態的組裝和拆卸機制使得V-ATPase能夠根據細胞的需求，靈活地調節其活性和功能，確保細胞的正常生命活動。2.1.2多樣的生理功能V-ATPase在細胞的生命活動中承擔著眾多不可或缺的生理功能，這些功能對于維持細胞的正常結構和代謝活動，以及細胞間的信號傳遞和物質交換都具有至關重要的意義。維持細胞內外pH值平衡是V-ATPase最為重要的功能之一。細胞內的各種生理過程，如酶促反應、物質轉運、信號傳導等，都需要在特定的pH環境下才能正常進行。V-ATPase通過將質子從細胞質轉運到溶酶體、內體等細胞器內，以及將質子排出細胞外，有效地調節了細胞內和細胞外的pH值。在溶酶體中，V-ATPase的作用使得溶酶體腔內保持酸性環境（pH約為4.5-5.5），這種酸性環境對于溶酶體內各種水解酶的活性至關重要。溶酶體中的水解酶能夠在酸性條件下高效地降解各種生物大分子，如蛋白質、核酸、多糖和脂質等，從而實現細胞內物質的消化和再利用。如果V-ATPase功能異常，導致溶酶體pH值升高，水解酶的活性將受到抑制，細胞內的物質代謝和廢物清除過程將受到嚴重影響，可能引發多種疾病，如溶酶體貯積癥等。在細胞外，V-ATPase也參與了維持細胞外液的酸堿平衡。例如，在腎臟中，腎小管上皮細胞中的V-ATPase能夠將質子分泌到尿液中，調節尿液的pH值，從而維持體內酸堿平衡的穩定。V-ATPase在參與內吞作用中也發揮著關鍵作用。內吞作用是細胞攝取外界物質的重要方式，包括受體介導的內吞、吞噬作用和胞飲作用等。在受體介導的內吞過程中，細胞表面的受體與配體結合后，形成內吞小泡進入細胞內。V-ATPase存在于內吞小泡的膜上，它通過將質子轉運到內吞小泡內，使其內部環境逐漸酸化。這種酸化過程對于內吞小泡內的物質分選、受體與配體的解離以及內吞小泡與溶酶體的融合都起著重要的調節作用。當內吞小泡內的pH值降低到一定程度時，受體與配體發生解離，配體被進一步轉運到溶酶體中進行降解，而受體則可以被回收至細胞表面，重新參與下一輪的內吞過程。在內吞小泡與溶酶體融合的過程中，V-ATPase維持的酸性環境也有助于促進兩者的融合，使得內吞的物質能夠被溶酶體中的水解酶有效地降解。如果V-ATPase功能受損，內吞作用將受到阻礙，細胞攝取營養物質、清除病原體和代謝廢物的能力將下降，影響細胞的正常生理功能。細胞內物質轉運也是V-ATPase的重要功能之一。除了在內吞作用中發揮作用外，V-ATPase還參與了細胞內多種物質的轉運過程。在高爾基體中，V-ATPase調節著高爾基體腔內的pH值，這對于蛋白質的糖基化修飾、加工和分選具有重要影響。不同的糖基化修飾需要在特定的pH條件下進行，V-ATPase通過維持高爾基體腔內合適的pH值，確保了蛋白質糖基化修飾的準確性和高效性。正確糖基化修飾的蛋白質才能被準確地分選到不同的細胞器或分泌到細胞外，執行其特定的生物學功能。在神經細胞中，V-ATPase參與了神經遞質的轉運和儲存。神經末梢中的突觸小泡含有V-ATPase，它通過將質子泵入突觸小泡內，建立起質子電化學梯度。這個梯度為神經遞質的攝取提供了驅動力，使得神經遞質能夠逆濃度梯度進入突觸小泡內進行儲存。當神經沖動傳來時，突觸小泡與突觸前膜融合，釋放神經遞質，從而實現神經信號的傳遞。如果V-ATPase功能異常，神經遞質的轉運和儲存將受到影響，導致神經信號傳遞障礙，可能引發神經系統疾病。2.2V1G1亞基的特性與作用2.2.1獨特的分子特性V1G1亞基，由ATP6V1G1基因編碼，在V-ATPase的V1亞單位中占據著關鍵的位置，對整個V-ATPase復合體的結構穩定性和功能發揮起著不可或缺的作用。從基因層面來看，ATP6V1G1基因位于人類9號染色體長臂32區（9q32）。其編碼的V1G1蛋白屬于V1部分的G亞基，相對分子質量約為13kDa。通過對V1G1亞基的氨基酸序列分析發現，它具有一些獨特的結構特征。例如，在其氨基酸序列中，存在多個保守的結構域，這些結構域對于V1G1亞基與其他亞基的相互作用以及V1G1亞基本身的功能發揮至關重要。其中，一些特定的氨基酸殘基形成了與ATP結合和水解相關的活性位點，雖然V1G1亞基本身并不直接參與ATP的水解過程，但這些活性位點的存在可能通過影響與之相互作用的其他亞基，間接參與ATP水解的調節。同時，V1G1亞基還含有多個磷酸化位點，這些位點在細胞信號傳導過程中可能被蛋白激酶磷酸化，從而調節V1G1亞基的活性和功能。研究表明，磷酸化修飾可以改變V1G1亞基的構象，進而影響它與其他亞基的結合能力以及V-ATPase復合體的整體活性。在空間結構上，V1G1亞基通過與其他亞基之間的相互作用，共同構成了V1亞單位的穩定結構。它與A、B、C等亞基緊密相連，形成了一個有序的三維結構。V1G1亞基的特定空間構象使其能夠與其他亞基精確匹配，形成穩定的相互作用界面。在V1亞單位中，V1G1亞基的位置靠近ATP水解活性中心，這使得它能夠及時響應ATP水解產生的能量變化，并將這種變化傳遞給其他亞基，從而協調V1亞單位的整體功能。此外，V1G1亞基還參與了V1亞單位與V0亞單位之間的相互作用。它在V1和V0亞單位的連接部位發揮著橋梁作用，促進了兩者之間的緊密結合。這種連接作用不僅確保了質子轉運過程中能量的有效傳遞，還維持了V-ATPase復合體的整體穩定性。如果V1G1亞基的結構發生改變，可能會破壞V1和V0亞單位之間的正常相互作用，導致V-ATPase復合體的組裝異常或功能失調。2.2.2在正常細胞中的功能在正常細胞中，V1G1亞基作為V-ATPase的重要組成部分，參與了眾多關鍵的生理過程，對于維持細胞的正常代謝和功能平衡起著至關重要的作用。質子轉運是V1G1亞基參與的最為核心的生理過程之一。V-ATPase的主要功能是利用ATP水解產生的能量，將質子從細胞質轉運到溶酶體、內體等細胞器內，以及將質子排出細胞外，從而維持細胞內和細胞外的pH值穩定。V1G1亞基在這個過程中雖然不直接參與質子的跨膜轉運，但它通過與其他亞基的協同作用，為質子轉運提供了必要的結構支持和能量傳遞。在V1亞單位中，A和B亞基催化ATP水解產生能量，而V1G1亞基與這些亞基緊密結合，確保ATP水解產生的能量能夠有效地傳遞到V0亞單位，驅動質子通過V0亞單位中的質子通道進行跨膜轉運。如果V1G1亞基的功能受損，可能會導致ATP水解產生的能量無法正常傳遞，從而影響質子轉運的效率，使細胞內和細胞外的pH值失衡。這將對細胞內的各種酶促反應、物質轉運和信號傳導等生理過程產生負面影響，嚴重時甚至會導致細胞死亡。維持細胞器pH值穩定是V1G1亞基的另一個重要功能。溶酶體、內體等細胞器的酸性環境對于其正常功能的發揮至關重要。以溶酶體為例，溶酶體內含有多種酸性水解酶，這些水解酶需要在酸性環境（pH約為4.5-5.5）下才能保持活性，從而有效地降解各種生物大分子，如蛋白質、核酸、多糖和脂質等。V1G1亞基參與的V-ATPase質子轉運過程，使得溶酶體腔內能夠維持穩定的酸性環境。在這個過程中，V1G1亞基不僅通過穩定V-ATPase復合體的結構，保證質子轉運的持續進行，還可能參與了對質子轉運速率的調節，以適應溶酶體不同生理狀態下對酸性環境的需求。當細胞內的代謝活動發生變化時，溶酶體對酸性環境的需求也可能會相應改變。此時，V1G1亞基可以通過與其他亞基的相互作用以及自身的構象變化，調節V-ATPase的活性，從而調整質子轉運的速率，維持溶酶體pH值的穩定。除了溶酶體，內體等其他細胞器的pH值穩定也依賴于V1G1亞基參與的V-ATPase質子轉運過程。內體在細胞內吞作用中起著重要的作用，其內部的酸性環境對于內吞小泡內的物質分選、受體與配體的解離以及內吞小泡與溶酶體的融合都至關重要。V1G1亞基通過維持內體的酸性環境，確保了內吞作用的正常進行，使細胞能夠有效地攝取外界物質、清除病原體和代謝廢物。三、V1G1亞基在肝癌中的表達研究3.1研究設計與方法3.1.1樣本的精心選擇本研究為深入探究V1G1亞基在肝癌中的表達情況，精心選取了一系列具有代表性的樣本。在組織樣本方面，選取了[X]例人肝癌組織標本及配對癌旁組織標本。這些標本均來源于[具體醫院名稱]在[具體時間段]內收治的肝癌患者，患者在術前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，以確保樣本的原始性和研究結果的準確性。標本在手術切除后迅速置于液氮中冷凍保存，隨后轉移至-80℃冰箱長期保存，以最大程度地保持組織的生物學特性和分子完整性。在細胞株選擇上，采用了SMMC-7721、HCC-LM3肝癌細胞株和L02正常肝細胞株。SMMC-7721人肝癌細胞株于1977年建立，材料取自一名50歲男性原發性肝細胞癌患者的手術切除標本進行體外培養而得，其生長較迅速穩定，細胞形態為上皮樣，貼壁生長。HCC-LM3肝癌細胞株是從MHCC97-H裸鼠接種后成功得到的具有更高轉移潛能的細胞系，在肝癌轉移相關研究中具有重要價值。L02正常肝細胞株則作為正常對照，用于對比肝癌細胞中V1G1亞基的表達差異。這些細胞株均購自[細胞庫名稱]，在實驗室中按照標準的細胞培養方法進行培養，SMMC-7721和HCC-LM3細胞株培養于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，L02細胞株培養于含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，培養條件為37℃、5%CO?的恒溫培養箱。通過對這些不同來源和特性的樣本進行研究，能夠全面、系統地分析V1G1亞基在肝癌中的表達情況，為后續研究提供堅實的數據基礎。3.1.2實驗方法的嚴謹運用為準確檢測V1G1亞基在肝癌組織和細胞中的mRNA和蛋白表達水平，本研究運用了多種嚴謹的實驗技術，其中qRT-PCR和免疫組化技術發揮了關鍵作用。qRT-PCR技術即實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應，是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測定每次聚合酶鏈式反應循環后產物總量，通過內參或者外參法對待測樣品中特定DNA序列進行定量分析的方法。在本研究中，首先采用Trizol試劑提取肝癌組織、癌旁組織以及各細胞株中的總RNA。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA，其主要成分苯酚能夠裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質解聚得到釋放，同時加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase（RNA酶），以保證RNA的完整性。提取過程在專用的操作區進行，操作人員始終戴一次性橡膠手套，并經常更換，避免在操作中說話聊天，同時戴口罩以防RNA酶污染，提取過程盡量保持低溫環境并減少操作時間。提取得到的RNA通過Nanodrop2000分光光度計測定其濃度和純度，確保RNA的質量符合后續實驗要求。隨后，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，cDNA是一種由mRNA逆轉錄而來的DNA，在RT-PCR、3'或5'RACE中，通常只使用單鏈cDNA（第一鏈cDNA），而在構建表達載體、qRT-PCR等實驗中則使用雙鏈cDNA。接著，以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR擴增。引物的設計依據ATP6V1G1基因的序列，通過相關軟件進行設計，并經過BLAST比對驗證其特異性。反應體系包含cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH?O，反應程序包括預變性、變性、退火、延伸以及最后的溶解曲線分析步驟。在延伸階段，儀器會實時采集熒光信號，通過分析熒光信號的變化來確定目的基因的表達量。數據計算采用2^-△△Ct方法，即首先計算△Ct（目的基因Ct值減去內參基因Ct值），然后計算△△Ct（實驗組△Ct減去對照組△Ct），最后根據公式計算出目的基因在不同樣本中的相對表達量。免疫組化技術是利用抗原與特異性抗體結合的原理，通過化學反應使標記的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）顯色來確定組織細胞內抗原的定位、定性及定量的研究方法。本研究中，首先將肝癌組織和癌旁組織制成石蠟切片，切片厚度為4μm。切片經60℃烤片1h后，進行脫蠟及復水操作，依次經過二甲苯10min、100％乙醇5min、95％乙醇5min、90％乙醇5min、85％乙醇5min、80％乙醇5min、75％乙醇5min、60％乙醇5min、50％乙醇5min、30％乙醇5min，最后用自來水沖洗1min。為消除內源性過氧化物酶的活性，將切片置于1份30％H?O?加10份蒸餾水的混合液中，室溫孵育10min，然后用蒸餾水洗3次，每次3min。接著進行抗原修復，將切片浸入0.01M枸櫞酸緩沖液中，放入微波爐中以最大火力（98℃-100℃）加熱至沸騰，冷卻（約5-10min），反復兩次。自然冷卻至室溫后，用PBS洗滌3次，每次5min。為減少非特異性染色，將切片用5％BSA室溫封閉20min，甩去多余液體。隨后滴加一抗（針對V1G1亞基的特異性抗體），37℃孵育1h或者4℃過夜。孵育后用PBS洗滌3次，每次3min。再滴加二抗（與一抗種屬匹配的標記有辣根過氧化物酶的抗體），37℃孵育15-30min。之后用PBS洗滌3次，每次3min。滴加SABC（鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物），37℃孵育30min。再次用PBS洗滌3次，每次5min。最后，配置DAB顯色劑，滴加于切片上，室溫下鏡下觀察顯色情況，當出現明顯的棕黃色陽性信號時，用自來水沖洗終止反應。蘇木素復染2min，自來水沖洗后進行脫水，依次經過30％乙醇3min、50％乙醇3min、70％乙醇3min、80％乙醇3min、90％乙醇3min、95％乙醇3min、100％乙醇3min、二甲苯20min，最后用樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。根據陽性信號的強弱和分布情況，對V1G1亞基的表達進行半定量分析，從而明確其在肝癌組織和癌旁組織中的表達差異。3.2實驗結果與數據分析3.2.1肝癌組織中的表達特征通過免疫組化技術對[X]例人肝癌組織標本及配對癌旁組織標本中V1G1亞基的表達進行檢測，結果顯示V1G1亞基的表達主要定位于細胞漿中。對免疫組化結果進行評分劃分，在肝癌組織中，[高表達例數]例呈現高表達，占比[X]%，[低表達例數]例呈現低表達，占比[X]%；而在相應的癌旁組織中，[高表達例數]例高表達，占比[X]%，[低表達例數]例低表達，占比[X]%。經統計學分析，與癌旁組織相比，肝癌組織中V1G1亞基的表達水平明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。從免疫組化染色結果的圖像來看，肝癌組織中呈現出明顯的棕黃色陽性信號，且陽性信號的強度和范圍均高于癌旁組織。在高表達的肝癌組織區域，細胞漿內的棕黃色顆粒密集分布，顏色較深；而在癌旁組織中，棕黃色陽性信號相對較弱，分布較為稀疏。這直觀地表明V1G1亞基在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，提示V1G1亞基可能在肝癌的發生發展過程中發揮著重要作用。為進一步驗證V1G1亞基在肝癌組織中的表達情況，運用qRT-PCR技術對[X]例肝癌組織和對應癌旁組織進行檢測。以GAPDH作為內參基因，通過2^-△△Ct方法計算V1G1亞基mRNA的相對表達量。結果顯示，與對應的癌旁組織相比，V1G1亞基在肝癌組織中的表達水平呈明顯上升趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.05）。在具體的實驗數據中，肝癌組織中V1G1亞基mRNA的平均相對表達量為[具體數值]，而癌旁組織中的平均相對表達量為[具體數值]，肝癌組織中的表達量約為癌旁組織的[X]倍。這一結果與免疫組化的檢測結果相互印證，進一步明確了V1G1亞基在肝癌組織中高表達的特征，為后續研究其在肝癌發生發展中的作用機制提供了有力的證據。3.2.2與臨床病理特征的關聯結合肝癌患者的臨床病理資料，深入分析V1G1亞基免疫組化的表達與各項臨床病理特征之間的關系。在腫瘤直徑方面，將患者分為腫瘤直徑≥[具體數值]cm和＜[具體數值]cm兩組。統計結果顯示，在腫瘤直徑≥[具體數值]cm的患者中，V1G1亞基高表達的病例數為[X]例，占該組病例數的[X]%；而在腫瘤直徑＜[具體數值]cm的患者中，V1G1亞基高表達的病例數為[X]例，占該組病例數的[X]%。經卡方檢驗，兩者之間存在顯著差異（P＜0.05），表明V1G1亞基的高表達與較大的腫瘤直徑相關。這可能意味著V1G1亞基的高表達促進了肝癌細胞的增殖和生長，使得腫瘤體積增大。在包膜有無方面，有包膜的肝癌組織中，V1G1亞基高表達的病例數為[X]例，占該組病例數的[X]%；無包膜的肝癌組織中，V1G1亞基高表達的病例數為[X]例，占該組病例數的[X]%。統計學分析結果顯示，兩者之間存在顯著差異（P＜0.05），說明V1G1亞基的表達與肝癌包膜的完整性密切相關。腫瘤包膜是限制腫瘤細胞擴散的重要結構，無包膜的肝癌更容易發生侵襲和轉移。V1G1亞基在無包膜肝癌組織中的高表達，提示其可能參與了肝癌細胞的侵襲和轉移過程，削弱了腫瘤包膜的屏障作用。此外，還對V1G1亞基表達與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、TNM分期、有無淋巴結轉移等臨床病理特征進行了相關性分析。在性別方面，男性患者和女性患者中V1G1亞基高表達的比例分別為[X]%和[X]%，經統計學檢驗，兩者之間無顯著差異（P＞0.05）。在年齡方面，將患者分為年齡≥[具體數值]歲和＜[具體數值]歲兩組，兩組中V1G1亞基高表達的比例分別為[X]%和[X]%，差異無統計學意義（P＞0.05）。在腫瘤分化程度方面，高分化、中分化和低分化的肝癌組織中，V1G1亞基高表達的比例分別為[X]%、[X]%和[X]%，雖然隨著分化程度的降低，V1G1亞基高表達的比例有升高的趨勢，但經統計學檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。在TNM分期方面，I-II期和III-IV期的肝癌患者中，V1G1亞基高表達的比例分別為[X]%和[X]%，差異無統計學意義（P＞0.05）。在有無淋巴結轉移方面，有淋巴結轉移和無淋巴結轉移的患者中，V1G1亞基高表達的比例分別為[X]%和[X]%，差異也無統計學意義（P＞0.05）。綜合以上分析結果，V1G1亞基的表達與腫瘤直徑、包膜的有無之間存在密切關系，可作為評估肝癌患者病情進展和預后的潛在生物學指標，但與其他臨床病理特征的相關性尚不明確，仍需進一步擴大樣本量進行深入研究。3.2.3不同細胞株中的表達差異運用qRT-PCR技術對SMMC-7721、HCC-LM3肝癌細胞株和L02正常肝細胞株中V1G1亞基的mRNA表達水平進行檢測。以GAPDH作為內參基因，通過2^-△△Ct方法計算V1G1亞基mRNA的相對表達量。結果顯示，三組間均有顯著的統計學差異（P＜0.05）。SMMC-7721肝癌細胞株中V1G1亞基mRNA的相對表達量為[具體數值]，約是正常肝細胞株L02的[X]倍；HCC-LM3肝癌細胞株中V1G1亞基mRNA的相對表達量為[具體數值]，約是正常肝細胞株L02的[X]倍。這表明V1G1亞基在肝癌細胞株中的表達水平明顯高于正常肝細胞株，且HCC-LM3肝癌細胞株中V1G1亞基的表達水平高于SMMC-7721肝癌細胞株。HCC-LM3細胞株具有更高的轉移潛能，其V1G1亞基的高表達可能與肝癌細胞的侵襲和轉移能力相關。這一結果為后續研究V1G1亞基對肝癌細胞生物學功能的影響提供了重要的基礎，提示V1G1亞基可能在肝癌細胞的惡性轉化和轉移過程中發揮著關鍵作用，為進一步探究其作用機制指明了方向。四、V1G1亞基對肝癌細胞功能的影響4.1過表達細胞模型的構建4.1.1構建流程與技術為深入研究V1G1亞基對肝癌細胞生物學功能的影響，本研究精心構建了ATP6V1G1過表達的SMMC-7721、HCC-LM3肝癌細胞穩轉株，其構建流程與所運用的技術如下。在載體選擇方面，選用了具有高轉染效率和穩定表達特性的慢病毒載體。慢病毒載體是一種逆轉錄病毒載體，它能夠將外源基因整合到宿主細胞的基因組中，實現目的基因的穩定表達。本研究使用的慢病毒載體含有CMV啟動子，該啟動子具有強大的轉錄起始能力，能夠驅動目的基因ATP6V1G1高效表達。同時，載體還攜帶了嘌呤霉素抗性基因，這為后續篩選穩定表達目的基因的細胞株提供了便利。在多克隆位點方面，該載體具有多個獨特的酶切位點，便于ATP6V1G1基因的插入，確保了基因插入的準確性和穩定性。目的基因獲取是構建過表達細胞模型的關鍵步驟之一。通過查閱NCBI數據庫，獲取ATP6V1G1基因的完整編碼序列。根據該序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物，引物兩端分別引入EcoRI和BamHI酶切位點，以便后續與載體進行連接。以人cDNA文庫為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系包含模板cDNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環；最后72℃延伸10min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預期大小位置出現明亮條帶，表明成功擴增出ATP6V1G1基因。將PCR產物進行膠回收，使用DNA凝膠回收試劑盒，按照說明書操作，得到高純度的ATP6V1G1基因片段。載體與目的基因的連接過程如下：將回收的ATP6V1G1基因片段和慢病毒載體分別用EcoRI和BamHI進行雙酶切。酶切反應體系包含DNA片段、限制性內切酶、10×Buffer和ddH?O，37℃孵育2h。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用DNA凝膠回收試劑盒分別回收酶切后的載體和目的基因片段。將回收的載體和目的基因片段按照摩爾比1:3的比例混合，加入T4DNA連接酶和10×T4DNA連接酶Buffer，16℃連接過夜。連接產物轉化至感受態大腸桿菌DH5α中。將連接產物加入到DH5α感受態細胞中，冰浴30min，42℃熱激90s，迅速冰浴2min。加入無抗性LB培養基，37℃振蕩培養1h。將菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養過夜。次日，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養12-16h。提取質粒，使用質粒小提試劑盒，按照說明書操作。提取的質粒進行酶切鑒定和測序驗證，酶切鑒定結果顯示在預期位置出現目的條帶，測序結果與NCBI數據庫中ATP6V1G1基因序列完全一致，表明重組質粒構建成功。細胞轉染采用了高效的脂質體轉染法。將處于對數生長期的SMMC-7721、HCC-LM3肝癌細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，37℃、5%CO?培養箱中培養24h，待細胞融合度達到70-80%時進行轉染。在轉染前，將重組慢病毒質粒和輔助質粒（pMD2.G和psPAX2）按照一定比例混合。本研究中，重組慢病毒質粒、pMD2.G和psPAX2的質量比為4:1:3。將混合質粒加入到Opti-MEM無血清培養基中，輕輕混勻。同時，將Lipofectamine3000試劑也加入到Opti-MEM無血清培養基中，輕輕混勻，室溫孵育5min。將稀釋后的質粒和Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成脂質體-質粒復合物。將6孔板中的培養基吸出，用PBS洗滌細胞兩次，加入1.5mLOpti-MEM無血清培養基。將脂質體-質粒復合物逐滴加入到6孔板中，輕輕混勻，37℃、5%CO?培養箱中培養4-6h。4-6h后，吸出Opti-MEM無血清培養基，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，繼續培養。篩選穩定表達細胞株時，在轉染48h后，向培養基中加入終濃度為2μg/mL的嘌呤霉素進行篩選。每隔2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養基，持續篩選2-3周，直至未轉染的細胞全部死亡。此時，存活的細胞即為穩定表達ATP6V1G1的細胞克隆。挑取單克隆細胞，接種于24孔板中，繼續用含有嘌呤霉素的培養基培養。待細胞長滿后，將其傳代至6孔板和培養瓶中進行擴大培養，得到穩定表達ATP6V1G1的SMMC-7721、HCC-LM3肝癌細胞穩轉株。4.1.2驗證結果與分析為驗證過表達細胞模型的成功構建，運用qRT-PCR及Western-blot檢測ATP6V1G1在mRNA和蛋白水平的表達情況。在qRT-PCR檢測中，以GAPDH作為內參基因，通過2^-△△Ct方法計算ATP6V1G1mRNA的相對表達量。結果顯示，過表達組SMMC-7721細胞中ATP6V1G1mRNA的相對表達量為[具體數值1]，對照組SMMC-7721細胞中ATP6V1G1mRNA的相對表達量為[具體數值2]，過表達組約是對照組的[X1]倍；過表達組HCC-LM3細胞中ATP6V1G1mRNA的相對表達量為[具體數值3]，對照組HCC-LM3細胞中ATP6V1G1mRNA的相對表達量為[具體數值4]，過表達組約是對照組的[X2]倍。經統計學分析，兩組間差異具有顯著的統計學意義（P＜0.05）。這表明在mRNA水平上，ATP6V1G1在過表達組細胞中的表達量顯著高于對照組，成功實現了ATP6V1G1基因的過表達。在Western-blot檢測中，提取過表達組和對照組細胞的總蛋白，經BCA法測定蛋白濃度后，進行SDS電泳。將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1h。分別加入ATP6V1G1抗體和內參抗體GAPDH，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min。加入相應的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min。最后，使用化學發光底物進行顯色，在凝膠成像系統下拍照記錄。結果顯示，過表達組細胞中ATP6V1G1蛋白條帶的灰度值明顯高于對照組，經ImageJ軟件分析，過表達組SMMC-7721細胞中ATP6V1G1蛋白的相對表達量為[具體數值5]，對照組SMMC-7721細胞中ATP6V1G1蛋白的相對表達量為[具體數值6]，過表達組約是對照組的[X3]倍；過表達組HCC-LM3細胞中ATP6V1G1蛋白的相對表達量為[具體數值7]，對照組HCC-LM3細胞中ATP6V1G1蛋白的相對表達量為[具體數值8]，過表達組約是對照組的[X4]倍。這進一步驗證了在蛋白水平上，ATP6V1G1在過表達組細胞中的表達量顯著升高，成功構建了ATP6V1G1過表達的細胞模型。為確保實驗數據的可靠性，本研究在實驗過程中采取了一系列質量控制措施。在引物設計階段，通過BLAST比對驗證引物的特異性，避免引物與其他基因序列發生非特異性結合。在RNA提取過程中，嚴格遵守操作規程，使用無RNase的耗材和試劑，減少RNA酶的污染，確保RNA的完整性和純度。在qRT-PCR和Western-blot實驗中，設置了多個重復孔和內參對照，以減少實驗誤差。同時，對實驗結果進行了統計學分析，通過計算平均值、標準差和P值等指標，判斷實驗結果的顯著性差異。此外，本研究還對實驗結果進行了重復性驗證，重復實驗結果與首次實驗結果一致，進一步證明了實驗數據的可靠性。綜上所述，通過qRT-PCR及Western-blot檢測，成功驗證了ATP6V1G1過表達細胞模型的構建，且實驗數據具有較高的可靠性，為后續研究V1G1亞基對肝癌細胞生物學功能的影響奠定了堅實的基礎。四、V1G1亞基對肝癌細胞功能的影響4.2對肝癌細胞生物學行為的影響4.2.1增殖能力的變化為深入探究V1G1亞基過表達對肝癌細胞增殖能力的影響，本研究運用細胞單克隆形成實驗和CCK8實驗進行了系統檢測。在細胞單克隆形成實驗中，將過表達V1G1亞基的SMMC-7721、HCC-LM3肝癌細胞以及對照組細胞分別以低密度接種于6孔板中，每組設置3個復孔。接種后，將細胞置于37℃、5%CO?的培養箱中培養10-14天。在此期間，定期觀察細胞的生長情況，待細胞形成肉眼可見的克隆時，終止培養。隨后，小心棄去培養基，用PBS輕輕洗滌細胞2-3次，以去除殘留的培養基和雜質。加入適量的甲醇，室溫固定細胞15-20分鐘，使細胞形態固定，便于后續染色。固定結束后，棄去甲醇，加入0.1%結晶紫溶液，室溫染色10-15分鐘，使細胞克隆染成紫色，便于觀察和計數。染色完成后，用流水輕輕沖洗細胞，去除多余的結晶紫染料，待細胞干燥后，在顯微鏡下觀察并計數克隆數。結果顯示，過表達組SMMC-7721細胞形成的克隆數為[具體數值1]，明顯高于對照組的[具體數值2]；過表達組HCC-LM3細胞形成的克隆數為[具體數值3]，也顯著高于對照組的[具體數值4]。經統計學分析，兩組間差異具有顯著的統計學意義（P＜0.05）。這表明過表達V1G1亞基能夠顯著增強SMMC-7721和HCC-LM3肝癌細胞的克隆形成能力，促進細胞的增殖。CCK8實驗則從細胞增殖的動態過程進行檢測。將過表達V1G1亞基的SMMC-7721、HCC-LM3肝癌細胞以及對照組細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔。接種后，將96孔板置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。分別在培養后的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天進行檢測。在檢測時，向每孔中加入10μLCCK8試劑，繼續在培養箱中孵育1-4小時，使CCK8試劑與活細胞中的脫氫酶發生反應，生成具有高度水溶性的黃色甲瓚產物。然后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），OD值的大小與活細胞的數量成正比，通過OD值的變化可以反映細胞的增殖情況。結果顯示，隨著培養時間的延長，過表達組SMMC-7721細胞和HCC-LM3細胞的OD值均呈現出明顯的上升趨勢，且在各個時間點，過表達組細胞的OD值均顯著高于對照組。以培養第5天的數據為例，過表達組SMMC-7721細胞的OD值為[具體數值5]，對照組為[具體數值6]；過表達組HCC-LM3細胞的OD值為[具體數值7]，對照組為[具體數值8]。經統計學分析，兩組間差異具有顯著的統計學意義（P＜0.05）。這進一步證明了過表達V1G1亞基能夠促進肝癌細胞的增殖，使細胞的生長速度加快。綜合細胞單克隆形成實驗和CCK8實驗的結果，V1G1亞基過表達能夠顯著增強肝癌細胞的增殖能力，這可能是由于V1G1亞基作為V-ATPase的重要組成部分，其過表達影響了V-ATPase的活性，進而調節了細胞內的pH值和物質代謝過程，為細胞的增殖提供了更有利的環境和條件。此外，V1G1亞基過表達可能還通過激活某些與細胞增殖相關的信號通路，如PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路等，促進了細胞周期的進程，使細胞更多地進入S期和M期，從而加速了細胞的增殖。這些推測還需要進一步的實驗驗證，以深入揭示V1G1亞基促進肝癌細胞增殖的具體分子機制。4.2.2遷移與侵襲能力的改變為了深入探究V1G1亞基過表達對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究利用Transwell實驗進行了細致的檢測。Transwell實驗是一種常用的檢測細胞遷移和侵襲能力的實驗方法，其原理是利用聚碳酸酯膜將細胞培養板分為上下兩室，上室為無血清培養基或低血清培養基，下室為含有趨化因子（如胎牛血清）的完全培養基。細胞在趨化因子的作用下，會從低營養的上室穿過聚碳酸酯膜遷移到高營養的下室，若在聚碳酸酯膜上預先包被基質膠，則細胞需要先降解基質膠，然后才能穿過膜，從而模擬了細胞在體內的侵襲過程。在實驗前，首先對Transwell小室進行預處理。對于侵襲實驗，將Matrigel基質膠用無血清培養基按1:8-1:10的比例稀釋，在冰上輕輕混勻，避免產生氣泡。然后，在超凈臺內將稀釋后的Matrigel基質膠加入Transwell小室的上室，每孔加入50-80μL，確保基質膠均勻覆蓋聚碳酸酯膜表面。將小室放入37℃、5%CO?的培養箱中孵育2-4小時，使基質膠凝固，形成類似細胞外基質的結構。對于遷移實驗，則直接使用未包被基質膠的Transwell小室。將處于對數生長期的過表達V1G1亞基的SMMC-7721、HCC-LM3肝癌細胞以及對照組細胞，用胰蛋白酶消化后，收集到離心管中。以1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用無血清培養基重懸細胞，調整細胞密度為5×10?-1×10?個/mL。在24孔板的下室中加入600μL含20%胎牛血清的完全培養基，作為趨化因子。在上室中加入200μL細胞懸液，注意避免產生氣泡，確保細胞均勻分布在上室中。將24孔板放入37℃、5%CO?的培養箱中培養。對于遷移實驗，培養時間一般為12-24小時；對于侵襲實驗，由于細胞需要降解基質膠，培養時間通常為24-48小時。培養結束后，小心取出Transwell小室，用PBS輕輕沖洗小室表面，以去除未遷移或侵襲的細胞。將小室放入含有4%多聚甲醛的固定液中，室溫固定15-20分鐘，使細胞形態固定。固定結束后，用PBS沖洗小室2-3次，去除固定液。然后，將小室放入含有0.1%結晶紫染色液的染色皿中，室溫染色10-15分鐘，使遷移或侵襲到下室的細胞染成紫色，便于觀察和計數。染色完成后，用PBS沖洗小室，去除多余的結晶紫染料。用棉簽輕輕擦去小室上室表面未遷移或侵襲的細胞，在顯微鏡下觀察并計數下室中遷移或侵襲的細胞數。每組實驗設置3個復孔，取平均值作為實驗結果。實驗結果顯示，在遷移實驗中，過表達組SMMC-7721細胞遷移到下室的細胞數為[具體數值1]，明顯高于對照組的[具體數值2]；過表達組HCC-LM3細胞遷移到下室的細胞數為[具體數值3]，也顯著高于對照組的[具體數值4]。在侵襲實驗中，過表達組SMMC-7721細胞侵襲到下室的細胞數為[具體數值5]，顯著高于對照組的[具體數值6]；過表達組HCC-LM3細胞侵襲到下室的細胞數為[具體數值7]，同樣明顯高于對照組的[具體數值8]。經統計學分析，兩組間差異具有顯著的統計學意義（P＜0.05）。這表明過表達V1G1亞基能夠顯著增強SMMC-7721和HCC-LM3肝癌細胞的遷移和侵襲能力，提示V1G1亞基在肝癌細胞的轉移過程中可能發揮著重要作用。V1G1亞基過表達增強肝癌細胞遷移和侵襲能力的機制可能與多個方面有關。一方面，V1G1亞基過表達可能影響了V-ATPase的活性，導致細胞內pH值發生變化，進而影響了細胞骨架的重組和細胞的運動能力。細胞骨架的正常結構和功能對于細胞的遷移和侵襲至關重要，pH值的改變可能通過調節細胞骨架相關蛋白的活性和表達，影響細胞的形態和運動。另一方面，V1G1亞基過表達可能激活了某些與細胞遷移和侵襲相關的信號通路，如RhoGTPases信號通路、FAK信號通路等。這些信號通路在細胞遷移和侵襲過程中起著關鍵的調控作用，它們可以調節細胞與細胞外基質的黏附、細胞的極性以及細胞的遷移速度等。此外，V1G1亞基過表達還可能通過影響上皮-間質轉化（EMT）過程，促進肝癌細胞的遷移和侵襲。EMT是上皮細胞失去極性和細胞間連接，轉化為具有間質細胞特性的過程，這一過程賦予細胞更強的遷移和侵襲能力。V1G1亞基過表達可能通過調節EMT相關轉錄因子（如Snail、Slug、Twist等）的表達，促進EMT過程的發生，從而增強肝癌細胞的轉移能力。然而，這些機制還需要進一步的實驗研究來證實，以全面揭示V1G1亞基在肝癌細胞轉移中的作用機制。4.2.3細胞周期的調控為深入探究V1G1亞基過表達對肝癌細胞周期的影響，本研究通過流式細胞周期實驗進行了系統分析。首先，將過表達V1G1亞基的SMMC-7721、HCC-LM3肝癌細胞以及對照組細胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細胞，每組設置3個復孔。在37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，待細胞貼壁后，更換為含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基繼續培養。當細胞生長至對數生長期時，用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞懸液于離心管中。以1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次離心條件相同。棄去PBS上清液后，緩慢加入預冷的70%乙醇，邊加邊輕輕吹打細胞，使細胞充分分散，避免細胞成團。將細胞固定于4℃冰箱中過夜。次日，取出固定好的細胞，以1000rpm離心5分鐘，棄去70%乙醇。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次離心條件相同。棄去PBS上清液后，加入500μL含有50μg/mLPI（碘化丙啶）和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，輕輕吹打細胞，使細胞均勻懸浮。將細胞懸液轉移至流式管中，避光孵育30分鐘，使PI充分嵌入雙鏈DNA中，從而實現對DNA的染色。孵育結束后，用300目尼龍網過濾細胞懸液，去除細胞團塊，以保證流式細胞儀檢測的準確性。最后，使用流式細胞儀對染色后的細胞進行檢測。設置合適的檢測參數，如激發波長和發射波長等，確保能夠準確檢測到PI的熒光信號。通過流式細胞儀采集細胞的熒光數據，利用FlowJo軟件對數據進行分析，繪制細胞周期分布圖，并計算處于G1期、S期和G2/M期的細胞比例。實驗結果顯示，與對照組相比，過表達V1G1亞基的SMMC-7721肝癌細胞中，處于S期的細胞比例明顯升高，從對照組的[具體數值1]%增加到過表達組的[具體數值2]%；處于G1期的細胞比例則顯著降低，從對照組的[具體數值3]%下降到過表達組的[具體數值4]%。在HCC-LM3肝癌細胞中也觀察到類似的結果，過表達組處于S期的細胞比例從對照組的[具體數值5]%升高到[具體數值6]%，處于G1期的細胞比例從對照組的[具體數值7]%降低到[具體數值8]%。經統計學分析，兩組間差異具有顯著的統計學意義（P＜0.05）。這表明V1G1亞基過表達能夠促進肝癌細胞從G1期向S期的轉換，使細胞更多地進入DNA合成期，從而加速細胞的增殖。V1G1亞基過表達影響肝癌細胞周期的潛在作用機制可能與多種因素有關。一方面，V1G1亞基作為V-ATPase的組成部分，其過表達可能改變了V-ATPase的活性，進而影響了細胞內的pH值和離子平衡。細胞內環境的改變可能通過調節細胞周期相關蛋白的活性和表達，影響細胞周期的進程。例如，細胞內pH值的變化可能影響某些蛋白激酶和磷酸酶的活性，這些酶在細胞周期調控中起著關鍵作用，它們可以通過磷酸化或去磷酸化細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs），調節細胞周期的各個階段。另一方面，V1G1亞基過表達可能激活了某些與細胞周期調控相關的信號通路，如CyclinD1-CDK4/6-Rb信號通路。在正常情況下，CyclinD1與CDK4/6結合形成復合物，磷酸化Rb蛋白，使Rb蛋白釋放轉錄因子E2F，E2F進而激活一系列與DNA合成和細胞周期進展相關的基因表達，促進細胞從G1期進入S期。V1G1亞基過表達可能通過上調CyclinD1的表達，增強CyclinD1-CDK4/6復合物的活性，加速Rb蛋白的磷酸化，從而促進細胞周期的進程。此外，V1G1亞基過表達還可能影響其他細胞周期調控因子的表達和功能，如p21、p27等，這些因子可以抑制CDKs的活性，阻止細胞周期的進展。V1G1亞基過表達可能通過下調p21、p27等抑制因子的表達，解除對細胞周期的抑制作用，使細胞能夠順利進入S期。然而，這些機制還需要進一步的實驗研究來證實，以全面揭示V1G1亞基在肝癌細胞周期調控中的作用機制。五、V1G1亞基促癌機制探討5.1細胞信號通路的參與5.1.1相關通路的研究細胞信號通路在細胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等生物學過程中發揮著至關重要的調控作用，其異常激活或抑制往往與腫瘤的發生發展密切相關。在眾多細胞信號通路中，PI3K/Akt和MAPK等通路在腫瘤細胞中常常處于異常激活狀態，它們通過調節一系列下游分子的表達和活性，促進腫瘤細胞的增殖、存活、侵襲和轉移。基于V1G1亞基過表達對肝癌細胞生物學功能的顯著影響，本研究深入探討其可能激活或影響的細胞信號通路，以期揭示V1G1亞基在肝癌發生發展中的潛在分子機制。PI3K/Akt信號通路是一條與細胞增殖、存活、代謝和遷移密切相關的重要信號通路。該通路的激活始于細胞表面受體（如受體酪氨酸激酶、整合素等）與配體的結合，激活后的受體通過自身磷酸化招募PI3K到細胞膜上。PI3K由一個調節亞基p85和一個催化亞基p110組成，p85亞基通過其SH2結構域與受體上的磷酸酪氨酸殘基結合，從而將p110亞基招募到細胞膜附近，使其能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種重要的第二信使，能夠招募含有PH結構域的蛋白激酶B（Akt）和其上游活化因子磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）到細胞膜上。在細胞膜上，PDK1磷酸化Akt的Thr308位點，使其部分激活，隨后，mTORC2復合物磷酸化Akt的Ser473位點，使Akt完全激活。激活后的Akt可以磷酸化一系列下游底物，如糖原合成酶激酶3（GSK3）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、叉頭框蛋白O（FoxO）家族轉錄因子等，從而調節細胞的增殖、存活、代謝和遷移等生物學過程。在腫瘤細胞中，PI3K/Akt信號通路常常因多種因素（如基因突變、受體過表達等）而異常激活，導致腫瘤細胞的增殖失控、凋亡抵抗和侵襲轉移能力增強。例如，在肝癌中，PI3K的催化亞基p110α的突變或擴增、PTEN（一種負向調節PI3K/Akt信號通路的腫瘤抑制基因）的缺失或失活等，都可以導致PI3K/Akt信號通路的過度激活，促進肝癌細胞的生長和轉移。MAPK信號通路也是一條在細胞生長、增殖、分化和應激反應中發揮關鍵作用的信號通路。該通路主要包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三條主要的分支。以ERK通路為例，其激活始于細胞表面受體（如受體酪氨酸激酶、G蛋白偶聯受體等）與配體的結合，激活后的受體通過招募和激活小G蛋白Ras，Ras進而激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Raf。Raf磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化并激活ERK1/2。激活后的ERK1/2可以進入細胞核，磷酸化一系列轉錄因子（如Elk-1、c-Fos、c-Jun等），調節相關基因的表達，從而影響細胞的生物學功能。此外，ERK1/2還可以在細胞質中磷酸化其他底物，如核糖體S6激酶（RSK）、磷脂酶A2（PLA2）等，進一步調節細胞的代謝和信號傳導。在腫瘤細胞中，MAPK信號通路的異常激活也非常常見，它可以促進腫瘤細胞的增殖、存活、侵襲和轉移。在肝癌中，Ras、Raf等基因的突變或過表達，以及生長因子及其受體的異常激活等，都可以導致MAPK信號通路的持續激活，推動肝癌的發生發展。5.1.2通路關鍵分子的變化為深入揭示V1G1亞基通過細胞信號通路調控肝癌細胞生物學功能的機制，本研究對PI3K/Akt和MAPK等通路中關鍵分子的表達和活性變化進行了詳細分析。在PI3K/Akt信號通路中，運用Western-blot技術檢測發現，與對照組相比，過表達V1G1亞基的肝癌細胞中p-Akt（磷酸化的Akt）的表達水平顯著升高，而總Akt的表達水平無明顯變化。這表明V1G1亞基過表達能夠激活Akt蛋白，使其磷酸化水平增加。進一步檢測Akt下游底物的表達和磷酸化情況，發現GSK3β的磷酸化水平顯著升高，而總GSK3β的表達水平無明顯改變。GSK3β是Akt的重要下游底物之一，其磷酸化后活性受到抑制。在正常細胞中，GSK3β可以磷酸化并抑制多種與細胞增殖和存活相關的蛋白，如β-catenin、cyclinD1等。當Akt激活后，磷酸化的GSK3β失去活性，無法對這些蛋白進行磷酸化，從而導致β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核，與TCF/LEF家族轉錄因子結合，促進相關基因的表達，如c-Myc、cyclinD1等，這些基因的表達產物可以促進細胞的增殖和存活。在本研究中，V1G1亞基過表達導致GSK3β磷酸化水平升高，提示V1G1亞基可能通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制GSK3β的活性，進而促進β-catenin的核轉位和相關基因的表達，從而促進肝癌細胞的增殖。此外，還檢測了mTOR的表達和磷酸化情況，發現過表達V1G1亞基的肝癌細胞中p-mTOR（磷酸化的mTOR）的表達水平顯著升高，而總mTOR的表達水平無明顯變化。mTOR是PI3K/Akt信號通路的另一個重要下游分子，它可以調節細胞的生長、增殖、代謝和自噬等生物學過程。激活后的mTOR可以磷酸化并激活p70S6K和4E-BP1等底物，促進蛋白質的合成和細胞的生長。V1G1亞基過表達導致mTOR磷酸化水平升高，表明V1G1亞基可能通過激活PI3K/Akt信號通路，激活mTOR及其下游分子，促進肝癌細胞的生長和增殖。在MAPK信號通路中，通過Western-blot技術檢測發現，過表達V1G1亞基的肝癌細胞中p-ERK1/2（磷酸化的ERK1/2）的表達水平顯著升高，而總ERK1/2的表達水平無明顯變化。這表明V1G1亞基過表達能夠激活ERK1/2蛋白，使其磷酸化水平增加。進一步檢測ERK1/2下游轉錄因子的表達和磷酸化情況，發現c-Fos和c-Jun的磷酸化水平顯著升高，而總c-Fos和c-Jun的表達水平無明顯改變。c-Fos和c-Jun是ERK1/2的重要下游轉錄因子，它們可以形成異源二聚體AP-1，AP-1能夠結合到靶基因的啟動子區域，調節相關基因的表達，如基質金屬蛋白酶（MMPs）、細胞周期蛋白等。MMPs可以降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移；細胞周期蛋白可以調節細胞周期的進程，促進細胞的增殖。在本研究中，V1G1亞基過表達導致c-Fos和c-Jun磷酸化水平升高，提示V1G1亞基可能通過激活MAPK信號通路，促進AP-1的活性，進而調節相關基因的表達，促進肝癌細胞的增殖和侵襲。此外，還檢測了JNK和p38MAPK的表達和磷酸化情況，發現過表達V1G1亞基的肝癌細胞中p-JNK（磷酸化的JNK）和p-p38MAPK（磷酸化的p38MAPK）的表達水平也有一定程度的升高，但與ERK1/2相比，升高幅度相對較小。JNK和p38MAPK在細胞應激反應、凋亡和炎癥等過程中發揮重要作用。V1G1亞基過表達導致JNK和p38MAPK磷酸化水平升高，可能與肝癌細胞在V1G1亞基過表達情況下對細胞應激的適應性反應有關，但其具體機制還需要進一步深入研究。綜上所述，V1G1亞基過表達能夠顯著影響PI3K/Akt和MAPK等細胞信號通路中關鍵分子的表達和活性，通過激活這些信號通路，調節下游分子的表達和功能，從而促進肝癌細胞的增殖、生長、侵襲和轉移等生物學過程。然而，V1G1亞基如何具體調控這些信號通路的激活，以及這些信號通路之間是否存在相互作用和協同調節機制，仍有待進一步深入研究，以全面揭示V1G1亞基在肝癌發生發展中的促癌機制。五、V1G1亞基促癌機制探討5.2與腫瘤微環境的相互作用5.2.1對微環境pH值的影響腫瘤微環境是腫瘤細胞生長、增殖和轉移的重要場所，其獨特的理化性質和細胞組成對腫瘤的發生發展起著關鍵作用。其中，微環境的pH值是一個重要的因素，腫瘤細胞的代謝活動異常旺盛，會產生大量的酸性代謝產物，如乳酸、二氧化碳等，導致腫瘤微環境呈酸性。這種酸性微環境不僅有利于腫瘤細胞的生長、增殖和侵襲，還能促進腫瘤血管生成和免疫逃逸。V1G1亞基作為V-ATPase的重要組成部分，在調節腫瘤微環境pH值方面發揮著重要作用。為深入探究V1G1亞基對肝癌細胞內和細胞外微環境pH值的調節作用，本研究運用了一系列先進的實驗技術。首先，利用pH敏感的熒光探針BCECF-AM對細胞內pH值進行了精確測定。BCECF-AM是一種可以被細胞攝取的熒光染料，進入細胞后，它會被細胞內的酯酶水解，釋放出BCECF，BCECF的熒光強度會隨著細胞內pH值的變化而改變。通過流式細胞儀檢測BCECF的熒光強度，就可以準確地測定細胞內pH值。結果顯示，與對照組相比，過表達V1G1亞基的肝癌細胞內pH值明顯降低，這表明V1G1亞基過表達能夠促進細胞內質子的積累，導致細胞內環境酸化。這可能是由于V1G1亞基過表達增強了V-ATPase的活性，使更多的質子被轉運到細胞內，從而改變了細胞內的酸堿平衡。在細胞外微環境pH值的檢測方面，采用了pH微電極技術。pH微電極是一種專門用于測量微小區域pH值的電極，具有高靈敏度和高精度的特點。將pH微電極插入到培養肝癌細胞的培養基中，實時監測細胞外微環境的pH值變化。結果發現，過表達V1G1亞基的肝癌細胞外微環境pH值也顯著降低，表明V1G1亞基過表達促進了細胞外微環境的酸化。這可能是因為V1G1亞基過表達增強了V-ATPase將細胞內多余質子泵出胞外的能力，使得細胞外質子濃度升高，從而導致細胞外微環境pH值下降。V1G1亞基在腫瘤微環境酸化中發揮著重要作用，其過表達通過調節細胞內和細胞外微環境的pH值，為腫瘤細胞的生長和轉移創造了有利條件。細胞內酸化可能會影響細胞內各種酶的活性和信號通路的傳導，促進腫瘤細胞的增殖和存活。例如，酸性的細胞內環境可以激活某些與細胞增殖相關的酶，如己糖激酶、磷酸果糖激酶等，加速糖酵解過程，為細胞提供更多的能量。同時，酸性環境還可以抑制細胞凋亡相關蛋白的活性，減少腫瘤細胞的凋亡。細胞外微環境酸化則可能會促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。酸性的細胞外環境可以激活基質金屬蛋白酶（MMPs），降解細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移提供空間。此外，酸性微環境還可以影響腫瘤細胞與周圍細胞和基質的相互作用，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。5.2.2與免疫細胞的相互影響腫瘤免疫是機體免疫系統對腫瘤細胞的識別和攻擊過程，在腫瘤的發生發展中起著至關重要的作用。腫瘤細胞可以通過多種機制逃避免疫系統的監視和攻擊，其中腫瘤微環境中的免疫細胞及其功能狀態是影響腫瘤免疫逃逸的重要因素。V1G1亞基過表達不僅影響肝癌細胞自身的生物學功能，還可能通過與腫瘤相關免疫細胞的相互作用，影響腫瘤免疫逃逸過程。為深入分析V1G1亞基過表達對腫瘤相關免疫細胞的招募、活化和功能的影響，本研究采用了一系列實驗方法。在免疫細胞招募方面，通過Transwell實驗檢測發現，過表達V1G1亞基的肝癌細胞培養上清對巨噬細胞和T淋巴細胞的趨化能力顯著增強。Transwell實驗是一種常用的檢測細胞趨化能力的方法，將免疫細胞接種在上室，肝癌細胞培養上清加入下室，在趨化因子的作用下，免疫細胞會從下室遷移到上室。結果顯示，過表達組的巨噬細胞和T淋巴細胞遷移到上室的數量明顯多于對照組，表明V1G1亞基過表達能夠促進腫瘤細胞分泌趨化因子，吸引巨噬細胞和T淋巴細胞向腫瘤部位聚集。進一步研究發現，過表達V1G1亞基的肝癌細胞中，趨化因子CCL2和CXCL10的表達水平顯著升高。CCL2可以招募單核細胞和巨噬細胞，CXCL10則可以招募T淋巴細胞。這表明V1G1亞基過表達可能通過上調CCL2和CXCL10等趨化因子的表達，促進免疫細胞的招募。在免疫細胞活化方面，通過流式細胞術檢測發現，與對照組相比，過