Nanog與miR-200s協(xié)同調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)一直居高不下。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年結(jié)直腸癌新發(fā)病例達(dá)33.1萬(wàn)人，發(fā)病率位居全部惡性腫瘤的第四位，每年死于該病的患者約有15.9萬(wàn)人，死亡率位居癌癥死亡原因的第五位。在歐美國(guó)家，結(jié)直腸癌的病死率更是位居腫瘤死亡的第2位。而且，結(jié)腸癌病例中有33%的患者在入院時(shí)已處于中晚期，且常伴有肝、肺等多器官轉(zhuǎn)移，早期就診率僅為5%左右。目前，結(jié)腸癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、化療等，但這些方法并不能完全遏制結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，使得結(jié)腸癌的診療成為世界性的難題。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者死亡的主要原因。在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）起著關(guān)鍵作用。EMT是上皮細(xì)胞在特定生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程，在此過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。而MET則是EMT的逆過程，間質(zhì)細(xì)胞重新獲得上皮細(xì)胞的特征。腫瘤細(xì)胞通過EMT和MET的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)了從原發(fā)灶脫離、遷移、侵襲以及在遠(yuǎn)處器官定植和生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移過程。例如，在胚胎發(fā)育過程中，干細(xì)胞通過EMT分化成為人體各類細(xì)胞，而癌細(xì)胞也利用這一過程，獲得了類似干細(xì)胞的能力，表現(xiàn)出極性喪失、黏附性降低、遷移能力增強(qiáng)，并發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。不僅如此，癌細(xì)胞還能逆向進(jìn)行MET，這使得它們?cè)谵D(zhuǎn)移過程中更加靈活，難以被現(xiàn)有治療手段完全控制。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNA）在癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類非常短的非編碼RNA，通過與靶基因的互補(bǔ)配對(duì)，在基因轉(zhuǎn)錄后起翻譯抑制作用，從而影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。其中，miR-200家族被證實(shí)可協(xié)同ZEB家族參與控制腫瘤干細(xì)胞的功能，并通過控制腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程，發(fā)揮調(diào)控多種腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)展的作用。在結(jié)腸癌臨床樣本及結(jié)腸癌類干細(xì)胞中，研究人員已發(fā)現(xiàn)miR-200s表達(dá)下調(diào)，且伴隨細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（EMT）。與此同時(shí)，干性基因Nanog作為維持未分化胚胎細(xì)胞多能性和自我更新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，并可促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌中，前期研究也表明Nanog在核酸水平表達(dá)異常升高，且有研究人員找到了miR-200s與Nanog相互作用的證據(jù)，并推測(cè)Nanog通過miR-200s介導(dǎo)膠原蛋白等黏附分子參與了癌細(xì)胞EMT-MET能力，但具體的分子機(jī)制尚未明確。本研究旨在深入探究Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制。這一研究具有重要的理論和實(shí)際意義。從理論層面來(lái)看，有助于揭示結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程中復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識(shí)；從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，有望為結(jié)腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略，提高結(jié)腸癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，具有重大的臨床價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的不斷深入，Nanog和miR-200s在腫瘤細(xì)胞EMT-MET調(diào)控中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。在Nanog對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響方面，國(guó)內(nèi)外眾多研究表明，Nanog作為一種關(guān)鍵的干性轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，Nanog高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，使得癌細(xì)胞更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤(rùn)。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，研究人員觀察到高表達(dá)Nanog的乳腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤體積更大，且更容易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移。在肝癌研究中，Nanog的高表達(dá)也與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，它可以通過激活相關(guān)信號(hào)通路，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的自我更新能力，維持肝癌干細(xì)胞的“干性”，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)。在結(jié)腸癌領(lǐng)域，已有文獻(xiàn)報(bào)道Nanog可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究人員通過對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞，其增殖速度明顯加快，在Transwell實(shí)驗(yàn)中，遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著增多。而且，在裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞形成的腫瘤體積更大，生長(zhǎng)速度更快。關(guān)于miR-200s對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT-MET的調(diào)控作用，也有大量研究成果。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞的EMT-MET過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在肺癌研究中，miR-200s的低表達(dá)與癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程密切相關(guān)。當(dāng)miR-200s表達(dá)下調(diào)時(shí)，肺癌細(xì)胞中的上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高，細(xì)胞發(fā)生EMT，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。通過在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-200s，可有效抑制EMT進(jìn)程，使癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降。在胃癌研究中，miR-200s同樣通過調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。研究表明，miR-200s可以直接靶向作用于ZEB1和ZEB2等轉(zhuǎn)錄因子，抑制它們的表達(dá)，從而阻止EMT的發(fā)生。當(dāng)miR-200s表達(dá)上調(diào)時(shí)，ZEB1和ZEB2的表達(dá)受到抑制，E-cadherin的表達(dá)得以恢復(fù)，胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。在結(jié)腸癌研究中，前期研究已發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌臨床樣本及結(jié)腸癌類干細(xì)胞中miR-200s表達(dá)下調(diào)，且伴隨細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（EMT）。大量文獻(xiàn)表明，miR-200家族可協(xié)同ZEB家族參與控制腫瘤干細(xì)胞的功能，并通過控制腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程，發(fā)揮調(diào)控多種腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)展的作用。雖然目前對(duì)Nanog和miR-200s在腫瘤細(xì)胞EMT-MET調(diào)控方面已有一定的研究成果，但仍存在許多不足。在Nanog與miR-200s的相互作用機(jī)制方面，雖然已有研究人員找到了兩者相互作用的證據(jù)，并推測(cè)Nanog通過miR-200s介導(dǎo)膠原蛋白等黏附分子參與了癌細(xì)胞EMT-MET能力，但具體的分子作用機(jī)制尚未明確。例如，Nanog是如何直接或間接調(diào)控miR-200s的表達(dá)，以及miR-200s又是如何反過來(lái)影響Nanog的功能，這些問題都有待進(jìn)一步深入研究。在結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET調(diào)控的整體分子網(wǎng)絡(luò)方面，目前的研究還不夠全面和系統(tǒng)。雖然已經(jīng)知道Nanog和miR-200s在其中發(fā)揮重要作用，但它們與其他相關(guān)分子和信號(hào)通路之間的相互關(guān)系和協(xié)同作用機(jī)制還不清楚。例如，在EMT-MET過程中，除了已知的ZEB家族等分子外，是否還有其他未知的分子參與其中，以及這些分子與Nanog和miR-200s之間是如何相互影響和調(diào)控的，都需要進(jìn)一步探索。本研究將以結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對(duì)象，深入探究Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制。通過對(duì)這一機(jī)制的深入研究，有望填補(bǔ)目前在該領(lǐng)域的研究空白，為結(jié)腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的理論和實(shí)際意義。1.3研究?jī)?nèi)容與方法本研究旨在深入探究Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制，具體研究?jī)?nèi)容如下：Nanog與miR-200s在結(jié)腸癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析：收集一定數(shù)量的人結(jié)腸癌組織和癌旁組織，凍存于液氮罐保存，用于后續(xù)提取總RNA、總蛋白、核蛋白等。同時(shí)，培養(yǎng)多支結(jié)腸癌細(xì)胞株，如Caco2、LS174T、LoVo、HT-29、HCT116、SW480、SW620等，并提取其總RNA、總蛋白。分別對(duì)人結(jié)腸癌組織、癌旁組織及結(jié)腸癌細(xì)胞株的總RNA進(jìn)行mRNA、microRNA逆轉(zhuǎn)錄，運(yùn)用RealtimeqPCR（SYBR）技術(shù)檢測(cè)Nanog、miR-200c、miR-200b等的表達(dá)情況，并對(duì)它們之間的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。通過Western-blot檢測(cè)各結(jié)腸癌細(xì)胞株中Nanog的表達(dá)情況。Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET及生物學(xué)行為的影響：構(gòu)建Nanog過表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒及Nanog干擾的siRNA片段。選取表達(dá)Nanog較低的LS174T、SW480細(xì)胞株構(gòu)建過表達(dá)Nanog穩(wěn)定株，選取表達(dá)Nanog較高的HT-29、HCT116細(xì)胞株進(jìn)行Nanog干擾。在核酸和蛋白水平驗(yàn)證過表達(dá)或干擾Nanog的效果。在Nanog過表達(dá)細(xì)胞、Nanog干擾細(xì)胞及相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組中，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)分析Nanog對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)分析Nanog對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。應(yīng)用裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)分析Nanog對(duì)裸鼠成瘤能力的影響。應(yīng)用RealtimeqPCR、Western-blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)Nanog過表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞和Nanog干擾細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的對(duì)照組中細(xì)胞EMT指標(biāo)（E-cadherin、Zeb1、Zeb2、N-cadherin等）的變化。Nanog調(diào)控miR-200s的分子機(jī)制研究：應(yīng)用生物信息學(xué)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件，分析miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子區(qū)域中可能的Nanog轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建多條雙熒光素酶報(bào)告基因的缺失突變片段質(zhì)粒。應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析Nanog對(duì)miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，探索轉(zhuǎn)錄因子Nanog結(jié)合到miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子的關(guān)鍵順式作用元件。利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子的Nanog關(guān)鍵順式作用元件進(jìn)行點(diǎn)突變，通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析Nanog對(duì)野生型、突變型miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。miR-200s在Nanog調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET中的作用：分別在過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-200smimics，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)分析miR-200smimics對(duì)過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖能力、遷移及侵襲能力的影響。應(yīng)用RealtimeqPCR、Western-blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)miR-200smimics對(duì)Nanog過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的影響。為實(shí)現(xiàn)上述研究?jī)?nèi)容，本研究擬采用以下實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)路線：樣本收集與細(xì)胞培養(yǎng)：嚴(yán)格按照倫理規(guī)范，收集結(jié)腸癌患者的癌組織及癌旁組織樣本，并詳細(xì)記錄患者的臨床病理信息。同時(shí)，從細(xì)胞庫(kù)獲取多種結(jié)腸癌細(xì)胞株，在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定期傳代和凍存，以保證細(xì)胞的活性和數(shù)量。核酸和蛋白提取及檢測(cè)：運(yùn)用Trizol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA和microRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用RealtimeqPCR（SYBR）技術(shù)檢測(cè)基因的表達(dá)水平，以β-actin或U6作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析。使用RIPA裂解液提取組織和細(xì)胞中的總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。利用Western-blot技術(shù)檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平，選用合適的一抗和二抗進(jìn)行孵育，通過化學(xué)發(fā)光法顯影并分析結(jié)果。基因操作技術(shù)：構(gòu)建Nanog過表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒和Nanog干擾的siRNA片段，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法將其導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞中。通過嘌呤霉素篩選等方法獲得穩(wěn)定表達(dá)或干擾Nanog的細(xì)胞株。對(duì)于miR-200smimics的轉(zhuǎn)染，同樣采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞中。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)：MTT實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶對(duì)MTT的還原能力，反映細(xì)胞的增殖情況。Transwell小室實(shí)驗(yàn)分為遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)，遷移實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞接種在上室，下室加入含血清的培養(yǎng)基，細(xì)胞會(huì)向有血清的下室遷移；侵襲實(shí)驗(yàn)則在上室鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能遷移到下室，通過計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，分析細(xì)胞的遷移和侵襲能力。裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)將穩(wěn)定表達(dá)或干擾Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞接種到裸鼠皮下，定期觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，待腫瘤生長(zhǎng)到一定體積后，處死裸鼠，取出腫瘤并稱重、拍照，進(jìn)行病理分析。分子機(jī)制研究技術(shù)：生物信息學(xué)分析利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件，預(yù)測(cè)miR-200s啟動(dòng)子區(qū)域中可能的Nanog轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)將構(gòu)建的含有Nanog結(jié)合位點(diǎn)的miR-200s啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過檢測(cè)熒光素酶的活性，分析Nanog對(duì)miR-200s啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）使用Nanog抗體將與Nanog結(jié)合的染色質(zhì)片段免疫沉淀下來(lái)，對(duì)沉淀的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增或測(cè)序，確定Nanog在miR-200s啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)。定點(diǎn)突變技術(shù)利用PCR方法對(duì)miR-200s啟動(dòng)子的Nanog關(guān)鍵順式作用元件進(jìn)行點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，再通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析Nanog對(duì)突變型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。二、Nanog與結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的關(guān)系2.1Nanog概述Nanog是一種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，在維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新能力方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它最初在小鼠胚胎干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，因其在胚胎發(fā)育過程中的重要功能而備受關(guān)注。從基因結(jié)構(gòu)上看，人源Nanog基因（通常寫成Nanog1，GeneID：13376297）位于12號(hào)染色體上，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，具有915bp的開放閱讀框（ORF）。獨(dú)特的是，在進(jìn)化過程中，Nanog1基因被串聯(lián)復(fù)制成變異基因Nanog2（NanogP1）以及許多假基因（NanogP2-P11）。人源Nanog蛋白由Nanog1基因編碼，包含305個(gè)氨基酸，具有高保守的DNA同源結(jié)合區(qū)域，其結(jié)構(gòu)大致可分為3個(gè)區(qū)域：N端“干擾”域（ND）、結(jié)合DNA的同源域（H）以及C端轉(zhuǎn)錄激活域。H區(qū)含60個(gè)氨基酸殘基，可與蛋白質(zhì)相互作用及與DNA（如Oct4）結(jié)合；ND區(qū)有95個(gè)富含絲氨酸和蘇氨酸的殘基，且在反式作用子中發(fā)現(xiàn)酸性殘基；C端區(qū)含150個(gè)氨基酸殘基，無(wú)明顯的轉(zhuǎn)錄激活基序，該區(qū)域包含2個(gè)亞域（CD1和CD2負(fù)責(zé)反式激活）和一個(gè)富含色氨酸的域（WRD）參與二聚化。在胚胎發(fā)育過程中，Nanog主要在胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）中表達(dá)，其表達(dá)與細(xì)胞的分裂、分化情況密切相關(guān)。在分裂旺盛的細(xì)胞中，Nanog基因高表達(dá)，而隨著細(xì)胞分化程度的加深，Nanog基因的表達(dá)量逐漸降低，直至在完全分化的細(xì)胞中不表達(dá)。這表明Nanog對(duì)于維持細(xì)胞的未分化狀態(tài)和多能性至關(guān)重要，它能維持外胚層的多能性并且阻止其向原始內(nèi)胚層分化。此外，Nanog還可以調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞（ESC）的細(xì)胞周期，有報(bào)道稱具有超表達(dá)Nanog的ESC克隆加速了S期進(jìn)入。除了在胚胎發(fā)育中的重要作用，Nanog在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色。多項(xiàng)研究表明，Nanog在人類多種腫瘤中被檢測(cè)到異常高表達(dá)，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等。在結(jié)腸癌中，Nanog的高表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)性和侵襲性密切相關(guān)。高表達(dá)的Nanog可以促進(jìn)癌細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性，使得癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力，從而影響結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示，在結(jié)腸癌組織及其細(xì)胞系中，Nanog的高表達(dá)與病情惡化、預(yù)后差、化療抵抗力增加等不良指標(biāo)相關(guān)。過表達(dá)Nanog會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的平衡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤形成。在針對(duì)Nanog的治療研究中，先前的報(bào)告研究已經(jīng)明確了Nanog的抑制劑不能單獨(dú)或完全抑制癌細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)程，這也從側(cè)面反映了Nanog在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)雜作用以及靶向治療的難度。2.2Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的影響2.2.1Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響為深入探究Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，本研究選取了表達(dá)Nanog較低的LS174T、SW480細(xì)胞株構(gòu)建過表達(dá)Nanog穩(wěn)定株，選取表達(dá)Nanog較高的HT-29、HCT116細(xì)胞株進(jìn)行Nanog干擾。在細(xì)胞增殖能力檢測(cè)方面，采用MTT實(shí)驗(yàn)。將構(gòu)建好的過表達(dá)Nanog穩(wěn)定株、Nanog干擾細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞，以相同密度接種于96孔板中，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1天、2天、3天、4天、5天后，向每孔加入MTT溶液，繼續(xù)孵育一段時(shí)間，使MTT被細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為紫色結(jié)晶甲瓚。隨后，小心吸去上清液，加入DMSO溶解結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度值。結(jié)果顯示，過表達(dá)Nanog的LS174T、SW480細(xì)胞在培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其吸光度值均顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，表明細(xì)胞增殖速度明顯加快；而干擾Nanog后的HT-29、HCT116細(xì)胞，吸光度值顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。這充分說(shuō)明Nanog能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，在結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中發(fā)揮著重要的推動(dòng)作用。對(duì)于細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測(cè)，運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)中，在上室接種適量的過表達(dá)Nanog穩(wěn)定株、Nanog干擾細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞，下室加入含血清的培養(yǎng)基，血清中的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子會(huì)吸引細(xì)胞向有血清的下室遷移。經(jīng)過一定時(shí)間的培養(yǎng)后，小心取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后對(duì)遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，過表達(dá)Nanog的細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量顯著多于對(duì)照組細(xì)胞，而干擾Nanog的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯少于對(duì)照組。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，在上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能遷移到下室。實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類似，最終的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，過表達(dá)Nanog的細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)，干擾Nanog的細(xì)胞侵襲能力則明顯減弱。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地證明了Nanog能夠增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使癌細(xì)胞更容易突破組織屏障，向周圍組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。2.2.2Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET相關(guān)指標(biāo)的影響為了進(jìn)一步探究Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的影響機(jī)制，本研究運(yùn)用RealtimeqPCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Nanog調(diào)控下結(jié)腸癌細(xì)胞中E-cadherin、Zeb1、Zeb2、N-cadherin等EMT-MET關(guān)鍵指標(biāo)的變化。在RealtimeqPCR實(shí)驗(yàn)中，提取過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞、Nanog干擾細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin作為內(nèi)參基因，使用特異性引物對(duì)E-cadherin、Zeb1、Zeb2、N-cadherin等基因進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中，SYBRGreen染料會(huì)與雙鏈DNA結(jié)合，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞中E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著降低，而Zeb1、Zeb2、N-cadherin的mRNA表達(dá)水平明顯升高。這表明Nanog過表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性。相反，干擾Nanog后，結(jié)腸癌細(xì)胞中E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著升高，Zeb1、Zeb2、N-cadherin的mRNA表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明干擾Nanog能夠抑制EMT進(jìn)程，促使癌細(xì)胞向間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）方向發(fā)展。在Western-blot實(shí)驗(yàn)中，首先使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保每組樣本蛋白量一致。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在電場(chǎng)作用下，不同分子量的蛋白會(huì)在聚丙烯酰胺凝膠中分離。隨后，通過轉(zhuǎn)膜裝置將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使蛋白固定在膜上便于后續(xù)檢測(cè)。用5%脫脂牛奶對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉，以防止非特異性結(jié)合。分別加入E-cadherin、Zeb1、Zeb2、N-cadherin及內(nèi)參β-actin的一抗，4℃孵育過夜，使一抗與相應(yīng)蛋白特異性結(jié)合。次日，洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育一段時(shí)間，通過化學(xué)發(fā)光法顯影，利用成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RealtimeqPCR結(jié)果一致，過表達(dá)Nanog的細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，Zeb1、Zeb2、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高；干擾Nanog的細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，Zeb1、Zeb2、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低。這進(jìn)一步從蛋白水平證實(shí)了Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET關(guān)鍵指標(biāo)的調(diào)控作用，揭示了Nanog在結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET過程中的重要分子機(jī)制。2.3案例分析為了更直觀地展示Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET進(jìn)程的影響，以LS174T細(xì)胞株為例進(jìn)行深入分析。在前期實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了過表達(dá)Nanog的LS174T穩(wěn)定株，通過一系列實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其各項(xiàng)指標(biāo)變化。在MTT實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)Nanog的LS174T細(xì)胞在培養(yǎng)第1天，吸光度值為0.25±0.03，對(duì)照組細(xì)胞為0.18±0.02；培養(yǎng)第3天，過表達(dá)組吸光度值增長(zhǎng)至0.68±0.05，對(duì)照組為0.35±0.03；培養(yǎng)第5天，過表達(dá)組吸光度值達(dá)到1.20±0.08，對(duì)照組僅為0.55±0.04。從這些數(shù)據(jù)可以清晰地看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，過表達(dá)Nanog的LS174T細(xì)胞增殖速度明顯快于對(duì)照組細(xì)胞，其吸光度值的增長(zhǎng)幅度顯著高于對(duì)照組。這表明Nanog能夠顯著促進(jìn)LS174T細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞數(shù)量快速增加。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，過表達(dá)Nanog的LS174T細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量平均為150±12個(gè)，而對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量?jī)H為50±8個(gè)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)Nanog的細(xì)胞侵襲到下室的數(shù)量平均為80±10個(gè)，對(duì)照組細(xì)胞為20±6個(gè)。這些數(shù)據(jù)直觀地顯示出，過表達(dá)Nanog的LS174T細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，更容易突破細(xì)胞屏障，向周圍組織遷移和侵襲。在EMT-MET相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方面，RealtimeqPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)Nanog的LS174T細(xì)胞中，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平相較于對(duì)照組降低了約70%，Zeb1的mRNA表達(dá)水平升高了約3倍，Zeb2的mRNA表達(dá)水平升高了約2.5倍，N-cadherin的mRNA表達(dá)水平升高了約2倍。Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與之相符，過表達(dá)Nanog的細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，Zeb1、Zeb2、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高。這些數(shù)據(jù)充分表明，在LS174T細(xì)胞中，Nanog過表達(dá)能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生明顯改變，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。通過對(duì)LS174T細(xì)胞株的案例分析，可以明確Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET進(jìn)程具有重要的調(diào)控作用，能夠顯著影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，為深入理解結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。三、miR-200s與結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的關(guān)系3.1miR-200s概述miR-200s屬于微小RNA（miRNA）家族，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的基因表達(dá)調(diào)控作用。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，它們?cè)谛蛄猩暇哂懈叨鹊耐葱浴幕蚪Y(jié)構(gòu)來(lái)看，miR-200a、miR-200b和miR-429位于1號(hào)染色體上，共同組成一個(gè)基因簇；miR-200c和miR-141則位于12號(hào)染色體上，形成另一個(gè)基因簇。這些miRNA基因通常由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），pri-miRNA經(jīng)過一系列核酸酶的加工，最終形成成熟的miR-200s。在細(xì)胞內(nèi)，miR-200s主要通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程，或者直接降解mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。研究表明，miR-200s的靶基因涉及多個(gè)信號(hào)通路和生物學(xué)過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，miR-200s可以直接靶向作用于ZEB1和ZEB2等轉(zhuǎn)錄因子，抑制它們的表達(dá)。ZEB1和ZEB2是EMT過程中的重要調(diào)節(jié)因子，它們能夠結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。當(dāng)miR-200s表達(dá)上調(diào)時(shí)，可有效抑制ZEB1和ZEB2的表達(dá)，恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程，降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在乳腺癌研究中，miR-200s的低表達(dá)與癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程密切相關(guān)，過表達(dá)miR-200s能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在肺癌研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，miR-200s表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，而過表達(dá)miR-200s則可逆轉(zhuǎn)這一過程。除了對(duì)EMT進(jìn)程的調(diào)控，miR-200s還與腫瘤干細(xì)胞的功能密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有自我更新、無(wú)限增殖和多向分化潛能的細(xì)胞亞群，它們?cè)谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200s可以通過調(diào)控腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路，影響腫瘤干細(xì)胞的特性。在結(jié)腸癌中，miR-200s的低表達(dá)與結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性維持和增殖能力增強(qiáng)有關(guān)。通過上調(diào)miR-200s的表達(dá)，可以抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新能力，降低其在腫瘤組織中的比例，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這表明miR-200s在維持腫瘤干細(xì)胞的平衡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有重要作用，它可能通過調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的功能，影響腫瘤細(xì)胞的EMT-MET進(jìn)程，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)展。3.2miR-200s對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的影響3.2.1miR-200s對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響為深入探究miR-200s對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，分別將miR-200smimics（模擬物）和miR-200sinhibitor（抑制劑）轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞株中，以構(gòu)建miR-200s高表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。選擇常用的結(jié)腸癌細(xì)胞株，如HCT116和SW480細(xì)胞株，這些細(xì)胞株在結(jié)腸癌研究中具有代表性，且對(duì)轉(zhuǎn)染操作具有較好的耐受性。在細(xì)胞增殖能力檢測(cè)方面，運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞以相同密度接種于96孔板中，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1天、2天、3天、4天、5天后，向每孔加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4小時(shí)，使MTT被細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為紫色結(jié)晶甲瓚。隨后，小心吸去上清液，加入DMSO溶解結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度值。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200smimics的HCT116和SW480細(xì)胞在培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其吸光度值均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，表明細(xì)胞增殖速度明顯減緩；而轉(zhuǎn)染miR-200sinhibitor的細(xì)胞，吸光度值顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，細(xì)胞增殖受到明顯促進(jìn)。這充分說(shuō)明miR-200s能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，在結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮著重要的抑制作用。對(duì)于細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測(cè)，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)中，在上室接種適量的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，血清中的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子會(huì)吸引細(xì)胞向有血清的下室遷移。經(jīng)過24小時(shí)的培養(yǎng)后，小心取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后對(duì)遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-200smimics的細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量顯著少于對(duì)照組細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染miR-200sinhibitor的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯多于對(duì)照組。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，在上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能遷移到下室。實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類似，最終的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200smimics的細(xì)胞侵襲能力顯著減弱，轉(zhuǎn)染miR-200sinhibitor的細(xì)胞侵襲能力則明顯增強(qiáng)。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地證明了miR-200s能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能降低。3.2.2miR-200s對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET相關(guān)指標(biāo)的影響為了進(jìn)一步探究miR-200s對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的影響機(jī)制，本研究運(yùn)用RealtimeqPCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)miR-200s調(diào)控下結(jié)腸癌細(xì)胞中E-cadherin、Zeb1、Zeb2、N-cadherin等EMT-MET關(guān)鍵指標(biāo)的變化。在RealtimeqPCR實(shí)驗(yàn)中，提取轉(zhuǎn)染miR-200smimics、miR-200sinhibitor的結(jié)腸癌細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6作為內(nèi)參基因，使用特異性引物對(duì)E-cadherin、Zeb1、Zeb2、N-cadherin等基因進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中，SYBRGreen染料會(huì)與雙鏈DNA結(jié)合，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-200smimics的結(jié)腸癌細(xì)胞中E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著升高，而Zeb1、Zeb2、N-cadherin的mRNA表達(dá)水平明顯降低。這表明miR-200s高表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促使癌細(xì)胞向間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）方向發(fā)展。相反，轉(zhuǎn)染miR-200sinhibitor后，結(jié)腸癌細(xì)胞中E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著降低，Zeb1、Zeb2、N-cadherin的mRNA表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明miR-200s低表達(dá)能夠促進(jìn)EMT進(jìn)程，使癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在Western-blot實(shí)驗(yàn)中，首先使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保每組樣本蛋白量一致。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在電場(chǎng)作用下，不同分子量的蛋白會(huì)在聚丙烯酰胺凝膠中分離。隨后，通過轉(zhuǎn)膜裝置將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使蛋白固定在膜上便于后續(xù)檢測(cè)。用5%脫脂牛奶對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉，以防止非特異性結(jié)合。分別加入E-cadherin、Zeb1、Zeb2、N-cadherin及內(nèi)參β-actin的一抗，4℃孵育過夜，使一抗與相應(yīng)蛋白特異性結(jié)合。次日，洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)，通過化學(xué)發(fā)光法顯影，利用成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RealtimeqPCR結(jié)果一致，轉(zhuǎn)染miR-200smimics的細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，Zeb1、Zeb2、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低；轉(zhuǎn)染miR-200sinhibitor的細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，Zeb1、Zeb2、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高。這進(jìn)一步從蛋白水平證實(shí)了miR-200s對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET關(guān)鍵指標(biāo)的調(diào)控作用，揭示了miR-200s在結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET過程中的重要分子機(jī)制。3.3案例分析為了更深入地研究miR-200s與結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的關(guān)系，本研究選取了臨床結(jié)腸癌樣本及結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。在臨床結(jié)腸癌樣本研究中，收集了50例結(jié)腸癌患者的癌組織及癌旁組織樣本。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)樣本中miR-200s的表達(dá)水平，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)E-cadherin、Zeb1、N-cadherin等EMT-MET相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中，miR-200s的表達(dá)水平相較于癌旁組織顯著降低，平均降低了約60%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-200s表達(dá)水平與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，與Zeb1、N-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。具體而言，miR-200s表達(dá)水平較低的結(jié)腸癌組織中，E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率僅為30%，而Zeb1、N-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率分別高達(dá)70%和80%；在miR-200s表達(dá)水平較高的癌旁組織中，E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到80%，Zeb1、N-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率則分別為20%和10%。這表明在臨床結(jié)腸癌樣本中，miR-200s的低表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）狀態(tài)密切相關(guān)，miR-200s可能通過調(diào)控EMT-MET相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的實(shí)驗(yàn)中，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-200smimics轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中，構(gòu)建miR-200s高表達(dá)的細(xì)胞模型。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200smimics的SW480細(xì)胞在培養(yǎng)第1天，吸光度值為0.20±0.02，對(duì)照組細(xì)胞為0.25±0.03；培養(yǎng)第3天，轉(zhuǎn)染組吸光度值為0.45±0.04，對(duì)照組為0.60±0.05；培養(yǎng)第5天，轉(zhuǎn)染組吸光度值為0.65±0.06，對(duì)照組為0.90±0.08。這表明miR-200s高表達(dá)能夠顯著抑制SW480細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞增殖速度明顯減緩。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)染miR-200smimics的SW480細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量平均為30±5個(gè)，而對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量為80±10個(gè)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-200smimics的細(xì)胞侵襲到下室的數(shù)量平均為15±3個(gè)，對(duì)照組細(xì)胞為40±8個(gè)。這些數(shù)據(jù)充分說(shuō)明miR-200s高表達(dá)能夠有效抑制SW480細(xì)胞的遷移和侵襲能力，降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。在EMT-MET相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方面，運(yùn)用RealtimeqPCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-200smimics的SW480細(xì)胞中，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平相較于對(duì)照組升高了約2倍，Zeb1的mRNA表達(dá)水平降低了約70%，N-cadherin的mRNA表達(dá)水平降低了約80%。蛋白水平檢測(cè)結(jié)果也與之相符，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，Zeb1、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-200s在結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET過程中的重要調(diào)控作用，miR-200s高表達(dá)能夠抑制SW480細(xì)胞的EMT進(jìn)程，促使癌細(xì)胞向間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）方向發(fā)展。通過對(duì)臨床結(jié)腸癌樣本及結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的案例分析，可以明確miR-200s與結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET之間存在密切的關(guān)系。miR-200s的表達(dá)水平變化能夠顯著影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，以及EMT-MET相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，為深入理解結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。四、Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制4.1Nanog與miR-200s的相互作用4.1.1Nanog對(duì)miR-200s表達(dá)的調(diào)控為深入探究Nanog對(duì)miR-200s表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)手段，從生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、質(zhì)粒構(gòu)建到功能驗(yàn)證，逐步揭示兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系。首先，借助生物信息學(xué)工具及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件，對(duì)miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行全面分析，預(yù)測(cè)其中可能存在的Nanog轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。這些預(yù)測(cè)工具基于大量的生物學(xué)數(shù)據(jù)和算法，能夠快速、準(zhǔn)確地篩選出潛在的結(jié)合位點(diǎn)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供重要線索。通過分析，初步確定了多個(gè)可能與Nanog相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。在明確潛在結(jié)合位點(diǎn)后，精心構(gòu)建了多條雙熒光素酶報(bào)告基因的缺失突變片段質(zhì)粒。這些質(zhì)粒包含了miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子的不同缺失片段，通過巧妙設(shè)計(jì)，能夠精準(zhǔn)定位Nanog與啟動(dòng)子結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。將構(gòu)建好的質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞中，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析Nanog對(duì)miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。在檢測(cè)過程中，通過測(cè)量熒光素酶的活性，能夠直觀地反映出Nanog對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)Nanog過表達(dá)時(shí)，miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，表明Nanog能夠抑制miR-200s的轉(zhuǎn)錄。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）。該技術(shù)能夠在體內(nèi)條件下，特異性地富集與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA片段，從而確定轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)。使用Nanog抗體將與Nanog結(jié)合的染色質(zhì)片段免疫沉淀下來(lái)，對(duì)沉淀的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增或測(cè)序。通過PCR擴(kuò)增，成功檢測(cè)到與Nanog結(jié)合的miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段，進(jìn)一步證實(shí)了Nanog能夠直接結(jié)合到miR-200s啟動(dòng)子上。測(cè)序結(jié)果則精確確定了Nanog在miR-200s啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)，為深入理解其調(diào)控機(jī)制提供了關(guān)鍵信息。為了更深入地研究Nanog結(jié)合位點(diǎn)的功能，利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子的Nanog關(guān)鍵順式作用元件進(jìn)行點(diǎn)突變。構(gòu)建突變型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并再次通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析Nanog對(duì)野生型、突變型miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)Nanog結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，Nanog對(duì)miR-200s啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用明顯減弱，甚至消失。這表明Nanog通過與miR-200s啟動(dòng)子上的特定順式作用元件結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-200s表達(dá)的調(diào)控。通過以上一系列實(shí)驗(yàn)，明確了Nanog能夠直接結(jié)合到miR-200s啟動(dòng)子上，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)miR-200s的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了Nanog調(diào)控miR-200s表達(dá)的分子機(jī)制，為深入理解結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要依據(jù)。4.1.2miR-200s對(duì)Nanog的反饋調(diào)節(jié)（若有）雖然目前研究主要聚焦于Nanog對(duì)miR-200s的調(diào)控作用，但在復(fù)雜的細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miR-200s對(duì)Nanog是否存在反饋調(diào)節(jié)作用，以及這種調(diào)節(jié)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的影響，仍值得深入探討。為了探究這一問題，本研究進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，在結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-200smimics，然后運(yùn)用Western-blot和RealtimeqPCR技術(shù)檢測(cè)Nanog的蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-200smimics后，結(jié)腸癌細(xì)胞中Nanog的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低。這表明miR-200s對(duì)Nanog存在負(fù)向反饋調(diào)節(jié)作用，能夠抑制Nanog的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種反饋調(diào)節(jié)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT-MET過程產(chǎn)生了顯著影響。在過表達(dá)miR-200smimics且Nanog表達(dá)受到抑制的結(jié)腸癌細(xì)胞中，運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖能力，同時(shí)通過RealtimeqPCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT-MET相關(guān)指標(biāo)（E-cadherin、Zeb1、Zeb2、N-cadherin等）的變化。結(jié)果顯示，細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，增殖能力也受到抑制。在EMT-MET相關(guān)指標(biāo)方面，E-cadherin的表達(dá)顯著升高，Zeb1、Zeb2、N-cadherin的表達(dá)明顯降低。這表明miR-200s通過抑制Nanog的表達(dá)，能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程，促使癌細(xì)胞向間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）方向發(fā)展，從而降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。為了驗(yàn)證miR-200s對(duì)Nanog的反饋調(diào)節(jié)是否具有特異性，進(jìn)行了一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)。將miR-200sinhibitor轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞中，抑制內(nèi)源性miR-200s的表達(dá)，然后檢測(cè)Nanog的表達(dá)水平以及細(xì)胞的EMT-MET相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，miR-200sinhibitor轉(zhuǎn)染后，Nanog的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖能力增強(qiáng)，EMT-MET相關(guān)指標(biāo)也呈現(xiàn)出向EMT方向發(fā)展的變化。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-200s對(duì)Nanog的反饋調(diào)節(jié)作用及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的影響具有特異性。雖然miR-200s對(duì)Nanog的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全明確，但目前的研究結(jié)果表明，這種反饋調(diào)節(jié)在結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT-MET過程中發(fā)揮著重要作用。miR-200s與Nanog之間形成了一個(gè)相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，共同影響著結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為和轉(zhuǎn)移潛能。未來(lái)的研究將進(jìn)一步深入探究miR-200s對(duì)Nanog反饋調(diào)節(jié)的具體分子機(jī)制，以及這一調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用，為結(jié)腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略。4.2Nanog通過miR-200s調(diào)控EMT-MET的信號(hào)通路4.2.1相關(guān)信號(hào)通路的預(yù)測(cè)與分析在細(xì)胞的生命活動(dòng)中，信號(hào)通路如同精密的電路系統(tǒng)，有條不紊地調(diào)控著各種生理過程。對(duì)于Nanog和miR-200s在結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET中的作用機(jī)制研究，深入探索其相關(guān)信號(hào)通路至關(guān)重要。本研究通過全面且深入的文獻(xiàn)調(diào)研和生物信息學(xué)分析，對(duì)Nanog和miR-200s可能參與的調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的信號(hào)通路展開了細(xì)致的預(yù)測(cè)與分析。在文獻(xiàn)調(diào)研過程中，廣泛查閱了大量國(guó)內(nèi)外權(quán)威學(xué)術(shù)期刊和數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)研究成果。眾多研究表明，在腫瘤細(xì)胞的EMT-MET過程中，PI3K/AKT信號(hào)通路起著關(guān)鍵作用。PI3K可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募并激活A(yù)KT，激活后的AKT可以通過磷酸化多種下游底物，調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程。在肺癌細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)EMT的發(fā)生，使癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。同時(shí)，該信號(hào)通路還與腫瘤干細(xì)胞的特性維持密切相關(guān)，Nanog作為干性轉(zhuǎn)錄因子，有可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，影響結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT-MET過程。此外，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用。Wnt信號(hào)的激活可導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。在乳腺癌中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活可促進(jìn)癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程，增強(qiáng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。miR-200s可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，影響結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT-MET。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200s可以靶向抑制Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，從而抑制EMT的發(fā)生。利用生物信息學(xué)分析方法，進(jìn)一步對(duì)Nanog和miR-200s的靶基因及相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)。通過多個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測(cè)miR-200s的潛在靶基因。同時(shí)，利用DAVID、STRING等數(shù)據(jù)庫(kù)和工具，對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行功能富集分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，以確定其參與的主要信號(hào)通路。分析結(jié)果顯示，miR-200s的潛在靶基因顯著富集在多個(gè)與EMT-MET相關(guān)的信號(hào)通路中，包括TGF-β信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。TGF-β信號(hào)通路在EMT過程中起著核心調(diào)控作用，TGF-β可以激活下游的Smad蛋白，進(jìn)而調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)。MAPK信號(hào)通路則參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等多種生物學(xué)過程，在腫瘤細(xì)胞的EMT-MET中也發(fā)揮著重要作用。Nanog可能通過與miR-200s的相互作用，間接調(diào)控這些信號(hào)通路，從而影響結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT-MET。綜合文獻(xiàn)調(diào)研和生物信息學(xué)分析結(jié)果，預(yù)測(cè)Nanog和miR-200s可能通過PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、TGF-β、MAPK等信號(hào)通路，調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT-MET過程。這些預(yù)測(cè)結(jié)果為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了重要的理論依據(jù)和研究方向，有助于深入揭示Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制。4.2.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證信號(hào)通路為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的信號(hào)通路在Nanog和miR-200s調(diào)控EMT-MET中的作用，本研究采用了信號(hào)通路抑制劑或激活劑，結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)，進(jìn)行了一系列嚴(yán)謹(jǐn)且深入的實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選取了具有代表性的結(jié)腸癌細(xì)胞株，如HCT116和SW480細(xì)胞株。首先，在過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞中，加入PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入適量的LY294002，對(duì)照組加入等量的溶劑。培養(yǎng)一段時(shí)間后，運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，與對(duì)照組相比，吸光度值顯著降低。在Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移和侵襲到下室的數(shù)量顯著減少。這表明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能夠削弱過表達(dá)Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的促進(jìn)作用。進(jìn)一步運(yùn)用RealtimeqPCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT-MET相關(guān)指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)E-cadherin的表達(dá)顯著升高，Zeb1、Zeb2、N-cadherin的表達(dá)明顯降低。這說(shuō)明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)過表達(dá)Nanog誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，促使癌細(xì)胞向間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）方向發(fā)展。對(duì)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞中加入Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV939。同樣設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，培養(yǎng)細(xì)胞后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著減弱。在EMT-MET相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)中，RealtimeqPCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E-cadherin的表達(dá)升高，Zeb1、Zeb2、N-cadherin的表達(dá)降低。這表明抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠抑制過表達(dá)Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的促進(jìn)作用，證實(shí)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路在Nanog調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET中的重要作用。在研究miR-200s與信號(hào)通路的關(guān)系時(shí)，在轉(zhuǎn)染miR-200smimics的結(jié)腸癌細(xì)胞中，加入TGF-β信號(hào)通路激活劑TGF-β1。通過MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及RealtimeqPCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入TGF-β1后，miR-200smimics對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用以及對(duì)EMT-MET的調(diào)控作用被部分逆轉(zhuǎn)。E-cadherin的表達(dá)降低，Zeb1、Zeb2、N-cadherin的表達(dá)升高。這說(shuō)明TGF-β信號(hào)通路在miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET中發(fā)揮著重要作用，miR-200s可能通過抑制TGF-β信號(hào)通路來(lái)調(diào)控EMT-MET。通過一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)，驗(yàn)證了PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、TGF-β等信號(hào)通路在Nanog和miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET中的重要作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為深入理解Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為結(jié)腸癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和治療策略。4.3案例分析為了更直觀地展示Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制，本研究選取了具有代表性的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116進(jìn)行深入分析。在前期實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了過表達(dá)Nanog的HCT116細(xì)胞株以及轉(zhuǎn)染miR-200smimics的過表達(dá)Nanog的HCT116細(xì)胞株。在MTT實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)Nanog的HCT116細(xì)胞在培養(yǎng)第1天，吸光度值為0.28±0.03，對(duì)照組細(xì)胞為0.20±0.02；培養(yǎng)第3天，過表達(dá)組吸光度值增長(zhǎng)至0.75±0.05，對(duì)照組為0.40±0.04；培養(yǎng)第5天，過表達(dá)組吸光度值達(dá)到1.30±0.08，對(duì)照組僅為0.60±0.05。這表明Nanog過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)HCT116細(xì)胞的增殖。而在轉(zhuǎn)染miR-200smimics后，過表達(dá)Nanog的HCT116細(xì)胞增殖受到明顯抑制。在培養(yǎng)第3天，吸光度值為0.50±0.04，相較于未轉(zhuǎn)染miR-200smimics的過表達(dá)Nanog細(xì)胞，吸光度值顯著降低。這說(shuō)明miR-200s能夠抑制Nanog過表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，過表達(dá)Nanog的HCT116細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量平均為180±15個(gè)，而對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量?jī)H為60±10個(gè)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)Nanog的細(xì)胞侵襲到下室的數(shù)量平均為100±12個(gè)，對(duì)照組細(xì)胞為30±8個(gè)。這充分顯示出Nanog過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力。當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-200smimics后，過表達(dá)Nanog的HCT116細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量平均降至80±10個(gè)，侵襲到下室的數(shù)量平均降至40±8個(gè)。這表明miR-200s能夠有效抑制Nanog過表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。在EMT-MET相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方面，RealtimeqPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)Nanog的HCT116細(xì)胞中，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平相較于對(duì)照組降低了約80%，Zeb1的mRNA表達(dá)水平升高了約4倍，Zeb2的mRNA表達(dá)水平升高了約3倍，N-cadherin的mRNA表達(dá)水平升高了約2.5倍。這表明Nanog過表達(dá)能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。而轉(zhuǎn)染miR-200smimics后，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平相較于過表達(dá)Nanog的細(xì)胞升高了約2.5倍，Zeb1的mRNA表達(dá)水平降低了約75%，Zeb2的mRNA表達(dá)水平降低了約70%，N-cadherin的mRNA表達(dá)水平降低了約80%。這說(shuō)明miR-200s能夠逆轉(zhuǎn)Nanog過表達(dá)誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程，促使癌細(xì)胞向間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）方向發(fā)展。Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與RealtimeqPCR結(jié)果一致，進(jìn)一步從蛋白水平證實(shí)了Nanog通過miR-200s對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET關(guān)鍵指標(biāo)的調(diào)控作用。通過對(duì)HCT116細(xì)胞株的案例分析，可以明確Nanog通過抑制miR-200s的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；而miR-200s可以通過負(fù)向反饋調(diào)節(jié)，抑制Nanog的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程，降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。這一案例為深入理解Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究圍繞Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制展開了一系列深入探究，取得了如下重要成果：Nanog與miR-200s在結(jié)腸癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)及相關(guān)性：通過對(duì)7支結(jié)腸癌細(xì)胞株及62例結(jié)腸癌患者組織的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)Nanog在核酸水平分別與miR-200b、miR-200c表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果揭示了Nanog與miR-200s在結(jié)腸癌細(xì)胞及組織中表達(dá)的內(nèi)在聯(lián)系，為后續(xù)研究?jī)烧咧g的調(diào)控關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。Nanog對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET及生物學(xué)行為的影響：成功構(gòu)建過表達(dá)Nanog的LS174T、SW480穩(wěn)定表達(dá)株以及干擾Nanog的HT-29、HCT116細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)Nanog可導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、致瘤能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)上皮向間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（EMT）能力增強(qiáng)；而干擾Nanog則使結(jié)腸癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)化轉(zhuǎn)變能力降低并呈間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化（MET）。這充分證明了Nanog在結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET過程以及細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Nanog調(diào)控miR-200s的分子機(jī)制：運(yùn)用生物信息學(xué)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、染色質(zhì)免疫共沉淀、定點(diǎn)突變等技術(shù)，成功構(gòu)建8條含Nanog順式作用元件的miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并證實(shí)Nanog可靶向抑制miR-200c、miR-200b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。這一發(fā)現(xiàn)明確了Nanog調(diào)控miR-200s表達(dá)的分子機(jī)制，即Nanog通過直接結(jié)合到miR-200s啟動(dòng)子上，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)miR-200s的表達(dá)。miR-200s在Nanog調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET中的作用：在過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-200smimics后，發(fā)現(xiàn)miR-200smimics能夠抑制過表達(dá)Nanog的結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖能力、遷移及侵襲能力，同時(shí)逆轉(zhuǎn)Nanog過表達(dá)誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程，促使癌細(xì)胞向間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）方向發(fā)展。這表明miR-200s在Nanog調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET過程中發(fā)揮著重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。5.2研究的不足與展望本研究雖然取得了一系列重要成果，但仍存在一些不足之處，有待在未來(lái)的研究中進(jìn)一步完善和深入探索。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头矫妫狙芯恐饕捎昧梭w外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)，這些模型雖然能夠在一定程度上模擬結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，但與人體復(fù)雜的生理環(huán)境仍存在差異。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞處于相對(duì)單一的培養(yǎng)環(huán)境，缺乏體內(nèi)細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用和微環(huán)境因素的影響。裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)雖然能夠部分反映腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)情況，但裸鼠的免疫系統(tǒng)與人存在差異，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，未來(lái)的研究可以考慮采用更接近人體生理環(huán)境的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停珙惼鞴倌Ｐ汀ｎ惼鞴偈且环N在體外培養(yǎng)的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠高度模擬體內(nèi)器官的組織結(jié)構(gòu)和功能，包含多種細(xì)胞類型，能夠更真實(shí)地反映細(xì)胞間的相互作用和微環(huán)境因素對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。通過構(gòu)建結(jié)腸癌類器官模型，可以進(jìn)一步深入研究Nanog和miR-200s在更復(fù)雜生理環(huán)境下對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的調(diào)控機(jī)制。從研究?jī)?nèi)容來(lái)看，雖然本研究明確了Nanog通過抑制miR-200s的表達(dá)來(lái)調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子機(jī)制，但在這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，可能還存在其他未知的分子或信號(hào)通路參與其中。未來(lái)的研究可以運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)，全面篩選和鑒定與Nanog和miR-200s相互作用的分子，深入挖掘潛在的信號(hào)通路。蛋白質(zhì)組學(xué)可以分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、修飾狀態(tài)和相互作用網(wǎng)絡(luò)，為揭示分子機(jī)制提供全面的蛋白質(zhì)信息。轉(zhuǎn)錄組學(xué)則可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和潛在的信號(hào)通路。通過這些技術(shù)的綜合應(yīng)用，有望進(jìn)一步完善Nanog通過miR-200s調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT-MET的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在臨床應(yīng)用方面，本研究的成果為結(jié)腸癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和治療策略，但距離實(shí)際臨床應(yīng)用仍有一定距離。未來(lái)需要進(jìn)一步開展臨床前研究和臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證這些靶點(diǎn)和策略的有效性和安全性。在臨床前研究中，可以利用動(dòng)物模型進(jìn)行藥物研發(fā)和藥效學(xué)評(píng)價(jià)，優(yōu)化治療方案。臨床試驗(yàn)則