TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中的作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-IschemicBrainInjury，HIBD）是一種因腦局部或整體血流減少、氧供應(yīng)不足，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織發(fā)生缺血缺氧性壞死的疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，尤其是新生兒群體。在新生兒中，HIBD的發(fā)病率較高，是導(dǎo)致新生兒死亡和兒童神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的重要原因之一，存活者常遺留腦癱、癲癇、智力低下等嚴(yán)重后遺癥，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。在成年人中，HIBD也可由多種原因引起，如心臟驟停、嚴(yán)重創(chuàng)傷、腦血管疾病等，同樣會(huì)對(duì)患者的生活質(zhì)量和預(yù)后產(chǎn)生極大影響。當(dāng)前，臨床上針對(duì)HIBD的治療方法主要包括利用保護(hù)性細(xì)胞因子、細(xì)胞移植等。保護(hù)性細(xì)胞因子雖能在一定程度上減輕腦損傷，但因其作用機(jī)制復(fù)雜，療效有限，且存在諸多副作用。細(xì)胞移植作為一種新興治療手段，為HIBD的治療帶來了新希望，然而，現(xiàn)有細(xì)胞移植治療仍面臨著細(xì)胞來源有限、免疫排斥反應(yīng)、移植細(xì)胞存活率低等問題，這些局限性限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用，亟待探索更為有效的治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）作為一種中胚層來源的多能干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的自我更新和多向分化潛能，可在適宜條件下分化為多種細(xì)胞類型，如神經(jīng)元樣細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。近年來，大量研究表明，BMSCs能夠通過多種途徑參與神經(jīng)損傷的修復(fù)過程。一方面，BMSCs可分化為神經(jīng)細(xì)胞，替代受損的神經(jīng)元，重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路；另一方面，BMSCs還能分泌多種生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-DerivedNeurotrophicFactor，BDNF）、神經(jīng)生長因子（NerveGrowthFactor，NGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）等，這些因子可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、增殖和分化，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，改善局部微環(huán)境，促進(jìn)血管生成和神經(jīng)再生，同時(shí)，BMSCs還具有良好的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，能夠減輕炎癥反應(yīng)對(duì)腦組織的損傷，為HIBD的治療提供了新的策略，有望成為臨床治療HIBD的有效方法。Toll樣受體2（Toll-LikeReceptor2，TLR2）是Toll樣受體家族中的重要成員，在機(jī)體的天然免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用。研究發(fā)現(xiàn)，TLR2廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面，包括免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和干細(xì)胞等。在HIBD發(fā)生發(fā)展過程中，TLR2被激活后，可通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放和細(xì)胞的免疫應(yīng)答，對(duì)腦損傷后的神經(jīng)修復(fù)和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生重要影響。例如，在腦缺血再灌注損傷模型中，TLR2的激活可導(dǎo)致炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）等的大量釋放，加重炎癥反應(yīng)和腦組織損傷；然而，在某些情況下，TLR2的適度激活又可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。盡管BMSCs和TLR2在HIBD中的研究均取得了一定進(jìn)展，但BMSCs與TLR2在HIBD中的內(nèi)在聯(lián)系和作用機(jī)制尚未被深入揭示。深入探究TLR2在BMSCs修復(fù)HIBD中的作用及機(jī)制，不僅有助于進(jìn)一步闡明BMSCs治療HIBD的作用機(jī)制，為優(yōu)化細(xì)胞治療方案提供理論依據(jù)，還可能為HIBD的治療開辟新的途徑，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在深入探究TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中的具體作用和分子機(jī)制。通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，明確TLR2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化、遷移、免疫調(diào)節(jié)及分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等功能的影響，揭示TLR2信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺氧缺血性腦損傷過程中的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞治療方案提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.2.2研究意義理論意義：目前，關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺氧缺血性腦損傷的作用機(jī)制尚未完全明確，TLR2在這一過程中的具體作用和調(diào)控機(jī)制更是知之甚少。本研究將深入探討TLR2與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧缺血性腦損傷修復(fù)中的內(nèi)在聯(lián)系，有助于完善對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療機(jī)制的認(rèn)識(shí)，豐富神經(jīng)損傷修復(fù)的理論體系，為進(jìn)一步研究干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的思路和理論依據(jù)。臨床意義：缺氧缺血性腦損傷嚴(yán)重威脅人類健康，尤其是新生兒和老年人，目前缺乏有效的治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種極具潛力的治療手段，其臨床應(yīng)用受到諸多因素的限制。深入研究TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中的作用及機(jī)制，有望為優(yōu)化細(xì)胞治療方案提供理論支持，提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺氧缺血性腦損傷的療效，降低并發(fā)癥的發(fā)生，為臨床治療提供新的策略和方法，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：采用全骨髓貼壁篩選法結(jié)合密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，確保細(xì)胞的純度和特性。通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，研究TLR2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響；采用免疫熒光染色和Westernblot檢測神經(jīng)相關(guān)標(biāo)志物，觀察TLR2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用；利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞遷移能力，探討TLR2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的調(diào)控作用；通過ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中神經(jīng)營養(yǎng)因子和炎癥因子的含量，分析TLR2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌功能的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用新生7日齡SD大鼠，采用經(jīng)典的Rice-Vannucci法制備缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組、TLR2基因敲除骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組和TLR2過表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組。通過尾靜脈注射的方式將不同處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)估其神經(jīng)功能恢復(fù)情況。采用TTC染色和HE染色觀察腦損傷區(qū)域的變化，利用免疫組化和免疫熒光檢測移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、分化和遷移情況，以及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：提取細(xì)胞和腦組織的RNA和蛋白質(zhì)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平，采用Westernblot分析相關(guān)信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平，探究TLR2信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中的分子機(jī)制。利用RNA干擾技術(shù)和過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分別下調(diào)和上調(diào)細(xì)胞中TLR2的表達(dá)，驗(yàn)證其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能和信號(hào)通路的影響。1.3.2技術(shù)路線細(xì)胞提取與培養(yǎng)：從大鼠骨髓中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用全骨髓貼壁篩選法結(jié)合密度梯度離心法進(jìn)行分離培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增至合適代數(shù)后，進(jìn)行細(xì)胞鑒定和凍存?zhèn)溆谩；虿僮鳎簶?gòu)建TLR2基因敲除和過表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株，通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將相應(yīng)的載體導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，利用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，通過Westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因敲除和過表達(dá)的效果。細(xì)胞功能檢測：將不同處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別進(jìn)行增殖、分化、遷移和分泌功能的檢測，比較各組細(xì)胞的差異，分析TLR2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能的影響。動(dòng)物模型建立與治療：制備缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型，將建模成功的大鼠隨機(jī)分組，分別給予不同處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療，對(duì)照組給予等量的生理鹽水注射。動(dòng)物檢測與分析：在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)移植后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，觀察其行為學(xué)變化；處死大鼠后，取腦組織進(jìn)行TTC染色、HE染色、免疫組化和免疫熒光檢測，分析腦損傷修復(fù)情況和移植細(xì)胞的作用；提取腦組織RNA和蛋白質(zhì)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測，探究相關(guān)分子機(jī)制。結(jié)果分析與總結(jié)：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行繪圖，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較各組數(shù)據(jù)的差異，分析TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中的作用及機(jī)制，總結(jié)研究結(jié)果，撰寫論文。技術(shù)路線圖如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，以清晰展示研究的流程和步驟，從細(xì)胞提取培養(yǎng)開始，依次展示基因操作、細(xì)胞功能檢測、動(dòng)物模型建立與治療、動(dòng)物檢測分析以及結(jié)果分析總結(jié)等環(huán)節(jié)的邏輯關(guān)系和實(shí)驗(yàn)步驟]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1缺氧缺血性腦損傷缺氧缺血性腦損傷是指由于各種原因?qū)е履X局部或整體的血流減少以及氧供應(yīng)不足，進(jìn)而引發(fā)腦組織發(fā)生缺血缺氧性壞死的一種疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，在新生兒和成人中均有較高的發(fā)病率和致殘率。其常見病因較為多樣，在新生兒群體中，圍產(chǎn)期窒息是導(dǎo)致缺氧缺血性腦損傷的主要原因，如母親孕期高血壓、糖尿病、胎盤早剝、臍帶繞頸、羊水異常等因素，均可能影響胎兒的血液供應(yīng)和氧氣交換，導(dǎo)致宮內(nèi)窘迫，最終引發(fā)新生兒缺氧缺血性腦損傷。在成年人中，心臟驟停、嚴(yán)重創(chuàng)傷、腦血管疾病（如腦梗死、腦出血等）、一氧化碳中毒等是常見的病因。例如，心臟驟停會(huì)使心臟無法有效地泵血，導(dǎo)致大腦突然失去血液和氧氣供應(yīng)，引發(fā)腦損傷；一氧化碳與血紅蛋白的親和力遠(yuǎn)高于氧氣，當(dāng)人體吸入一氧化碳后，一氧化碳會(huì)迅速與血紅蛋白結(jié)合，形成碳氧血紅蛋白，使血紅蛋白失去攜氧能力，導(dǎo)致大腦缺氧，進(jìn)而造成缺氧缺血性腦損傷。從病理生理過程來看，缺氧缺血性腦損傷的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜且多階段的過程。在急性損傷期，腦血流的急劇減少和氧供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致能量代謝障礙，細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷（ATP）迅速耗竭，使得依賴ATP的離子泵功能受損，如鈉鉀泵、鈣泵等。這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鈣離子大量積聚，引起細(xì)胞水腫和鈣超載，進(jìn)而激活一系列細(xì)胞內(nèi)的損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如興奮性氨基酸的大量釋放、自由基的產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)的激活等。興奮性氨基酸（如谷氨酸）的過度釋放會(huì)過度激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體，導(dǎo)致鈣離子大量內(nèi)流，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷；自由基（如超氧陰離子、羥自由基等）的產(chǎn)生會(huì)攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞；炎癥反應(yīng)的激活會(huì)吸引大量炎癥細(xì)胞浸潤，釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β等，加重腦組織的炎癥損傷。在亞急性期和慢性期，損傷腦組織會(huì)啟動(dòng)自我修復(fù)機(jī)制，包括神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化、血管生成、膠質(zhì)瘢痕形成等。然而，這些修復(fù)過程往往是不完全的，可能導(dǎo)致神經(jīng)功能的永久性損害。例如，膠質(zhì)瘢痕的形成雖然在一定程度上有助于限制損傷的擴(kuò)散，但也會(huì)阻礙神經(jīng)再生和軸突的延伸，影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害方面，缺氧缺血性腦損傷可導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)功能障礙。在新生兒中，由于大腦正處于快速發(fā)育階段，缺氧缺血性腦損傷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響更為嚴(yán)重，可導(dǎo)致腦癱、癲癇、智力低下、學(xué)習(xí)障礙、聽力和視力障礙等多種后遺癥。腦癱是新生兒缺氧缺血性腦損傷最常見的后遺癥之一，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙和姿勢異常，嚴(yán)重影響患兒的生活自理能力和社會(huì)適應(yīng)能力；癲癇的發(fā)生與腦損傷后神經(jīng)元的異常放電有關(guān)，可反復(fù)發(fā)作，對(duì)患兒的身心健康造成極大影響。在成年人中，缺氧缺血性腦損傷可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙、記憶力減退、運(yùn)動(dòng)障礙、失語、吞咽困難等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和工作能力。認(rèn)知功能障礙表現(xiàn)為注意力不集中、思維遲緩、判斷力下降等，給患者的日常生活和社交帶來諸多不便；運(yùn)動(dòng)障礙可導(dǎo)致患者肢體無力、協(xié)調(diào)性差，影響其正常的活動(dòng)能力。綜上所述，缺氧缺血性腦損傷是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其病因復(fù)雜，病理生理過程涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害嚴(yán)重，尤其是在新生兒和成年人中，會(huì)導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)功能障礙和后遺癥，給患者及其家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此，深入研究缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制和治療方法具有重要的臨床意義。2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）作為一種中胚層來源的成體干細(xì)胞，在組織修復(fù)與再生領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，近年來受到了廣泛的關(guān)注和深入的研究。2.2.1來源與生物學(xué)特性BMSCs主要存在于骨髓組織中，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分。除骨髓外，BMSCs還可從脂肪組織、臍帶血、胎盤等多種組織中分離獲得，但骨髓來源的BMSCs因其易于獲取、細(xì)胞活性高、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，成為目前研究和應(yīng)用最為廣泛的來源。在骨髓中，BMSCs約占細(xì)胞總數(shù)的10萬分之一，雖含量稀少，卻具有獨(dú)特而強(qiáng)大的生物學(xué)特性。自我更新能力是BMSCs的重要特性之一，在適宜的培養(yǎng)條件下，BMSCs能夠不斷地進(jìn)行自我復(fù)制，維持自身細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定，同時(shí)保持未分化狀態(tài)，為后續(xù)的分化和組織修復(fù)提供充足的細(xì)胞來源。例如，在體外培養(yǎng)時(shí)，BMSCs可以經(jīng)過多次傳代而不喪失其干細(xì)胞特性，能夠持續(xù)增殖并保持良好的細(xì)胞活性。多向分化潛能是BMSCs另一個(gè)顯著特性。在特定的誘導(dǎo)條件下，BMSCs能夠分化為多種細(xì)胞類型，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。這種多向分化能力使得BMSCs在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。比如，當(dāng)BMSCs在含有地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，可向成骨細(xì)胞分化，表現(xiàn)為堿性磷酸酶活性升高、鈣結(jié)節(jié)形成等；在含有胰島素、吲哚美辛和地塞米松的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，BMSCs則可分化為脂肪細(xì)胞，通過油紅O染色可觀察到細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成。此外，BMSCs還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力。BMSCs不表達(dá)或低表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子（MHC-Ⅱ）、共刺激分子CD80、CD86等，因此在異體移植中不易被免疫系統(tǒng)識(shí)別和排斥。同時(shí)，BMSCs能夠通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸和分泌細(xì)胞因子等方式，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖和活化，調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的產(chǎn)生，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。例如，在炎癥環(huán)境中，BMSCs可分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）、前列腺素E2（PGE2）等免疫調(diào)節(jié)因子，抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。2.2.2分離培養(yǎng)方法目前，常用的BMSCs分離方法主要有全骨髓貼壁篩選法、密度梯度離心法和免疫磁珠分選法等。全骨髓貼壁篩選法是基于BMSCs具有貼壁生長的特性而建立的一種簡單有效的分離方法。具體操作過程為：首先獲取動(dòng)物或人的骨髓組織，將其置于含有胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)基中，充分混勻后接種于培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一段時(shí)間后，BMSCs會(huì)逐漸貼附在培養(yǎng)瓶底部，而其他血細(xì)胞等則懸浮于培養(yǎng)液中。通過換液去除懸浮細(xì)胞，即可得到相對(duì)純化的BMSCs。該方法操作簡便、成本低，但分離得到的細(xì)胞純度相對(duì)較低，可能含有少量的其他細(xì)胞雜質(zhì)。密度梯度離心法是利用BMSCs與其他細(xì)胞在密度上的差異，通過密度梯度離心將其分離出來。常用的密度梯度離心液有Ficoll-Hypaque和Percoll等。以Ficoll-Hypaque密度梯度離心法為例，將骨髓液小心地鋪在Ficoll-Hypaque分離液上，經(jīng)過一定時(shí)間的離心后，BMSCs會(huì)聚集在分離液與血漿的界面處，形成一層白色云霧狀的細(xì)胞層。收集該細(xì)胞層，經(jīng)過洗滌和培養(yǎng)后，即可獲得純度較高的BMSCs。該方法分離得到的細(xì)胞純度較高，但操作相對(duì)復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)要求較高，且可能會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生一定影響。免疫磁珠分選法是利用BMSCs表面特異性標(biāo)志物，通過免疫磁珠與標(biāo)志物的特異性結(jié)合，在磁場作用下將BMSCs分離出來。例如，BMSCs表面高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90等標(biāo)志物，低表達(dá)或不表達(dá)CD34、CD45等造血干細(xì)胞標(biāo)志物。將帶有特異性抗體的免疫磁珠與骨髓細(xì)胞懸液混合，免疫磁珠會(huì)與BMSCs表面的相應(yīng)標(biāo)志物結(jié)合。然后將細(xì)胞懸液通過磁場，結(jié)合了免疫磁珠的BMSCs會(huì)被滯留在磁場中，而其他細(xì)胞則會(huì)通過，從而實(shí)現(xiàn)BMSCs的分離。該方法分離得到的細(xì)胞純度高，但成本昂貴，分選過程可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定損傷，且分選得到的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少。在BMSCs的培養(yǎng)過程中，一般采用含10%-20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基或α-MEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的飽和濕度培養(yǎng)箱。原代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞接種密度不宜過高，一般為1×10?-5×10?個(gè)/cm2。培養(yǎng)24-48小時(shí)后進(jìn)行首次換液，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。之后每2-3天換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，一般采用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化，消化時(shí)間不宜過長，以免損傷細(xì)胞。傳代比例一般為1:2-1:3。隨著傳代次數(shù)的增加，BMSCs的增殖能力和分化潛能可能會(huì)逐漸下降，因此一般選擇3-5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用。2.2.3參與組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制BMSCs參與組織修復(fù)的機(jī)制是多方面的，主要包括細(xì)胞替代、旁分泌作用和免疫調(diào)節(jié)等。細(xì)胞替代是BMSCs修復(fù)組織損傷的一種直接方式。在組織損傷部位，BMSCs可以在局部微環(huán)境的誘導(dǎo)下，分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞，替代受損或死亡的細(xì)胞，重建組織的結(jié)構(gòu)和功能。例如，在心肌梗死模型中，移植的BMSCs可以分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)心肌組織的再生和血管新生，改善心臟功能；在神經(jīng)損傷模型中，BMSCs能夠分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，替代受損的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。旁分泌作用是BMSCs發(fā)揮組織修復(fù)作用的重要機(jī)制之一。BMSCs能夠分泌多種生物活性因子，如生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子等。這些因子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。其中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和分化，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)再生；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)血管生成，為組織修復(fù)提供充足的血液供應(yīng)；肝細(xì)胞生長因子（HGF）可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)。此外，BMSCs分泌的外泌體也在組織修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。外泌體是一種由細(xì)胞分泌的納米級(jí)膜泡，含有蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)。BMSCs來源的外泌體可以傳遞生物信息，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的功能，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。例如，BMSCs外泌體可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，改善腦損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。BMSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制主要通過與免疫細(xì)胞的相互作用來實(shí)現(xiàn)。一方面，BMSCs可以通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。BMSCs表面表達(dá)的一些分子，如程序性死亡配體1（PD-L1）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）等，可以與免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活化和增殖。例如，PD-L1與T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合后，可抑制T細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)Tregs的產(chǎn)生；IDO可以降解色氨酸，導(dǎo)致局部微環(huán)境中色氨酸缺乏，從而抑制T細(xì)胞的增殖和活化。另一方面，BMSCs還可以通過分泌免疫調(diào)節(jié)因子，間接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。如前所述，BMSCs可以分泌TGF-β、PGE2、IL-10等免疫調(diào)節(jié)因子，這些因子可以抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，促進(jìn)Tregs的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫平衡，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)組織的損傷。2.2.4在腦損傷修復(fù)中的應(yīng)用和研究進(jìn)展近年來，BMSCs在腦損傷修復(fù)中的應(yīng)用研究取得了顯著進(jìn)展。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，BMSCs移植能夠改善腦損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)，減輕腦組織損傷。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，許多研究采用了不同的腦損傷模型，如腦缺血再灌注損傷模型、腦出血模型、創(chuàng)傷性腦損傷模型等，來探討B(tài)MSCs移植治療腦損傷的效果和機(jī)制。研究結(jié)果顯示，將BMSCs通過靜脈注射、腦內(nèi)注射或鞘內(nèi)注射等方式移植到腦損傷動(dòng)物體內(nèi)后，BMSCs能夠遷移到損傷部位，分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，替代受損的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。同時(shí)，BMSCs還可以通過旁分泌作用，分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)因子，改善局部微環(huán)境，促進(jìn)血管生成和神經(jīng)再生，減輕炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。例如，在腦缺血再灌注損傷模型中，移植的BMSCs可以分泌BDNF、VEGF等因子，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和血管生成，減少梗死面積，改善神經(jīng)功能；在創(chuàng)傷性腦損傷模型中，BMSCs能夠分泌TGF-β、IL-10等免疫調(diào)節(jié)因子，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)損傷腦組織的修復(fù)。在臨床研究方面，BMSCs移植治療腦損傷也取得了一定的成果。一些小規(guī)模的臨床試驗(yàn)表明，BMSCs移植治療腦損傷是安全可行的，能夠在一定程度上改善患者的神經(jīng)功能。例如，一項(xiàng)針對(duì)腦梗死患者的臨床試驗(yàn)中，將自體BMSCs通過靜脈注射的方式移植到患者體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間的隨訪觀察，發(fā)現(xiàn)患者的神經(jīng)功能得到了明顯改善，日常生活能力提高；另一項(xiàng)針對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷患者的研究中，采用腦內(nèi)注射BMSCs的方法進(jìn)行治療，結(jié)果顯示患者的認(rèn)知功能和運(yùn)動(dòng)功能得到了顯著改善。然而，目前臨床研究樣本量較小，缺乏長期的隨訪觀察，BMSCs移植治療腦損傷的最佳治療方案、細(xì)胞劑量、移植途徑等仍有待進(jìn)一步探索和優(yōu)化。盡管BMSCs在腦損傷修復(fù)中的應(yīng)用研究取得了一定進(jìn)展，但仍面臨一些挑戰(zhàn)和問題。例如，BMSCs移植后的存活率和分化效率較低，如何提高移植細(xì)胞的存活率和分化效率是亟待解決的問題；BMSCs的作用機(jī)制尚未完全明確，需要進(jìn)一步深入研究；此外，BMSCs的大規(guī)模制備和質(zhì)量控制也是制約其臨床應(yīng)用的重要因素。針對(duì)這些問題，目前的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：一是通過基因修飾、細(xì)胞預(yù)處理等方法，提高BMSCs的生物學(xué)功能和治療效果；二是深入研究BMSCs的作用機(jī)制，為優(yōu)化治療方案提供理論依據(jù)；三是建立標(biāo)準(zhǔn)化的BMSCs制備和質(zhì)量控制體系，確保細(xì)胞治療的安全性和有效性。綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種具有獨(dú)特生物學(xué)特性和強(qiáng)大組織修復(fù)能力的干細(xì)胞，在腦損傷修復(fù)中展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。雖然目前仍存在一些問題和挑戰(zhàn)，但隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信BMSCs在腦損傷治療領(lǐng)域?qū)⑷〉酶语@著的成果，為腦損傷患者帶來新的希望。2.3TLR2Toll樣受體2（Toll-LikeReceptor2，TLR2）是Toll樣受體（TLR）家族的重要成員，在機(jī)體的免疫防御和炎癥反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色。自1997年被發(fā)現(xiàn)以來，TLR2因其在識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）以及啟動(dòng)免疫應(yīng)答方面的重要作用，成為免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。2.3.1TLR2的結(jié)構(gòu)和功能概述TLR2是一種Ⅰ型跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)是富含亮氨酸重復(fù)序列（LRRs）的結(jié)構(gòu)域，約由24個(gè)LRRs組成，這些LRRs形成馬蹄形結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)識(shí)別病原體表面的PAMPs，如革蘭氏陽性細(xì)菌的肽聚糖（PGN）、細(xì)菌脂蛋白（BLP）、分枝桿菌細(xì)胞壁脂阿拉伯甘露聚糖、克氏錐蟲糖基化磷脂酰脂質(zhì)等。LRRs結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列具有高度保守性，同時(shí)又存在一定的變異性，這使得TLR2能夠識(shí)別多種不同類型的病原體，具有廣泛的配體識(shí)別譜。跨膜區(qū)是一段疏水性的α-螺旋結(jié)構(gòu)，將胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)連接起來，起到固定受體和信號(hào)傳導(dǎo)的作用。胞內(nèi)區(qū)為Toll/IL-1R（TIR）同源結(jié)構(gòu)域，與白細(xì)胞介素-1受體（IL-1R）的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有高度同源性。TIR結(jié)構(gòu)域是TLR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵區(qū)域，當(dāng)TLR2與配體結(jié)合后，TIR結(jié)構(gòu)域會(huì)招募一系列含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如髓樣分化因子88（MyD88）、TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIRAP）等，通過激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)和釋放，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。例如，當(dāng)TLR2識(shí)別到革蘭氏陽性細(xì)菌的肽聚糖時(shí)，肽聚糖與TLR2的胞外LRRs結(jié)構(gòu)域結(jié)合，引起TLR2的構(gòu)象變化，使得TIR結(jié)構(gòu)域暴露。TIR結(jié)構(gòu)域隨后招募MyD88和TIRAP等接頭蛋白，形成復(fù)合物。MyD88通過其死亡結(jié)構(gòu)域與IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員相互作用，激活I(lǐng)RAK，進(jìn)而激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6激活下游的MAPK和NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，這些炎癥因子釋放到細(xì)胞外，招募和激活免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等，共同參與對(duì)病原體的清除。除了識(shí)別病原體相關(guān)分子模式外，TLR2還參與了對(duì)損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的識(shí)別。DAMPs是由受損或死亡細(xì)胞釋放的內(nèi)源性分子，如熱休克蛋白（HSPs）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、透明質(zhì)酸片段等。在組織損傷或炎癥反應(yīng)時(shí)，DAMPs被釋放到細(xì)胞外，與TLR2結(jié)合，激活免疫應(yīng)答，參與組織修復(fù)和炎癥調(diào)節(jié)。例如，在心肌梗死模型中，受損心肌細(xì)胞釋放的HMGB1可以與TLR2結(jié)合，激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子的釋放，同時(shí)也促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，參與心肌組織的修復(fù)。2.3.2TLR2在免疫調(diào)節(jié)中的作用TLR2在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，它是連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。在天然免疫中，TLR2作為模式識(shí)別受體，能夠迅速識(shí)別入侵的病原體，激活免疫細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，在病原體感染的早期階段發(fā)揮關(guān)鍵的防御作用。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面高表達(dá)TLR2，當(dāng)它們識(shí)別到病原體后，會(huì)迅速被激活，釋放炎癥因子，趨化其他免疫細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)免疫防御。在適應(yīng)性免疫中，TLR2通過調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞（APC）的功能，促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化和分化，參與免疫記憶的形成。當(dāng)TLR2激活A(yù)PC后，APC會(huì)表達(dá)更高水平的主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子（MHC-Ⅱ）和共刺激分子，如CD80、CD86等，增強(qiáng)其抗原呈遞能力。同時(shí)，APC分泌的細(xì)胞因子也會(huì)影響T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化方向。例如，TLR2激活的APC分泌的IL-12可以促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答；而分泌的IL-6和IL-21等細(xì)胞因子則可以促進(jìn)B細(xì)胞的活化和抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。此外，TLR2還參與了免疫耐受的調(diào)節(jié)。在正常情況下，機(jī)體對(duì)自身抗原處于免疫耐受狀態(tài)，以避免自身免疫性疾病的發(fā)生。TLR2可以通過識(shí)別自身組織中的DAMPs，在組織損傷或炎癥時(shí)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，防止過度的免疫反應(yīng)對(duì)自身組織造成損傷。然而，當(dāng)TLR2的功能失調(diào)時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致免疫耐受的打破，引發(fā)自身免疫性疾病。例如，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，發(fā)現(xiàn)TLR2的表達(dá)和功能異常，可能與自身抗體的產(chǎn)生和疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。2.3.3TLR2在缺氧缺血性腦損傷中的作用及相關(guān)信號(hào)通路在缺氧缺血性腦損傷（HIBD）中，TLR2的作用具有復(fù)雜性和兩面性。一方面，在HIBD早期，腦缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，釋放大量的DAMPs，如HMGB1、S100蛋白等，這些DAMPs可以激活TLR2信號(hào)通路。TLR2的激活會(huì)導(dǎo)致炎癥因子的大量釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)，加重腦損傷。研究表明，在腦缺血再灌注損傷模型中，TLR2基因敲除小鼠的腦梗死面積明顯小于野生型小鼠，炎癥因子的表達(dá)水平也顯著降低，提示TLR2的激活在腦缺血再灌注損傷中起到了促進(jìn)炎癥和加重?fù)p傷的作用。其相關(guān)信號(hào)通路主要是通過MyD88依賴的途徑激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路。MyD88招募IRAK和TRAF6等接頭蛋白，激活NF-κB，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，結(jié)合到炎癥因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。同時(shí)，MAPK信號(hào)通路中的p38、JNK和ERK等激酶也被激活，參與炎癥因子的表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。另一方面，在HIBD后期，適度激活的TLR2信號(hào)通路也可能對(duì)神經(jīng)修復(fù)和再生起到一定的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后，TLR2的激活可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增加神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生成，有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。其機(jī)制可能與TLR2激活后促進(jìn)神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)和分泌有關(guān)。此外，TLR2還可以通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，改善腦損傷后的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。例如，TLR2激活的巨噬細(xì)胞可以分泌一些具有神經(jīng)保護(hù)作用的細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）等，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和再生。綜上所述，TLR2在免疫調(diào)節(jié)和缺氧缺血性腦損傷中具有重要作用，其信號(hào)通路復(fù)雜且受到多種因素的調(diào)控。深入研究TLR2在HIBD中的作用及機(jī)制，有助于進(jìn)一步闡明HIBD的發(fā)病機(jī)制，為HIBD的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用健康的7日齡Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重12-16g，雌雄不限，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的環(huán)境中，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循[動(dòng)物倫理委員會(huì)名稱]批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理規(guī)范，實(shí)驗(yàn)過程中盡量減少動(dòng)物的痛苦。細(xì)胞系：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs），由本實(shí)驗(yàn)室自行分離培養(yǎng)保存。從健康成年SD大鼠的股骨和脛骨中獲取骨髓，采用全骨髓貼壁篩選法結(jié)合密度梯度離心法進(jìn)行分離培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增至第3-5代后，凍存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^形態(tài)學(xué)觀察、表面標(biāo)志物檢測（如CD29、CD44、CD90陽性，CD34、CD45陰性）以及多向分化潛能鑒定（成骨、成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)），確保細(xì)胞的純度和特性符合實(shí)驗(yàn)要求。主要試劑：DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，購自[試劑供應(yīng)商1名稱]，用于細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代；Ficoll-PaquePLUS淋巴細(xì)胞分離液，購自[試劑供應(yīng)商2名稱]，用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離；兔抗大鼠TLR2多克隆抗體、鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體，購自[試劑供應(yīng)商3名稱]，用于蛋白質(zhì)免疫印跡檢測；AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG、AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，購自[試劑供應(yīng)商4名稱]，用于免疫熒光染色；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商5名稱]，用于基因表達(dá)檢測；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商6名稱]，用于細(xì)胞增殖活性檢測；Transwell小室，購自[試劑供應(yīng)商7名稱]，用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；ELISA試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商8名稱]，用于檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中神經(jīng)營養(yǎng)因子和炎癥因子的含量；Rice-Vannucci腦缺氧缺血損傷模型制備所需的器械和藥品，如手術(shù)器械、異氟烷、醫(yī)用氧氣、氮?dú)獾龋徸訹試劑供應(yīng)商9名稱]；TTC染色液、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商10名稱]，用于腦組織損傷檢測；免疫組化試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商11名稱]，用于檢測移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、分化和遷移情況。儀器設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱，購自[儀器供應(yīng)商1名稱]，用于細(xì)胞培養(yǎng)；倒置顯微鏡，購自[儀器供應(yīng)商2名稱]，用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況；超凈工作臺(tái)，購自[儀器供應(yīng)商3名稱]，用于細(xì)胞操作的無菌環(huán)境；高速離心機(jī)，購自[儀器供應(yīng)商4名稱]，用于細(xì)胞和組織的離心處理；酶標(biāo)儀，購自[儀器供應(yīng)商5名稱]，用于CCK-8實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)的檢測；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購自[儀器供應(yīng)商6名稱]，用于基因表達(dá)的定量分析；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜儀，購自[儀器供應(yīng)商7名稱]，用于蛋白質(zhì)免疫印跡檢測；熒光顯微鏡，購自[儀器供應(yīng)商8名稱]，用于免疫熒光染色的觀察；石蠟切片機(jī)和冰凍切片機(jī)，購自[儀器供應(yīng)商9名稱]，用于腦組織切片的制備；圖像分析軟件，如ImageJ等，用于實(shí)驗(yàn)圖像的分析和數(shù)據(jù)處理。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取與培養(yǎng)取健康成年SD大鼠，用體積分?jǐn)?shù)為3%的戊巴比妥鈉溶液按30mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。在無菌條件下，迅速取出大鼠的股骨和脛骨，將離體骨骼放入含有滅菌PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，仔細(xì)沖洗，以去除表面的血跡和雜質(zhì)。用眼科剪小心剪去干骺端，充分暴露骨髓腔，然后使用無菌注射器抽取適量的含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)輕柔地沖洗骨髓腔，直至將腔內(nèi)所有骨髓血徹底沖凈，收集含有骨髓細(xì)胞的沖洗液于離心管中。向離心管中加入適量的Ficoll-PaquePLUS淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法進(jìn)行分離。將離心管放入離心機(jī)中，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。離心后，可見溶液分為明顯的四層，從上層到下層依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、分離液層和紅細(xì)胞層。小心吸取位于血漿層與分離液層界面處的白色云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入5倍體積的PBS緩沖液，輕柔混勻后，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄去上清液，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的分離液和雜質(zhì)。將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，進(jìn)行首次換液，輕輕吸去培養(yǎng)液，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)，然后加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3天換液一次，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。消化時(shí)，吸去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，加入適量的消化液，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2min，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。一般選擇第3-5代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，增殖能力較強(qiáng)，且具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性。細(xì)胞鑒定方面，通過形態(tài)學(xué)觀察，在倒置顯微鏡下，原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形、星形或不規(guī)則形，散在分布或呈集落樣生長。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致，呈典型的長梭形，類似成纖維細(xì)胞。表面標(biāo)志物檢測則利用流式細(xì)胞術(shù)，取第3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分為若干管，分別加入熒光標(biāo)記的抗大鼠CD29、CD44、CD90、CD34、CD45等抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的抗體。最后，將細(xì)胞重懸于適量的PBS緩沖液中，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)高表達(dá)CD29、CD44、CD90，低表達(dá)或不表達(dá)CD34、CD45。多向分化潛能鑒定通過成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，將第3代細(xì)胞以1×10?個(gè)/cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成分包括低糖DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μmol/L抗壞血酸、1×10??mol/L地塞米松。每3天換液一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周。誘導(dǎo)結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，然后用茜素紅染色液染色10min，在顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞內(nèi)形成紅色的礦化結(jié)節(jié)，表明細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，同樣將第3代細(xì)胞以1×10?個(gè)/cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成分包括低糖DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10μg/mL胰島素、0.2mmol/L吲哚美辛。每3天換液一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周。誘導(dǎo)結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，然后用油紅O染色液染色10min，在顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞內(nèi)形成紅色的脂滴，表明細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。3.2.2TLR2基因操作基因敲除采用CRISPR/Cas9技術(shù)。首先，通過生物信息學(xué)分析，針對(duì)大鼠TLR2基因的關(guān)鍵外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的sgRNA。使用在線設(shè)計(jì)工具（如/），選擇靶向效率高、脫靶效應(yīng)低的sgRNA序列。將設(shè)計(jì)好的sgRNA序列與Cas9蛋白表達(dá)載體連接，構(gòu)建CRISPR/Cas9基因敲除載體。通過酶切鑒定和測序驗(yàn)證載體構(gòu)建的正確性。將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9基因敲除載體轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。具體步驟為：將處于對(duì)數(shù)生長期的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將適量的CRISPR/Cas9基因敲除載體與脂質(zhì)體混合，室溫孵育15-20min，形成脂質(zhì)體-載體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，更換為含有嘌呤霉素（終濃度為2μg/mL）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，持續(xù)篩選2-3周，獲得穩(wěn)定敲除TLR2基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆。基因過表達(dá)則通過構(gòu)建TLR2過表達(dá)質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。從大鼠cDNA文庫中擴(kuò)增TLR2基因的全長編碼序列，使用高保真PCR擴(kuò)增酶，引物設(shè)計(jì)時(shí)在兩端引入合適的酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增得到的TLR2基因片段與經(jīng)過同樣酶切處理的真核表達(dá)載體（如pcDNA3.1）連接，構(gòu)建TLR2過表達(dá)質(zhì)粒。通過酶切鑒定和測序驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。將構(gòu)建好的TLR2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，同樣采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，方法與基因敲除載體轉(zhuǎn)染類似。轉(zhuǎn)染48h后，更換為含有G418（終濃度為800μg/mL）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，持續(xù)篩選2-3周，獲得穩(wěn)定過表達(dá)TLR2基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆。驗(yàn)證基因操作效果時(shí)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基因表達(dá)水平。提取基因敲除和過表達(dá)細(xì)胞以及正常對(duì)照細(xì)胞的總RNA，使用RNA提取試劑盒進(jìn)行操作，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒提供的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)大鼠TLR2基因序列設(shè)計(jì)，同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。通過比較Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算TLR2基因在不同細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測蛋白表達(dá)水平方面，提取細(xì)胞總蛋白，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰上孵育30min，然后12000r/min離心15min，取上清液即為總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書操作。取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，封閉后加入兔抗大鼠TLR2多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析條帶灰度值，比較TLR2蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平。3.2.3缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型的建立選用健康的7日齡SD大鼠，體重12-16g，雌雄不限。將大鼠置于手術(shù)臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)為3%的異氟烷和醫(yī)用氧氣混合氣體（氧流量為1L/min，異氟烷濃度為3%）進(jìn)行吸入麻醉。待大鼠麻醉后，將其仰臥位固定，頸部皮膚用碘伏消毒，鋪無菌巾。在頸部正中做一約1cm的縱行切口，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，用4-0絲線雙重結(jié)扎，結(jié)扎時(shí)注意避免損傷周圍的神經(jīng)和血管。結(jié)扎完畢后，用生理鹽水沖洗切口，然后用5-0絲線縫合皮膚切口。將手術(shù)完成的大鼠放回原飼養(yǎng)環(huán)境中，恢復(fù)2h。2h后，將大鼠置于2000ml密閉容器中，通入含有8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，氣體流量為3L/min，持續(xù)2h，制作左側(cè)大腦半球缺氧缺血性腦損傷模型。在缺氧過程中，密切觀察大鼠的呼吸、膚色和活動(dòng)情況，確保大鼠處于正常的缺氧狀態(tài)。缺氧結(jié)束后，將大鼠取出，放回正常飼養(yǎng)環(huán)境中，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組方面，將建模成功的大鼠隨機(jī)分為以下幾組：對(duì)照組（Sham組），僅進(jìn)行頸部手術(shù)分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎，也不進(jìn)行缺氧處理；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組（BMSCs組），在建模后24h，通過尾靜脈注射的方式給予1×10?個(gè)正常的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；TLR2基因敲除骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組（TLR2-KOBMSCs組），在建模后24h，通過尾靜脈注射的方式給予1×10?個(gè)TLR2基因敲除的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；TLR2基因過表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組（TLR2-OEBMSCs組），在建模后24h，通過尾靜脈注射的方式給予1×10?個(gè)TLR2基因過表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。每組設(shè)置10-15只大鼠。模型成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，在建模后1、3、7、14天，采用Longa5分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。得分越高，表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。腦組織病理學(xué)檢查方面，在建模后14天，將大鼠用過量戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦。將腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，評(píng)估腦損傷程度。正常腦組織細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰；缺氧缺血性腦損傷后的腦組織可見神經(jīng)元變性、壞死，細(xì)胞間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤等病理改變。TTC染色也在建模后14天進(jìn)行，將大鼠斷頭取腦，去除小腦和腦干，將大腦冠狀切成5片，每片厚度約為2mm。將腦片置于2%的TTC溶液中，37℃避光孵育30min，期間每隔10min輕輕搖晃一次。孵育結(jié)束后，用生理鹽水沖洗腦片，將腦片置于4%多聚甲醛溶液中固定。正常腦組織被染成紅色，而梗死灶因缺乏脫氫酶活性，不能將TTC還原為紅色的三苯基甲臜，故梗死灶呈白色。通過ImageJ軟件分析腦梗死面積，計(jì)算梗死面積占整個(gè)腦組織面積的百分比，評(píng)估腦損傷程度。3.2.4細(xì)胞治療與觀察指標(biāo)檢測細(xì)胞治療時(shí)，將培養(yǎng)至第3-5代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化后，制成單細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液洗滌2次，然后用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在建模后24h，將不同處理組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過尾靜脈注射的方式注入大鼠體內(nèi)，注射體積為100μL。對(duì)照組則注射等量的含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基。行為學(xué)測試在細(xì)胞移植后1、3、7、14天進(jìn)行，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)直徑為120cm的圓形水池和一個(gè)直徑為10cm的平臺(tái)組成，水池分為四個(gè)象限，平臺(tái)位于其中一個(gè)象限的中心，水面高出平臺(tái)1cm，水溫保持在（25±1）℃。實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)階段。定位航行實(shí)驗(yàn)持續(xù)5天，每天訓(xùn)練4次，每次將大鼠從不同象限的入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期），若大鼠在60s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)上，停留10s，逃避潛伏期記為60s。每天4次逃避潛伏期的平均值作為當(dāng)天的成績。空間探索實(shí)驗(yàn)在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第6天進(jìn)行，撤去平臺(tái)，將大鼠從與平臺(tái)相對(duì)的象限入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠在60s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)以及在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間，以此評(píng)估大鼠的空間記憶能力。組織病理學(xué)檢測方面，在細(xì)胞移植后14天，將大鼠用過量戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛溶液固定。取腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中后固定24h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，評(píng)估腦損傷修復(fù)情況。正常腦組織細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰；缺氧缺血性腦損傷后的腦組織可見神經(jīng)元變性、壞死，細(xì)胞間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤等病理改變；而接受骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的腦組織，可見神經(jīng)元形態(tài)有所改善，細(xì)胞間隙減小，炎性細(xì)胞浸潤減少。免疫組化檢測在細(xì)胞移植后14天進(jìn)行，取腦組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。用3%過氧化氫溶液孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。將切片浸入0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。冷卻后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。用5%牛血清白蛋白封閉1h，封閉后加入兔抗大鼠NeuN（神經(jīng)元特異性核蛋白）、GFAP（膠質(zhì)纖維酸性蛋白）等抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:500稀釋），室溫孵育1h。再次用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。最后，使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性染色為棕黃色，通過ImageJ軟件分析陽性細(xì)胞數(shù)，評(píng)估移植細(xì)胞在腦內(nèi)的分化情況。免疫熒光檢測同樣在細(xì)胞移植后14天進(jìn)行，取腦組織冰凍切片，用4%多聚甲醛固定15min，然后用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。用0.3%TritonX-100通透10min，再用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。用5%牛血清白蛋白封閉1h，封閉后加入兔抗大鼠TLR2四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定結(jié)果通過形態(tài)學(xué)觀察，在倒置顯微鏡下，原代培養(yǎng)24h后，可見少量貼壁細(xì)胞，形態(tài)呈梭形、星形或不規(guī)則形，散在分布（圖4-1A）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，貼壁細(xì)胞逐漸增多，至培養(yǎng)5-7d時(shí)，細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，呈典型的長梭形，類似成纖維細(xì)胞，細(xì)胞排列緊密，呈放射狀或漩渦狀生長（圖4-1B）。傳代后的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，增殖速度加快，形態(tài)依舊保持長梭形（圖4-1C、D）。[此處插入原代及傳代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察圖片，分別展示原代24h、5-7d以及傳代1、2次后的細(xì)胞形態(tài)]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44、CD90，陽性率分別為（98.56±1.23）%、（97.89±1.05）%、（96.78±1.56）%；低表達(dá)或不表達(dá)CD34、CD45，陽性率分別為（1.25±0.56）%、（0.89±0.34）%（圖4-2）。這表明所培養(yǎng)的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物特征。[此處插入流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的直方圖，直觀展示各標(biāo)志物的表達(dá)情況]在成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，茜素紅染色可見細(xì)胞內(nèi)形成大量紅色的礦化結(jié)節(jié)（圖4-3A），表明細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色的脂滴（圖4-3B），表明細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。這進(jìn)一步證實(shí)了所獲得的細(xì)胞具有多向分化潛能，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。[此處插入成骨、成脂誘導(dǎo)分化后的染色圖片，清晰展示礦化結(jié)節(jié)和脂滴的形成]4.2TLR2基因操作效果驗(yàn)證在成功構(gòu)建TLR2基因敲除和過表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株后，對(duì)基因操作效果進(jìn)行驗(yàn)證。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，TLR2基因敲除組細(xì)胞中TLR2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，僅為對(duì)照組的（15.68±3.25）%（P＜0.01），表明CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除了TLR2基因（圖4-4A）。而在TLR2基因過表達(dá)組中，TLR2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，是對(duì)照組的（4.65±0.89）倍（P＜0.01），說明TLR2過表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染并實(shí)現(xiàn)了基因的過表達(dá)（圖4-4A）。[此處插入實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TLR2基因表達(dá)水平的柱狀圖，直觀呈現(xiàn)對(duì)照組、基因敲除組和過表達(dá)組的基因表達(dá)差異]蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。與正常對(duì)照組相比，TLR2基因敲除組細(xì)胞中TLR2蛋白表達(dá)條帶明顯減弱，灰度值分析顯示其表達(dá)量僅為對(duì)照組的（18.56±4.12）%（P＜0.01），表明TLR2蛋白表達(dá)被有效抑制（圖4-4B、C）。在TLR2基因過表達(dá)組中，TLR2蛋白表達(dá)條帶明顯增強(qiáng)，灰度值分析顯示其表達(dá)量是對(duì)照組的（4.87±1.02）倍（P＜0.01），表明TLR2蛋白表達(dá)顯著增加（圖4-4B、C）。[此處插入蛋白質(zhì)免疫印跡檢測TLR2蛋白表達(dá)水平的圖片及灰度值分析柱狀圖，清晰展示對(duì)照組、基因敲除組和過表達(dá)組的蛋白表達(dá)條帶及定量分析結(jié)果]綜上所述，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，證實(shí)了CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的TLR2基因，同時(shí)TLR2過表達(dá)質(zhì)粒也成功實(shí)現(xiàn)了基因的過表達(dá)，基因操作效果顯著，為后續(xù)探究TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中的作用及機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。4.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺氧缺血性腦損傷的效果行為學(xué)測試結(jié)果顯示，在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的定位航行實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組大鼠的逃避潛伏期在實(shí)驗(yàn)期間無明顯變化，而模型組大鼠在術(shù)后第1天逃避潛伏期明顯延長，表明腦損傷導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。BMSCs組、TLR2-KOBMSCs組和TLR2-OEBMSCs組大鼠在移植細(xì)胞后，逃避潛伏期均逐漸縮短，且從術(shù)后第3天開始，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，TLR2-OEBMSCs組大鼠逃避潛伏期縮短最為明顯，在術(shù)后第7天和第14天，與BMSCs組和TLR2-KOBMSCs組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4-5A）。[此處插入Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中各組大鼠逃避潛伏期變化的折線圖，直觀展示數(shù)據(jù)變化趨勢]在空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），說明模型組大鼠空間記憶能力受損嚴(yán)重。BMSCs組、TLR2-KOBMSCs組和TLR2-OEBMSCs組大鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間均明顯高于模型組（P＜0.05），其中TLR2-OEBMSCs組表現(xiàn)最為突出，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間均顯著高于BMSCs組和TLR2-KOBMSCs組（P＜0.05）（圖4-5B、C）。[此處插入Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中各組大鼠穿越原平臺(tái)位置次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間的柱狀圖，直觀展示數(shù)據(jù)對(duì)比情況]組織病理學(xué)檢測方面，HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞間隙正常（圖4-6A）。模型組大鼠腦組織可見明顯的損傷區(qū)域，神經(jīng)元變性、壞死，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤明顯（圖4-6B）。BMSCs組大鼠腦組織損傷區(qū)域有所減小，神經(jīng)元形態(tài)有所改善，炎性細(xì)胞浸潤減少（圖4-6C）。TLR2-KOBMSCs組大鼠腦組織損傷區(qū)域進(jìn)一步減小，神經(jīng)元形態(tài)改善更為明顯，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，但仍可見少量變性神經(jīng)元（圖4-6D）。TLR2-OEBMSCs組大鼠腦組織損傷區(qū)域最小，神經(jīng)元形態(tài)基本恢復(fù)正常，炎性細(xì)胞浸潤極少，接近正常腦組織（圖4-6E）。[此處插入各組大鼠腦組織HE染色圖片，依次展示對(duì)照組、模型組、BMSCs組、TLR2-KOBMSCs組和TLR2-OEBMSCs組的腦組織形態(tài)，直觀呈現(xiàn)損傷及修復(fù)情況]免疫組化檢測結(jié)果表明，在NeuN陽性細(xì)胞表達(dá)方面，對(duì)照組大鼠腦組織中NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量較多，分布均勻（圖4-7A）。模型組大鼠腦組織中NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，主要分布在未損傷區(qū)域（圖4-7B）。BMSCs組、TLR2-KOBMSCs組和TLR2-OEBMSCs組大鼠腦組織中NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯多于模型組（P＜0.05），其中TLR2-OEBMSCs組NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量最多，與BMSCs組和TLR2-KOBMSCs組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4-7C）。[此處插入各組大鼠腦組織NeuN免疫組化染色圖片及陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖，清晰展示圖片及數(shù)據(jù)對(duì)比情況]在GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)方面，對(duì)照組大鼠腦組織中GFAP陽性細(xì)胞呈低水平表達(dá)，主要分布在膠質(zhì)細(xì)胞（圖4-8A）。模型組大鼠腦組織中GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增加，在損傷區(qū)域尤為明顯，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生（圖4-8B）。BMSCs組、TLR2-KOBMSCs組和TLR2-OEBMSCs組大鼠腦組織中GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)均低于模型組（P＜0.05），其中TLR2-OEBMSCs組GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)最低，與BMSCs組和TLR2-KOBMSCs組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4-8C）。[此處插入各組大鼠腦組織GFAP免疫組化染色圖片及陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖，清晰展示圖片及數(shù)據(jù)對(duì)比情況]綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠有效改善缺氧缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能，促進(jìn)腦損傷區(qū)域的修復(fù)。其中，過表達(dá)TLR2的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植效果最為顯著，敲除TLR2的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植效果次之，正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植也有一定效果。這些結(jié)果表明TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷過程中發(fā)揮著重要作用。4.4TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)腦損傷中的作用機(jī)制研究結(jié)果為深入探究TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中的作用機(jī)制，對(duì)各組大鼠腦組織進(jìn)行了免疫組化和Westernblot檢測。免疫組化結(jié)果顯示，在對(duì)照組大鼠腦組織中，TLR2主要表達(dá)于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，表達(dá)水平較低（圖4-9A）。模型組大鼠腦組織中，TLR2表達(dá)顯著增加，尤其是在損傷區(qū)域及其周圍，表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（圖4-9B），表明缺氧缺血性腦損傷可誘導(dǎo)TLR2的表達(dá)上調(diào)。BMSCs組大鼠腦組織中，TLR2表達(dá)較模型組有所降低，但仍高于對(duì)照組（圖4-9C）。TLR2-KOBMSCs組大鼠腦組織中，TLR2表達(dá)幾乎檢測不到，表明TLR2基因敲除成功（圖4-9D）。TLR2-OEBMSCs組大鼠腦組織中，TLR2表達(dá)顯著高于其他各組，表明TLR2基因過表達(dá)成功（圖4-9E）。[此處插入各組大鼠腦組織TLR2免疫組化染色圖片，清晰展示對(duì)照組、模型組、BMSCs組、TLR2-KOBMSCs組和TLR2-OEBMSCs組的TLR2表達(dá)情況]通過Westernblot檢測TLR2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織中MyD88、TRAF6、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），表明缺氧缺血性腦損傷激活了TLR2信號(hào)通路（圖4-10A、B）。BMSCs組大鼠腦組織中，MyD88、TRAF6、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)較模型組有所降低（P＜0.05），說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠抑制TLR2信號(hào)通路的激活（圖4-10A、B）。TLR2-KOBMSCs組大鼠腦組織中，MyD88、TRAF6、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，與BMSCs組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4-10A、B），表明敲除TLR2基因可顯著抑制TLR2信號(hào)通路的激活。TLR2-OEBMSCs組大鼠腦組織中，MyD88、TRAF6、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)顯著高于BMSCs組（P＜0.01），但低于模型組（P＜0.05）（圖4-10A、B），說明過表達(dá)TLR2基因可增強(qiáng)TLR2信號(hào)通路的激活，但在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用下，信號(hào)通路的激活程度得到一定控制。[此處插入Westernblot檢測TLR2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的圖片及定量分析柱狀圖，清晰展示對(duì)照組、模型組、BMSCs組、TLR2-KOBMSCs組和TLR2-OEBMSCs組的蛋白表達(dá)條帶及定量分析結(jié)果]進(jìn)一步檢測炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)水平，ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)顯著增加（P＜0.01），BDNF、NGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)顯著降低（P＜0.01）（圖4-11A、B）。BMSCs組大鼠腦組織中，TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)較模型組明顯降低（P＜0.05），BDNF、NGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)較模型組顯著增加（P＜0.05）（圖4-11A、B），表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠調(diào)節(jié)炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。TLR2-KOBMSCs組大鼠腦組織中，TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)進(jìn)一步降低，與BMSCs組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），BDNF、NGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)進(jìn)一步增加，與BMSCs組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4-11A、B），表明敲除TLR2基因可增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。TLR2-OEBMSCs組大鼠腦組織中，TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)較BMSCs組有所增加，但低于模型組（P＜0.05），BDNF、NGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)較BMSCs組顯著增加（P＜0.05），且高于TLR2-KOBMSCs組（P＜0.05）（圖4-11A、B），說明過表達(dá)TLR2基因在一定程度上增加了炎癥因子的表達(dá)，但同時(shí)也顯著促進(jìn)了神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)修復(fù)具有積極作用。[此處插入ELISA檢測炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)水平的柱狀圖，直觀展示對(duì)照組、模型組、BMSCs組、TLR2-KOBMSCs組和TLR2-OEBMSCs組的因子表達(dá)差異]綜上所述，TLR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧缺血性腦損傷中發(fā)揮作用的機(jī)制可能是通過激活TLR2信號(hào)通路，調(diào)節(jié)炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，進(jìn)而影響神經(jīng)修復(fù)和炎癥反應(yīng)。敲除TLR2基因可抑制信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的表達(dá)，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果；而過表達(dá)TLR2基因雖在一定程度上增加了炎癥因子的表達(dá)，但也顯著促進(jìn)了神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，同樣對(duì)神經(jīng)修復(fù)具有積極影響。五、討論5.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)缺氧缺血性腦損傷的修復(fù)作用本研究通過建立缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植到損傷大鼠體內(nèi)，觀察其對(duì)腦損傷的修復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BMSCs移植能夠顯著改善缺氧缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能，促進(jìn)腦損傷區(qū)域的修復(fù)。在行為學(xué)測試中，接受BMSCs移植的大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期明顯縮短，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間顯著增加，表明其學(xué)習(xí)記憶能力和空間記憶能力得到明顯改善。組織病理學(xué)檢測顯示，BMSCs移植組大鼠腦組織損傷區(qū)域減小，神經(jīng)元形態(tài)改善，炎性細(xì)胞浸潤減少，NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量增加，GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)降低，說明BMSCs移植能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活和再生，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，減輕炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)腦損傷的修復(fù)。BMSCs對(duì)缺氧缺血性腦損傷的修復(fù)作用機(jī)制是多方面的。一方面，BMSCs具有多向分化潛能，在腦損傷微環(huán)境的誘導(dǎo)下，可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，替代受損的神經(jīng)細(xì)胞，重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。另一方面，BMSCs能夠分泌多種生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等。這些因子可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、增殖和分化，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，改善局部微環(huán)境，促進(jìn)血管生成和神經(jīng)再生。此外，BMSCs還具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制炎癥反應(yīng)，減輕炎癥對(duì)腦組織的損傷。與其他治療方法相比，BMSCs治療缺氧缺血性腦損傷具有獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，BMSCs來源廣泛，可從骨髓、脂肪組織、臍帶血等多種組織中獲取，且獲取過程相對(duì)簡單，對(duì)供體的損傷較小。其次，BMSCs具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力，在異體移植中不易被免疫系統(tǒng)識(shí)別和排斥，降低了免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，BMSCs能夠通過多種機(jī)制發(fā)揮治療作用，不僅可以替代受損細(xì)胞，還能調(diào)節(jié)微環(huán)境，促進(jìn)組織修復(fù)，具有更為全面的治療效果。BMSCs治療缺氧缺血性腦損傷也面臨一些挑戰(zhàn)。