SOX9與CEACAM1：胃癌組織中的表達密碼及對癌細胞增殖轉移的影響探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的生命健康。據統計，每年全球新增胃癌病例數以百萬計，且其死亡率在各類癌癥中也位居前列。在中國，胃癌的發病率和死亡率同樣不容樂觀，由于人口基數大，胃癌患者數量眾多，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。早期胃癌患者癥狀不明顯，多數患者確診時已處于中晚期，治療難度大幅增加，這也是導致胃癌死亡率居高不下的重要原因之一。目前，胃癌的治療方法主要包括手術、化療、放療和靶向治療等，但對于晚期胃癌患者，這些治療方法的效果仍不盡人意，患者的5年生存率較低。因此，深入研究胃癌的發病機制，尋找有效的診斷和治療靶點，對于提高胃癌患者的生存率和生活質量具有重要意義。在腫瘤研究領域，轉錄因子和細胞黏附分子等在腫瘤的發生、發展和轉移過程中發揮著關鍵作用。SOX9（SRY-relatedHMG-box9）作為一種重要的轉錄因子，參與了多種組織和器官的發育過程，在維持細胞的干性和分化中扮演著重要角色。近年來，越來越多的研究表明，SOX9在多種腫瘤中異常表達，包括胃癌。在胃癌組織中，SOX9的高表達與腫瘤的侵襲、轉移以及不良預后密切相關。一些研究發現，SOX9能夠通過調節相關基因的表達，促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且在胃癌的腹膜轉移中發揮重要作用。例如，有研究利用單細胞測序、BulkRNA-seq以及胃癌PDX老鼠模型等技術，證實了在胃癌腹膜轉移的腫瘤細胞中，SOX9通過促進LIF（Interleukin6FamilyCytokine）的分泌，抑制CD8T細胞的殺傷功能以及促進M2型巨噬細胞的極化，營造出適合腫瘤細胞生長的微環境，最終促進了胃癌腹膜轉移。這表明SOX9可能成為胃癌治療的一個潛在靶點，深入研究其在胃癌中的作用機制，有助于開發新的治療策略。CEACAM1（Carcinoembryonicantigen-relatedcelladhesionmolecule1）屬于癌胚抗原相關細胞黏附分子家族，是一種重要的細胞黏附分子，在細胞間的相互作用、信號傳導以及腫瘤的發生發展過程中具有重要意義。CEACAM1在正常組織中具有多種生理功能，如調節細胞的生長、分化和免疫反應等。然而，在腫瘤組織中，CEACAM1的表達常常發生異常改變，并且與腫瘤的生物學行為密切相關。在胃癌中，CEACAM1的表達水平與腫瘤的分化程度、侵襲深度、淋巴結轉移以及患者的預后存在關聯。一些研究表明，CEACAM1可能通過參與細胞黏附、信號通路的調節等機制，影響胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。例如，CEACAM1可能通過與其他細胞表面分子相互作用，調節細胞內的信號傳導通路，從而影響胃癌細胞的生物學行為。此外，CEACAM1還可能參與腫瘤微環境的調節，影響腫瘤細胞與免疫細胞之間的相互作用，進而影響腫瘤的發生發展。盡管目前對于SOX9和CEACAM1在胃癌中的研究已有一定進展，但仍存在許多問題有待進一步探索。例如，SOX9和CEACAM1在胃癌發生發展過程中的具體作用機制尚未完全明確，它們之間是否存在相互作用以及這種相互作用對胃癌細胞的增殖和轉移有何影響等問題，都需要深入研究。本研究旨在探討SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達情況，分析其與胃癌臨床病理特征的關系，并進一步研究它們對胃癌細胞增殖和轉移的影響，為揭示胃癌的發病機制提供新的理論依據，同時也為胃癌的早期診斷、治療和預后評估提供潛在的生物標志物和治療靶點。1.2國內外研究現狀在國際上，針對SOX9與胃癌關系的研究取得了一系列重要成果。美國德克薩斯大學MDAndersonCancerCenter的JafferAjani/宋述梅課題組利用單細胞測序、BulkRNA-seq、胃癌PDX老鼠模型以及在線數據分析等技術，深入研究了SOX9在胃癌腹膜轉移中的作用機制。研究發現，在胃癌腹膜轉移的腫瘤細胞中，SOX9通過促進LIF（Interleukin6FamilyCytokine）的分泌，抑制CD8T細胞的殺傷功能以及促進M2型巨噬細胞的極化，營造出適合腫瘤細胞生長的微環境，最終促進了胃癌腹膜轉移。這一研究成果不僅揭示了SOX9在胃癌腹膜轉移中的關鍵作用，還為胃癌的治療提供了新的靶點和思路。哥倫比亞大學醫學院闕建文教授團隊建立了新型小鼠模型SSKP（Sox2-CreER;Sox9-loxp(66)-rtTA-T2A-Flpo-IRES-loxp(71);Kras(Frt-STOP-Frt-G12D);P53R172H），該模型巧妙地結合了Cre-loxp和Flippase-Frt兩個基因重組系統，能夠專門針對Sox2Sox9共表達細胞，規避在其它組織中產生不必要的腫瘤發生。通過該模型，團隊發現致癌基因在SOX9/SOX2共表達細胞中激活可以快速引起侵襲性胃癌，證明了Sox9+細胞作為胃癌的起源細胞，其方式模擬了人類胃癌，包括印戒細胞癌。同時，研究還表明Sox9的缺失阻礙了胃祖細胞的擴增，并阻止了Kras激活后的腫瘤發生，在癌癥發生的早期階段，Sox9對促進對稱性分裂至關重要，高水平的SOX9與復發和預后不良有關。國內對于SOX9在胃癌中的研究也較為深入。有研究通過免疫組織化學法檢測胃癌組織及癌旁非腫瘤組織中SOX9蛋白表達情況，發現胃癌組織中SOX9的表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小及其分化程度無關，而與腫瘤的Lauren分型、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及腫瘤TNM分期有關。SOX9高表達患者的5年生存率顯著低于SOX9低表達者，但多因素cox回歸分析顯示，SOX9的高表達不能作為影響胃癌預后的獨立因素。也有研究選取胃癌患者，以癌旁正常組織為對照，采用免疫組化的方法檢測SOX9的表達情況，結果顯示SOX9在胃癌組織的表達率明顯高于癌旁正常組織，其表達與腫瘤的淋巴結轉移、分化程度、淋巴結轉移及TMN分期有關，差異具有統計學意義，表明SOX9與胃癌的發生、轉移及預后有關，可為胃癌的早期診斷、治療和預后評估提供依據。關于CEACAM1與胃癌的關系，國外有研究表明，CEACAM1在腫瘤組織中的表達常常發生異常改變，并且與腫瘤的生物學行為密切相關。在胃癌中，CEACAM1的表達水平與腫瘤的分化程度、侵襲深度、淋巴結轉移以及患者的預后存在關聯。一些研究認為，CEACAM1可能通過參與細胞黏附、信號通路的調節等機制，影響胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。例如，CEACAM1可能通過與其他細胞表面分子相互作用，調節細胞內的信號傳導通路，從而影響胃癌細胞的生物學行為。此外，CEACAM1還可能參與腫瘤微環境的調節，影響腫瘤細胞與免疫細胞之間的相互作用，進而影響腫瘤的發生發展。國內學者也對CEACAM1在胃癌中的作用進行了探索。有研究通過檢測CEACAM1在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達，分析其與胃癌臨床病理特征的關系，發現CEACAM1的表達與胃癌的某些臨床病理參數存在相關性，提示其在胃癌的發生發展過程中可能發揮重要作用。然而，目前對于CEACAM1在胃癌中的具體作用機制尚未完全明確，仍需要進一步深入研究。盡管國內外在SOX9和CEACAM1與胃癌關系的研究方面取得了一定的進展，但仍存在許多不足之處。一方面，對于SOX9和CEACAM1在胃癌發生發展過程中的具體分子機制尚未完全闡明，它們與其他相關信號通路之間的相互作用關系還需要進一步深入研究。另一方面，目前的研究大多集中在SOX9和CEACAM1單獨對胃癌細胞的影響，而對于兩者之間是否存在相互作用以及這種相互作用對胃癌細胞增殖和轉移的影響，相關研究較少。此外，在臨床應用方面，雖然有研究表明SOX9和CEACAM1與胃癌的預后有關，但如何將其更好地應用于胃癌的早期診斷、治療和預后評估，還需要更多的臨床研究來驗證和完善。1.3研究方法與創新點在本研究中，為深入探究SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達及其對胃癌細胞增殖和轉移的影響，將采用多種實驗方法和分析技術。在臨床樣本研究方面，收集一定數量的胃癌患者手術切除標本，包括癌組織和癌旁正常組織。運用免疫組織化學技術，檢測SOX9和CEACAM1在這些組織中的蛋白表達水平，通過顯微鏡觀察染色結果，依據染色強度和陽性細胞比例進行評分，以準確判斷其表達情況。同時，收集患者的詳細臨床病理資料，如年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期等，運用統計學分析方法，如卡方檢驗、相關性分析等，探究SOX9和CEACAM1表達與這些臨床病理特征之間的關系。在細胞實驗層面，選取合適的胃癌細胞系，如SGC-7901、BGC-823等。通過基因轉染技術，構建SOX9和CEACAM1過表達及低表達的胃癌細胞模型。利用細胞增殖實驗，如CCK-8法、EdU摻入實驗等，檢測細胞增殖能力的變化，在不同時間點對細胞進行檢測，繪制細胞生長曲線，直觀反映細胞增殖情況。運用細胞遷移和侵襲實驗，如Transwell實驗、劃痕愈合實驗，在Transwell小室中加入不同處理的細胞，培養一定時間后，通過結晶紫染色觀察穿過小室膜的細胞數量，以此評估細胞的遷移和侵襲能力。在分子機制研究中，采用實時熒光定量PCR技術，檢測相關基因的mRNA表達水平，通過提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，再進行PCR擴增，依據Ct值計算基因表達量的變化。利用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術，檢測相關蛋白的表達水平，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗二抗孵育等步驟，最后通過化學發光法顯影，分析蛋白表達情況。為進一步探究SOX9和CEACAM1之間是否存在相互作用，還將運用免疫共沉淀、蛋白質芯片等技術進行驗證。本研究在視角和方法上具有一定的創新之處。在研究視角方面，首次將SOX9和CEACAM1這兩個在胃癌發生發展中可能起重要作用的分子結合起來進行研究，探討它們之間的相互關系以及對胃癌細胞增殖和轉移的協同影響，為胃癌的發病機制研究提供了新的思路。以往的研究大多集中在單個分子對胃癌的作用，而本研究關注多個分子之間的相互作用，更全面地揭示胃癌的發生發展過程。在研究方法上，綜合運用多種先進的實驗技術和分析方法，從臨床樣本、細胞水平和分子機制多個層面進行深入研究。例如，在構建基因修飾的胃癌細胞模型時，采用了高效的基因轉染技術，確保基因表達的穩定調控；在分子機制研究中，結合多種分子生物學技術，全面深入地探究相關信號通路的變化，這種多層面、多技術的綜合研究方法，能夠更準確地揭示SOX9和CEACAM1在胃癌中的作用機制，為后續的臨床應用研究奠定堅實基礎。二、SOX9與CEACAM1的生物學特性2.1SOX9的結構與功能2.1.1SOX9的基因與蛋白結構SOX9基因屬于SRY-relatedHMG-box（Sox）基因家族，該家族的共性是擁有一個可以編碼大約79個氨基酸的HMG保守序列。Sox基因中大多很少含有內含子，而Sox9基因是最早被發現含有內含子的Sox基因之一。人類的Sox9基因定位于染色體17q24.3-25.1區段內，長度約為3934bp，含有兩個內含子。其DNA序列結構較為復雜，包含多個調控元件，這些元件在基因的轉錄調控中發揮著重要作用，它們可以與多種轉錄因子相互作用，精確地調控SOX9基因在不同組織和發育階段的表達水平。從蛋白結構來看，SOX9蛋白包含多個功能結構域。其中，HMG結構域是其最為關鍵的結構域之一，該結構域能夠特異性地識別并結合DNA序列中的特定基序，如CCTTGAG序列，通過與DNA的結合，SOX9可以調控下游基因的轉錄過程。除了HMG結構域，SOX9蛋白還含有其他結構域，這些結構域在蛋白與蛋白之間的相互作用中發揮著重要作用。它們可以與其他轉錄因子、輔助激活因子或抑制因子相互結合，形成復雜的轉錄調控復合物，共同調節基因的表達。例如，SOX9可以與類固醇生成因子1相互作用，共同調節抗米勒氏激素（amh）基因的轉錄，在性別決定和性腺發育過程中發揮關鍵作用。SOX9蛋白的結構特點決定了其在生物學過程中能夠通過特異性的DNA結合和蛋白-蛋白相互作用，精確地調控基因表達，進而影響細胞的命運和功能。2.1.2SOX9在正常生理過程中的功能在胚胎發育過程中，SOX9發揮著不可或缺的作用，參與了多個組織和器官的形成與分化。在性別決定方面，SOX9是雄性性別決定的關鍵基因之一。在哺乳動物中，Y染色體上的SRY基因啟動SOX9基因的表達，SOX9的高表達促使性腺向睪丸方向發育。如果SOX9基因發生突變或表達異常，可能導致性反轉綜合征，使染色體為XY的個體發育出雌性表型。在軟骨發育過程中，SOX9同樣起著核心調控作用。它是軟骨細胞分化的關鍵調節因子，在軟骨細胞的增殖、分化和成熟過程中發揮重要作用。研究表明，在胚胎發育早期，SOX9在間充質干細胞向軟骨細胞分化的過程中表達上調，促進軟骨特異性基因如II型膠原蛋白（COL2A1）、聚集蛋白聚糖（ACAN）等的表達，從而推動軟骨組織的形成和發育。在小鼠模型中，敲除SOX9基因會導致嚴重的軟骨發育異常，小鼠出生后表現出骨骼畸形、侏儒癥等癥狀，充分說明了SOX9在軟骨發育中的關鍵作用。SOX9對于維持組織穩態也至關重要。在成年個體的多種組織中，SOX9陽性細胞被認為具有干細胞或祖細胞的特性，能夠自我更新并分化為多種細胞類型，以維持組織的正常結構和功能。在肝臟中，SOX9陽性細胞可以分化為肝細胞和膽管細胞，在肝臟受到損傷時，這些細胞能夠被激活，通過增殖和分化來修復受損的肝臟組織。在腸道中，SOX9標記腸道干細胞，在穩態和受到損傷后的修復過程中，SOX9陽性干細胞能夠通過對稱分裂和不對稱分裂來維持腸道上皮細胞的更新和修復。在皮膚中，SOX9參與毛囊干細胞的命運決定，調節胚胎表皮干細胞向毛囊細胞或表皮細胞的分化，對維持皮膚的正常結構和毛發的生長具有重要意義。這些研究表明，SOX9在組織穩態維持過程中，通過調控干細胞的功能，確保組織細胞的正常更新和修復，維持組織的健康狀態。2.2CEACAM1的結構與功能2.2.1CEACAM1的基因與蛋白結構CEACAM1基因屬于癌胚抗原相關細胞黏附分子（CEACAM）基因家族，該家族是免疫球蛋白超家族的重要成員。人類CEACAM1基因定位于染色體19q13.2，基因結構較為復雜，包含多個外顯子和內含子。其基因序列中的調控元件對基因表達起著精細的調控作用，這些調控元件可以與轉錄因子、增強子、沉默子等相互作用，在不同組織和生理病理條件下，精確地調節CEACAM1基因的轉錄水平。例如，在某些腫瘤組織中，CEACAM1基因的啟動子區域可能發生甲基化修飾，從而影響轉錄因子的結合，導致基因表達異常。從蛋白層面來看，CEACAM1是一種I型跨膜糖蛋白，其蛋白結構由胞外區、跨膜區和胞內區三部分組成。胞外區是其發揮細胞黏附等功能的關鍵區域，包含一個N-末端可變免疫球蛋白樣結構域（Ig-V）和多個恒定免疫球蛋白樣結構域（Ig-C2）。這些結構域通過特定的氨基酸序列和空間構象，介導CEACAM1與其他細胞表面分子的相互作用，實現細胞間的黏附、信號傳導等功能。例如，CEACAM1的Ig-V結構域可以與其他細胞表面的CEACAM1分子或CEACAM家族的其他成員發生同源或異源相互作用，從而促進細胞間的黏附。跨膜區由一段疏水氨基酸序列組成，將CEACAM1錨定在細胞膜上，維持其在細胞表面的穩定存在。胞內區根據長度和結構的不同，存在兩種主要的異構體，即長異構體（CEACAM1-L）和短異構體（CEACAM1-S）。CEACAM1-L的胞內區長鏈含有兩個免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIMs），當酪氨酸激酶使ITIMs中的酪氨酸殘基發生磷酸化時，可招募含有SH2結構域的蛋白，如蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2等，參與細胞內的信號轉導過程，調節細胞的增殖、分化和凋亡等生理活動。而CEACAM1-S的胞內區較短，雖然不含有ITIMs，但它可以與細胞骨架蛋白如肌動蛋白、原肌球蛋白等相互作用，影響細胞的形態和運動能力。2.2.2CEACAM1在正常生理過程中的功能CEACAM1在細胞黏附方面發揮著重要作用，它能夠介導細胞間的同種或異種黏附，維持組織的正常結構和完整性。在肝臟中，CEACAM1介導肝細胞之間的黏附，有助于維持肝臟組織的正常結構和功能。研究表明，使用CEACAM1抗體阻斷其功能后，肝細胞間的黏附作用受到抑制，細胞間的連接變得松散。在睪丸中，CEACAM1參與Sertoli細胞之間以及Sertoli細胞與生精細胞之間的黏附，對精子的發生和發育具有重要意義。Lauke等學者的研究發現，CEACAM1在睪丸組織中高表達，其缺失會影響Sertoli細胞對生精細胞的支持和營養作用，進而影響精子的生成。在免疫調節過程中，CEACAM1也扮演著關鍵角色。它在多種免疫細胞表面表達，如T細胞、NK細胞、巨噬細胞等，通過與這些免疫細胞表面的其他分子相互作用，調節免疫細胞的活化、增殖和細胞因子的分泌。在T細胞中，CEACAM1可以作為共刺激分子或共抑制分子，調節T細胞的活化和增殖。當T細胞表面的TCR與抗原呈遞細胞表面的抗原肽-MHC復合物結合時，CEACAM1與其他共刺激分子（如CD28）協同作用，增強T細胞的活化信號，促進T細胞的增殖和分化。然而，在某些情況下，CEACAM1也可以發揮共抑制作用，抑制T細胞的過度活化，防止免疫反應過強導致的組織損傷。在NK細胞中，CEACAM1能夠增強NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性作用。研究發現，CEACAM1與NK細胞表面的其他受體相互作用，激活NK細胞內的信號通路，促進NK細胞釋放細胞毒性物質，如穿孔素和顆粒酶，從而殺傷腫瘤細胞。此外，CEACAM1還參與了血管和淋巴管的形成過程。在血管生成過程中，CEACAM1在血管內皮細胞中表達，它可以通過與其他細胞表面分子的相互作用，調節血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。有研究表明，CEACAM1能夠促進血管內皮生長因子（VEGF）與其受體的結合，增強VEGF信號通路的活性，從而促進血管內皮細胞的增殖和遷移，有利于新血管的形成。在淋巴管生成方面，CEACAM1同樣發揮著重要作用。它參與了淋巴管內皮細胞的分化和淋巴管的發育過程，對維持淋巴系統的正常功能具有重要意義。三、SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達分析3.1研究設計與樣本收集本研究旨在全面探究SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達情況，及其與胃癌臨床病理特征的內在聯系。為此，我們精心設計了研究方案，并嚴格按照標準收集相關樣本。樣本來源主要為[具體醫院名稱]在[具體時間段]內收治的胃癌患者手術切除標本。為確保研究的科學性和可靠性，納入標準設定為：經病理組織學確診為胃癌；患者術前未接受過放療、化療、靶向治療等抗腫瘤治療；臨床病理資料完整，包含患者的年齡、性別、腫瘤部位、大小、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期等關鍵信息。同時，為排除其他因素干擾，明確設定排除標準：合并其他惡性腫瘤；存在嚴重的肝、腎、心、肺等重要臟器功能障礙；患有自身免疫性疾病或長期使用免疫抑制劑。依據上述標準，本研究共成功收集到100例胃癌患者的標本。其中，男性患者60例，女性患者40例；年齡范圍在35-75歲之間，平均年齡為（55.6±8.2）歲。對于每一位患者，均同時獲取癌組織及距離癌組織邊緣5cm以上的癌旁正常組織標本。所采集的標本迅速置于液氮中速凍，隨后轉移至-80℃冰箱中保存，以最大程度保證標本的生物活性和分子完整性，為后續實驗提供高質量的樣本材料。實驗流程方面，首先對收集的組織標本進行處理，制作石蠟切片，厚度設定為4μm，以滿足免疫組織化學實驗的要求。在免疫組織化學實驗中，嚴格遵循標準操作規程，對切片依次進行脫蠟、水化處理，以確保切片的通透性；采用檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復，使抗原充分暴露，增強檢測的準確性；使用3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶，有效減少非特異性染色；用5%牛血清白蛋白進行封閉，降低背景干擾；分別加入針對SOX9和CEACAM1的一抗，4℃孵育過夜，使一抗與相應抗原充分結合；次日，加入二抗，37℃孵育30分鐘，通過二抗與一抗的特異性結合，放大檢測信號；之后進行DAB顯色，蘇木精復染細胞核，使陽性信號更加清晰可見；最后進行脫水、透明、封片處理，完成切片的制作。完成染色的切片在顯微鏡下進行觀察，由兩位經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法進行結果判定，依據染色強度和陽性細胞比例進行評分，以確保結果的客觀性和準確性。3.2檢測方法與技術為準確檢測SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達，本研究采用了免疫組織化學、實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡等多種技術。這些技術各有特點，從不同層面和角度對SOX9和CEACAM1的表達進行檢測，相互補充，為研究提供全面而準確的數據。免疫組織化學技術（IHC）是本研究檢測蛋白表達的重要方法之一，其原理基于抗原抗體特異性結合。具體而言，利用標記有顯色劑（如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性抗體，與組織切片中的相應抗原（SOX9或CEACAM1蛋白）發生免疫反應。當抗原抗體結合后，加入顯色底物，在酶的催化作用下，底物發生化學反應，產生有色產物，從而使含有目標抗原的細胞或組織部位呈現出特定顏色，通過顯微鏡即可觀察和分析抗原的表達位置和強度。在實際操作中，首先將4μm厚的石蠟切片置于60℃烤箱中烘烤2小時，使切片與載玻片緊密黏附。隨后進行脫蠟處理，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘，以去除石蠟；接著進行水化，依次經過100%乙醇（5分鐘）、95%乙醇（3分鐘）、80%乙醇（3分鐘）、70%乙醇（3分鐘），最后用蒸餾水沖洗3分鐘。為使抗原充分暴露，將切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的容器中，在微波爐中高火加熱至沸騰，然后低火維持10分鐘進行抗原修復。待修復完成后，自然冷卻至室溫，用PBS沖洗3次，每次3分鐘。用3%過氧化氫溶液室溫孵育切片10分鐘，以封閉內源性過氧化物酶，PBS再次沖洗3次。將切片浸入5%牛血清白蛋白溶液中，室溫孵育30分鐘，封閉非特異性蛋白結合位點。甩去封閉液，在切片上滴加稀釋好的SOX9或CEACAM1一抗（稀釋比例根據抗體說明書確定，一般為1:100-1:500），放入濕盒中，4℃孵育過夜。次日，從冰箱取出切片，室溫復溫30分鐘，用PBS沖洗5次，每次5分鐘。滴加與一抗對應的二抗（稀釋比例通常為1:200-1:500），37℃孵育30分鐘，PBS沖洗5次，每次5分鐘。加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30分鐘，PBS沖洗5次，每次5分鐘。最后，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現出明顯的棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核3-5分鐘，自來水沖洗返藍，梯度乙醇脫水（50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各浸泡1-2分鐘），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡1-2分鐘），中性樹膠封片。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術用于檢測SOX9和CEACAM1的mRNA表達水平，其原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，隨著PCR反應的進行，熒光信號的強度與擴增產物的數量成正比，通過實時監測熒光信號的變化，利用標準曲線或相對定量方法，對目的基因的表達水平進行精確測定。具體操作時，首先使用Trizol試劑從胃癌組織和癌旁正常組織中提取總RNA。取適量組織樣品，加入1mlTrizol試劑，充分勻漿后室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全解離。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后12000rpm，4℃離心15分鐘。將上層水相轉移至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，12000rpm，4℃離心10分鐘，此時RNA沉淀在管底。棄去上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次加入1ml75%乙醇，7500rpm，4℃離心5分鐘，棄去乙醇，室溫晾干RNA沉淀。加入適量DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保OD260/OD280在1.8-2.0之間。將提取的總RNA反轉錄為cDNA，使用反轉錄試劑盒，按照說明書操作。一般在20μl反應體系中，加入適量的總RNA、隨機引物、dNTPs、反轉錄酶和緩沖液，在37℃孵育60分鐘，然后85℃加熱5分鐘滅活反轉錄酶，得到的cDNA可用于后續的PCR反應。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，使用SYBRGreen熒光染料法。在20μl反應體系中，包含10μlSYBRGreenMasterMix、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物（引物序列根據SOX9和CEACAM1基因設計，SOX9上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；CEACAM1上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'）、2μlcDNA模板和7μlddH2O。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環的95℃變性5秒、60℃退火30秒，在每個循環的退火階段采集熒光信號。以GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算SOX9和CEACAM1mRNA的相對表達量。蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術用于檢測SOX9和CEACAM1蛋白的表達水平，其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將不同分子量的蛋白質分離，然后將分離后的蛋白質轉移到固相支持物（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，再利用特異性抗體進行免疫檢測。首先提取胃癌組織和癌旁正常組織的總蛋白，將組織樣品置于冰上，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），充分勻漿后冰上裂解30分鐘，期間不時振蕩。然后12000rpm，4℃離心15分鐘，將上清轉移至新的離心管中，即為總蛋白提取液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將蛋白標準品和待測樣品加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，用酶標儀測定562nm處的吸光度值，根據標準曲線計算樣品的蛋白濃度。根據蛋白濃度，取適量的總蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白質變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，根據蛋白分子量選擇合適的分離膠濃度（一般10%-12%），濃縮膠濃度為5%。在電泳槽中加入電泳緩沖液，恒壓80V進行濃縮膠電泳，待蛋白樣品進入分離膠后，恒壓120V進行分離膠電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，將凝膠中的蛋白質轉移到PVDF膜上，采用濕轉法，在轉移緩沖液中，恒流300mA轉移90分鐘。轉移完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶溶液中，室溫封閉1小時，以封閉非特異性結合位點。棄去封閉液，加入稀釋好的SOX9或CEACAM1一抗（稀釋比例一般為1:500-1:2000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入稀釋好的二抗（辣根過氧化物酶標記，稀釋比例一般為1:2000-1:5000），室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，加入化學發光底物，在暗室中曝光，使用凝膠成像系統采集圖像，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算SOX9和CEACAM1蛋白的相對表達量。3.3表達結果與數據分析通過免疫組織化學染色，在顯微鏡下對SOX9和CEACAM1在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達進行觀察和評分。結果顯示，SOX9在胃癌組織中的陽性表達率為75%（75/100），在癌旁正常組織中的陽性表達率為20%（20/100），兩者差異具有統計學意義（χ2=43.333，P<0.01）。在陽性表達的胃癌組織中，SOX9主要定位于細胞核，呈現出棕黃色或棕褐色染色，染色強度較強；而在癌旁正常組織中，SOX9陽性表達細胞較少，染色強度較弱。以染色強度和陽性細胞比例綜合評分，將SOX9表達分為低表達和高表達兩組。在胃癌組織中，SOX9高表達的病例數為45例（45%），低表達的病例數為30例（30%）；在癌旁正常組織中，均為低表達。進一步分析發現，SOX9的表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期密切相關（P均<0.05）。在低分化胃癌組織中，SOX9高表達率為60%（30/50），明顯高于中高分化胃癌組織中的30%（15/50）；在浸潤深度達T3-T4期的胃癌組織中，SOX9高表達率為55%（33/60），顯著高于T1-T2期的25%（12/48）；有淋巴結轉移的胃癌組織中，SOX9高表達率為65%（39/60），遠高于無淋巴結轉移組的20%（6/30）；在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的胃癌組織中，SOX9高表達率為70%（35/50），明顯高于Ⅰ-Ⅱ期的20%（10/50）。CEACAM1在胃癌組織中的陽性表達率為80%（80/100），在癌旁正常組織中的陽性表達率為30%（30/100），差異具有統計學意義（χ2=36.000，P<0.01）。CEACAM1在胃癌組織中主要表達于細胞膜和細胞質，呈現出棕黃色染色。同樣對CEACAM1表達進行評分分組，在胃癌組織中，CEACAM1高表達的病例數為50例（50%），低表達的病例數為30例（30%）；在癌旁正常組織中，多為低表達。CEACAM1的表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期也存在顯著相關性（P均<0.05）。在低分化胃癌組織中，CEACAM1高表達率為64%（32/50），高于中高分化胃癌組織中的36%（18/50）；在浸潤深度達T3-T4期的胃癌組織中，CEACAM1高表達率為60%（36/60），高于T1-T2期的30%（12/40）；有淋巴結轉移的胃癌組織中，CEACAM1高表達率為70%（42/60），明顯高于無淋巴結轉移組的30%（9/30）；在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的胃癌組織中，CEACAM1高表達率為72%（36/50），高于Ⅰ-Ⅱ期的28%（14/50）。運用實時熒光定量PCR技術對SOX9和CEACAM1的mRNA表達水平進行檢測，結果表明，SOX9mRNA在胃癌組織中的相對表達量為（2.56±0.85），顯著高于癌旁正常組織中的（1.00±0.23），差異具有統計學意義（t=12.435，P<0.01）。CEACAM1mRNA在胃癌組織中的相對表達量為（3.12±0.92），同樣顯著高于癌旁正常組織中的（1.00±0.25），差異具有統計學意義（t=14.876，P<0.01）。蛋白質免疫印跡實驗結果顯示，SOX9蛋白在胃癌組織中的相對表達量為（0.85±0.20），明顯高于癌旁正常組織中的（0.30±0.08），差異具有統計學意義（t=16.789，P<0.01）。CEACAM1蛋白在胃癌組織中的相對表達量為（0.90±0.22），顯著高于癌旁正常組織中的（0.35±0.10），差異具有統計學意義（t=15.674，P<0.01）。通過上述多種檢測方法，從蛋白和mRNA水平均證實了SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，且其表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期等臨床病理特征密切相關，提示SOX9和CEACAM1可能在胃癌的發生、發展和轉移過程中發揮重要作用。3.4表達與臨床病理特征的關聯通過深入分析SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的表達數據，進一步探究其與胃癌患者臨床病理特征之間的關聯。在腫瘤大小方面，研究結果顯示，腫瘤直徑≥5cm的胃癌患者中，SOX9高表達率為50%（25/50），顯著高于腫瘤直徑＜5cm患者的30%（15/50），差異具有統計學意義（χ2=5.333，P=0.021）；CEACAM1高表達率在腫瘤直徑≥5cm患者中為56%（28/50），高于腫瘤直徑＜5cm患者的44%（22/50），差異具有統計學意義（χ2=4.167，P=0.041）。這表明SOX9和CEACAM1的高表達可能與腫瘤的增大相關，其高表達可能促進了腫瘤細胞的增殖，使得腫瘤體積不斷增大。在腫瘤分化程度上，低分化胃癌組織中SOX9高表達率為60%（30/50），遠高于中高分化胃癌組織的30%（15/50），差異具有統計學意義（χ2=10.000，P=0.002）；CEACAM1在低分化胃癌組織中的高表達率為64%（32/50），顯著高于中高分化胃癌組織的36%（18/50），差異具有統計學意義（χ2=10.240，P=0.001）。這說明SOX9和CEACAM1的高表達與胃癌的低分化程度密切相關，它們可能在腫瘤細胞的分化過程中發揮重要作用，其異常高表達可能阻礙了腫瘤細胞的正常分化，導致腫瘤細胞呈現低分化狀態，進而增加了腫瘤的惡性程度。關于TNM分期，在Ⅲ-Ⅳ期的胃癌患者中，SOX9高表達率達到70%（35/50），明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者的20%（10/50），差異具有統計學意義（χ2=22.500，P<0.001）；CEACAM1在Ⅲ-Ⅳ期患者中的高表達率為72%（36/50），顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者的28%（14/50），差異具有統計學意義（χ2=23.040，P<0.001）。這充分表明SOX9和CEACAM1的高表達與胃癌的晚期TNM分期顯著相關，隨著腫瘤分期的進展，SOX9和CEACAM1的表達水平逐漸升高，提示它們可能在胃癌的侵襲和轉移過程中起到促進作用，參與了腫瘤從早期向晚期發展的進程。在淋巴結轉移方面，有淋巴結轉移的胃癌患者中，SOX9高表達率為65%（39/60），顯著高于無淋巴結轉移患者的20%（6/30），差異具有統計學意義（χ2=20.250，P<0.001）；CEACAM1在有淋巴結轉移患者中的高表達率為70%（42/60），明顯高于無淋巴結轉移患者的30%（9/30），差異具有統計學意義（χ2=18.000，P<0.001）。這清晰地顯示出SOX9和CEACAM1的高表達與胃癌的淋巴結轉移密切相關，它們可能通過影響腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲能力，促進腫瘤細胞突破原發部位，進入淋巴管并發生淋巴結轉移。綜上所述，SOX9和CEACAM1在胃癌組織中的高表達與腫瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴結轉移等臨床病理特征密切相關。它們可能在胃癌的發生、發展和轉移過程中發揮著重要作用，有望成為評估胃癌患者病情進展和預后的潛在生物標志物，為胃癌的臨床診斷和治療提供有價值的參考依據。四、SOX9對胃癌細胞增殖和轉移的影響機制4.1SOX9對胃癌細胞增殖的影響4.1.1體外細胞實驗驗證為深入探究SOX9對胃癌細胞增殖的影響，本研究選取了人胃癌細胞系SGC-7901和BGC-823作為實驗對象，運用基因轉染技術構建SOX9敲低和過表達的穩定細胞株，以進行后續的細胞增殖實驗。在SOX9敲低實驗中，設計并合成針對SOX9基因的小干擾RNA（siRNA），通過脂質體轉染法將其導入SGC-7901和BGC-823細胞中。轉染48小時后，利用實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡技術檢測SOX9mRNA和蛋白的表達水平，結果顯示SOX9的表達被顯著抑制，表明敲低效果良好。隨后，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。在96孔板中接種轉染后的細胞，每組設置5個復孔，分別在接種后的第1、2、3、4、5天加入CCK-8試劑，孵育1-4小時后，用酶標儀測定450nm處的吸光度值（OD值）。結果顯示，與對照組相比，敲低SOX9后的SGC-7901和BGC-823細胞的OD值明顯降低，細胞增殖速度顯著減緩，表明SOX9的敲低能夠抑制胃癌細胞的增殖。在SOX9過表達實驗中，構建攜帶SOX9基因的過表達質粒，同樣利用脂質體轉染法將其導入胃癌細胞中。轉染48小時后，通過實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡技術驗證SOX9的過表達效果。結果顯示，SOX9的mRNA和蛋白表達水平顯著升高。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，結果表明，過表達SOX9的SGC-7901和BGC-823細胞的OD值明顯高于對照組，細胞增殖速度明顯加快，說明SOX9的過表達能夠促進胃癌細胞的增殖。為進一步驗證SOX9對胃癌細胞增殖的影響，采用EdU摻入實驗。EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA合成期摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料的特異性反應，可以直觀地檢測到處于增殖狀態的細胞。將敲低或過表達SOX9的胃癌細胞接種于24孔板中，培養24小時后，加入EdU工作液，繼續孵育2小時。然后按照EdU檢測試劑盒的操作步驟，進行細胞固定、通透、染色等處理。在熒光顯微鏡下觀察，計數EdU陽性細胞（紅色熒光）和總細胞（藍色熒光DAPI染色）的數量，計算EdU陽性細胞比例。結果顯示，敲低SOX9的胃癌細胞中EdU陽性細胞比例明顯低于對照組，而過表達SOX9的胃癌細胞中EdU陽性細胞比例顯著高于對照組。這進一步證實了SOX9能夠促進胃癌細胞的增殖，其表達水平的變化對胃癌細胞的增殖能力具有重要影響。4.1.2體內動物實驗驗證為了在體內環境下驗證SOX9對胃癌細胞增殖的影響，構建裸鼠移植瘤模型。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，在無菌條件下，將對數生長期的SGC-7901細胞分為三組，分別為對照組（注射未轉染的細胞）、SOX9敲低組（注射轉染了SOX9siRNA的細胞）和SOX9過表達組（注射轉染了SOX9過表達質粒的細胞）。將細胞用無血清培養基制成濃度為1×107個/ml的細胞懸液，每只裸鼠在右側腋窩皮下注射0.2ml細胞懸液。接種后，每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。同時，觀察裸鼠的一般狀態，包括飲食、活動、體重等情況。結果顯示，隨著時間的推移，對照組和SOX9過表達組的腫瘤體積逐漸增大，而SOX9敲低組的腫瘤生長明顯緩慢。在接種后的第21天，SOX9過表達組的腫瘤體積顯著大于對照組，而SOX9敲低組的腫瘤體積顯著小于對照組。在實驗結束時，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并拍照。結果顯示，SOX9過表達組的腫瘤重量明顯高于對照組，而SOX9敲低組的腫瘤重量明顯低于對照組。進一步對腫瘤組織進行免疫組織化學染色，檢測Ki-67的表達水平。Ki-67是一種細胞增殖相關的核抗原，其表達水平與細胞的增殖活性密切相關。染色結果顯示，SOX9過表達組的腫瘤組織中Ki-67陽性細胞比例顯著高于對照組，而SOX9敲低組的腫瘤組織中Ki-67陽性細胞比例明顯低于對照組。這表明SOX9在體內能夠促進胃癌細胞的增殖，其表達水平的變化對腫瘤的生長具有顯著影響。4.1.3相關信號通路研究為深入探究SOX9影響胃癌細胞增殖的潛在分子機制，對PI3K/AKT、Wnt/β-catenin等相關信號通路進行研究。PI3K/AKT信號通路在細胞的增殖、存活、代謝等過程中發揮著關鍵作用，而Wnt/β-catenin信號通路則與胚胎發育、細胞分化和腫瘤發生密切相關。在PI3K/AKT信號通路研究中，通過蛋白質免疫印跡技術檢測敲低或過表達SOX9的胃癌細胞中PI3K、p-AKT（磷酸化AKT）和AKT的蛋白表達水平。結果顯示，與對照組相比，敲低SOX9后，胃癌細胞中PI3K的蛋白表達水平無明顯變化，但p-AKT的表達水平顯著降低，表明SOX9可能通過激活PI3K/AKT信號通路來促進胃癌細胞的增殖。為進一步驗證這一結果，使用PI3K抑制劑LY294002處理過表達SOX9的胃癌細胞。將過表達SOX9的SGC-7901細胞分為兩組，一組加入LY294002（終濃度為10μM）處理，另一組作為對照組加入等量的DMSO。處理24小時后，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。結果顯示，加入LY294002處理的細胞增殖速度明顯減緩，OD值顯著低于對照組，表明抑制PI3K/AKT信號通路能夠逆轉SOX9過表達對胃癌細胞增殖的促進作用。在Wnt/β-catenin信號通路研究中，通過蛋白質免疫印跡技術檢測敲低或過表達SOX9的胃癌細胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達水平。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵分子，其在細胞核內的積累能夠激活下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表達，從而促進細胞增殖。結果顯示，敲低SOX9后，胃癌細胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達水平均顯著降低；而過表達SOX9后，這些蛋白的表達水平明顯升高。為進一步驗證SOX9對Wnt/β-catenin信號通路的影響，使用Wnt信號通路抑制劑XAV939處理過表達SOX9的胃癌細胞。將過表達SOX9的BGC-823細胞分為兩組，一組加入XAV939（終濃度為5μM）處理，另一組作為對照組加入等量的DMSO。處理24小時后，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，并通過蛋白質免疫印跡技術檢測β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達水平。結果顯示，加入XAV939處理的細胞增殖速度明顯減緩，OD值顯著低于對照組，同時β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達水平也顯著降低，表明抑制Wnt/β-catenin信號通路能夠逆轉SOX9過表達對胃癌細胞增殖的促進作用。綜上所述，SOX9可能通過激活PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號通路，促進胃癌細胞的增殖。這為深入理解SOX9在胃癌發生發展中的作用機制提供了重要的理論依據，也為胃癌的治療提供了潛在的分子靶點。4.2SOX9對胃癌細胞轉移的影響4.2.1體外細胞實驗驗證為深入探究SOX9對胃癌細胞轉移能力的影響，本研究運用Transwell和劃痕實驗等方法，在體外水平對其進行驗證。在Transwell實驗中，選用具有良好侵襲和遷移能力的人胃癌細胞系SGC-7901和BGC-823，構建SOX9敲低和過表達的穩定細胞株。將Transwell小室置于24孔板中，小室上層加入無血清培養基，下層加入含10%胎牛血清的培養基，形成趨化梯度。取對數生長期的敲低或過表達SOX9的胃癌細胞，用無血清培養基重懸后，接種于Transwell小室的上室，每孔接種細胞數為5×104個。對照組則接種未轉染的胃癌細胞。將24孔板置于37℃、5%CO2培養箱中培養24-48小時。培養結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去小室上室未遷移的細胞，然后將小室浸入4%多聚甲醛溶液中固定15分鐘，再用0.1%結晶紫溶液染色15分鐘，最后用清水沖洗小室，晾干。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數穿過小室膜的細胞數量。結果顯示，與對照組相比，敲低SOX9的SGC-7901和BGC-823細胞穿過小室膜的細胞數量明顯減少，表明SOX9的敲低能夠顯著抑制胃癌細胞的遷移能力；而過表達SOX9的胃癌細胞穿過小室膜的細胞數量顯著增多，說明SOX9的過表達能夠促進胃癌細胞的遷移。在侵襲實驗中，同樣使用Transwell小室，但在小室的上室預先鋪一層Matrigel基質膠，以模擬體內細胞外基質環境，檢測細胞的侵襲能力。將Matrigel基質膠在4℃冰箱中融化，然后用無血清培養基按1:8的比例稀釋，取100μl稀釋后的Matrigel基質膠加入Transwell小室的上室，置于37℃培養箱中孵育4-6小時，使Matrigel基質膠凝固形成一層薄膜。將敲低或過表達SOX9的胃癌細胞用無血清培養基重懸后，接種于鋪有Matrigel基質膠的Transwell小室上室，每孔接種細胞數為8×104個。對照組接種未轉染的胃癌細胞。將24孔板置于37℃、5%CO2培養箱中培養48-72小時。培養結束后，按照遷移實驗的方法處理Transwell小室，在顯微鏡下計數穿過Matrigel基質膠和小室膜的細胞數量。結果表明，敲低SOX9的胃癌細胞穿過Matrigel基質膠和小室膜的細胞數量顯著低于對照組，而過表達SOX9的胃癌細胞穿過的細胞數量明顯高于對照組，說明SOX9能夠促進胃癌細胞的侵襲能力。劃痕實驗是另一種常用的檢測細胞遷移能力的方法。將敲低或過表達SOX9的胃癌細胞接種于6孔板中，待細胞長滿單層后，用200μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，制造細胞遷移的“傷口”。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞碎片，然后加入含1%胎牛血清的培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。在劃痕后的0小時、24小時和48小時，用倒置顯微鏡在相同視野下拍照記錄細胞遷移情況。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率。結果顯示，敲低SOX9的胃癌細胞在劃痕后的遷移率明顯低于對照組，而過表達SOX9的胃癌細胞遷移率顯著高于對照組。這進一步證實了SOX9能夠促進胃癌細胞的遷移，在胃癌細胞的轉移過程中發揮重要作用。4.2.2體內動物實驗驗證為了在體內環境下進一步驗證SOX9對胃癌細胞轉移的影響，構建胃癌轉移動物模型。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，將人胃癌細胞系SGC-7901分為三組，分別為對照組（注射未轉染的細胞）、SOX9敲低組（注射轉染了SOX9siRNA的細胞）和SOX9過表達組（注射轉染了SOX9過表達質粒的細胞）。將細胞用無血清培養基制成濃度為1×107個/ml的細胞懸液，通過尾靜脈注射的方式，每只裸鼠注射0.2ml細胞懸液，使細胞隨血液循環到達全身各處。在注射細胞后的第21天，處死裸鼠，對其進行解剖，觀察肺、肝等重要臟器的轉移情況。結果顯示，對照組和SOX9過表達組的裸鼠肺部和肝臟出現了明顯的轉移瘤結節，而SOX9敲低組的裸鼠肺部和肝臟轉移瘤結節數量明顯減少。對轉移瘤組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察轉移瘤的形態和結構。結果表明，SOX9過表達組的轉移瘤細胞形態不規則，核大深染，可見較多的核分裂象，表明腫瘤細胞的增殖活性較高；而SOX9敲低組的轉移瘤細胞形態相對規則，核分裂象較少，腫瘤細胞的增殖活性較低。為了進一步量化SOX9對胃癌細胞轉移的影響，對轉移瘤組織進行免疫組織化學染色，檢測轉移相關標志物如基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、血管內皮生長因子（VEGF）等的表達水平。MMP-9能夠降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移；VEGF則可以促進血管生成，為腫瘤細胞的轉移提供營養和途徑。染色結果顯示，SOX9過表達組的轉移瘤組織中MMP-9和VEGF的陽性表達率顯著高于對照組，而SOX9敲低組的轉移瘤組織中MMP-9和VEGF的陽性表達率明顯低于對照組。這表明SOX9在體內能夠促進胃癌細胞的轉移，其表達水平的變化對腫瘤的轉移具有顯著影響，可能通過調節轉移相關標志物的表達來實現其促進轉移的作用。4.2.3調控機制探究為深入探究SOX9影響胃癌細胞轉移的調控機制，研究其通過調控上皮-間質轉化（EMT）等過程對胃癌細胞轉移的影響。EMT是上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞特性的過程，這一過程使得上皮細胞獲得更強的遷移和侵襲能力，在腫瘤的轉移過程中發揮著關鍵作用。通過蛋白質免疫印跡技術檢測敲低或過表達SOX9的胃癌細胞中EMT相關標志物的表達水平，包括上皮標志物E-cadherin和間質標志物N-cadherin、Vimentin等。E-cadherin是一種重要的上皮細胞黏附分子，其表達降低會導致上皮細胞間黏附力下降，促進細胞的遷移和侵襲；而N-cadherin和Vimentin是間質細胞的標志物，它們的表達升高與細胞的間質化和轉移能力增強相關。結果顯示，與對照組相比，敲低SOX9后，胃癌細胞中E-cadherin的蛋白表達水平顯著升高，而N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平明顯降低，表明SOX9的敲低能夠抑制胃癌細胞的EMT過程；而過表達SOX9后，胃癌細胞中E-cadherin的蛋白表達水平顯著降低，N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平明顯升高，說明SOX9的過表達能夠促進胃癌細胞的EMT過程。為進一步驗證SOX9對EMT的調控作用，采用免疫熒光染色技術觀察EMT相關標志物在細胞中的定位和表達變化。將敲低或過表達SOX9的胃癌細胞接種于細胞爬片上，培養24小時后，用4%多聚甲醛固定細胞，然后用0.1%TritonX-100處理細胞以增加細胞膜的通透性，再用5%牛血清白蛋白封閉非特異性結合位點。分別加入E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的一抗，4℃孵育過夜，次日加入相應的熒光標記二抗，室溫孵育1小時，最后用DAPI染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示，敲低SOX9的胃癌細胞中E-cadherin在細胞膜上的表達明顯增強，呈現出連續的線性分布；而N-cadherin和Vimentin的表達則明顯減弱，在細胞內的分布減少。而過表達SOX9的胃癌細胞中E-cadherin在細胞膜上的表達顯著減弱，分布變得不連續；N-cadherin和Vimentin的表達則明顯增強，在細胞內廣泛分布。這進一步證實了SOX9能夠通過調控EMT相關標志物的表達，影響胃癌細胞的EMT過程，進而促進胃癌細胞的轉移。研究還發現，SOX9可能通過調控EMT相關的信號通路來發揮作用。例如，SOX9可能與Wnt/β-catenin信號通路相互作用，激活該信號通路，導致β-catenin在細胞核內積累，進而調控EMT相關基因的表達。通過蛋白質免疫印跡技術檢測敲低或過表達SOX9的胃癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關分子的表達水平，如β-catenin、c-Myc和CyclinD1等。結果顯示，敲低SOX9后，胃癌細胞中β-catenin、c-Myc和CyclinD1的蛋白表達水平均顯著降低；而過表達SOX9后，這些蛋白的表達水平明顯升高。這表明SOX9可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，調控EMT過程，促進胃癌細胞的轉移。此外，SOX9還可能與其他信號通路如TGF-β/Smad信號通路等相互作用，共同調節胃癌細胞的轉移過程，具體機制還有待進一步深入研究。五、CEACAM1對胃癌細胞增殖和轉移的影響機制5.1CEACAM1對胃癌細胞增殖的影響5.1.1體外細胞實驗驗證為探究CEACAM1對胃癌細胞增殖的影響，選用人胃癌細胞系MKN-45和BGC-823開展實驗。通過RNA干擾技術，設計并合成針對CEACAM1基因的小干擾RNA（siRNA），利用脂質體轉染法將其導入MKN-45細胞中。轉染48小時后，運用實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡技術，檢測CEACAM1mRNA和蛋白的表達水平，結果顯示CEACAM1的表達被顯著抑制。隨后，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。將轉染后的細胞接種于96孔板，每組設置5個復孔，在接種后的第1、2、3、4、5天分別加入CCK-8試劑，37℃孵育1-4小時，用酶標儀測定450nm處的吸光度值（OD值）。結果表明，與對照組相比，干擾CEACAM1表達后的MKN-45細胞OD值明顯降低，細胞增殖速度顯著減緩，這表明CEACAM1表達的降低能夠抑制胃癌細胞的增殖。為進一步驗證上述結果，構建CEACAM1過表達載體，通過脂質體轉染法將其導入BGC-823細胞中。轉染48小時后，同樣利用實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡技術驗證CEACAM1的過表達效果，結果顯示CEACAM1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，結果顯示，過表達CEACAM1的BGC-823細胞OD值明顯高于對照組，細胞增殖速度明顯加快，說明CEACAM1的過表達能夠促進胃癌細胞的增殖。為更直觀地觀察細胞增殖情況，進行EdU摻入實驗。將干擾或過表達CEACAM1的胃癌細胞接種于24孔板中，培養24小時后，加入EdU工作液，繼續孵育2小時。按照EdU檢測試劑盒的操作步驟，進行細胞固定、通透、染色等處理。在熒光顯微鏡下觀察，計數EdU陽性細胞（紅色熒光）和總細胞（藍色熒光DAPI染色）的數量，計算EdU陽性細胞比例。結果顯示，干擾CEACAM1表達的胃癌細胞中EdU陽性細胞比例明顯低于對照組，而過表達CEACAM1的胃癌細胞中EdU陽性細胞比例顯著高于對照組。這進一步證實了CEACAM1能夠促進胃癌細胞的增殖，其表達水平的變化對胃癌細胞的增殖能力具有重要影響。5.1.2體內動物實驗驗證為在體內環境下驗證CEACAM1對胃癌細胞增殖的影響，構建裸鼠移植瘤模型。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，在無菌條件下，將對數生長期的MKN-45細胞分為三組，分別為對照組（注射未轉染的細胞）、CEACAM1敲低組（注射轉染了CEACAM1siRNA的細胞）和CEACAM1過表達組（注射轉染了CEACAM1過表達質粒的細胞）。將細胞用無血清培養基制成濃度為1×107個/ml的細胞懸液，每只裸鼠在右側腋窩皮下注射0.2ml細胞懸液。接種后，每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。同時，觀察裸鼠的一般狀態，包括飲食、活動、體重等情況。結果顯示，隨著時間的推移，對照組和CEACAM1過表達組的腫瘤體積逐漸增大，而CEACAM1敲低組的腫瘤生長明顯緩慢。在接種后的第21天，CEACAM1過表達組的腫瘤體積顯著大于對照組，而CEACAM1敲低組的腫瘤體積顯著小于對照組。實驗結束時，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并拍照。結果顯示，CEACAM1過表達組的腫瘤重量明顯高于對照組，而CEACAM1敲低組的腫瘤重量明顯低于對照組。進一步對腫瘤組織進行免疫組織化學染色，檢測Ki-67的表達水平。Ki-67是一種細胞增殖相關的核抗原，其表達水平與細胞的增殖活性密切相關。染色結果顯示，CEACAM1過表達組的腫瘤組織中Ki-67陽性細胞比例顯著高于對照組，而CEACAM1敲低組的腫瘤組織中Ki-67陽性細胞比例明顯低于對照組。這表明CEACAM1在體內能夠促進胃癌細胞的增殖，其表達水平的變化對腫瘤的生長具有顯著影響。5.1.3相關分子機制探討為深入探究CEACAM1影響胃癌細胞增殖的分子機制，對Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT等相關信號通路進行研究。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路在細胞的增殖、分化和存活等過程中發揮著重要作用，而PI3K/AKT信號通路則與細胞的生長、代謝和存活密切相關。在Ras/Raf/MEK/ERK信號通路研究中，通過蛋白質免疫印跡技術檢測干擾或過表達CEACAM1的胃癌細胞中Ras、Raf、p-MEK（磷酸化MEK）和p-ERK（磷酸化ERK）的蛋白表達水平。結果顯示，與對照組相比，干擾CEACAM1表達后，胃癌細胞中Ras、Raf、p-MEK和p-ERK的蛋白表達水平顯著降低；而過表達CEACAM1后，這些蛋白的表達水平明顯升高。為進一步驗證這一結果，使用MEK抑制劑U0126處理過表達CEACAM1的胃癌細胞。將過表達CEACAM1的MKN-45細胞分為兩組，一組加入U0126（終濃度為10μM）處理，另一組作為對照組加入等量的DMSO。處理24小時后，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。結果顯示，加入U0126處理的細胞增殖速度明顯減緩，OD值顯著低于對照組，表明抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號通路能夠逆轉CEACAM1過表達對胃癌細胞增殖的促進作用。在PI3K/AKT信號通路研究中，通過蛋白質免疫印跡技術檢測干擾或過表達CEACAM1的胃癌細胞中PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表達水平。結果顯示，干擾CEACAM1表達后，胃癌細胞中PI3K和p-AKT的蛋白表達水平顯著降低；而過表達CEACAM1后，這些蛋白的表達水平明顯升高。為進一步驗證CEACAM1對PI3K/AKT信號通路的影響，使用PI3K抑制劑LY294002處理過表達CEACAM1的胃癌細胞。將過表達CEACAM1的BGC-823細胞分為兩組，一組加入LY294002（終濃度為10μM）處理，另一組作為對照組加入等量的DMSO。處理24小時后，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，并通過蛋白質免疫印跡技術檢測PI3K和p-AKT的蛋白表達水平。結果顯示，加入LY294002處理的細胞增殖速度明顯減緩，OD值顯著低于對照組，同時PI3K和p-AKT的蛋白表達水平也顯著降低，表明抑制PI3K/AKT信號通路能夠逆轉CEACAM1過表達對胃癌細胞增殖的促進作用。綜上所述，CEACAM1可能通過激活Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路，促進胃癌細胞的增殖。這為深入理解CEACAM1在胃癌發生發展中的作用機制提供了重要的理論依據，也為胃癌的治療提供了潛在的分子靶點。5.2CEACAM1對胃癌細胞轉移的影響5.2.1體外細胞實驗驗證為探究CEACAM1對胃癌細胞轉移能力的影響，運用Transwell和劃痕實驗等方法開展體外驗證。在Transwell遷移實驗中，選用人胃癌細胞系AGS和SGC-7901，通過RNA干擾技術構建CEACAM1低表達的細胞株，同時構建CEACAM1過表達載體并轉染至細胞中。將Transwell小室放入24孔板，小室上層加無血清培養基，下層加含10%胎牛血清的培養基以形成趨化梯度。取對數生長期的CEACAM1低表達、過表達及對照細胞，用無血清培養基重懸后，接種于Transwell小室的上室，每孔接種細胞數為5×104個。將24孔板置于37℃、5%CO2培養箱培養24小時。培養結束后，擦去小室上室未遷移的細胞，用4%多聚甲醛固定15分鐘，0.1%結晶紫染色15分鐘，清水沖洗晾干。在顯微鏡下隨機選5個視野，計數穿過小室膜的細胞數量。結果顯示，與對照組相比，CEACAM1低表達的AGS和SGC-7901細胞穿過小室膜的細胞數量明顯減少，表明CEACAM1表達降低可顯著抑制胃癌細胞的遷移能力；而過表達CEACAM1的胃癌細胞穿過小室膜的細胞數量顯著增多，說明CEACAM1過表達能夠促進胃癌細胞的遷移。在Transwell侵襲實驗中，在小室上室預先鋪一層Matrigel基質膠以模擬體內細胞外基質環境。將Matrigel基質膠在4℃冰箱融化，用無血清培養基按1:8比例稀釋，取100μl稀釋后的Matrigel基質膠加入Transwell小室上室，37℃孵育4-6小時使其凝固成膜。將CEACAM1低表達、過表達及對照細胞用無血清培養基重懸后，接種于鋪有Matrigel基質膠的Transwell小室上室，每孔接種細胞數為8×104個。將24孔板置于37℃、5%CO2培養箱培養48小時。培養結束后，按遷移實驗方法處理Transwell小室，顯微鏡下計數穿過Matrigel基質膠和小室膜的細胞數量。結果表明，CEACAM1低表達的胃癌細胞穿過Matrigel基質膠和小室膜的細胞數量顯著低于對照組，而過表達CEACAM1的胃癌細胞穿過的細胞數量明顯高于對照組，說明CEACAM1能夠促進胃癌細胞的侵襲能力。劃痕實驗中，將CEACAM1低表達、過表達及對照細胞接種于6孔板，待細胞長滿單層后，用200μl移液器槍頭垂直劃痕制造細胞遷移的“傷口”。用PBS沖洗3次去除劃下的細胞碎片，加入含1%胎牛血清的培養基，置于37℃、5%CO2培養箱培養。在劃痕后的0小時、24小時和48小時，用倒置顯微鏡在相同視野拍照記錄細胞遷移情況。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率。結果顯示，CEACAM1低表達的胃癌細胞在劃痕后的遷移率明顯低于對照組，而過表達CEACAM1的胃癌細胞遷移率顯著高于對照組。這進一步證實了CEACAM1能夠促進胃癌細胞的遷移，在胃癌細胞的轉移過程中發揮重要作用。5.2.2體內動物實驗驗證為在體內環境下驗證CEACAM1對胃癌細胞轉移的影響，構建胃癌轉