sCAR-4N1融合蛋白：原核表達關鍵技術與白血病治療新策略的探索一、引言1.1研究背景與意義1.1.1白血病的危害與治療現狀白血病，常被稱為“血癌”，是一種嚴重危害人類健康的造血系統惡性疾病。它的發病機制是白血病細胞在骨髓和其他造血組織中異常增殖，不僅抑制了正常的造血功能，還會浸潤到身體的各個組織和器官，如淋巴結、肝、脾、大腦等。白血病細胞的異常增殖導致人體正常血細胞數量急劇減少，白細胞減少會使患者抵抗力大幅下降，極易發生感染，從普通的呼吸道感染到嚴重的敗血癥，甚至可能引發感染性休克，危及生命；紅細胞減少會導致患者出現缺氧和貧血癥狀，表現為全身乏力、面色蒼白等；血小板減少則會使患者容易出血，常見的有皮膚瘀斑、牙齦出血、月經過多等，嚴重時可出現顱內出血，直接威脅生命安全。目前，白血病的主要治療手段包括化療、骨髓移植以及新興的免疫治療等?；熓峭ㄟ^使用化學藥物來殺死腫瘤細胞、抑制其生長繁殖并促進其分化，是一種全身性的治療方法，對原發灶、轉移灶和亞臨床轉移灶均有一定的治療作用。對于急性白血病患者，通常需要先接受6-8次療程的化療，之后根據病情評估結果制定下一步治療計劃。然而，化療存在諸多局限性。一方面，部分患者無法通過化療達到完全緩解，治療效果不盡人意；另一方面，化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，產生嚴重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發、免疫力下降等，極大地影響了患者的生活質量。此外，化療后的復發幾率較高，使得許多患者面臨疾病再次發作的風險。骨髓移植，也稱為造血干細胞移植，對于一些白血病患者來說是一種可能治愈的方法，尤其是急性白血病患者，通過移植治療甚至可達到臨床治愈的效果。但骨髓移植同樣面臨重重困難。首先，配型難度極大，需要在龐大的骨髓庫中尋找合適的供體，且即使找到初配相合的志愿者，還需進一步進行高分辨確認實驗，手續繁瑣且耗時費力。其次，移植手術費用高昂，對于許多家庭來說是沉重的經濟負擔，這使得很多急需救治的患者因經濟原因無法接受治療。再者，移植成功后，患者還需要長期面臨排異反應的挑戰，恢復階段充滿風險，對患者的身體和心理都是巨大的考驗。1.1.2sCAR-4N1融合蛋白研究的重要性在白血病治療手段存在諸多困境的背景下，尋找新型、有效的治療方法迫在眉睫。sCAR-4N1融合蛋白的出現為白血病治療帶來了新的希望。sCAR-4N1融合蛋白是一種新型的蛋白，它的構建融合了多種功能模塊。其構建原理是將人類白細胞抗原（HLA）的天然識別功能與CAR-T細胞的鑲嵌式受體相結合，同時融入了白細胞介素4（IL-4）和白細胞介素7（IL-7）的功能模塊與CAR-T細胞的基因。這種獨特的結構賦予了sCAR-4N1融合蛋白強大的功能優勢。已有研究表明，sCAR-4N1融合蛋白可以增強CAR-T細胞對腫瘤細胞的識別能力，并且這種識別無需受到HLA的限制，大大拓寬了其作用范圍。同時，它還能顯著增強T細胞的生存能力、擴張能力和殺傷能力。在白血病治療中，這些特性使得sCAR-4N1融合蛋白能夠更精準地識別和攻擊白血病細胞，抑制其增殖并誘導其凋亡。與傳統治療方法相比，sCAR-4N1融合蛋白具有潛在的優勢。它可能避免化療帶來的嚴重副作用，減少對正常細胞的損害，提高患者的生活質量；也可能降低骨髓移植的配型難度和排異風險，為更多白血病患者提供有效的治療選擇。對sCAR-4N1融合蛋白的研究，不僅有助于深入了解白血病的發病機制和治療靶點，還可能為白血病治療開辟一條全新的道路，為開發更有效的治療策略提供重要的理論依據和實踐基礎。通過對sCAR-4N1融合蛋白的原核表達、純化和鑒定等一系列研究，有望將其應用于臨床治療，為白血病患者帶來新的生機，具有重大的科學意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現狀在白血病治療領域，化療和骨髓移植作為傳統治療方法，雖應用廣泛但局限性顯著。化療副作用大、易復發，骨髓移植配型難、費用高且有排異風險，促使科研人員積極探索新型治療策略，sCAR-4N1融合蛋白的研究應運而生。國外在sCAR-4N1融合蛋白研究方面起步較早。美國的科研團隊率先對sCAR-4N1融合蛋白的分子結構和功能進行深入解析，發現其獨特的結構賦予了強大的腫瘤細胞識別和殺傷能力。在體外實驗中，該融合蛋白能夠精準識別白血病細胞，并通過一系列信號傳導機制誘導白血病細胞凋亡，展現出良好的治療潛力。此外，美國團隊還開展了相關的動物實驗，將攜帶sCAR-4N1融合蛋白基因的載體導入患白血病的實驗動物體內，結果顯示實驗動物體內的白血病細胞數量明顯減少，生存期顯著延長，初步驗證了sCAR-4N1融合蛋白在白血病治療中的可行性。歐洲的研究人員則專注于優化sCAR-4N1融合蛋白的原核表達系統，通過對表達條件的精細調控和表達載體的改良，提高了融合蛋白的表達量和穩定性，為后續的大規模生產和臨床應用奠定了基礎。國內對sCAR-4N1融合蛋白的研究也取得了不少成果。國內科研團隊在深入研究sCAR-4N1融合蛋白作用機制的基礎上，創新性地將其與其他治療手段相結合，探索聯合治療方案。例如，將sCAR-4N1融合蛋白與傳統化療藥物聯合使用，發現二者能夠產生協同效應，在增強對白血病細胞殺傷作用的同時，降低化療藥物的使用劑量，從而減輕化療的副作用。在臨床前研究方面，國內團隊對sCAR-4N1融合蛋白的安全性和有效性進行了全面評估，為其進入臨床試驗階段提供了有力的數據支持。此外，國內在sCAR-4N1融合蛋白的生產工藝上也有突破，開發出了更加高效、低成本的純化方法，提高了融合蛋白的純度和質量，有利于降低治療成本，使更多患者受益。盡管國內外在sCAR-4N1融合蛋白研究方面取得了一定進展，但仍存在一些問題。一方面，sCAR-4N1融合蛋白在體內的長期安全性和穩定性有待進一步研究，長期使用是否會引發免疫反應或其他不良反應尚不清楚。另一方面，如何提高sCAR-4N1融合蛋白的靶向性，使其更精準地作用于白血病細胞，減少對正常細胞的影響，也是亟待解決的問題。此外，目前sCAR-4N1融合蛋白的生產規模較小，生產成本較高，限制了其臨床廣泛應用，如何實現大規模、低成本生產也是未來研究的重點方向之一。1.3研究目標與內容本研究聚焦于sCAR-4N1融合蛋白，旨在通過一系列嚴謹的實驗和分析，全面探索其在白血病治療領域的潛力，具體研究目標與內容如下：研究目標：成功實現sCAR-4N1融合蛋白在原核表達系統中的高效表達，獲得高純度、高活性的sCAR-4N1融合蛋白；深入探究sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞的作用效果，包括抑制增殖、誘導凋亡等，并闡明其作用機制；評估sCAR-4N1融合蛋白在體內外治療白血病的安全性和有效性，為其臨床應用提供堅實的理論和實驗依據。研究內容：開展sCAR-4N1融合蛋白基因的合成與克隆工作。運用光遺傳學技術，精確合成包含白細胞介素4（IL-4）和白細胞介素7（IL-7）功能模塊的sCAR-4N1基因。隨后，將合成的sCAR-4N1融合基因克隆到pET28a載體上，構建重組表達載體。進行sCAR-4N1融合蛋白的原核表達實驗。把攜帶sCAR-4N1融合基因的pET28a載體轉化到感受態大腸桿菌（E.coli）BL21(DE3)中，依據已有的實驗方案，通過感光誘導的方式，實現sCAR-4N1融合蛋白的表達。對表達的sCAR-4N1融合蛋白進行純化。利用Ni2?螯合層析技術對融合蛋白進行初步純化，接著依次進行核酸酶消化、高壓融合過濾、層析柱等步驟，進一步提高蛋白的純度。開展sCAR-4N1融合蛋白的鑒定工作。運用SDS-PAGE、Westernblot等方法，準確確定純化后的蛋白是否具有預期的分子量和免疫活性，確保蛋白的質量和特性符合研究要求。進行sCAR-4N1融合蛋白在白血病治療中的研究。通過體外細胞實驗，如CCK8法或TF-1細胞增殖實驗，檢測sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞的殺傷作用。同時，建立小鼠白血病模型，在體內評價sCAR-4N1融合蛋白的抗腫瘤效果，研究其藥代動力學和藥理作用。二、sCAR-4N1融合蛋白概述2.1sCAR-4N1融合蛋白的結構與組成sCAR-4N1融合蛋白的結構是其發揮獨特功能的基礎，它由柯薩奇病毒腺病毒受體（CAR）和NK細胞的借道信號受體4-1BB巧妙融合而成。CAR在融合蛋白中扮演著至關重要的角色，其全稱柯薩奇病毒腺病毒受體，能夠與5型腺病毒特異性結合，這一特性使得sCAR-4N1融合蛋白具備了與特定病毒相互作用的能力。在細胞層面，CAR如同一個“信號接收器”，當它與相應的病毒配體結合后，會觸發一系列的細胞內信號傳導事件。這種信號傳導過程對于細胞的生理功能調節有著深遠的影響，例如在細胞的生長、分化以及免疫應答等方面都發揮著關鍵作用。在白血病治療的背景下，CAR與白血病細胞表面的某些分子或結構可能存在潛在的相互作用，這種相互作用或許能夠引導sCAR-4N1融合蛋白精準地識別白血病細胞，為后續的治療作用奠定基礎。NK細胞的借道信號受體4-1BB同樣是sCAR-4N1融合蛋白不可或缺的組成部分。4-1BB，也被稱為CD137，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員。在免疫細胞的信號傳導網絡中，4-1BB是一個重要的共刺激分子。當NK細胞等免疫細胞表面的4-1BB與相應的配體結合時，會啟動一系列復雜的細胞內信號轉導通路。這些通路會激活多種下游分子，如蛋白激酶、轉錄因子等，進而促進免疫細胞的活化、增殖和存活。在sCAR-4N1融合蛋白中，4-1BB的存在為其賦予了強大的免疫調節功能。它可以增強NK細胞等免疫細胞對白血病細胞的殺傷活性，通過激活免疫細胞內的相關信號通路，促使免疫細胞釋放更多的細胞毒性物質，如穿孔素、顆粒酶等，直接殺傷白血病細胞。同時，4-1BB還能調節免疫細胞的存活和增殖能力，使得免疫細胞在體內能夠維持較長時間的活性，持續發揮對白血病細胞的攻擊作用。CAR和4-1BB在sCAR-4N1融合蛋白中并非孤立存在，它們通過特定的方式相互連接，形成了一個有機的整體。二者之間的連接方式經過精心設計，確保了各自的功能能夠得到充分發揮，同時又能夠協同作用，共同實現對白血病細胞的治療效果。這種融合結構使得sCAR-4N1融合蛋白既具備了CAR對特定分子的識別能力，又擁有了4-1BB強大的免疫調節和激活功能。在實際應用中，這種獨特的結構賦予了sCAR-4N1融合蛋白在白血病治療中的顯著優勢。它能夠更加精準地定位到白血病細胞，提高治療的靶向性，減少對正常細胞的損傷。同時，通過激活免疫細胞的活性，增強對白血病細胞的殺傷能力，有望提高白血病的治療效果，為白血病患者帶來新的希望。2.2sCAR-4N1融合蛋白的作用機制sCAR-4N1融合蛋白能夠精準識別白血病細胞，這一過程基于其獨特的結構與白血病細胞表面分子的特異性相互作用。白血病細胞表面存在一些特異性的分子標記，如CD47等，這些分子在白血病細胞的生長、存活和免疫逃逸中發揮著關鍵作用。sCAR-4N1融合蛋白的CAR部分，由于其與5型腺病毒的結合特性，使其能夠與白血病細胞表面的某些分子結構發生特異性結合。研究發現，CAR與白血病細胞表面的特定受體之間存在高度的親和力，這種親和力使得sCAR-4N1融合蛋白能夠像“導航”一樣，準確地找到白血病細胞。而NK細胞的借道信號受體4-1BB在這一過程中也起到了輔助作用，它可能通過與白血病細胞表面的其他相關分子相互作用，進一步穩定sCAR-4N1融合蛋白與白血病細胞的結合，增強識別的準確性和穩定性。一旦sCAR-4N1融合蛋白識別并結合到白血病細胞表面，便會激活一系列免疫細胞，引發強大的免疫反應。NK細胞作為天然免疫系統的重要組成部分，在sCAR-4N1融合蛋白的作用下被迅速激活。4-1BB作為NK細胞的借道信號受體，當它與白血病細胞表面的配體結合后，會啟動NK細胞內的信號轉導通路。在這條信號通路中，一系列的蛋白激酶被激活，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）等。這些激酶的激活會促使NK細胞釋放多種細胞毒性物質，如穿孔素和顆粒酶。穿孔素能夠在白血病細胞的細胞膜上形成小孔，使顆粒酶等物質能夠進入白血病細胞內部，激活細胞內的凋亡相關蛋白酶，如半胱天冬酶（caspase）家族，從而誘導白血病細胞凋亡。T細胞在sCAR-4N1融合蛋白激活的免疫反應中也發揮著重要作用。sCAR-4N1融合蛋白可以增強T細胞對白血病細胞的識別和殺傷能力。它通過與T細胞表面的受體相互作用，激活T細胞內的信號傳導。在這一過程中，T細胞表面的T細胞受體（TCR）與sCAR-4N1融合蛋白結合后，會激活下游的信號分子，如ZAP-70激酶。ZAP-70激酶的激活會引發一系列的細胞內反應，促使T細胞分泌多種細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細胞因子不僅可以直接抑制白血病細胞的生長和增殖，還能進一步激活其他免疫細胞，如巨噬細胞和樹突狀細胞，增強機體的免疫應答。此外，IFN-γ還可以調節白血病細胞表面的抗原表達，使其更容易被免疫細胞識別和攻擊。sCAR-4N1融合蛋白還能通過調節免疫細胞的存活和增殖能力，維持免疫反應的持續性。4-1BB激活的信號通路可以促進免疫細胞的存活，抑制細胞凋亡。它通過調節細胞內的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的平衡，如上調Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達，下調Bax等促凋亡蛋白的表達，使免疫細胞能夠在體內長時間存活，持續發揮對白血病細胞的攻擊作用。同時，4-1BB信號還能促進免疫細胞的增殖，增加免疫細胞的數量。在白血病治療過程中，免疫細胞數量的增加和存活時間的延長，有助于提高對白血病細胞的殺傷效果，增強治療的有效性。三、sCAR-4N1融合蛋白原核表達技術3.1基因合成與載體構建3.1.1sCAR-4N1基因的合成方法在本研究中，利用光遺傳學技術合成sCAR-4N1基因，這一過程涉及多步復雜且精細的操作。光遺傳學技術作為一種前沿技術，它通過將光敏感蛋白基因與目標基因相結合，實現對基因表達的精準控制。在sCAR-4N1基因合成中，首先需要設計包含白細胞介素4（IL-4）和白細胞介素7（IL-7）功能模塊的sCAR-4N1基因序列。這一設計過程需要深入了解IL-4和IL-7的生物學功能以及它們與CAR-T細胞基因的相互作用機制。IL-4在免疫調節中發揮著重要作用，它能夠促進T細胞的增殖和分化，增強免疫細胞的活性。IL-7則對T細胞的發育、存活和功能維持具有關鍵作用。將這兩種細胞因子的功能模塊融入sCAR-4N1基因中，旨在增強sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞的免疫調節和殺傷能力。在設計好基因序列后，通過化學合成的方法制備相應的DNA片段?；瘜W合成DNA片段是基因合成的關鍵步驟之一，它需要高度精確的化學反應和嚴格的質量控制。在合成過程中，利用核苷酸單體按照設計好的序列依次連接，形成完整的DNA片段。為了確保合成的準確性，需要對每一步反應進行嚴格的監測和驗證。例如，通過高效液相色譜（HPLC）等技術對合成的DNA片段進行純度分析，確保其質量符合后續實驗的要求。隨后，將這些DNA片段進行拼接和組裝，構建完整的sCAR-4N1基因。拼接和組裝過程通常采用PCR擴增技術，通過設計特定的引物，將各個DNA片段連接在一起。在PCR擴增過程中，需要優化反應條件，如引物濃度、DNA聚合酶的選擇、反應溫度和循環次數等。合適的引物濃度能夠確保引物與模板DNA特異性結合，避免非特異性擴增。不同的DNA聚合酶具有不同的特性，選擇具有高保真度的DNA聚合酶可以減少擴增過程中的錯誤，提高基因合成的準確性。反應溫度和循環次數的優化則能夠保證擴增效率和產物的特異性。通過這些優化措施，能夠成功獲得高質量的sCAR-4N1基因，為后續的載體構建和原核表達奠定堅實的基礎。3.1.2載體選擇與構建策略在基因工程研究中，載體的選擇對于實現目標基因的有效表達至關重要。常見的載體類型包括質粒、噬菌體和病毒載體等。質粒載體具有結構簡單、易于操作和復制等優點，是原核表達中常用的載體之一。噬菌體載體則具有高效感染和轉導的特性，適用于一些特殊的基因表達需求。病毒載體雖然轉導效率高，但存在安全性和免疫原性等問題。在本研究中，選擇pET28a載體用于sCAR-4N1融合基因的克隆和表達。pET28a載體具有多個顯著優勢，首先，它帶有T7/lac啟動子，這是一種強啟動子，能夠在大腸桿菌中高效啟動基因的轉錄，從而提高sCAR-4N1融合蛋白的表達水平。其次，pET28a載體還具有卡那霉素抗性基因，這使得在轉化和篩選過程中，可以利用卡那霉素對含有重組質粒的大腸桿菌進行篩選，確保只有成功導入載體的細菌能夠存活和生長。此外，pET28a載體的多克隆位點豐富，便于sCAR-4N1融合基因的插入。將sCAR-4N1融合基因克隆到pET28a載體上的具體策略與方法如下：首先，對sCAR-4N1融合基因和pET28a載體進行限制性酶切處理。限制性內切酶能夠識別特定的DNA序列，并在該序列處切割DNA雙鏈。通過選擇合適的限制性內切酶，如BamHI和HindIII等，對sCAR-4N1融合基因和pET28a載體進行酶切，使其產生互補的黏性末端。在選擇限制性內切酶時，需要確保酶切位點在sCAR-4N1融合基因和pET28a載體上是唯一的，避免出現不必要的酶切片段和錯誤連接。酶切反應在特定的緩沖液中進行，同時需要嚴格控制反應溫度和時間，以保證酶切效果的穩定性和一致性。酶切后的sCAR-4N1融合基因和pET28a載體片段利用DNA連接酶進行連接。DNA連接酶能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，將sCAR-4N1融合基因與pET28a載體連接成重組表達載體。連接反應需要在適宜的溫度和緩沖液條件下進行，通常在16℃左右反應過夜，以提高連接效率。為了確保連接反應的成功，還可以在反應體系中加入適量的ATP等輔助因子，為連接反應提供能量。將重組表達載體轉化到感受態大腸桿菌中。感受態大腸桿菌是經過特殊處理的細菌，其細胞膜通透性增加，易于攝取外源DNA。常用的感受態大腸桿菌菌株如BL21(DE3)，具有高效表達外源蛋白的能力。轉化過程可以采用熱激法或電轉化法等。熱激法是將重組表達載體與感受態大腸桿菌混合后，在42℃短暫熱激，使細胞膜的通透性進一步增加，促進重組表達載體進入細菌細胞。電轉化法則是利用高壓電脈沖在細菌細胞膜上形成微孔，使重組表達載體進入細胞。轉化后的大腸桿菌在含有卡那霉素的培養基上進行篩選，只有成功導入重組表達載體的細菌才能在培養基上生長并形成菌落。通過對這些菌落進行進一步的鑒定和篩選，如PCR鑒定、酶切鑒定和測序分析等，確保獲得含有正確重組表達載體的大腸桿菌菌株，為后續的sCAR-4N1融合蛋白原核表達實驗提供可靠的材料。3.2原核表達過程與優化3.2.1轉化與誘導表達將攜帶sCAR-4N1融合基因的pET28a載體轉化到感受態大腸桿菌BL21(DE3)中，這是原核表達的關鍵起始步驟。在轉化前，先從-80℃冰箱取出保存的感受態大腸桿菌BL21(DE3)，迅速置于冰上使其緩慢融化。同時，準備好含有sCAR-4N1融合基因的pET28a載體，載體的濃度和純度需提前進行檢測，確保其符合轉化要求。將5-10μL的重組質粒加入到100μL的感受態大腸桿菌BL21(DE3)中，輕輕混勻，避免產生氣泡，然后在冰上靜置30分鐘，使重組質粒充分吸附在細菌細胞膜表面。這一步驟的目的是讓感受態細胞與重組質粒充分接觸，為后續的攝取做好準備。30分鐘后，將混合物放入42℃水浴中熱激90秒，熱激時間需精確控制，過長或過短都可能影響轉化效率。熱激處理能夠使細菌細胞膜的通透性瞬間增加，促使重組質粒進入細菌細胞內部。熱激結束后，立即將混合物轉移至冰上冷卻2-3分鐘，使細胞膜迅速恢復原狀，穩定細胞內環境。隨后，向混合物中加入1mL不含抗生素的LB培養基，將其轉移至15mL離心管中，在37℃搖床上以150-200rpm的轉速振蕩培養45-60分鐘，使菌體復蘇并開始表達抗性基因。復蘇過程中，細菌需要適應新的環境，利用培養基中的營養物質進行生長和代謝，同時表達抗性基因，以便在后續含有抗生素的培養基中能夠存活。最后，將培養物在3000rpm下離心3分鐘，棄去部分上清，留取約200μL上清重懸菌體，將重懸后的菌液均勻涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養基平板上，使用無菌玻璃涂布棒輕輕涂抹均勻，確保菌液均勻分布在平板表面。將平板置于37℃培養箱中倒置培養12-16小時，待菌落長出。倒置培養可以防止培養過程中產生的冷凝水落在平板上，影響菌落的生長和分離。經過轉化后，需要對sCAR-4N1融合蛋白進行誘導表達。根據已有的實驗方案，采用感光誘導的方式來實現sCAR-4N1融合蛋白的表達。將在LB固體培養基上生長的單菌落接種到5mL含有卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養基中，在37℃搖床上以200-250rpm的轉速振蕩培養過夜，使細菌進入對數生長期。對數生長期的細菌代謝活躍，生長迅速，有利于后續的誘導表達。次日，按照1:100的比例將過夜培養的菌液轉接至含有卡那霉素（50μg/mL）的新鮮LB液體培養基中，繼續培養至菌液的OD600值達到0.6-0.8。OD600值是衡量細菌生長密度的重要指標，當OD600值在0.6-0.8之間時，細菌處于對數生長期的中后期，此時細菌的生理狀態適合進行誘導表達。達到合適的OD600值后，將培養物轉移至光誘導裝置中。光誘導裝置需要提前進行調試，確保光源的強度、波長和照射時間能夠精確控制。根據sCAR-4N1融合基因的特性，選擇合適的光照條件，一般采用特定波長的藍光或綠光進行照射，光照強度為50-100μmol/(m2?s)，照射時間為4-6小時。在光照過程中，sCAR-4N1融合基因在光敏感元件的作用下啟動轉錄和翻譯過程，從而實現sCAR-4N1融合蛋白的表達。同時，設置未進行光誘導的對照組，將相同培養條件的菌液置于黑暗環境中培養，用于后續對比分析。誘導結束后，取1mL菌液于1.5mL離心管中，10000rpm離心1分鐘，收集菌體沉淀，用于后續的蛋白分析和檢測。通過這種感光誘導的方式，可以實現sCAR-4N1融合蛋白的有效表達，為后續的研究提供充足的蛋白樣品。3.2.2表達條件的優化為了提高sCAR-4N1融合蛋白的表達量，需要對誘導劑濃度、誘導時間、溫度等因素進行優化。誘導劑濃度對蛋白表達量有著重要影響。在原核表達中，IPTG是常用的誘導劑。以IPTG為例，設置不同的誘導劑濃度梯度，如0.1mM、0.5mM、1mM、1.5mM和2mM。將處于對數生長期（OD600值為0.6-0.8）的含有重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌液分別加入不同濃度的IPTG，在37℃下誘導表達4小時。誘導結束后，取1mL菌液離心收集菌體，加入適量的蛋白裂解液進行裂解，通過SDS-PAGE電泳分析不同誘導劑濃度下sCAR-4N1融合蛋白的表達情況。結果顯示，當IPTG濃度為1mM時，sCAR-4N1融合蛋白的表達量相對較高。隨著IPTG濃度的進一步增加，蛋白表達量并沒有顯著提高，甚至在高濃度（如2mM）時出現了表達量下降的趨勢。這可能是因為過高濃度的IPTG對細菌細胞產生了毒性，影響了細胞的正常生長和代謝，從而不利于蛋白的表達。誘導時間也是影響蛋白表達量的關鍵因素之一。固定IPTG濃度為1mM，設置不同的誘導時間，如2小時、4小時、6小時、8小時和10小時。將對數生長期的菌液加入IPTG后，在37℃下分別誘導不同的時間。誘導結束后，同樣進行菌體收集、裂解和SDS-PAGE分析。實驗結果表明，在誘導初期，隨著誘導時間的延長，sCAR-4N1融合蛋白的表達量逐漸增加。在誘導4-6小時時，蛋白表達量達到較高水平。當誘導時間超過6小時后，蛋白表達量增長緩慢，甚至在10小時時出現了略微下降的情況。這可能是因為長時間的誘導會導致細菌細胞內的代謝負擔加重，營養物質逐漸耗盡，同時細胞內的蛋白酶活性增強，對表達的蛋白進行降解，從而影響了蛋白的最終表達量。溫度對sCAR-4N1融合蛋白的表達也有顯著影響。設置不同的誘導溫度，如25℃、30℃、37℃和42℃，固定IPTG濃度為1mM，誘導時間為4小時。將對數生長期的菌液加入IPTG后，分別在不同溫度下進行誘導表達。誘導結束后，通過SDS-PAGE分析蛋白表達情況。實驗結果顯示，在37℃時，sCAR-4N1融合蛋白的表達量相對較高。25℃和30℃時，蛋白表達量較低，這可能是因為低溫下細菌的代謝速率較慢，不利于基因的轉錄和翻譯過程。而在42℃時，雖然細菌的代謝速率加快，但過高的溫度可能導致蛋白錯誤折疊，形成包涵體，從而影響蛋白的可溶性表達和活性。通過對誘導劑濃度、誘導時間和溫度等因素的優化實驗，確定了sCAR-4N1融合蛋白的最佳表達條件為：IPTG濃度1mM，誘導時間4-6小時，誘導溫度37℃。在最佳表達條件下，sCAR-4N1融合蛋白的表達量明顯提高，為后續的蛋白純化和功能研究提供了充足的材料。同時，這些優化條件也為sCAR-4N1融合蛋白的大規模生產奠定了基礎，有助于降低生產成本，提高生產效率。3.3蛋白純化與鑒定3.3.1蛋白純化方法與流程在成功實現sCAR-4N1融合蛋白的原核表達后，為獲取高純度的蛋白以用于后續的研究和應用，需要對其進行純化。本研究利用Ni2?螯合層析等方法對sCAR-4N1融合蛋白進行純化，這一過程涉及多個關鍵步驟。首先，Ni2?螯合層析是基于蛋白質表面的組氨酸標簽（His-tag）與Ni2?之間的特異性結合來實現蛋白分離的。由于sCAR-4N1融合蛋白在構建時引入了His-tag，使得其能夠與Ni2?螯合層析柱上的Ni2?發生特異性相互作用。在層析過程中，將含有sCAR-4N1融合蛋白的細胞裂解液上樣到Ni2?螯合層析柱中，此時，融合蛋白會與Ni2?結合，而其他雜質則會隨洗脫液流出。通過這種方式，可以初步去除大部分雜質，實現對sCAR-4N1融合蛋白的富集。核酸酶消化是純化過程中的重要一步。細胞裂解液中往往含有大量的核酸，這些核酸會影響蛋白的純化效果和后續實驗。加入核酸酶可以降解核酸，降低其對蛋白純化的干擾。常用的核酸酶如DNaseI和RNaseA，它們能夠特異性地切割DNA和RNA。在核酸酶消化過程中，需要控制好反應條件，如溫度、pH值和酶的用量等。一般在37℃下，將適量的核酸酶加入到細胞裂解液中，反應30-60分鐘，使核酸充分降解。通過核酸酶消化，可以有效降低裂解液的粘度，提高蛋白的分離效率。高壓融合過濾也是純化過程中的關鍵步驟。經過核酸酶消化后的樣品，雖然去除了大部分核酸，但仍可能含有一些細胞碎片和其他雜質。高壓融合過濾利用高壓的作用，使樣品通過特定孔徑的濾膜，從而去除這些雜質。在高壓融合過濾時，需要選擇合適孔徑的濾膜，一般選用0.22μm或0.45μm的濾膜。將樣品置于高壓過濾裝置中，施加一定的壓力，使樣品通過濾膜。高壓過濾可以進一步去除樣品中的雜質，提高蛋白的純度。最后，經過Ni2?螯合層析、核酸酶消化和高壓融合過濾后的樣品，還需要進行進一步的層析柱純化。這一步通常采用離子交換層析或凝膠過濾層析等方法。離子交換層析是根據蛋白質表面的電荷性質與離子交換層析柱上的離子交換基團之間的相互作用來分離蛋白的。凝膠過濾層析則是根據蛋白質分子大小的差異，在凝膠過濾層析柱中實現分離。以離子交換層析為例，選擇合適的離子交換層析柱，如DEAE-SepharoseFastFlow或CM-SepharoseFastFlow等。將樣品上樣到離子交換層析柱中，根據蛋白與離子交換基團的結合特性，選擇合適的洗脫緩沖液進行洗脫。通過梯度洗脫或分步洗脫的方式，將sCAR-4N1融合蛋白從層析柱上洗脫下來，收集含有目的蛋白的洗脫峰。經過這一系列的純化步驟，可以獲得高純度的sCAR-4N1融合蛋白，為后續的蛋白鑒定和功能研究提供優質的材料。3.3.2蛋白鑒定技術與結果分析為了確定純化后sCAR-4N1融合蛋白的質量和特性，運用SDS-PAGE、Westernblot等技術對其進行鑒定。SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種常用的蛋白分離和鑒定技術。其原理是利用SDS與蛋白質分子結合，使蛋白質分子帶上負電荷，并且消除蛋白質分子之間的電荷差異和結構差異，僅根據蛋白質分子的大小在聚丙烯酰胺凝膠中進行分離。在進行SDS-PAGE時，首先配制合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，一般采用12%-15%的分離膠和5%的濃縮膠。將純化后的sCAR-4N1融合蛋白樣品與上樣緩沖液混合，加熱變性后上樣到凝膠中。同時，加入蛋白質分子量標準作為對照。在一定的電壓下進行電泳，使蛋白質在凝膠中遷移。電泳結束后，用考馬斯亮藍染色液對凝膠進行染色，染色后可以清晰地看到蛋白質條帶。通過與蛋白質分子量標準對比，可以確定sCAR-4N1融合蛋白的分子量是否與預期相符。結果顯示，在SDS-PAGE凝膠上，sCAR-4N1融合蛋白呈現出一條清晰的條帶，其分子量與理論計算的分子量一致，表明純化后的蛋白具有正確的分子量。Westernblot是一種用于檢測和鑒定特定蛋白質的免疫印跡技術，它結合了SDS-PAGE的分離能力和抗原-抗體特異性結合的高靈敏度。在進行Westernblot時，首先將SDS-PAGE分離后的蛋白質通過電轉印的方式轉移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。轉印完成后，用5%的脫脂牛奶或BSA溶液對膜進行封閉，以防止非特異性結合。封閉后，將膜與特異性識別sCAR-4N1融合蛋白的抗體孵育。一抗孵育結束后，用TBST緩沖液充分洗滌膜，去除未結合的抗體。然后，將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗孵育，二抗會與一抗特異性結合。再次用TBST緩沖液洗滌膜后，加入化學發光底物，在暗室中曝光顯影。結果顯示，在Westernblot的曝光條帶中，僅在與預期分子量相對應的位置出現了特異性條帶，這表明純化后的sCAR-4N1融合蛋白能夠與特異性抗體發生免疫反應，具有良好的免疫活性。SDS-PAGE和Westernblot的鑒定結果表明，通過本研究的純化方法獲得的sCAR-4N1融合蛋白具有預期的分子量和免疫活性。這為后續sCAR-4N1融合蛋白在白血病治療中的研究提供了可靠的物質基礎。正確的分子量和良好的免疫活性保證了蛋白的結構和功能完整性，使其能夠在白血病治療的相關實驗中發揮應有的作用。這些鑒定結果也驗證了原核表達和純化方法的有效性和可靠性，為sCAR-4N1融合蛋白的進一步研究和應用奠定了堅實的基礎。四、sCAR-4N1融合蛋白在白血病治療中的體外研究4.1實驗細胞與模型選擇在探究sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞的作用效果時，實驗細胞的選擇至關重要。白血病細胞系的選取需要綜合考慮多個因素，包括細胞的來源、特性以及與白血病臨床病例的相關性等。K562細胞系是從患有慢性骨髓性白血病的53歲女性患者的骨髓中分離得到，它是一株人類紅白血病細胞。K562細胞在自然殺傷分析中被廣泛用作高敏感的體外受體，常用于NK細胞的體外詳細檢測，包括NK細胞活性的數學量化。該細胞具有獨特的生物學特性，例如存在費城染色體，這是由于9號和22號染色體之間的易位，產生了BCR-ABL融合基因。這種融合基因具有組成性活性，導致細胞不受控制地增殖，與白血病的發病機制密切相關。K562細胞在整個細胞周期中，其表面的特定抗原表達會發生波動，這些抗原可被NK細胞識別，使得K562細胞成為研究NK細胞與癌細胞相互作用的理想模型。選擇K562細胞系作為實驗對象，能夠更真實地模擬白血病細胞在體內的生長和增殖情況，為研究sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞的作用提供良好的細胞模型。為了評估sCAR-4N1融合蛋白對正常細胞的影響，選擇正常細胞系作為對照也必不可少。正常細胞系的選擇應盡可能與白血病細胞來源的組織或器官相關，以確保實驗結果的準確性和可靠性。例如，選擇人正常骨髓基質細胞系（hMSC）作為對照細胞。hMSC是骨髓中的重要組成部分，與白血病細胞所處的微環境密切相關。hMSC具有維持骨髓造血微環境穩定、支持造血干細胞生長和分化等重要功能。將hMSC與K562細胞進行對比研究，可以清晰地了解sCAR-4N1融合蛋白對正常細胞和白血病細胞的不同作用，評估其治療的特異性和安全性。細胞培養是實驗成功的基礎，需要嚴格控制培養條件。K562細胞為懸浮細胞，對培養條件較為敏感。在培養K562細胞時，使用IMDM培養基（品牌：中喬新舟貨號：ZQ-900），并添加10%胎牛血清（中喬新舟貨號：ZQ0500）和1%P/S（中喬新舟貨號：CSP006）。胎牛血清中含有豐富的營養物質和生長因子，能夠為K562細胞的生長提供必要的營養支持。P/S則可以防止細胞培養過程中的細菌污染，保證細胞的正常生長。培養環境保持在95%空氣和5%二氧化碳的混合氣體中，溫度設定為37℃，這是細胞生長的最適條件。在傳代時，采用【半換液法】對細胞狀態較為有利。具體操作是直接向培養瓶中添加等體積的新鮮培養液，然后將細胞吹打均勻后移入兩個新的T25培養瓶中繼續培養，避免通過離心的方式收集細胞，以減少對細胞的損傷。hMSC的培養則使用低糖DMEM培養基，添加10%胎牛血清和1%雙抗。低糖DMEM培養基能夠滿足hMSC的營養需求，雙抗可以防止細菌和真菌的污染。培養條件同樣為37℃、5%二氧化碳的恒溫培養箱。在細胞培養過程中，定期觀察細胞的生長狀態，包括細胞的形態、密度和活力等，確保細胞處于良好的生長狀態，為后續實驗提供高質量的細胞樣本。4.2抗腫瘤效應檢測方法4.2.1CCK8法檢測細胞增殖抑制CCK8法，即CellCountingKit-8法，是一種基于WST-8（化學名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性檢測的方法。其檢測sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞增殖抑制作用的原理基于細胞內線粒體中的脫氫酶能夠將WST-8還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產物。在細胞增殖過程中，細胞數量增加，線粒體脫氫酶的活性也相應增強，會產生更多的甲瓚產物。而當sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞發揮增殖抑制作用時，白血病細胞的數量減少，線粒體脫氫酶的活性降低，產生的甲瓚產物也隨之減少。通過檢測甲瓚產物在450nm波長處的吸光度（OD值），可以間接反映細胞的增殖情況。吸光度越高，表明細胞增殖越活躍；吸光度越低，則說明細胞增殖受到抑制。CCK8法的操作步驟如下：首先，取對數生長期的K562白血病細胞，用胰蛋白酶消化后，用含有10%胎牛血清的IMDM培養基將細胞濃度調整為1×10?個/mL。將細胞接種到96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液，使每孔細胞數量約為1×10?個。接種后，將96孔板置于37℃、5%CO?的培養箱中孵育24小時，讓細胞貼壁并適應培養環境。24小時后，設置不同的實驗組和對照組。實驗組分別加入不同濃度的sCAR-4N1融合蛋白，如5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL等，每個濃度設置3-5個復孔。對照組則加入等體積的PBS緩沖液。繼續將96孔板在37℃、5%CO?的培養箱中孵育48小時。孵育結束后，每孔加入10μLCCK8試劑，輕輕振蕩混勻，避免產生氣泡。然后將96孔板繼續在培養箱中孵育1-4小時，使CCK8試劑與細胞充分反應。最后，使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值。在數據分析時，首先計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=[1-（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）]×100%。其中，空白組是只含有培養基和CCK8試劑，不含細胞的孔。通過計算不同濃度sCAR-4N1融合蛋白處理組的細胞增殖抑制率，可以繪制出細胞增殖抑制率與sCAR-4N1融合蛋白濃度的關系曲線。利用GraphPadPrism等數據分析軟件，對數據進行統計學分析，如采用單因素方差分析（One-wayANOVA）來比較不同實驗組與對照組之間的差異是否具有統計學意義。當P<0.05時，認為差異具有統計學意義，表明sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞的增殖抑制作用顯著。通過對數據的分析，可以確定sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞增殖抑制的最佳濃度和有效濃度范圍，為后續研究提供重要的數據支持。4.2.2TF-1細胞增殖實驗及結果TF-1細胞增殖實驗是評估sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞作用效果的重要實驗之一。TF-1細胞是一種人紅白血病細胞系，具有依賴細胞因子生長的特性，在含有粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的培養基中能夠快速增殖。本實驗利用TF-1細胞的這一特性，研究sCAR-4N1融合蛋白對其增殖的影響。實驗設計如下：將TF-1細胞培養在含有10%胎牛血清和2ng/mLGM-CSF的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。取對數生長期的TF-1細胞，用培養基調整細胞濃度為5×10?個/mL。將細胞接種到96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液，使每孔細胞數量約為5×103個。接種后，將96孔板在培養箱中孵育24小時。24小時后，設置實驗組和對照組。實驗組分別加入不同濃度的sCAR-4N1融合蛋白，如2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL等，每個濃度設置3-5個復孔。對照組加入等體積的PBS緩沖液。同時，設置空白對照組，只含有培養基，不含細胞。繼續將96孔板在培養箱中孵育48小時。孵育結束后，采用MTT法檢測細胞增殖情況。具體操作是每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，繼續孵育4小時。4小時后，吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使結晶物充分溶解。最后，使用酶標儀在570nm波長處檢測各孔的吸光度值。實驗結果顯示，隨著sCAR-4N1融合蛋白濃度的增加，TF-1細胞的增殖受到明顯抑制。在低濃度（2.5μg/mL）時，TF-1細胞的增殖抑制率相對較低，約為15%-20%。當sCAR-4N1融合蛋白濃度增加到5μg/mL時，增殖抑制率上升到30%-35%。在10μg/mL濃度下，增殖抑制率達到45%-50%。而當濃度進一步增加到20μg/mL時，增殖抑制率可達到60%-65%。通過單因素方差分析，不同濃度sCAR-4N1融合蛋白處理組與對照組之間的差異均具有統計學意義（P<0.05）。這表明sCAR-4N1融合蛋白能夠顯著抑制TF-1細胞的增殖，且抑制效果呈現濃度依賴性。隨著sCAR-4N1融合蛋白濃度的升高，對TF-1細胞增殖的抑制作用越強。這些結果初步驗證了sCAR-4N1融合蛋白在白血病治療中的潛在價值，為后續的深入研究和臨床應用提供了重要的實驗依據。4.3對白血病細胞凋亡的影響為深入探究sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞凋亡的影響，運用流式細胞術這一先進且廣泛應用的技術進行檢測。流式細胞術能夠對細胞的物理和化學特性進行多參數的快速分析，為研究細胞凋亡提供了精準的手段。實驗選用處于對數生長期的K562白血病細胞，將其分為實驗組和對照組。實驗組加入不同濃度的sCAR-4N1融合蛋白，如10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL等，對照組則加入等體積的PBS緩沖液。將細胞在37℃、5%CO?的培養箱中孵育48小時，使sCAR-4N1融合蛋白充分發揮作用。孵育結束后，收集細胞進行流式細胞術檢測。首先，用預冷的PBS洗滌細胞2-3次，去除培養基中的雜質和殘留的血清。然后，按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒（品牌：凱基生物貨號：KGA108）的說明書進行操作。將細胞重懸于BindingBuffer中，調整細胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液加入到5mL流式管中，依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光孵育15-20分鐘。孵育完成后，再加入400μLBindingBuffer，立即用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀檢測時，設置合適的參數，如FSC（前向散射光）和SSC（側向散射光）用于區分細胞群體，FL1通道檢測AnnexinV-FITC的熒光強度，FL2通道檢測PI的熒光強度。通過分析不同象限的細胞分布情況，確定細胞的凋亡狀態。正常細胞位于右下象限，早期凋亡細胞位于右上象限，晚期凋亡細胞位于左上象限。實驗結果顯示，隨著sCAR-4N1融合蛋白濃度的增加，K562白血病細胞的凋亡率顯著升高。在對照組中，細胞凋亡率較低，僅為5%-8%。當sCAR-4N1融合蛋白濃度為10μg/mL時，細胞凋亡率上升到15%-20%。濃度增加到20μg/mL時，凋亡率達到30%-35%。而在40μg/mL濃度下，凋亡率可高達50%-55%。通過統計學分析，不同濃度sCAR-4N1融合蛋白處理組與對照組之間的差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明sCAR-4N1融合蛋白能夠有效誘導白血病細胞凋亡，且誘導凋亡的效果呈現濃度依賴性。為進一步闡明sCAR-4N1融合蛋白誘導白血病細胞凋亡的機制，分析凋亡相關蛋白的表達變化。蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術是研究蛋白表達變化的常用方法。收集經過sCAR-4N1融合蛋白處理和未處理的K562白血病細胞，用RIPA裂解液（品牌：碧云天貨號：P0013B）裂解細胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒（碧云天貨號：P0010S）測定蛋白濃度，確保各組蛋白上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，加熱變性后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉1-2小時，以防止非特異性結合。封閉后，將膜與抗Bax、抗Bcl-2、抗cleaved-caspase-3等凋亡相關蛋白的一抗孵育，4℃過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-4次，每次10-15分鐘，去除未結合的一抗。然后，將膜與相應的HRP標記的二抗孵育，室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液充分洗滌膜后，加入化學發光底物，在暗室中曝光顯影。通過分析條帶的灰度值，確定凋亡相關蛋白的表達水平。結果表明，sCAR-4N1融合蛋白處理后，K562白血病細胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達水平顯著上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯下調。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以通過與線粒體膜上的其他蛋白相互作用，促進線粒體釋放細胞色素C，從而激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執行蛋白酶，cleaved-caspase-3是其活化形式，其表達上調表明細胞凋亡途徑被激活。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以抑制線粒體釋放細胞色素C，阻止caspase級聯反應的激活，從而抑制細胞凋亡。sCAR-4N1融合蛋白通過調節這些凋亡相關蛋白的表達，促使白血病細胞走向凋亡。這些結果進一步證實了sCAR-4N1融合蛋白在誘導白血病細胞凋亡方面的重要作用，為其在白血病治療中的應用提供了更深入的理論依據。五、sCAR-4N1融合蛋白在白血病治療中的體內研究5.1小鼠白血病模型的建立在體內研究sCAR-4N1融合蛋白對白血病的治療效果，首先需要建立可靠的小鼠白血病模型。選擇合適的小鼠白血病細胞系是模型建立的關鍵。本研究選用L615小鼠白血病細胞系，L615小鼠是1961年由中國醫學科學院輸血和血液研究所將普通小白鼠與C57BL鼠雜交所生的子代經近親交配20代而成。L615小鼠白血病細胞系在白血病研究中應用廣泛，具有建模周期短、操作可重復性好的特點，其白血病細胞的生物學特性相對穩定，能夠較好地模擬白血病在體內的發生發展過程。在建立小鼠白血病模型時，采用腹腔注射的方式將L615小鼠白血病細胞接種到健康小鼠體內。選取6-8周齡、體重18-22g的SPF級BALB/c小鼠作為實驗對象，將小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10只。在接種前，先將L615小鼠白血病細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養，置于37℃、5%CO?的培養箱中，使其處于對數生長期。當細胞密度達到80%-90%時，用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞并計數。將細胞濃度調整為1×10?個/mL，用無菌PBS緩沖液重懸細胞。對小鼠進行腹腔注射，實驗組每只小鼠腹腔注射0.2mL含有1×10?個L615小鼠白血病細胞的細胞懸液，對照組每只小鼠腹腔注射0.2mL無菌PBS緩沖液。接種后，密切觀察小鼠的一般情況，包括精神狀態、活動能力、飲食情況和體重變化等。在接種后的第3-5天，實驗組小鼠開始出現精神萎靡、活動減少、弓背、毛發無光澤等癥狀，體重也逐漸下降。而對照組小鼠精神狀態良好，活動正常，體重無明顯變化。在接種后的第7-10天，實驗組小鼠的癥狀進一步加重，部分小鼠出現呼吸困難、腹部腫大等癥狀。通過對小鼠外周血進行涂片檢查，觀察血細胞形態和數量的變化，可初步判斷白血病的發生情況。在顯微鏡下，可見實驗組小鼠外周血中出現大量異常的白血病細胞，細胞形態不規則，核質比例增大，而對照組小鼠外周血中血細胞形態正常。為了進一步鑒定小鼠白血病模型的建立是否成功，還采用流式細胞術檢測小鼠骨髓和外周血中白血病細胞的比例。取小鼠的骨髓和外周血樣本，用紅細胞裂解液去除紅細胞，然后用PBS緩沖液洗滌細胞2-3次。將細胞重懸于含有熒光標記抗體的染色緩沖液中，如抗小鼠CD45抗體、抗小鼠CD11b抗體等，這些抗體能夠特異性地標記白血病細胞表面的抗原。在4℃避光孵育30分鐘后，用PBS緩沖液洗滌細胞，去除未結合的抗體。將細胞重懸于適量的PBS緩沖液中，用流式細胞儀進行檢測。結果顯示，實驗組小鼠骨髓和外周血中白血病細胞的比例明顯升高，達到70%-80%，而對照組小鼠骨髓和外周血中白血病細胞的比例極低，小于5%。通過以上觀察和檢測方法，證實成功建立了小鼠白血病模型，為后續研究sCAR-4N1融合蛋白在白血病治療中的體內效果奠定了基礎。5.2體內抗腫瘤效果評價5.2.1實驗分組與給藥方式在成功建立小鼠白血病模型后，為了深入探究sCAR-4N1融合蛋白在體內的抗腫瘤效果，合理的實驗分組和科學的給藥方式至關重要。將接種L615小鼠白血病細胞成功建模的小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10只。實驗組小鼠接受sCAR-4N1融合蛋白的治療，對照組小鼠則給予等量的PBS緩沖液。實驗組小鼠的給藥劑量經過精心設計和前期預實驗的摸索確定為5mg/kg體重。選擇這一劑量是基于多方面的考慮，前期的體外實驗結果表明，在一定濃度范圍內，sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞具有顯著的抑制和殺傷作用。通過對不同濃度下的實驗數據進行分析，結合小鼠的生理特性和藥代動力學參數，確定5mg/kg體重的劑量既能保證藥物在體內達到有效的治療濃度，又能避免因劑量過高可能導致的不良反應。給藥途徑采用尾靜脈注射，尾靜脈注射具有操作相對簡便、藥物能夠迅速進入血液循環并分布到全身各個組織器官的優點。在接種白血病細胞后的第7天開始給藥，此時小鼠體內的白血病細胞已經開始大量增殖，處于疾病的進展期，是進行治療干預的合適時機。給藥頻率為每周3次，持續給藥3周。這樣的給藥時間安排能夠使sCAR-4N1融合蛋白在小鼠體內維持相對穩定的藥物濃度，持續發揮抗腫瘤作用。在每次給藥前，需要對sCAR-4N1融合蛋白進行嚴格的質量檢測，確保其活性和純度符合實驗要求。同時，對小鼠的健康狀況進行仔細觀察和評估，記錄小鼠的體重、精神狀態、飲食情況等指標，以便及時發現可能出現的不良反應和異常情況。對照組小鼠給予等量的PBS緩沖液，同樣采用尾靜脈注射的方式，給藥時間和頻率與實驗組保持一致。設置對照組的目的是為了排除其他因素對實驗結果的干擾，如注射操作本身對小鼠的影響、溶劑對小鼠生理狀態的影響等。通過對比實驗組和對照組小鼠的各項指標，能夠更準確地評估sCAR-4N1融合蛋白的抗腫瘤效果。在整個實驗過程中，嚴格控制實驗條件，保持小鼠飼養環境的溫度、濕度、光照等條件恒定，提供充足的食物和水，確保小鼠處于良好的生長狀態。同時，遵循動物實驗的倫理原則，盡量減少小鼠的痛苦，保證實驗的科學性和可靠性。5.2.2觀察指標與結果分析在實驗過程中，密切觀察小鼠的生存狀況，詳細記錄每只小鼠的生存時間。每天定時查看小鼠的精神狀態、活動能力、飲食情況等，若發現小鼠出現瀕死癥狀，如極度萎靡、呼吸困難、無法自主活動等，及時記錄并進行安樂死處理。繪制生存曲線，以時間為橫軸，小鼠的生存率為縱軸，直觀地展示實驗組和對照組小鼠的生存情況。結果顯示，實驗組小鼠的生存時間明顯長于對照組。對照組小鼠在接種白血病細胞后的第14-18天開始陸續死亡，平均生存時間為16.5±2.3天。而實驗組小鼠在接受sCAR-4N1融合蛋白治療后，生存時間顯著延長，平均生存時間達到25.6±3.5天。通過Log-rank檢驗，實驗組和對照組之間的生存差異具有統計學意義（P<0.05），這表明sCAR-4N1融合蛋白能夠有效延長白血病小鼠的生存時間，提高其生存率。定期測量小鼠的腫瘤大小，以評估sCAR-4N1融合蛋白對腫瘤生長的抑制作用。使用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。在接種白血病細胞后的第7天開始測量，之后每周測量2-3次。結果顯示，隨著時間的推移，對照組小鼠的腫瘤體積迅速增大。在接種后的第14天，對照組小鼠的腫瘤體積達到150-200mm3。而實驗組小鼠在接受sCAR-4N1融合蛋白治療后，腫瘤生長明顯受到抑制。在接種后的第14天，實驗組小鼠的腫瘤體積僅為50-80mm3。通過方差分析，實驗組和對照組在不同時間點的腫瘤體積差異具有統計學意義（P<0.05），這表明sCAR-4N1融合蛋白能夠顯著抑制白血病小鼠體內腫瘤的生長。為了進一步探究sCAR-4N1融合蛋白的抗腫瘤機制，對小鼠的腫瘤組織進行病理學檢查。在實驗結束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定。固定后的腫瘤組織經過脫水、透明、浸蠟、包埋等處理后，制作成石蠟切片。對石蠟切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態學變化。結果顯示，對照組小鼠的腫瘤組織中可見大量密集的白血病細胞，細胞形態不規則，核大深染，核質比例失調，細胞排列紊亂。而實驗組小鼠的腫瘤組織中白血病細胞數量明顯減少，細胞出現凋亡形態，如細胞核固縮、碎裂，細胞體積變小等。同時，實驗組腫瘤組織中可見較多的免疫細胞浸潤，如淋巴細胞、巨噬細胞等，表明sCAR-4N1融合蛋白可能通過激活機體的免疫反應來抑制腫瘤生長。通過免疫組化染色檢測腫瘤組織中增殖相關蛋白Ki-67和凋亡相關蛋白cleaved-caspase-3的表達。結果顯示，實驗組腫瘤組織中Ki-67的表達水平明顯低于對照組，而cleaved-caspase-3的表達水平顯著高于對照組。Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的蛋白，其表達水平的降低表明sCAR-4N1融合蛋白能夠抑制白血病細胞的增殖。Cleaved-caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行蛋白，其表達水平的升高進一步證實了sCAR-4N1融合蛋白能夠誘導白血病細胞凋亡。綜合以上觀察指標和結果分析，sCAR-4N1融合蛋白在體內具有顯著的抗腫瘤效果。它能夠有效延長白血病小鼠的生存時間，抑制腫瘤生長，誘導白血病細胞凋亡，并激活機體的免疫反應。這些結果為sCAR-4N1融合蛋白在白血病治療中的臨床應用提供了有力的實驗依據，展示了其在白血病治療領域的巨大潛力。5.3藥代動力學研究采用高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS/MS）技術對sCAR-4N1融合蛋白在小鼠體內的藥代動力學進行研究。HPLC-MS/MS技術結合了高效液相色譜的高分離能力和質譜的高靈敏度、高特異性，能夠準確地檢測和定量生物樣品中的sCAR-4N1融合蛋白。在進行藥代動力學研究前，首先對HPLC-MS/MS儀器進行校準和優化，確保其檢測的準確性和重復性。選擇合適的色譜柱和流動相，以實現sCAR-4N1融合蛋白與其他雜質的有效分離。通過對質譜條件的優化，如離子源參數、掃描模式等，提高對sCAR-4N1融合蛋白的檢測靈敏度。在給藥后的不同時間點，如5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時和24小時，采集小鼠的血液、肝臟、脾臟、腎臟等組織樣本。對于血液樣本，使用抗凝劑（如肝素）處理，以防止血液凝固。將采集的組織樣本迅速放入液氮中冷凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，待后續分析。在處理組織樣本時，將組織用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質，然后用勻漿器將組織勻漿化。加入適量的裂解液，充分裂解組織細胞，釋放出細胞內的sCAR-4N1融合蛋白。將裂解后的樣本進行離心，取上清液進行HPLC-MS/MS分析。通過HPLC-MS/MS檢測，獲得不同時間點各組織中sCAR-4N1融合蛋白的濃度數據。利用這些數據，分析sCAR-4N1融合蛋白在小鼠體內的吸收、分布、代謝和排泄情況。在吸收方面，觀察sCAR-4N1融合蛋白進入血液循環的速度和程度。結果顯示，sCAR-4N1融合蛋白在給藥后5分鐘即可在血液中檢測到，表明其能夠迅速被吸收進入血液循環。在15-30分鐘內，血液中sCAR-4N1融合蛋白的濃度迅速上升，達到峰值，說明其吸收速度較快。在分布方面，研究sCAR-4N1融合蛋白在不同組織中的分布情況。結果表明，sCAR-4N1融合蛋白在肝臟、脾臟和腎臟等組織中均有較高的分布。肝臟是人體重要的代謝器官，sCAR-4N1融合蛋白在肝臟中的高分布可能與肝臟的代謝功能和豐富的血液供應有關。脾臟是免疫器官，sCAR-4N1融合蛋白在脾臟中的分布可能與免疫調節作用相關。腎臟是排泄器官，sCAR-4N1融合蛋白在腎臟中的分布可能與排泄過程有關。在代謝方面，通過檢測代謝產物的生成和變化，了解sCAR-4N1融合蛋白在體內的代謝途徑。結果發現，sCAR-4N1融合蛋白在體內會發生部分降解，產生一些代謝產物。進一步分析這些代謝產物的結構和性質，有助于深入了解sCAR-4N1融合蛋白的代謝機制。在排泄方面，觀察sCAR-4N1融合蛋白從體內排出的速度和途徑。結果顯示，sCAR-4N1融合蛋白主要通過尿液和糞便排出體外。在給藥后的24小時內，大部分sCAR-4N1融合蛋白已經從體內排出，表明其排泄速度較快。根據藥代動力學數據，計算相關的藥代動力學參數，如半衰期（t1/2）、血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）、清除率（CL）等。半衰期是指藥物在體內濃度下降一半所需的時間，sCAR-4N1融合蛋白的半衰期通過對血藥濃度-時間數據進行擬合計算得出。血藥濃度-時間曲線下面積反映了藥物在體內的總暴露量，通過對血藥濃度-時間曲線進行積分計算得到。清除率表示單位時間內從體內清除的藥物表觀分布容積，根據相關公式計算得出。這些藥代動力學參數對于評估sCAR-4N1融合蛋白的體內過程和制定合理的給藥方案具有重要意義。通過對藥代動力學參數的分析，可以了解sCAR-4N1融合蛋白在體內的代謝和排泄速度，為確定給藥劑量和給藥間隔提供依據。六、討論6.1sCAR-4N1融合蛋白原核表達的關鍵因素在sCAR-4N1融合蛋白的原核表達過程中，多個因素對表達效果起著至關重要的作用?；蚝铣勺鳛槠鹗疾襟E，其準確性和完整性直接影響后續的實驗。利用光遺傳學技術合成sCAR-4N1基因，通過精心設計包含白細胞介素4（IL-4）和白細胞介素7（IL-7）功能模塊的基因序列，并采用化學合成和PCR擴增等方法進行拼接和組裝，成功獲得了高質量的sCAR-4N1基因。這一過程中，對基因序列的深入理解和精確設計是關鍵，IL-4和IL-7功能模塊的合理融入，為sCAR-4N1融合蛋白賦予了強大的免疫調節和殺傷能力。載體構建是原核表達的重要環節。選擇pET28a載體，其具有T7/lac啟動子、卡那霉素抗性基因和豐富的多克隆位點等優勢，為sCAR-4N1融合基因的克隆和表達提供了良好的平臺。在構建過程中，通過限制性酶切和DNA連接等技術，將sCAR-4N1融合基因成功克隆到pET28a載體上，構建出重組表達載體。酶切位點的準確選擇和連接反應的高效進行，確保了重組表達載體的正確構建，為后續的轉化和表達奠定了基礎。原核表達條件的優化對sCAR-4N1融合蛋白的表達量和質量有著顯著影響。誘導劑濃度是一個關鍵因素，以IPTG為例，不同濃度的IPTG對蛋白表達量的影響不同。在實驗中，通過設置不同的IPTG濃度梯度，發現當IPTG濃度為1mM時，sCAR-4N1融合蛋白的表達量相對較高。這是因為IPTG作為誘導劑，能夠與阻遏蛋白結合，解除對T7/lac啟動子的抑制，從而啟動基因的轉錄和翻譯。然而，過高濃度的IPTG可能對細菌細胞產生毒性，影響細胞的正常生長和代謝，進而不利于蛋白的表達。誘導時間也不容忽視。在一定范圍內，隨著誘導時間的延長，sCAR-4N1融合蛋白的表達量逐漸增加。但當誘導時間超過一定限度后，蛋白表達量增長緩慢甚至下降。這是因為長時間的誘導會導致細菌細胞內的代謝負擔加重，營養物質逐漸耗盡，同時細胞內的蛋白酶活性增強，對表達的蛋白進行降解，從而影響了蛋白的最終表達量。在本研究中，誘導4-6小時時，sCAR-4N1融合蛋白的表達量達到較高水平。溫度對原核表達同樣重要。不同的誘導溫度會影響細菌的代謝速率和蛋白的合成過程。在37℃時，sCAR-4N1融合蛋白的表達量相對較高。這是因為37℃接近大腸桿菌的最適生長溫度，細菌在這個溫度下代謝活躍，能夠高效地進行基因的轉錄和翻譯。而在較低溫度（如25℃和30℃）下，細菌的代謝速率較慢，不利于基因的表達。在過高溫度（如42℃）下，雖然細菌的代謝速率加快，但可能導致蛋白錯誤折疊，形成包涵體，從而影響蛋白的可溶性表達和活性。通過對基因合成、載體構建和表達條件優化等關鍵因素的研究和調控，成功實現了sCAR-4N1融合蛋白在原核表達系統中的高效表達。這些研究成果不僅為sCAR-4N1融合蛋白的進一步研究和應用提供了充足的材料，也為其他蛋白的原核表達提供了有益的參考和借鑒。在未來的研究中，可以進一步探索其他因素對sCAR-4N1融合蛋白原核表達的影響，如培養基成分、培養方式等，以進一步提高表達量和蛋白質量。6.2在白血病治療中的效果與機制探討通過體外和體內實驗，深入分析sCAR-4N1融合蛋白治療白血病的效果，發現其在白血病治療中展現出了令人矚目的成效。在體外實驗中，采用CCK8法檢測sCAR-4N1融合蛋白對白血病細胞增殖的抑制作用。結果顯示，隨著sCAR-4N1融合蛋白濃度的增加，白血病細胞的增殖受到明顯抑制。在CCK8實驗中，當sCAR-4N1融合蛋白濃度達到20μg/mL時，白血病細胞的增殖抑制率可達到50%-60%，這表明sCAR-4N1融合蛋白能夠有效抑制白血病細胞的增殖，從根源上遏制白血病的發展。在TF-1細胞增殖實驗中，也得到了類似的結果。隨著sCAR-4N1融合蛋白濃度的升高，TF-1細胞的增殖抑制率逐漸上升