RNA干擾技術對胃癌細胞SGC-7901中Nanog表達的調控及影響研究一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據統計，中國每年的新發胃癌病例數占全球新發病例數的近一半，大多數患者在確診時已處于中晚期，治療難度和死亡率顯著增加。盡管目前胃癌的治療手段不斷發展，包括手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但總體預后仍不理想，5年生存率較低。因此，深入研究胃癌的發病機制，尋找有效的治療靶點和新的治療策略具有重要的臨床意義。近年來，癌癥干細胞（CancerStemCells，CSCs）理論的提出為腫瘤研究提供了新的視角。CSCs是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化潛能和高致瘤性的一小部分細胞，被認為是腫瘤發生、發展、復發和轉移的根源。Nanog基因作為一種重要的干細胞多能性因子，在維持胚胎干細胞的自我更新和多能性中發揮著關鍵作用。研究發現，Nanog基因在多種腫瘤組織中異常表達，包括胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌等，且與腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移及預后密切相關。在胃癌中，Nanog基因的高表達與腫瘤的惡性程度、淋巴結轉移、遠處轉移及不良預后顯著相關，提示Nanog基因可能作為胃癌診斷、預后評估的生物標志物及治療靶點。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術是一種由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導的序列特異性基因沉默現象，能夠高效、特異性地抑制靶基因的表達。自發現以來，RNAi技術因其具有高度特異性、高效性、操作簡便等優點，迅速成為研究基因功能和疾病治療的有力工具。在腫瘤研究領域，RNAi技術被廣泛應用于腫瘤相關基因的功能研究和腫瘤治療的探索。通過設計針對腫瘤相關基因的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）或短發夾RNA（shorthairpinRNA，shRNA），可以特異性地沉默這些基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移，誘導腫瘤細胞凋亡，為腫瘤的基因治療提供了新的策略。本研究旨在利用RNA干擾技術抑制胃癌細胞SGC-7901中Nanog基因的表達，探討Nanog基因在胃癌發生、發展中的作用機制，為胃癌的基因治療提供實驗依據和理論基礎。1.2研究目的與意義本實驗旨在利用RNA干擾技術，特異性地抑制胃癌細胞SGC-7901中Nanog基因的表達，通過觀察細胞生物學行為的改變，深入探究Nanog基因在胃癌發生、發展過程中的作用機制。具體而言，研究目的包括以下幾個方面：其一，構建針對Nanog基因的小干擾RNA（siRNA）表達載體，并將其成功轉染至胃癌細胞SGC-7901中，實現對Nanog基因表達的有效抑制；其二，檢測抑制Nanog基因表達后，胃癌細胞SGC-7901的增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學行為的變化，明確Nanog基因對胃癌細胞生物學特性的影響；其三，通過對相關信號通路和分子機制的研究，揭示Nanog基因在胃癌發生、發展中的潛在作用機制。本研究具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。在理論方面，深入研究Nanog基因在胃癌中的作用機制，有助于進一步闡明胃癌的發病機制，為癌癥干細胞理論在胃癌研究中的應用提供新的證據和思路。同時，通過揭示Nanog基因與胃癌細胞生物學行為之間的關系，可能發現新的胃癌相關分子標志物和潛在的治療靶點，豐富對胃癌分子生物學的認識。在臨床應用方面，基于RNA干擾技術的基因治療策略為胃癌的治療提供了新的方向。如果能夠成功抑制Nanog基因的表達，從而有效抑制胃癌細胞的生長、侵襲和轉移，誘導癌細胞凋亡，將為胃癌的治療提供一種全新的、特異性的治療方法。這不僅可以提高胃癌的治療效果，改善患者的預后，還可能減少傳統治療方法帶來的不良反應，為胃癌患者帶來新的希望。此外，對Nanog基因的研究還可能為胃癌的早期診斷和預后評估提供更準確的指標，有助于實現胃癌的個體化治療。1.3研究思路與方法本研究以胃癌細胞SGC-7901為研究對象，利用RNA干擾技術特異性地抑制Nanog基因的表達，進而深入探究其在胃癌發生、發展中的作用機制。研究思路是首先通過設計并合成針對Nanog基因的小干擾RNA（siRNA），并構建相應的表達載體。隨后將其轉染至胃癌細胞SGC-7901中，借助多種分子生物學檢測技術，驗證Nanog基因表達的抑制效果。然后，對抑制Nanog基因表達后的胃癌細胞，展開一系列細胞生物學行為的檢測，包括細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等方面，以明確Nanog基因對胃癌細胞生物學特性的影響。最后，深入研究相關信號通路和分子機制，揭示Nanog基因在胃癌發生、發展中的潛在作用機制。在研究方法上，運用RNA干擾技術，根據Nanog基因的序列，設計并合成具有特異性的siRNA，通過化學合成或構建表達載體的方式獲得siRNA。在細胞培養方面，復蘇并培養胃癌細胞SGC-7901，將其置于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養基中，在37℃、5%CO?的培養箱中常規培養，定期傳代和換液，以保證細胞處于良好的生長狀態。轉染實驗時，當細胞密度達到70%-80%，使用脂質體轉染試劑將siRNA或對照序列轉染至胃癌細胞中，設置實驗組和對照組，每組設置多個復孔，以確保實驗結果的可靠性。利用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR），提取轉染后細胞的總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR擴增，通過檢測Ct值，計算Nanog基因mRNA的相對表達量，從而分析RNA干擾對Nanog基因轉錄水平的影響。同時，采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot），提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉移至PVDF膜上，用特異性抗體孵育，再加入二抗，通過化學發光法檢測目的蛋白條帶，分析Nanog基因蛋白表達水平的變化。在細胞生物學行為檢測中，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，在不同時間點向細胞培養孔中加入CCK-8試劑，孵育后檢測450nm處的吸光度值，繪制細胞生長曲線，分析細胞增殖情況；通過流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期，用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率，用PI染色法分析細胞周期分布；運用Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移能力，在Transwell小室的上室加入細胞懸液，下室加入含血清的培養基，培養一定時間后，固定并染色侵襲或遷移到下室的細胞，計數分析細胞侵襲和遷移能力的變化。二、相關理論與技術基礎2.1RNA干擾技術2.1.1RNA干擾的原理RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種在真核生物中廣泛存在的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導的序列特異性基因沉默現象。其核心原理是細胞內的dsRNA被核酸酶Dicer識別并切割成21-23個核苷酸長度的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。這些siRNA具有獨特的結構特征，其兩條鏈的3’端各有2個堿基的游離，5’端為磷酸化狀態。隨后，siRNA與體內一些酶和蛋白質共同形成RNA誘導沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在ATP供能的情況下，RISC中的解旋酶將siRNA的雙鏈解開，其中的反義鏈引導RISC識別并結合到與其互補的靶mRNA序列上。接著，RISC中的核酸內切酶Ago發揮作用，在距離siRNA3'端12個堿基的位置切割靶mRNA，導致mRNA降解，從而實現對靶基因表達的抑制，使基因沉默。此外，在某些情況下，RNAi還可以通過抑制翻譯過程來沉默基因，即RISC結合到靶mRNA上后，并不切割mRNA，而是阻止核糖體與mRNA的結合，從而抑制蛋白質的合成。除了siRNA介導的RNAi途徑外，短發夾狀RNA（shorthairpinRNA，shRNA）也能引發RNA干擾。shRNA是一種人工合成的RNA分子，其結構包含一個莖環結構，在細胞內可以被加工成類似siRNA的分子，進而激活RNAi機制。與siRNA不同的是，shRNA可以通過構建表達載體，利用病毒載體等工具將其導入細胞中，實現穩定且持續的基因沉默效果，這對于需要長期抑制靶基因表達的研究和應用具有重要意義。RNAi過程還存在一個倍增階段，即少量的siRNA在RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA為模板，擴增產生更多的dsRNA，這些dsRNA又可以被Dicer酶切割成新的siRNA，再次形成RISC，繼續降解mRNA，從而產生級聯放大效應，使得少量的起始dsRNA就能引發強大的基因沉默效果。2.1.2RNA干擾技術在癌癥研究中的應用RNA干擾技術在癌癥研究中具有廣泛且重要的應用，為深入探究癌癥的發病機制和開發新型治療策略提供了有力工具。在癌癥基因功能研究方面，RNAi技術能夠特異性地沉默與癌癥發生、發展相關的基因，從而幫助研究人員明確這些基因在腫瘤生物學過程中的具體功能。例如，通過設計針對癌基因如KRAS、BRAF等的siRNA或shRNA，抑制其表達，觀察腫瘤細胞在增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學行為上的變化，揭示這些癌基因在腫瘤發生發展中的關鍵作用機制。有研究針對肺癌細胞中的KRAS基因突變體，利用RNAi技術成功抑制了KRAS基因的表達，發現肺癌細胞的增殖能力顯著下降，侵襲和遷移能力也明顯減弱，這表明KRAS基因在肺癌的惡性進展中起著關鍵作用。在癌癥靶向治療研究中，RNAi技術展現出巨大的潛力。它可以直接靶向腫瘤細胞中的關鍵致癌基因，抑制腫瘤細胞的生長和存活。例如，針對抗凋亡蛋白Bcl-2的RNAi治療策略，通過沉默Bcl-2基因的表達，能夠誘導腫瘤細胞凋亡，為癌癥治療提供了新的思路。在白血病的研究中，利用RNAi技術沉默Bcl-2基因，使得白血病細胞對化療藥物的敏感性增強，提高了治療效果。此外，RNAi技術還可以用于克服腫瘤的耐藥性。許多腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性，嚴重影響了治療效果。通過RNAi技術干擾腫瘤細胞中與耐藥相關的基因，如多藥耐藥基因（MDR1）等，可以逆轉腫瘤細胞的耐藥性，恢復化療藥物的療效。在乳腺癌的研究中，通過RNAi抑制MDR1基因的表達，使得原本對化療藥物耐藥的乳腺癌細胞重新對藥物敏感，為乳腺癌的治療提供了新的策略。RNAi技術還可與其他治療方法聯合應用，增強癌癥的治療效果。例如，與傳統化療藥物聯合使用，可以提高化療藥物的療效，減少藥物用量，降低藥物的毒副作用；與免疫治療聯合，有望增強機體對腫瘤細胞的免疫應答，提高免疫治療的效果。有研究將針對腫瘤相關抗原的RNAi與免疫檢查點抑制劑聯合應用于小鼠腫瘤模型，發現能夠顯著增強腫瘤細胞的免疫原性，激活機體的抗腫瘤免疫反應，抑制腫瘤生長。在癌癥診斷和預后評估方面，RNAi技術也具有潛在的應用價值。通過檢測腫瘤組織中特定基因經RNAi處理后的表達變化，有可能為癌癥的早期診斷提供新的生物標志物；同時，根據RNAi對腫瘤細胞生物學行為的影響，還可以預測腫瘤的預后，為臨床治療決策提供參考。2.2Nanog基因2.2.1Nanog基因的結構與功能Nanog基因最初是在小鼠胚胎干細胞中被發現，其名稱來源于蓋爾語中“TirnanOg”，寓意著“永恒之地”，象征著其在維持細胞多能性方面的重要作用。人源Nanog基因位于12號染色體上，由4個外顯子和3個內含子組成，開放閱讀框長度為915bp，編碼包含305個氨基酸的蛋白質。該蛋白結構包含N端“干擾”域（ND）、DNA同源結合域（H）和C端轉錄激活域。其中，H區含有60個氨基酸殘基，可與蛋白質相互作用以及與DNA結合，對Nanog行使轉錄調控功能至關重要；ND區富含絲氨酸和蘇氨酸殘基，還包含酸性殘基，在反式作用中發揮作用；C端區無明顯轉錄激活基序，但包含2個負責反式激活的亞域（CD1和CD2）以及參與二聚化的富含色氨酸的域（WRD）。Nanog基因在維持干細胞多能性方面發揮著核心作用。在胚胎發育早期，Nanog在胚泡的內細胞團（ICM）中特異性表達，對維持ICM細胞的多能性和阻止其向內胚層分化起到關鍵作用。研究表明，Nanog基因能夠獨立于白血病抑制因子（LIF）/信號轉導和轉錄激活因子3（Stat3）信號通路，維持胚胎干細胞（ESCs）的自我更新和多能性。它通過與一系列轉錄因子如Oct4、Sox2等相互作用，形成復雜的調控網絡，共同維持ESCs的多能性狀態。具體而言，Nanog與Oct4、Sox2可以結合到彼此的啟動子區域，相互激活表達，形成一個正反饋調節環，穩定多能性基因的表達。同時，Nanog還能通過抑制分化相關基因的表達，如Cdx2、Gata6等，維持干細胞處于未分化狀態。在ESCs的細胞周期調控方面，Nanog也發揮著重要作用。有研究報道，超表達Nanog的ESCs克隆能夠加速S期進入，促進細胞增殖，表明Nanog在調節干細胞的細胞周期進程、維持干細胞的自我更新能力中具有重要意義。在腫瘤領域，越來越多的研究表明Nanog基因與腫瘤的發生、發展密切相關。Nanog被認為是癌癥干細胞（CSCs）的重要標志物之一，在多種腫瘤組織中異常高表達，如乳腺癌、肺癌、肝癌、結直腸癌等。Nanog在腫瘤中的高表達與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移、耐藥以及不良預后密切相關。其可能的作用機制包括：通過激活Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活；調節上皮-間質轉化（EMT）相關基因的表達，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力；維持腫瘤干細胞的干性，使其具有自我更新和多向分化潛能，從而導致腫瘤的復發和耐藥。例如，在乳腺癌細胞中，Nanog通過激活Wnt/β-catenin信號通路，上調CyclinD1、c-Myc等基因的表達，促進細胞周期進程，加速腫瘤細胞增殖；在肺癌細胞中，Nanog能夠誘導EMT過程，使上皮細胞標志物E-cadherin表達下調，間質細胞標志物N-cadherin、Vimentin等表達上調，從而增強肺癌細胞的侵襲和遷移能力。2.2.2Nanog基因與胃癌的關系大量研究表明，Nanog基因在胃癌組織和細胞系中呈現高表達狀態，且其表達水平與胃癌的臨床病理特征及預后密切相關。通過對臨床胃癌組織標本的檢測發現，Nanog的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，且Nanog的高表達與胃癌患者的腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移以及不良預后顯著相關。一項針對50例胃癌患者的研究顯示，Nanog在胃癌組織中的陽性表達率為70%，而在癌旁正常組織中僅為20%；進一步分析發現，Nanog高表達的胃癌患者5年生存率顯著低于Nanog低表達患者，提示Nanog可作為評估胃癌患者預后的重要指標。在胃癌細胞的生物學行為方面，Nanog基因發揮著重要的調控作用。在細胞增殖方面，研究證實敲低Nanog基因的表達能夠顯著抑制胃癌細胞的增殖能力。通過RNA干擾技術抑制胃癌細胞系MGC-803和SGC-7901中Nanog基因的表達后，采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，結果顯示實驗組細胞的增殖活性明顯低于對照組，細胞生長曲線明顯變緩，表明Nanog基因對胃癌細胞的增殖具有促進作用。其機制可能是Nanog通過激活PI3K/Akt信號通路，上調CyclinD1、PCNA等細胞增殖相關蛋白的表達，從而促進胃癌細胞的增殖。在細胞凋亡方面，Nanog基因的表達與胃癌細胞的凋亡密切相關。研究發現，抑制Nanog基因的表達可以誘導胃癌細胞凋亡。通過流式細胞術檢測發現，敲低Nanog后的胃癌細胞凋亡率明顯增加，同時凋亡相關蛋白Bax的表達上調，Bcl-2的表達下調，表明Nanog可能通過調節凋亡相關蛋白的表達，抑制胃癌細胞的凋亡，促進腫瘤細胞的存活。在細胞遷移和侵襲方面，Nanog基因也發揮著關鍵作用。Transwell實驗結果表明，沉默Nanog基因能夠顯著降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力。進一步研究發現，Nanog通過調控EMT過程來影響胃癌細胞的遷移和侵襲。敲低Nanog后，胃癌細胞中上皮標志物E-cadherin的表達上調，間質標志物N-cadherin、Vimentin等的表達下調，表明Nanog通過誘導EMT過程，增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力，促進胃癌的轉移。2.3胃癌細胞SGC-7901胃癌細胞SGC-7901是1979年從一名56歲男性胃腺癌患者的腹水轉移灶中分離建立的細胞系，屬于人低分化胃腺癌細胞。該細胞系具有典型的上皮樣形態，細胞呈多邊形或短梭形，貼壁生長，排列緊密，具有較強的增殖能力。在常規培養條件下，SGC-7901細胞的倍增時間約為24-36小時，能夠在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養基中良好生長。SGC-7901細胞在胃癌研究中具有廣泛的應用，是研究胃癌發病機制、治療靶點及藥物篩選等方面的常用細胞模型。其優勢在于：一方面，它能夠較好地模擬胃癌細胞在體內的生物學行為，如高增殖活性、侵襲和轉移能力等，有助于深入研究胃癌的發生、發展過程；另一方面，該細胞系來源明確，性質穩定，便于不同實驗室之間的研究對比和重復，為研究結果的可靠性和可重復性提供了保障。在研究胃癌細胞的增殖機制時，以SGC-7901細胞為模型，通過抑制相關基因的表達，觀察細胞增殖的變化，發現了多個與胃癌細胞增殖密切相關的信號通路和分子靶點；在藥物研發領域，SGC-7901細胞被廣泛用于篩選和評價抗胃癌藥物的活性和療效，為新藥的開發提供了重要的實驗依據。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞系與實驗動物胃癌細胞SGC-7901購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。細胞復蘇后，培養于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS，Gibco公司，美國）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL，Solarbio公司，中國）的RPMI-1640培養基（Hyclone公司，美國）中。將其置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱（ThermoScientific公司，美國）中常規培養，定期進行傳代和換液操作，以維持細胞的良好生長狀態。當細胞密度達到80%-90%，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA，Solarbio公司，中國）消化液進行消化傳代，傳代比例為1:3-1:4。實驗動物選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物飼養于無特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）級動物房，室內溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，采用12h光照/12h黑暗的晝夜節律。給予動物無菌飼料和飲用水，自由攝食和飲水。在實驗開始前，動物適應性飼養1周，以確保其生理狀態穩定，適應實驗環境。3.1.2主要試劑與儀器RNA干擾相關試劑：針對Nanog基因的小干擾RNA（siRNA）由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成，包括干擾序列（si-Nanog）和陰性對照序列（si-NC）。轉染試劑選用脂質體Lipofectamine3000（Invitrogen公司，美國），按照說明書進行轉染操作。細胞培養試劑：除上述提及的RPMI-1640培養基、胎牛血清和雙抗外，還包括細胞凍存液（含90%胎牛血清和10%二甲基亞砜，DMSO，Sigma公司，美國）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4，Solarbio公司，中國）、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液等。檢測試劑：總RNA提取試劑采用TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）；反轉錄試劑盒為PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司，日本）；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑選用SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司，日本）；蛋白質提取試劑為RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Solarbio公司，中國）；BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司，中國）用于蛋白定量；兔抗人Nanog多克隆抗體（Abcam公司，英國）、鼠抗人GAPDH單克隆抗體（Proteintech公司，美國）作為一抗；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（Proteintech公司，美國）作為二抗；化學發光底物試劑盒（Millipore公司，美國）用于Westernblot檢測。細胞增殖檢測試劑CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本）；細胞凋亡檢測試劑盒AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國）；細胞周期檢測試劑碘化丙啶（PI，Sigma公司，美國）；Transwell小室（Corning公司，美國）及Matrigel基質膠（BDBiosciences公司，美國）用于細胞侵襲和遷移實驗。主要儀器：實時熒光定量PCR儀（CFX96Touch，Bio-Rad公司，美國）用于mRNA表達水平的檢測；凝膠成像系統（ChemiDocXRS+，Bio-Rad公司，美國）用于PCR產物和Westernblot條帶的成像分析；蛋白質電泳儀（Mini-PROTEANTetraSystem，Bio-Rad公司，美國）和垂直電泳槽（Mini-PROTEANTGXStain-FreeProteinGels，Bio-Rad公司，美國）用于蛋白質的分離和電泳；恒溫搖床（THZ-98A，上海一恒科學儀器有限公司）用于細胞培養過程中的振蕩培養；酶標儀（MultiskanGO，ThermoScientific公司，美國）用于CCK-8實驗的吸光度檢測；流式細胞儀（FACSCalibur，BDBiosciences公司，美國）用于細胞凋亡和細胞周期的檢測；超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司）用于細胞培養和實驗操作過程中的無菌環境維持；二氧化碳培養箱（ThermoScientific公司，美國）用于細胞的培養；離心機（5810R，Eppendorf公司，德國）用于細胞和蛋白樣品的離心分離；倒置顯微鏡（CKX41，Olympus公司，日本）用于細胞形態和生長狀態的觀察；Transwell小室配套的細胞培養板（24孔板，Corning公司，美國）用于細胞侵襲和遷移實驗。3.2實驗方法3.2.1RNA干擾載體的構建與篩選根據GenBank中Nanog基因的mRNA序列（登錄號：NM_024865.4），利用RNA干擾設計軟件（如Ambion公司的siRNADesignTool），設計3條針對Nanog基因不同區域的小干擾RNA（siRNA）序列，同時設計1條陰性對照siRNA序列（si-NC），其序列不與任何已知基因具有同源性。設計的siRNA序列需滿足以下條件：長度為21-23個核苷酸；GC含量在30%-50%；避免連續的相同堿基，尤其是4個或以上的T或A；與其他基因的同源性低于70%。將設計好的siRNA序列交由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。合成后的siRNA序列經HPLC純化，以確保其純度和質量。將純化后的siRNA溶解于無RNA酶的水中，配制成100μmol/L的儲存液，于-20℃保存備用。為構建siRNA表達載體，選擇合適的載體（如pGPU6/GFP/Neo載體）。首先，用限制性內切酶（如BamHⅠ和HindⅢ）對載體進行雙酶切，酶切體系為：載體1μg，10×Buffer2μL，BamHⅠ1μL，HindⅢ1μL，加ddH?O至20μL。37℃孵育2-3小時，然后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收線性化的載體片段。將合成的siRNA序列進行退火處理，形成雙鏈DNA。退火體系為：SensesiRNA（100μmol/L）1μL，AntisensesiRNA（100μmol/L）1μL，10×AnnealingBuffer2μL，加ddH?O至20μL。將退火體系置于PCR儀中，按照95℃5分鐘，然后以每分鐘降低1℃的速度降至25℃的程序進行退火反應，得到雙鏈siRNA。將雙鏈siRNA與線性化的載體片段進行連接反應，連接體系為：線性化載體100ng，雙鏈siRNA50ng，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，加ddH?O至10μL。16℃連接過夜，然后將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。轉化方法為：取5μL連接產物加入到100μLDH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘；42℃熱激90秒，然后迅速冰浴2分鐘；加入900μL無抗LB培養基，37℃振蕩培養1小時；將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp，50μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養過夜。次日，挑取平板上的單菌落，接種于含Amp的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。提取質粒，用PCR和雙酶切鑒定重組質粒，鑒定正確的重組質粒送測序公司（如上海生工生物工程股份有限公司）進行測序驗證。測序結果與設計序列一致的重組質粒即為成功構建的針對Nanog基因的siRNA表達載體。為篩選干擾效果最佳的載體，將構建好的3種針對Nanog基因的siRNA表達載體（si-Nanog-1、si-Nanog-2、si-Nanog-3）及陰性對照載體（si-NC）分別轉染至胃癌細胞SGC-7901中。轉染前1天，將胃癌細胞SGC-7901以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，37℃、5%CO?培養箱中培養。當細胞密度達到70%-80%，按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書進行轉染操作。轉染體系為：每孔加入2μLLipofectamine3000試劑和2μLP3000試劑，分別用50μLOpti-MEM培養基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；然后將兩者混合，室溫孵育20分鐘，形成脂質體-siRNA復合物；將復合物加入到含細胞的6孔板中，輕輕混勻，37℃、5%CO?培養箱中繼續培養。轉染后48小時，收集細胞，提取總RNA和總蛋白，分別采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測Nanog基因mRNA和蛋白的表達水平。以轉染陰性對照載體的細胞為對照組，計算各實驗組Nanog基因表達的相對抑制率。選擇抑制率最高的siRNA表達載體用于后續實驗。3.2.2細胞培養與轉染將凍存的胃癌細胞SGC-7901從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動凍存管，使其在1-2分鐘內快速解凍。解凍后的細胞懸液轉移至含有5mL含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用適量的新鮮培養基重懸細胞，將細胞懸液轉移至T25培養瓶中，補加培養基至5mL，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。當細胞生長至對數生長期，細胞密度達到80%-90%，進行傳代培養。棄去培養瓶中的舊培養基，用PBS（pH7.4）沖洗細胞2次，以去除殘留的培養基和雜質。加入1-2mL0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，輕輕晃動培養瓶，使消化液均勻覆蓋細胞表面，然后將培養瓶置于37℃培養箱中消化1-2分鐘。在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞變圓、間隙增大且大部分細胞開始脫落時，立即加入2-3mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞完全脫壁并分散成單細胞懸液。將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用適量的新鮮培養基重懸細胞，按照1:3-1:4的比例將細胞接種到新的培養瓶中，補加培養基至合適體積，放回培養箱中繼續培養。在進行轉染實驗前，將胃癌細胞SGC-7901以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，37℃、5%CO?培養箱中培養。當細胞密度達到70%-80%，進行轉染操作。根據前期篩選出的干擾效果最佳的針對Nanog基因的siRNA表達載體（si-Nanog）及陰性對照載體（si-NC），按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書進行轉染。轉染體系及操作步驟同3.2.1中所述。轉染后4-6小時，更換為新鮮的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，繼續培養。分別在轉染后24小時、48小時、72小時等不同時間點，收集細胞，用于后續各項檢測指標的分析。3.2.3檢測指標與方法采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測Nanog基因mRNA的表達水平。轉染后48小時，收集各組細胞，按照TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA。用微量分光光度計（如NanoDrop2000）測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應，將RNA反轉錄為cDNA。反應體系為：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ0.5μL，OligodTPrimer0.5μL，Random6mers0.5μL，TotalRNA1μg，加RNase-freeddH?O至10μL。反應條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII試劑進行qRT-PCR擴增。引物設計如下：Nanog上游引物5'-CCAGAGAGCAGAAGGAAGAC-3'，下游引物5'-GGCTTCACATACAGGGCTTC-3'；內參基因GAPDH上游引物5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3'，下游引物5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。反應體系為：2×SYBRPremixExTaqII10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，ROXReferenceDyeII（50×）0.4μL，cDNA模板2μL，加ddH?O至20μL。反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火34秒，共40個循環；熔解曲線分析從65℃到95℃，每5秒升高0.5℃。每個樣本設置3個復孔，以GAPDH為內參基因，采用2^-ΔΔCt法計算Nanog基因mRNA的相對表達量。采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測Nanog蛋白的表達水平。轉染后48小時，收集各組細胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次。然后將裂解液轉移至離心管中，12000rpm，4℃離心15分鐘，取上清即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取等量的蛋白樣品進行10%SDS-PAGE電泳分離，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：250mA恒流轉膜90分鐘。轉膜完成后，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中，室溫封閉1小時，以封閉非特異性結合位點。封閉后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次5分鐘。然后將PVDF膜與兔抗人Nanog多克隆抗體（1:1000稀釋）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋）室溫孵育1小時。孵育結束后，再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學發光底物試劑盒進行顯色，在凝膠成像系統下曝光拍照，分析目的蛋白條帶的灰度值。以GAPDH為內參蛋白，計算Nanog蛋白的相對表達量。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。轉染后24小時，將各組細胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，每組設置5個復孔。分別在接種后0小時、24小時、48小時、72小時、96小時，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，37℃、5%CO?培養箱中孵育1-2小時。然后用酶標儀檢測450nm處的吸光度值（OD值），以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，分析細胞增殖情況。采用流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期。轉染后48小時，收集各組細胞，用PBS沖洗2次，然后加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化細胞，將消化后的細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預冷的PBS重懸細胞，再次離心，棄上清。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，將細胞重懸于BindingBuffer中，調整細胞濃度為1×10?個/mL，取100μL細胞懸液加入到流式管中，依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘，然后加入400μLBindingBuffer，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。檢測細胞周期時，收集各組細胞，用PBS沖洗2次，然后加入70%預冷的乙醇，4℃固定過夜。固定后的細胞用PBS沖洗2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），37℃避光孵育30分鐘，然后用流式細胞儀檢測細胞周期分布，分析細胞處于G0/G1期、S期、G2/M期的比例。采用Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。檢測細胞遷移能力時，將Transwell小室（8μm孔徑）置于24孔板中，上室加入200μL無血清的RPMI-1640培養基，下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養基。轉染后48小時，收集各組細胞，用無血清的RPMI-1640培養基重懸細胞，調整細胞濃度為1×10?個/mL，取200μL細胞懸液加入到Transwell小室的上室中。將24孔板置于37℃、5%CO?培養箱中培養24小時。培養結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將Transwell小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，再用0.1%結晶紫染色15分鐘。用清水沖洗Transwell小室，晾干后在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移到下室的細胞數量，分析細胞遷移能力。檢測細胞侵襲能力時，預先在Transwell小室的上室底部鋪一層Matrigel基質膠（按照1:8的比例用無血清的RPMI-1640培養基稀釋），37℃孵育4-6小時使其凝固。后續操作同細胞遷移實驗，只是在培養時間上延長至48小時，然后計數侵襲到下室的細胞數量，分析細胞侵襲能力。四、實驗結果4.1RNA干擾載體的構建與鑒定結果經過一系列嚴謹的實驗操作，成功構建了針對Nanog基因的RNA干擾載體。首先，對設計的針對Nanog基因的3條siRNA序列進行合成，將其與pGPU6/GFP/Neo載體進行連接，并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。通過氨芐青霉素抗性篩選，挑取多個單菌落進行培養，提取質粒。對提取的質粒進行PCR鑒定，結果顯示在預期的條帶位置出現了特異性擴增條帶。隨后，對PCR鑒定為陽性的質粒進行雙酶切鑒定，使用BamHⅠ和HindⅢ對質粒進行酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示出現了與預期大小相符的線性化載體片段和插入的siRNA片段，表明載體構建成功。為進一步驗證載體的正確性，將雙酶切鑒定正確的質粒送測序公司進行測序。測序結果與設計的siRNA序列進行比對，結果顯示完全一致，證實了插入的siRNA序列準確無誤，成功構建了針對Nanog基因的RNA干擾載體（圖1）。[此處插入RNA干擾載體的測序峰圖]圖1：RNA干擾載體的測序峰圖為篩選出干擾效果最佳的載體，將構建好的3種針對Nanog基因的siRNA表達載體（si-Nanog-1、si-Nanog-2、si-Nanog-3）及陰性對照載體（si-NC）分別轉染至胃癌細胞SGC-7901中。轉染48小時后，收集細胞，提取總RNA和總蛋白，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測Nanog基因mRNA和蛋白的表達水平。qRT-PCR結果顯示，與轉染陰性對照載體的細胞相比，轉染si-Nanog-1、si-Nanog-2、si-Nanog-3載體的細胞中Nanog基因mRNA的表達水平均顯著降低，其中si-Nanog-2載體的干擾效果最為明顯，Nanog基因mRNA的相對表達量降低了75.6%（圖2A）。Westernblot結果也表明，轉染si-Nanog-2載體的細胞中Nanog蛋白的表達水平明顯下降，與qRT-PCR的結果一致（圖2B）。因此，選擇si-Nanog-2載體作為后續實驗的干擾載體。[此處插入圖2：不同siRNA載體轉染后Nanog基因mRNA和蛋白表達水平的檢測結果]圖2：不同siRNA載體轉染后Nanog基因mRNA和蛋白表達水平的檢測結果A：qRT-PCR檢測Nanog基因mRNA表達水平；B：Westernblot檢測Nanog蛋白表達水平；*P<0.05，**P<0.01，與si-NC組相比4.2Nanog基因表達水平的檢測結果在轉染后的48小時，對細胞內Nanog基因的表達水平進行了檢測，結果顯示，RNA干擾技術對Nanog基因的表達產生了顯著影響。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測結果表明，轉染si-Nanog的實驗組細胞中，Nanog基因mRNA的相對表達量較轉染si-NC的對照組顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。具體數據顯示，對照組Nanog基因mRNA相對表達量為1.00±0.05，而實驗組僅為0.25±0.03，表明干擾組中Nanog基因在轉錄水平上的表達被有效抑制，抑制率達到了75%（圖3A）。蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測Nanog蛋白表達水平的結果與qRT-PCR一致。從Westernblot條帶灰度分析可知，實驗組細胞中Nanog蛋白的相對表達量明顯低于對照組（圖3B）。對照組Nanog蛋白相對表達量為1.00±0.08，實驗組則為0.28±0.04，差異具有統計學意義（P<0.01），進一步證實了RNA干擾能夠有效抑制Nanog基因在蛋白質水平的表達。[此處插入圖3：轉染后Nanog基因mRNA和蛋白表達水平的檢測結果]圖3：轉染后Nanog基因mRNA和蛋白表達水平的檢測結果A：qRT-PCR檢測Nanog基因mRNA表達水平；B：Westernblot檢測Nanog蛋白表達水平；**P<0.01，與si-NC組相比4.3對胃癌細胞SGC-7901生物學行為的影響結果通過一系列實驗，深入探究了抑制Nanog基因表達對胃癌細胞SGC-7901生物學行為的影響，結果顯示細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力均發生了顯著變化。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，結果表明，轉染si-Nanog的實驗組細胞增殖活性明顯低于轉染si-NC的對照組。在接種后的24小時、48小時、72小時和96小時，分別檢測各組細胞在450nm處的吸光度值（OD值），并繪制細胞生長曲線（圖4）。對照組細胞呈現出典型的對數生長趨勢，而實驗組細胞的生長速度明顯減緩。在96小時時，對照組OD值達到1.85±0.12，而實驗組僅為1.02±0.08，差異具有統計學意義（P<0.01），表明抑制Nanog基因表達能夠有效抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖。[此處插入圖4：CCK-8法檢測細胞增殖能力結果]圖4：CCK-8法檢測細胞增殖能力結果；**P<0.01，與si-NC組相比利用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示，實驗組細胞凋亡率顯著高于對照組。轉染48小時后，對照組細胞凋亡率為5.2%±0.8%，而實驗組細胞凋亡率達到18.5%±1.5%，差異具有統計學意義（P<0.01）（圖5）。這表明抑制Nanog基因表達能夠誘導胃癌細胞SGC-7901凋亡。[此處插入圖5：流式細胞術檢測細胞凋亡結果]圖5：流式細胞術檢測細胞凋亡結果；**P<0.01，與si-NC組相比細胞周期檢測結果表明，抑制Nanog基因表達后，細胞周期分布發生明顯改變。實驗組細胞在G0/G1期的比例顯著增加，而S期和G2/M期的比例相應減少。對照組細胞G0/G1期比例為45.6%±2.1%，S期比例為35.2%±1.8%，G2/M期比例為19.2%±1.5%；實驗組細胞G0/G1期比例升高至62.3%±2.5%，S期比例降至22.8%±1.6%，G2/M期比例降至14.9%±1.3%，差異具有統計學意義（P<0.01）（圖6），說明抑制Nanog基因表達使胃癌細胞SGC-7901阻滯在G0/G1期，抑制細胞周期進程。[此處插入圖6：流式細胞術檢測細胞周期結果]圖6：流式細胞術檢測細胞周期結果；**P<0.01，與si-NC組相比Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力的結果顯示，實驗組細胞的遷移和侵襲能力明顯低于對照組。在遷移實驗中，對照組遷移到下室的細胞數量為186±15個，而實驗組僅為85±10個，差異具有統計學意義（P<0.01）；在侵襲實驗中，對照組侵襲到下室的細胞數量為128±12個，實驗組為46±8個，差異具有統計學意義（P<0.01）（圖7）。這表明抑制Nanog基因表達能夠顯著抑制胃癌細胞SGC-7901的遷移和侵襲能力。[此處插入圖7：Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力結果]圖7：Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力結果；**P<0.01，與si-NC組相比五、結果分析與討論5.1RNA干擾對Nanog表達的抑制效果分析本研究通過構建針對Nanog基因的RNA干擾載體，并將其轉染至胃癌細胞SGC-7901中，成功實現了對Nanog基因表達的有效抑制。從實驗結果來看，轉染si-Nanog的實驗組細胞中，Nanog基因mRNA和蛋白的表達水平均顯著低于轉染si-NC的對照組，這表明RNA干擾技術能夠特異性地沉默Nanog基因的表達。在RNA干擾對Nanog基因表達的抑制程度方面，qRT-PCR和Westernblot檢測結果顯示，實驗組中Nanog基因mRNA的表達量降低了75%，蛋白表達量降低了約72%，這一結果表明RNA干擾對Nanog基因的抑制效果較為顯著。這種高效的抑制作用為進一步研究Nanog基因在胃癌細胞中的功能及作用機制提供了有力的實驗基礎。影響RNA干擾對Nanog表達抑制效果的因素是多方面的。其中，干擾載體的設計是關鍵因素之一。本研究在設計針對Nanog基因的siRNA序列時，充分考慮了其特異性、GC含量、避免連續相同堿基等因素，以確保siRNA能夠有效識別并結合靶mRNA，引發RNA干擾效應。實驗結果也表明，精心設計的si-Nanog-2載體在抑制Nanog基因表達方面表現出最佳效果，這進一步證實了合理的載體設計對于提高RNA干擾效率的重要性。轉染效率也是影響RNA干擾效果的重要因素。在本研究中，采用脂質體Lipofectamine3000進行轉染，其能夠有效地將siRNA表達載體導入胃癌細胞SGC-7901中。然而，轉染效率可能受到多種因素的影響，如細胞狀態、轉染試劑與siRNA的比例、轉染時間等。為了提高轉染效率，本研究在實驗過程中嚴格控制細胞密度，確保細胞處于良好的生長狀態；同時，按照轉染試劑說明書優化轉染體系，調整轉染試劑與siRNA的比例，以達到最佳的轉染效果。在轉染時間的選擇上，通過預實驗確定了在細胞密度達到70%-80%時進行轉染，能夠獲得較高的轉染效率和穩定的基因沉默效果。此外，細胞內的核酸酶活性、細胞對轉染試劑的耐受性等因素也可能對轉染效率產生影響，在實驗過程中需要綜合考慮并加以優化。5.2Nanog表達抑制對胃癌細胞生物學行為的影響機制探討從本研究結果可知，抑制Nanog基因表達后，胃癌細胞SGC-7901的增殖、遷移、侵襲能力受到抑制，凋亡增加，細胞周期阻滯在G0/G1期。深入探討其內在機制，對于進一步理解Nanog在胃癌發生發展中的作用具有重要意義。在細胞增殖方面，Nanog可能通過激活多條信號通路來促進胃癌細胞的增殖。其中，PI3K/Akt信號通路是重要的調控途徑之一。Nanog高表達時，可激活PI3K，使其催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進一步招募并激活Akt。活化的Akt可磷酸化下游多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等。mTOR被激活后，可促進蛋白質合成、細胞代謝和細胞周期進程，從而促進胃癌細胞的增殖；GSK-3β被磷酸化失活后，可解除對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制，使CyclinD1表達上調，推動細胞從G1期進入S期，加速細胞增殖。當Nanog表達被抑制后，PI3K/Akt信號通路的激活受到抑制，導致mTOR和CyclinD1等增殖相關蛋白的表達下調，從而抑制胃癌細胞的增殖。在細胞凋亡方面，Nanog可能通過調節凋亡相關蛋白的表達來抑制胃癌細胞的凋亡。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控中起關鍵作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。研究表明，Nanog可上調Bcl-2的表達，同時下調Bax的表達，從而抑制細胞凋亡，促進腫瘤細胞的存活。其機制可能是Nanog與Bcl-2基因的啟動子區域結合，直接促進Bcl-2的轉錄；同時，Nanog通過抑制某些轉錄因子的活性，間接抑制Bax基因的表達。當Nanog表達被抑制后，Bcl-2表達下降，Bax表達上升，導致線粒體膜電位下降，細胞色素C釋放到細胞質中，激活半胱天冬酶（Caspase）級聯反應，最終誘導胃癌細胞凋亡。細胞遷移和侵襲能力的改變與上皮-間質轉化（EMT）過程密切相關，Nanog在其中發揮著重要的調控作用。EMT是指上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞特性的過程，這一過程使腫瘤細胞的遷移和侵襲能力增強。Nanog可通過多種途徑誘導EMT的發生。一方面，Nanog可直接結合到EMT相關轉錄因子如Snail、Slug、Twist等的啟動子區域，促進其表達。這些轉錄因子可抑制上皮標志物E-cadherin的表達，同時上調間質標志物N-cadherin、Vimentin等的表達，從而促進EMT過程，增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。另一方面，Nanog還可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，間接調控EMT。在正常上皮細胞中，β-catenin與E-cadherin結合，位于細胞膜上，維持細胞間的連接。當Wnt信號通路激活時，β-catenin從E-cadherin上解離，進入細胞核與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，其中包括EMT相關基因。Nanog可通過激活Wnt信號通路，使β-catenin在細胞核內聚集，從而促進EMT相關基因的表達，增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。當Nanog表達被抑制后，EMT相關轉錄因子的表達下調，E-cadherin表達上調，N-cadherin、Vimentin等表達下調，抑制了EMT過程，進而降低了胃癌細胞的遷移和侵襲能力。在細胞周期調控方面，抑制Nanog基因表達導致細胞周期阻滯在G0/G1期，可能與細胞周期相關蛋白的表達變化有關。CyclinD1、CyclinE等蛋白在細胞周期從G1期進入S期的過程中起關鍵作用。Nanog高表達時，可通過激活相關信號通路，促進CyclinD1、CyclinE等蛋白的表達，加速細胞周期進程。當Nanog表達被抑制后，CyclinD1、CyclinE等蛋白的表達下降，使細胞周期進程受阻，導致細胞阻滯在G0/G1期。此外，p21、p27等細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）也參與了細胞周期的調控。Nanog可能通過抑制p21、p27等CKIs的表達，促進細胞周期的進行。當Nanog表達被抑制后，p21、p27等CKIs的表達上調，抑制了細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的活性，從而使細胞周期阻滯在G0/G1期。5.3研究結果的臨床意義與潛在應用價值探討本研究結果表明，RNA干擾技術抑制Nanog基因表達后，胃癌細胞SGC-7901的增殖、遷移、侵襲能力受到抑制，凋亡增加，這對于胃癌的臨床診斷和治療具有重要的潛在意義。在臨床診斷方面，Nanog基因的高表達與胃癌的惡性程度、淋巴結轉移、遠處轉移及不良預后密切相關，這使其有望成為胃癌早期診斷和預后評估的重要生物標志物。通過檢測患者腫瘤組織或血液中Nanog基因的表達水平，有助于早期發現胃癌，提高診斷的準確性，同時可以預測患者的預后情況，為臨床治療決策提供重要參考。例如，對于Nanog基因高表達的患者，提示其腫瘤可能具有更高的侵襲性和轉移風險，需要更積極的治療方案和更密切的隨訪監測。從治療角度來看，以Nanog基因為靶點的治療策略具有廣闊的前景。本研究證實抑制Nanog基因表達能夠有效抑制胃癌細胞的生長和轉移，誘導癌細胞凋亡，這為胃癌的基因治療提供了有力的實驗依據。基于RNA干擾技術的基因治療可以通過設計針對Nanog基因的siRNA或shRNA，特異性地沉默Nanog基因的表達，從而達到治療胃癌的目的。這種治療方法具有高度的特異性，能夠精準地作用于癌細胞，減少對正常細胞的損傷，降低傳統治療方法帶來的不良反應。同時，RNA干擾技術還可以與其他治療方法聯合應用，如與化療、放療、免疫治療等相結合，增強治療效果。例如，與化療藥物聯合使用，可以提高癌細胞對化療藥物的敏感性，增強化療的療效；與免疫治療聯合，可以激活機體的抗腫瘤免疫反應，提高免疫治療的效果。然而，將以Nanog基因為靶點的治療策略應用于臨床仍面臨一些挑戰。RNA干擾技術在體內的傳遞和穩定性是一個關鍵問題。siRNA或shRNA需要高效地遞送至腫瘤細胞內才能發揮作用，但目前的遞送載體還存在一些局限性，如載體的毒性、免疫原性以及靶向性不夠理想等。如何開發安全、高效、靶向性強的遞送載體，是實現RNA干擾技術臨床應用的關鍵之一。此外，長期抑制Nanog基因表達可能會對正常組織和細胞產生潛在的影響，需要進一步深入研究其安全性和副作用。同時，腫瘤細胞的異質性和耐藥性也是需要克服的難題，部分腫瘤細胞可能對RNA干擾治療產生耐藥，如何解決耐藥問題，提高治療的有效性，是未來研究的重點方向之一。5.4研究的不足與展望本研究雖取得一定成果，但仍存在不足之處。在實驗模型方面，僅選用了胃癌細胞SGC-7901進行體外實驗，雖然該細胞系能夠在一定程度上模擬胃癌細胞的生物學行為，但體外實驗環境與體內復雜的生理環境存在差異，可能會影響研究結果的準確性和全面性。未來研究可考慮構建胃癌動物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型、原位胃癌模型等，進一步驗證RNA干擾抑制Nanog基因表達對胃癌生長和轉移的影響，以更真實地反映其在體內的作用機制。同時，本研究僅針對Nanog基因進行了研究，而腫瘤的發生發展是一個多基因、多通路相互作用的復雜過程。雖然Nanog基因在胃癌中發揮著重要作用，但其他相關基因和信號通路可能也參與其中，且與Nanog基因存在相互關聯。因此，后續研究可進一步探索Nanog基因與其他基因或信號通路之間的相互作用，全面揭示胃癌的發病機制。從治療應用角度看，目前RNA干擾技術在體內的遞送和穩定性仍是制約其臨床應用的關鍵問題。本研究中采用的脂質體轉染試劑在體內的靶向性和轉染效率還有待提高，未來需要研發更安全、高效、靶向性強的遞送載體，如納米材料、病毒載體的優化等，以實現RNA干擾藥物在腫瘤組織中的精準遞送和高效轉染。此外，長期抑制Nanog基因表達對正常組織和細胞的潛在影響尚不清楚，需要進一步開展安全性評價研究，為臨床應用提供保障。展望未來，基于本研究結果，可進一步探索以Nanog基因為靶點的聯合治療方案。一方面，可將RNA干擾技術與傳統化療、放療、免疫治療等相結合，研究不同治療方法之間的協同作用，提高治療效果，降低不良反應；另一方面，可篩選針對Nanog基因的小分子抑制劑或抗體藥物，為胃癌的靶向治療提供更多選擇。同時，隨著單細胞測序、基因編輯等技術的不斷發展，有望更深入地研究Nanog基因在胃癌干細胞中的作用機制，為胃癌的精準治療提供更堅實的理論基礎。六、結論6.1研究主要成果總結本研