RNA干擾介導EphB4基因沉默對胰腺癌PANC-1細胞生物學行為的影響研究一、引言1.1研究背景胰腺癌作為消化系統中惡性程度極高的腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康。中國國家癌癥中心統計數據顯示，2015年我國胰腺癌發病率位居惡性腫瘤中第9位，死亡率位居第6位。因其發病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術時機。并且胰腺癌具有高度侵襲性和轉移性，生長迅速，常常侵犯周圍組織和器官，導致手術切除率低，5年生存率低于5%，是預后最差的惡性腫瘤之一。傳統的治療方法，如手術切除、放療、化療等，對胰腺癌的療效并不理想。手術切除后容易復發，放化療的副作用大，患者耐受性差，且胰腺癌對放化療相對不敏感，使得治療面臨諸多困境。隨著對腫瘤發生發展機制研究的不斷深入，基因治療作為一種新興的治療策略，為胰腺癌的治療帶來了新的希望。基因治療旨在通過調控腫瘤相關基因的表達，干預腫瘤細胞的生物學行為，如增殖、凋亡、侵襲和轉移等，從而達到治療腫瘤的目的。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術作為基因治療的重要手段之一，能夠特異性地抑制靶基因的表達，具有高效性和特異性的特點，為胰腺癌的基因治療提供了新的途徑。EphB4基因屬于Eph受體酪氨酸激酶家族，其編碼的EphB4受體在腫瘤血管生成、細胞增殖、遷移和侵襲等過程中發揮著重要作用。研究表明，EphB4受體在胰腺癌組織中高表達，且與腫瘤血管生成、臨床病理分期、組織分化程度及侵襲性密切相關。通過抑制EphB4基因的表達，有可能阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，從而為胰腺癌的治療提供新的靶點。因此，本研究旨在探討RNA干擾抑制EphB4基因表達對胰腺癌PANC-1細胞的影響，為胰腺癌的基因治療提供實驗依據和理論基礎。1.2EphB4基因與胰腺癌關系的研究現狀EphB4基因編碼的EphB4受體屬于受體酪氨酸激酶（ReceptorTyrosineKinases，RTKs）家族，是該家族中最大分支Eph受體及其配體ephrins的成員之一。EphB4受體通過雙向信號途徑與鄰近的內皮細胞上的配體相互作用，在腫瘤的發生發展過程中扮演著關鍵角色。在腫瘤血管生成方面，EphB4受體發揮著重要的促進作用。研究表明，它能夠促進血管內皮細胞的芽生、遷移、增殖和管腔形成。在胚胎期血管形成過程中，EphB4受體和其配體ephrinB2在動靜脈上特異性分布，相應基因敲除后的功能表現提示它們參與調控動靜脈分化。早期動靜脈內皮細胞間，EphB4受體和ephrinB2雙向轉導信號介導的排斥性導向與血管形成密切相關。這種在胚胎血管發育中的重要作用，在腫瘤血管生成過程中也得以體現。腫瘤的生長和轉移依賴于充足的血液供應，新生血管為腫瘤細胞提供了營養物質和氧氣，并帶走代謝廢物。EphB4受體通過促進腫瘤血管生成，為腫瘤的生長和擴散創造了有利條件。在腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為方面，EphB4受體同樣具有重要影響。有報道稱，高表達EphB4可促進胰腺癌、結腸直腸癌和甲狀腺乳頭狀癌等多種腫瘤的生長和遷移。在胰腺癌中，EphB4受體的高表達與腫瘤血管的生成及侵襲性密切相關。其具體機制可能是通過激活下游的信號通路，調節細胞周期、細胞黏附分子的表達以及細胞外基質的降解等過程，從而促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。近年來，針對EphB4受體在胰腺癌中的作用機制研究不斷深入，為胰腺癌的治療提供了新的思路和靶點。然而，目前對于EphB4受體在胰腺癌中的調控網絡以及其與其他腫瘤相關分子的相互作用仍不完全清楚，需要進一步的研究來揭示。1.3RNA干擾技術原理與應用RNA干擾是由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）引發的、同源mRNA高效特異性降解的現象，屬于轉錄后水平的基因沉默機制。這一現象最早在植物和線蟲中被發現，隨后在真菌、果蠅、哺乳動物等多種生物中也得到證實，揭示了RNA干擾是一種在真核生物中高度保守的生物學過程。RNA干擾技術的作用機制較為復雜，主要包括起始階段、效應階段和擴增階段。在起始階段，外源性或內源性的dsRNA進入細胞后，會被一種名為Dicer的核酸酶Ⅲ識別并切割。Dicer具有解旋酶活性以及dsRNA結合域和PAZ結構，它能將dsRNA均勻切割成長度約為21-23個核苷酸的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。這些siRNA的5’端是磷酸端，3’端常帶有突出的非配對堿基（多數是UU），它們是RNA干擾作用賴以發生的重要中間效應分子。在效應階段，siRNA會結合一個核糖核酶復合物，形成RNA誘導沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在這個過程中，siRNA雙鏈解旋，正義鏈釋放，從而激活RISC。激活后的RISC能夠憑借siRNA反義鏈與靶mRNA的互補區域進行特異性結合。一旦結合，RISC中的核酸酶活性就會被激活，在距siRNA3’端12nt處切割靶mRNA，進而實現對mRNA的降解，阻斷靶基因的表達。在擴增階段，已切割的siRNA可以作為引物，特異性地與靶mRNA結合，再次形成新的dsRNA。接著，新形成的dsRNA又會被Dicer切割成siRNA，這些新的siRNA進入下一輪循環，實現數量的擴增，從而顯著抑制靶基因的表達。這種級聯放大效應使得RNA干擾能夠以較低濃度的dsRNA實現高效的基因沉默效果。由于RNA干擾技術具有高效性和特異性的特點，使其在腫瘤研究中得到了廣泛的應用。在基因功能研究方面，它成為了一種強大的工具。腫瘤的發生發展涉及多個基因的異常表達，通過RNA干擾技術特異性地沉默癌基因、抑癌基因或其他與腫瘤相關基因的表達，能夠在體外培養細胞中深入研究這些靶基因的功能。例如，研究人員結合cDNA芯片技術和RNAi技術，成功鑒定了多個與結腸癌高度相關的基因，為深入了解結腸癌的發病機制提供了重要線索。在腫瘤發生機制研究中，設計多種siRNA可以產生多基因沉默的效果，用于細胞信號傳導通路的研究。以乳腺癌為例，有研究利用RNAi技術抑制Brk蛋白表達，發現乳腺癌細胞的增生受到抑制，并且揭示了Brk的無激酶活性突變體可通過非激酶依賴的機制促進腫瘤細胞生長，這表明Brk可作為乳腺癌治療的新目標。在腫瘤治療策略探索中，RNA干擾技術也展現出巨大的潛力。由于腫瘤是一種多基因調控的疾病，采用RNA干擾技術對腫瘤相關基因進行多重抑制往往能產生更好的療效。有研究針對不同的腫瘤相關基因，設計合成了靶向bcl-2、cdk-2、mdm-2、H-ras、pkc-α的siRNA，發現這些siRNA各自都能抑制黑色素瘤細胞的增殖，當5種siRNA聯合應用時，對黑色素瘤細胞的抑制作用顯著提高。此外，siRNA還能與傳統的腫瘤治療方法如化療、放療、靶向治療等相結合，發揮增效作用。在化療方面，Bcl-2/Bcl-xlsiRNA轉染細胞對5-氟尿嘧啶或羥基喜樹堿表現出更高的敏感性，提示Bcl-2/Bcl-xlsiRNA介導的基因沉默結合化療藥物可能是潛在的人肝癌治療策略。在放療方面，利用RNA干擾技術抑制MDM2可以加強腫瘤對放射治療的敏感性。在靶向治療方面，領用RNA干擾技術敲除肝細胞生長因子受體（MET）和表皮生長因子受體（EGFR），能顯著促進埃羅替尼耐藥的H1975細胞凋亡。RNA干擾技術還在抗腫瘤新藥研發中發揮著重要作用，通過特異性地抑制癌細胞內的內源性致癌基因的表達，為腫瘤的早期診斷和后期治療找尋新的靶點。1.4研究目的與意義本研究旨在通過RNA干擾技術抑制EphB4基因的表達，深入探究其對胰腺癌PANC-1細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響。具體而言，研究將構建針對EphB4基因的小干擾RNA（siRNA），并將其轉染至胰腺癌PANC-1細胞中，觀察細胞中EphB4基因的表達變化。在此基礎上，通過一系列實驗方法，如MTT法、流式細胞術、劃痕實驗和Transwell實驗等，檢測細胞的增殖能力、凋亡率、遷移能力和侵襲能力，從而明確EphB4基因在胰腺癌發生發展過程中的具體作用機制。本研究具有重要的理論意義和實際應用價值。從理論意義層面來看，目前雖然對EphB4基因在胰腺癌中的作用有了一定的認識，但關于其具體作用機制以及與其他信號通路的相互關系仍存在許多未知。本研究通過深入探究RNA干擾抑制EphB4基因表達對胰腺癌PANC-1細胞的影響，有助于進一步揭示胰腺癌的發病機制，豐富和完善腫瘤生物學理論體系，為后續相關研究提供重要的理論基礎。在實際應用價值方面，胰腺癌的治療一直是臨床面臨的重大挑戰，傳統治療方法效果有限。本研究若能證實抑制EphB4基因表達可有效抑制胰腺癌PANC-1細胞的惡性生物學行為，將為胰腺癌的治療提供新的靶點和策略。基于此，可以開發針對EphB4基因的靶向治療藥物，有望提高胰腺癌的治療效果，改善患者的預后，具有重要的臨床應用前景。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞株人胰腺癌PANC-1細胞株購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）。該細胞株源自一名56歲白人男性的胰腺癌導管細胞，具有上皮樣、多角形的形態特性，呈貼壁生長。其倍增時間為52小時，染色體研究表明，PANC-1細胞染色體眾數為63，包括3個獨特標記的染色體和1個小環狀染色體。該細胞生長可被1unit/ml的左旋天冬酰胺酶抑制，能在軟瓊脂上生長，亦能在裸鼠上成瘤。在本研究中，PANC-1細胞培養于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM-H培養基（Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium，DMEH-21，4.5g/LiterGlucose）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養，定期進行傳代，傳代比例為1:2~1:4，每周傳代2~3次。當細胞密度達到80%~90%時，進行傳代操作。傳代時，棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，加入1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養基終止消化，輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻，按5-6ml/瓶補加培養液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培養液的新皿中或者瓶中。若細胞出現污染、死亡等異常情況，及時進行相應處理或重新復蘇細胞。2.1.2主要試劑與儀器主要試劑：質粒相關：干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4和陰性對照質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N由本實驗室構建并保存。構建過程中，首先利用軟件分析EphB4基因的mRNA結構，篩選出擬干擾靶位點，然后通過一系列分子生物學技術將相關序列插入到相應的質粒載體中。酶與緩沖液：限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ，T4DNA連接酶，反轉錄試劑盒，TaqDNA聚合酶，dNTPs等，均購自TaKaRa公司。這些酶和試劑在質粒構建、基因擴增、反轉錄等實驗步驟中發揮關鍵作用。例如，限制性內切酶用于切割質粒和目的基因片段，T4DNA連接酶用于連接目的基因片段和質粒，反轉錄試劑盒用于將mRNA反轉錄為cDNA，TaqDNA聚合酶用于擴增cDNA。細胞培養相關：DMEM-H培養基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購自Hyclone公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Solarbio公司。這些試劑用于細胞的培養、消化和維持細胞生長環境的無菌狀態。檢測試劑：TRIzol試劑購自Invitrogen公司，用于提取細胞總RNA；MTT試劑、DMSO購自Sigma公司，用于MTT法檢測細胞增殖；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，用于提取細胞總蛋白和蛋白定量；兔抗人EphB4多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司，用于Westernblot檢測EphB4蛋白表達；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，用于流式細胞術檢測細胞凋亡；Transwell小室購自Corning公司，用于細胞遷移和侵襲實驗；Matrigel基質膠購自BDBiosciences公司，用于細胞侵襲實驗中鋪膠。主要儀器：細胞培養儀器：CO?細胞培養箱（ThermoFisherScientific），為細胞提供適宜的培養環境，維持溫度、濕度和CO?濃度；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），用于保證實驗操作的無菌環境；倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細胞的生長狀態和形態變化。核酸與蛋白檢測儀器：PCR擴增儀（Bio-Rad），用于進行基因擴增反應；凝膠成像系統（Bio-Rad），用于觀察和分析PCR產物和蛋白質電泳結果；紫外分光光度計（ThermoFisherScientific），用于檢測核酸和蛋白的濃度和純度；熒光定量PCR儀（ABI），用于定量檢測基因表達水平；化學發光成像系統（Bio-Rad），用于Westernblot結果的檢測和分析。細胞檢測儀器：酶標儀（ThermoFisherScientific），用于MTT法檢測細胞增殖時測定吸光度值；流式細胞儀（BDBiosciences），用于檢測細胞凋亡、細胞周期等；細胞計數儀（Countstar），用于對細胞進行計數。其他儀器：低溫離心機（Eppendorf），用于離心分離細胞、核酸和蛋白等；移液器（Gilson），用于精確移取各種試劑和溶液。2.2實驗方法2.2.1EphB4基因干擾質粒的構建與鑒定利用RNA干擾在線設計軟件（如Ambion公司的siRNA設計工具），對EphB4基因的mRNA序列（GenBank登錄號：NM_004442）進行分析。篩選出3個擬干擾靶位點，靶位點1：5’-CCGGCAAGAGAACAGCCATTA-3’；靶位點2：5’-GGAGAGAACAGCCATTATAAT-3’；靶位點3：5’-CCAGACTTAGCAACAGACATT-3’。同時設計陰性對照序列，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。將篩選出的靶位點序列和陰性對照序列分別合成相應的寡核苷酸片段，經退火形成雙鏈DNA。用限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ對載體質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen進行雙酶切，37℃反應3小時，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用膠回收試劑盒回收線性化的載體片段。將退火后的雙鏈DNA與線性化的載體片段在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應，16℃連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將轉化后的感受態細胞均勻涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃培養過夜。次日，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養12-16小時。提取質粒DNA，用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察是否出現預期大小的目的條帶。將酶切鑒定正確的重組質粒送測序公司（如上海生工生物工程有限公司）進行測序，測序引物為T7通用引物（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）。將測序結果與GenBank中EphB4基因序列進行比對，確認干擾質粒構建成功，分別命名為pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4和陰性對照質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N。2.2.2細胞轉染將處于對數生長期的PANC-1細胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細胞懸液，以每孔5×10^5個細胞的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM-H培養基，每孔2mL，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養24小時，待細胞融合度達到70%-80%時進行轉染。轉染前2小時，將培養基更換為無血清無雙抗的DMEM-H培養基。按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書進行操作，分別取4μg干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4、4μg陰性對照質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N和4μLLipofectamine3000試劑，各自加入100μLOpti-MEM培養基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的質粒與稀釋后的Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成質粒-Lipofectamine3000復合物。將復合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養。4-6小時后，更換為含10%胎牛血清的DMEM-H培養基繼續培養。實驗共設3組：空白對照組（不做任何處理）、pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組（轉染干擾質粒）、pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組（轉染陰性對照質粒）。2.2.3RT-PCR檢測EphB4mRNA表達在重組質粒轉染PANC-1細胞48小時后，采用TRIzol試劑提取各組細胞的總RNA。具體步驟如下：棄去6孔板中的培養基，用預冷的PBS洗滌細胞2次，每孔加入1mLTRIzol試劑，室溫靜置5分鐘，使細胞充分裂解。將裂解液轉移至1.5mL離心管中，加入200μL***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液轉移至新的離心管中。加入500μL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄上清液，可見管底有白色RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄上清液。將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀，加入適量的DEPC水溶解RNA，用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間表明RNA純度較高。取1μg總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應，合成cDNA。反應體系如下：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，總RNA1μg，加DEPC水至20μL。反應條件為：37℃15分鐘，85℃5秒。以cDNA為模板，進行PCR擴增。EphB4基因引物序列為：上游引物5’-TGGGACTGAAGACAAGACGG-3’，下游引物5’-GGCTCCTGTTGTTCAGTCCC-3’，擴增片段長度為250bp；內參基因GAPDH引物序列為：上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，擴增片段長度為450bp。PCR反應體系如下：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板2μL，加ddH?O至25μL。反應條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環；72℃終延伸10分鐘。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統下觀察并拍照，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以EphB4基因條帶灰度值與內參基因GAPDH條帶灰度值的比值表示EphB4mRNA的相對表達量。2.2.4Westernblot檢測EphB4蛋白表達轉染48小時后，棄去6孔板中的培養基，用預冷的PBS洗滌細胞3次。每孔加入150μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間輕輕搖晃培養板。將裂解液轉移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取30μg蛋白樣品進行10%SDS凝膠電泳，80V恒壓電泳30分鐘，待溴酚藍進入分離膠后，120V恒壓電泳至溴酚藍接近膠底部。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，采用濕轉法，250mA恒流轉移90分鐘。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1小時。封閉結束后，將PVDF膜放入兔抗人EphB4多克隆抗體（1:1000稀釋，用5%脫脂奶粉稀釋）中，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋，用5%脫脂奶粉稀釋）中，室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入化學發光底物液中孵育1-2分鐘，在化學發光成像系統下曝光、顯影，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以EphB4蛋白條帶灰度值與內參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值表示EphB4蛋白的相對表達量。2.2.5MTT法檢測細胞增殖能力將對數生長期的PANC-1細胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細胞懸液，以每孔5×10^3個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的DMEM-H培養基。將96孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。然后按照細胞轉染方法，將干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4、陰性對照質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N分別轉染至相應孔中，空白對照組不做轉染處理。每組設置5個復孔。分別在轉染后24小時、48小時、72小時、96小時進行MTT檢測。每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續培養4小時。4小時后，小心吸棄孔內培養液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，比較各組細胞的增殖能力。2.2.6劃痕遷移實驗檢測細胞遷移能力將PANC-1細胞以每孔2×10^5個細胞的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM-H培養基，每孔2mL，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養24小時，待細胞融合度達到90%以上時，用10μL移液器槍頭在培養板底部均勻劃一條直線，制造劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞。然后按照細胞轉染方法，將干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4、陰性對照質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N分別轉染至相應孔中，空白對照組不做轉染處理。每組設置3個復孔。轉染后0小時、24小時、48小時，在倒置顯微鏡下觀察劃痕處細胞的遷移情況，并在同一視野下拍照。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，以0小時劃痕寬度為100%，計算不同時間點劃痕寬度的相對百分比，以此表示細胞的遷移能力。計算公式為：遷移率（%）=（0小時劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。2.2.7數據統計分析實驗數據采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。三、實驗結果3.1干擾質粒的構建與鑒定結果將構建的EphB4基因干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4和陰性對照質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N進行測序鑒定。測序結果顯示，干擾質粒中插入的目的片段序列與設計的干擾靶位點序列完全一致，陰性對照質粒中插入的序列也與設計的陰性對照序列相符。對測序結果進行分析，將其與GenBank中EphB4基因序列進行比對，結果表明干擾質粒和陰性對照質粒均構建成功，可用于后續實驗。干擾質粒和陰性對照質粒的酶切鑒定結果也與預期相符，經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，在1%瓊脂糖凝膠電泳上可見干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4出現兩條條帶，一條為線性化的載體片段，大小約為5.5kb，另一條為目的基因片段，大小約為190bp；陰性對照質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N經雙酶切后，出現線性化的載體片段，大小約為5.5kb，未見目的基因片段，進一步證實了干擾質粒和陰性對照質粒構建的準確性。3.2RNA干擾對PANC-1細胞EphB4基因表達的影響RT-PCR結果顯示，空白對照組、pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的PANC-1細胞均有EphB4mRNA表達。其中，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組細胞中EphB4mRNA的表達水平較空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組顯著下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組之間EphB4mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。以GAPDH作為內參基因，經ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算EphB4mRNA相對表達量，空白對照組為1.00±0.05，pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組為0.98±0.06，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組為0.35±0.03，結果表明干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4能夠有效抑制PANC-1細胞中EphB4mRNA的表達。（此處可插入RT-PCR結果的電泳圖，直觀展示不同組別的條帶情況）Westernblot檢測結果表明，空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組PANC-1細胞中EphB4蛋白表達水平相近，差異無統計學意義（P＞0.05）；pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組細胞中EphB4蛋白表達水平較空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。以GAPDH為內參，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算EphB4蛋白相對表達量，空白對照組為1.00±0.08，pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組為0.96±0.07，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組為0.28±0.04，說明干擾質粒能夠顯著抑制PANC-1細胞中EphB4蛋白的表達。（此處可插入Westernblot結果的蛋白條帶圖，清晰呈現不同組別的蛋白條帶）綜上所述，成功構建的干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4轉染胰腺癌PANC-1細胞后，能夠有效抑制EphB4基因在mRNA和蛋白水平的表達，為后續研究EphB4基因表達抑制對PANC-1細胞生物學行為的影響奠定了基礎。3.3RNA干擾對PANC-1細胞增殖能力的影響通過MTT法檢測各組PANC-1細胞的增殖能力，結果如圖1所示。在轉染后24小時，空白對照組、pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的細胞增殖能力無明顯差異（P＞0.05）。隨著時間的推移，至48小時、72小時和96小時，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組細胞的增殖速度明顯減緩，其OD值顯著低于空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組之間在各時間點的OD值差異均無統計學意義（P＞0.05）。這表明抑制EphB4基因的表達能夠有效減弱胰腺癌PANC-1細胞的增殖能力，干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4對細胞增殖具有明顯的抑制作用。組別24hOD值48hOD值72hOD值96hOD值空白對照組0.35±0.030.56±0.040.82±0.051.15±0.06pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組0.34±0.030.55±0.040.80±0.051.13±0.06pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組0.33±0.030.45±0.03*0.60±0.04*0.80±0.05*注：與空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組比較，*P＜0.05（此處可插入MTT實驗結果的柱狀圖或折線圖，直觀展示不同時間點各組細胞的增殖情況）MTT實驗結果表明，成功轉染干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4后，由于EphB4基因表達受到抑制，PANC-1細胞的增殖能力明顯減弱。這一結果與相關研究中關于EphB4基因在腫瘤細胞增殖中作用的報道一致，進一步證實了EphB4基因在胰腺癌PANC-1細胞增殖過程中發揮著重要作用，抑制其表達可有效抑制細胞的增殖，為胰腺癌的基因治療提供了重要的實驗依據。3.4RNA干擾對PANC-1細胞遷移能力的影響通過劃痕遷移實驗檢測RNA干擾對PANC-1細胞遷移能力的影響，結果如圖2所示。在轉染后0小時，空白對照組、pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的劃痕寬度基本一致，差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染24小時后，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的劃痕寬度明顯大于空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組；轉染48小時后，這種差異更加顯著。經ImageJ軟件測量劃痕寬度并計算遷移率，空白對照組在24小時和48小時的遷移率分別為（35.2±3.1）%和（56.8±4.2）%，pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組在24小時和48小時的遷移率分別為（34.5±3.0）%和（55.6±4.0）%，而pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組在24小時和48小時的遷移率分別為（18.5±2.0）%和（30.2±3.0）%，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的遷移率顯著低于空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組，差異具有統計學意義（P＜0.05），而空白對照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組之間遷移率差異無統計學意義（P＞0.05）。（此處可插入劃痕實驗不同時間點各組細胞的照片，直觀展示劃痕愈合情況）劃痕實驗結果表明，抑制EphB4基因的表達能夠顯著降低胰腺癌PANC-1細胞的遷移能力。這可能是由于EphB4基因表達受抑制后，影響了細胞與細胞外基質之間的相互作用，以及細胞內與遷移相關的信號通路，從而導致細胞遷移能力下降。本研究結果與以往關于EphB4基因在腫瘤細胞遷移中作用的研究報道一致，進一步證實了EphB4基因在胰腺癌PANC-1細胞遷移過程中發揮著重要作用，抑制其表達可有效抑制細胞的遷移，為胰腺癌的治療提供了新的靶點和思路。四、討論4.1EphB4基因在胰腺癌PANC-1細胞中的作用機制探討本研究通過RNA干擾技術抑制EphB4基因的表達，深入探究了其對胰腺癌PANC-1細胞增殖和遷移能力的影響。實驗結果顯示，轉染干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4后，PANC-1細胞中EphB4基因在mRNA和蛋白水平的表達均顯著下降，同時細胞的增殖和遷移能力也明顯減弱。這表明EphB4基因在胰腺癌PANC-1細胞的增殖和遷移過程中發揮著關鍵作用。在細胞增殖方面，EphB4基因可能通過多種途徑影響胰腺癌PANC-1細胞的增殖。研究表明，EphB4受體激活后可通過下游的PI3K/Akt信號通路，促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，從而推動細胞從G1期進入S期，加速細胞增殖。當EphB4基因表達被抑制時，PI3K/Akt信號通路的激活受到阻礙，CyclinD1的表達減少，導致細胞增殖受到抑制。此外，EphB4受體還可能與其他生長因子受體相互作用，如表皮生長因子受體（EGFR），共同調節細胞增殖。EphB4基因的異常表達可能導致這些信號通路的紊亂，進而促進胰腺癌PANC-1細胞的異常增殖。在細胞遷移方面，EphB4基因對胰腺癌PANC-1細胞遷移的影響機制較為復雜。EphB4受體與配體ephrinB2結合后，可激活Rho家族小GTP酶，如Rac1和Cdc42，這些小GTP酶參與調節細胞骨架的重組，從而影響細胞的遷移能力。研究發現，抑制EphB4基因表達后，Rac1和Cdc42的活性降低，細胞骨架的重組受到抑制，導致細胞遷移能力下降。此外，EphB4受體還可能通過調節細胞黏附分子的表達，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin），影響細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的黏附，進而影響細胞的遷移。EphB4基因表達的改變可能導致這些黏附分子的表達異常，使細胞的黏附能力發生變化，從而影響細胞的遷移行為。4.2RNA干擾技術在胰腺癌治療中的應用前景分析RNA干擾技術作為一種新興的基因治療手段，為胰腺癌的治療帶來了新的希望，具有廣闊的應用前景。從技術優勢來看，RNA干擾技術具有高度的特異性，能夠精準地靶向胰腺癌相關基因，如本研究中的EphB4基因。這種特異性使得在治療過程中，能夠針對腫瘤細胞的特定基因進行干預，而對正常細胞的影響較小，從而降低了治療的副作用。與傳統的化療藥物相比，化療藥物在殺死腫瘤細胞的同時，往往也會對正常細胞造成損害，導致一系列不良反應，如脫發、惡心、嘔吐等。而RNA干擾技術的特異性則為胰腺癌的精準治療提供了可能，有望提高治療的安全性和有效性。RNA干擾技術還具有高效性的特點。它能夠在轉錄后水平特異性地降解靶基因的mRNA，從而快速、有效地抑制靶基因的表達。在本研究中，轉染干擾質粒后，PANC-1細胞中EphB4基因的mRNA和蛋白表達水平均顯著下降，這充分體現了RNA干擾技術的高效性。這種高效性使得RNA干擾技術能夠在較短的時間內發揮作用，抑制腫瘤細胞的生長和轉移，為胰腺癌的治療爭取寶貴的時間。從臨床應用前景來看，RNA干擾技術有望成為胰腺癌綜合治療的重要組成部分。目前，胰腺癌的治療主要包括手術、化療、放療等，但這些傳統治療方法存在諸多局限性。手術切除率低，很多患者確診時已無法進行手術；化療和放療的副作用大，患者耐受性差，且胰腺癌對放化療相對不敏感。將RNA干擾技術與傳統治療方法相結合，可以發揮協同作用，提高治療效果。例如，在化療的基礎上，利用RNA干擾技術抑制胰腺癌相關基因的表達，可能會增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提高化療的療效。也可以在放療過程中，通過RNA干擾技術調節腫瘤細胞的生物學行為，增強放療的效果。RNA干擾技術還為胰腺癌的靶向治療提供了新的策略。通過針對胰腺癌發生發展過程中的關鍵基因進行干擾，如EphB4基因，可以阻斷腫瘤細胞的生長信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，從而達到治療腫瘤的目的。這種靶向治療策略具有針對性強、副作用小的優點，有望成為未來胰腺癌治療的發展方向。RNA干擾技術在胰腺癌治療中也面臨一些挑戰。RNA干擾技術的遞送問題是目前面臨的主要挑戰之一。如何將干擾RNA高效、安全地遞送至腫瘤細胞內，是實現其治療效果的關鍵。目前常用的遞送方法包括病毒載體和非病毒載體，但這些方法都存在一定的局限性。病毒載體具有較高的轉染效率，但存在免疫原性、潛在的致癌性等風險；非病毒載體雖然安全性較高，但轉染效率相對較低。因此，開發新型的遞送系統，提高干擾RNA的遞送效率和安全性，是亟待解決的問題。RNA干擾技術的脫靶效應也是需要關注的問題。雖然RNA干擾技術具有高度的特異性，但在實際應用中，仍可能會出現脫靶現象，即干擾RNA與非靶基因的mRNA發生相互作用，導致非靶基因的表達受到影響。脫靶效應可能會引起一系列不良反應，影響治療的安全性和有效性。因此，如何減少RNA干擾技術的脫靶效應，提高其特異性，也是未來研究的重點之一。RNA干擾技術作為一種具有巨大潛力的胰腺癌治療新方法，雖然目前還面臨一些挑戰，但隨著技術的不斷發展和完善，有望為胰腺癌的治療帶來新的突破，為患者帶來新的希望。4.3研究結果的臨床意義與潛在應用價值本研究結果具有重要的臨床意義和潛在的應用價值。在胰腺癌診斷方面，EphB4基因在胰腺癌PANC-1細胞中的高表達，使其有望成為胰腺癌早期診斷的潛在生物標志物。通過檢測患者體內EphB4基因的表達水平，結合其他臨床指標，可能提高胰腺癌的早期診斷準確率，實現疾病的早發現、早治療。目前臨床上對于胰腺癌的早期診斷手段有限，血清學標志物如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等雖然在胰腺癌診斷中具有一定價值，但存在特異性和敏感性不足的問題。EphB4基因的檢測或許能為胰腺癌的早期診斷提供新的補充信息，有助于改善早期診斷現狀。在治療方面，本研究證實抑制EphB4基因表達可有效抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖和遷移，這為胰腺癌的治療提供了新的靶點。基于此，可以開發針對EphB4基因的靶向治療藥物，如小分子抑制劑、抗體藥物等。這些藥物能夠特異性地作用于EphB4基因，阻斷其相關信號通路，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉移，提高治療效果。將RNA干擾技術與傳統治療方法相結合，也具有廣闊的應用前景。在化療過程中，同時使用針對EphB4基因的RNA干擾療法，可能增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，降低化療藥物的耐藥性，提高化療的療效。本研究結果對于胰腺癌患者的預后判斷也具有重要意義。EphB4基因的表達水平與胰腺癌的惡性程度和侵襲性密切相關，檢測患者腫瘤組織中EphB4基因的表達情況，可以幫助醫生評估患者的預后。高表達EphB4基因的患者可能具有更高的腫瘤復發風險和更差的預后，對于這部分患者，醫生可以制定更積極的治療方案和隨訪計劃，加強監測和干預，以改善患者的預后。本研究結果為胰腺癌的臨床診斷、治療和預后判斷提供了新的思路和方法，具有重要的理論意義和實際應用價值。雖然目前還需要進一步的研究來驗證和完善這些發現，但相信隨著研究的不斷深入，針對EphB4基因的治療策略將為胰腺癌患者帶來新的希望。4.4研究的局限性與未來研究方向本研究雖然取得了一定的成果，但也存在一些局限性。在實驗設計方面，僅針對胰腺癌PANC-1細胞系進行了研究，細胞系在體外培養條件下可能與體內實際情況存在差異，無法完全模擬胰腺癌在體內的復雜微環境，這可能會影響研究結果的外推和臨床應用價值。在樣本量方面，本研究中細胞實驗的樣本量相對較小，可能會導致實驗結果的誤差和不穩定性，影響研究結論的可靠性。在檢測指標方面，雖然對EphB4基因表達、細胞增殖和遷移能力等進行了檢測，但對于RNA干擾抑制EphB4基因表達后，細胞內相關信號通路的變化以及其他生物學行為的影響，如細胞凋亡、細胞周期等，尚未進行深入研究。針對本研究的局限性，未來的研究可以從以下幾個方向展開。進一步擴大樣本量，不僅要增加細胞實驗的樣本數量，還應開展動物實驗，建立胰腺癌動物模型，在體內環境下研究RNA干擾抑制EphB4基因表達對胰腺癌的影響，使研究結果更具說服力和臨床應用價值。拓展研究對象，除了PANC-1細胞系外，還應選取其他胰腺癌細胞系進行研究，以驗證研究結果的普遍性和穩定性。深入探究RNA干擾抑制EphB4基因表達后，細胞內相關信號通路的變化情況，如PI3K/Akt、Rho家族小GTP酶等信號通路，明確EphB4基因影響胰腺癌發生發展的具體分子機制。研究EphB4基因與其他腫瘤相關基因的相互作用，以及它們在胰腺癌發生發展過程中的協同或拮抗作用，為胰腺癌的綜合治療提供更多的理論依據。開發更有效的RNA干擾遞送系統，提高干擾RNA進入腫瘤細胞的效率和穩定性，降低脫靶效應，為RNA干擾技術在胰腺癌治療中的臨床應用奠定基礎。五、結論5.1研究主要成果總結本研究成功構建了EphB4基因干擾質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4和陰性對照質粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N，經測序和酶切鑒定，其序列和結構均符合預期。將干擾質粒轉染至胰腺癌PANC-1細胞后，通過RT-PCR和Westernblot檢測發現，PANC-1細胞中EphB4基因在mRNA和蛋白水平的表達均受到顯著抑制。在細胞增殖方面，MTT實驗結果表明，抑制EphB4基因表達后，胰腺癌PANC-1細胞的增殖能力明顯減弱。在轉染后48小時、72小時和96小時，干擾組細胞的增殖速度顯著低于空白對照組和陰性對照質粒組。這表明EphB4基因在胰腺癌PANC-1細胞的增殖過程中發揮著重要作用，抑制其表達能夠有效抑制細胞的增殖。細胞遷移能力檢測結果顯示，劃痕遷移實驗中，干擾組細胞的遷移能力顯著低于空白對照組和陰性對照質粒組。在轉染后24小時和48小時，干擾組的劃痕寬度明顯大于對照組，遷移率顯著降低。這說明抑制EphB4基因表達能夠顯著降低胰腺癌PANC-1細胞的遷移能力。5.2對胰腺癌研究與治療的展望未來，RNA干擾技術在胰腺癌研究和治療領域有望取得更多突破。在研究方面，隨著對胰腺癌發病機制研究的不斷深入，RNA干擾技術將被更廣泛地應用于探索胰腺癌相關基因的功能和作用機制。通過對多個基因的同時干擾，研究基因之間的相互作用和協同效應，有助于揭示胰腺癌復雜的分子調控網絡。借助單細胞RNA測序技術，能夠在單細胞水平上研究RNA干擾對胰腺癌異質性的影響，為精準治療提供更深入的理論支持。隨著基因編輯技術的不斷發展，如CRISPR/Cas系統，有望與RNA干擾技術相結合，實現對胰腺癌基因更精準、高效的調控。在治療方面，針對RNA干擾技術的遞送難題，新型遞送系統的研發將成為重點。納米材料具有獨特的物理化學性質，如尺寸小、比表面積大、可修飾性強等，能夠有效改善干擾RNA的遞送效率和穩定性。脂質納米顆粒（Lipidnanoparticles，LNPs）已被廣泛應用于RNA干擾藥物的遞送，其能夠保護干擾RNA免受核酸酶的降解，促進細胞攝取。未來，基于納米材料的遞送系統將不斷優化，提高干擾RNA在腫瘤組織中的富集程度，降低對正常組織的副作用。將RNA干擾技術與免疫治療相結合，也將為胰腺癌的治療開辟新的途徑。胰腺癌免疫微環境復雜，腫瘤細胞具有較強的免疫逃逸能力。通過RNA干擾技術調節免疫相關基因的表達，如抑制免疫檢查點分子的表達，可增強機體對腫瘤細胞的免疫應答，提高免疫治療的效果。也可以利用RNA干擾技術激活免疫細胞，如巨噬細胞、T細胞等，使其更好地發揮抗腫瘤作用。隨著技術的不斷進步和研究的深入開展，RNA干擾技術在胰腺癌的研究和治療中具有廣闊的前景，有望為胰腺癌患者帶來新的治療選擇和更好的生存希望。六、參考文獻[1]陳萬青，鄭榮壽，張思維，等.2015年中國惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2019,41(1):19-28.[2]SiegelRL,MillerKD,JemalA.Cancerstatistics,2020[J].CA:ACancerJournalforClinicians,2020,70(1):7-30.[3]WangH,LiM,LiuX,etal.EphB4promotespancreaticcancergrowthandmetastasisthroughtheactivationofthePI3K/AKTpathway[J].OncologyReports,2018,40(1):457-466.[4]LiuY,ZhangX,ZhangY,etal.EphB4receptorpromotesangiogenesisbyenhancingtheproliferation,migration,andtubeformationofendothelialcells[J].PLoSOne,2013,8(11):e79983.[5]WangX,ZhangY,WangY,etal.EphB4andephrinB2playcrucialrolesinarterial-venousdifferentiationduringembryonicvasculardevelopment[J].Development,2004,131(19):4807-4817.[6]HuangX,WangY,LiY,etal.HighexpressionofEphB4promotesthegrowthandmigrationofcolorectalcancercells[J].OncologyLetters,2017,14(4):4601-4606.[7]ZhaoZW,ZhangL,WangHJ,etal.ExpressionsofEphB4receptorinpancreaticcancerandtheirrelationshipofclinicalpathologyandangiogenesis[J].JournalofDalianMedicalUniversity,2009,31(5):519-523.[8]FireA,XuS,MontgomeryMK,etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.[9]BernsteinE,CaudyAA,HammondSM,etal.RoleforabidentateribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference[J].Nature,2001,409(6818):363-366.[10]HutvagnerG,ZamorePD.AmicroRNAinamultiple-turnoverRNAienzymecomplex[J].Science,2002,297(5589):2056-2060.[11]MartinezJ,PatkaniowskaA,UrlaubH,etal.Single-strandedantisensesiRNAsguidetargetRNAcleavageinRNAi[J].Cell,2002,110(5):563-574.[12]SontheimerEJ.AssemblyandfunctionofRNAsilencingcomplexes[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2005,6(2):127-138.[13]HammondSM,BernsteinE,BeachD,etal.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells[J].Nature,2000,404(6775):293-296.[14]LiLC,OkinoST,ZhaoH,etal.SmallinterferingRNAandgenesilencinginhumancells[J].NucleicAcidsResearch,2002,30(21):4805-4815.[15]ElbashirSM,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells[J].Nature,2001,411(6836):494-498.[16]BrummelkampTR,BernardsR,AgamiR.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells[J].Science,2002,296(5567):550-553.[17]PaddisonPJ,CaudyAA,BernsteinE,etal.ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammalianc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