RNA干擾CD133基因：解鎖人結(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的密碼一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。近年來(lái)，其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，結(jié)腸癌的發(fā)病率位居惡性腫瘤前列，而在我國(guó)，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，結(jié)腸癌的發(fā)病也日益增多，在消化道腫瘤中的地位愈發(fā)突出。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出，為腫瘤的研究與治療帶來(lái)了新的視角。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，腫瘤組織中存在一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞。這些細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。對(duì)于結(jié)腸癌而言，結(jié)腸癌干細(xì)胞（CCSC）在結(jié)腸癌的進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌干細(xì)胞不僅能夠維持腫瘤的生長(zhǎng)，還與腫瘤對(duì)放化療的抵抗密切相關(guān)。傳統(tǒng)的結(jié)腸癌治療方法，如手術(shù)、化療和放療，雖然在一定程度上能夠緩解病情，但往往難以徹底清除腫瘤干細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這也是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的主要原因之一。因此，深入研究結(jié)腸癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性，尋找有效的靶向治療方法，成為當(dāng)前結(jié)腸癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。CD133作為一種專(zhuān)性干細(xì)胞標(biāo)記物，在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，結(jié)腸癌也不例外。大量研究表明，CD133陽(yáng)性的癌細(xì)胞具有強(qiáng)大的組織形成能力和干細(xì)胞特性，是結(jié)腸癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一。通過(guò)對(duì)CD133基因的調(diào)控，有望影響結(jié)腸癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為，為結(jié)腸癌的治療開(kāi)辟新的途徑。RNA干擾（RNAi）技術(shù)的出現(xiàn)，為基因功能研究和疾病治療提供了有力工具。RNAi是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的、特異性降解相應(yīng)序列mRNA的過(guò)程，能夠高效、特異地抑制靶基因的表達(dá)。利用RNAi技術(shù)靶向CD133基因，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)CD133表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控，從而深入探究其對(duì)人結(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。本研究旨在運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，深入探究敲減CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。這一研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，有助于我們更深入地理解結(jié)腸癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性和CD133基因在其中的作用機(jī)制，豐富腫瘤干細(xì)胞的理論研究；從臨床應(yīng)用角度出發(fā)，為結(jié)腸癌干細(xì)胞的靶向治療提供了新的思路和理論基礎(chǔ)，有望開(kāi)發(fā)出更有效的治療策略，提高結(jié)腸癌患者的治療效果和生存率，為攻克結(jié)腸癌這一醫(yī)學(xué)難題做出貢獻(xiàn)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，RNA干擾技術(shù)在腫瘤研究領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展。在結(jié)腸癌的研究中，RNAi技術(shù)被廣泛應(yīng)用于探索基因功能和開(kāi)發(fā)新的治療策略。國(guó)外眾多研究團(tuán)隊(duì)聚焦于利用RNAi技術(shù)沉默關(guān)鍵致癌基因，以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。例如，有研究通過(guò)RNAi干擾結(jié)腸癌細(xì)胞中與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)能夠有效阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在對(duì)信號(hào)通路的研究中，利用RNAi技術(shù)靶向干擾與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，結(jié)果顯示該信號(hào)通路被有效抑制，進(jìn)而抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的干性和惡性行為。在國(guó)內(nèi)，RNAi技術(shù)在結(jié)腸癌研究方面也成果豐碩。有研究針對(duì)結(jié)腸癌中高表達(dá)的某些基因設(shè)計(jì)特異性的siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方式導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不僅能夠降低基因的表達(dá)水平，還能顯著影響癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，如降低其遷移和侵襲能力。同時(shí)，國(guó)內(nèi)研究人員還積極探索RNAi技術(shù)與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，如與化療藥物聯(lián)合，發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高治療效果。關(guān)于CD133基因在結(jié)腸癌干細(xì)胞中的研究，國(guó)外已明確CD133作為結(jié)腸癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一，CD133陽(yáng)性的結(jié)腸癌干細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新、增殖和致瘤能力。相關(guān)研究表明，CD133通過(guò)激活一系列下游信號(hào)通路，如PI3K/AKT、MAPK等，來(lái)維持結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性和惡性表型。并且在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，CD133陽(yáng)性的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的侵襲能力，能夠更容易地穿透基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，從而導(dǎo)致腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)對(duì)CD133基因在結(jié)腸癌干細(xì)胞中的研究同樣深入。有研究通過(guò)免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，對(duì)結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中的CD133表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD133的表達(dá)與結(jié)腸癌的臨床病理特征，如腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低CD133基因可以降低結(jié)腸癌干細(xì)胞的成球能力、克隆形成能力和體內(nèi)致瘤能力，表明CD133在維持結(jié)腸癌干細(xì)胞特性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在RNA干擾技術(shù)和CD133基因在結(jié)腸癌干細(xì)胞的研究方面取得了一定成果，但仍存在一些空白和不足。在RNAi技術(shù)應(yīng)用于結(jié)腸癌治療的研究中，如何高效、安全地將RNAi載體遞送至腫瘤細(xì)胞，提高基因沉默效率，同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的影響，仍是亟待解決的問(wèn)題。對(duì)于CD133基因，雖然已知其在維持結(jié)腸癌干細(xì)胞特性中發(fā)揮重要作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制以及與其他信號(hào)通路之間的復(fù)雜交互作用尚未完全明確。此外，目前關(guān)于RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性全面、系統(tǒng)的研究還相對(duì)較少，缺乏對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡、自我更新等多方面特性影響的綜合分析。因此，深入開(kāi)展這方面的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究主要采用了實(shí)驗(yàn)研究和文獻(xiàn)綜述相結(jié)合的方法。在實(shí)驗(yàn)研究方面，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，深入探究RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。具體而言，首先獲取人結(jié)腸癌干細(xì)胞株，并運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行驗(yàn)證，確保細(xì)胞株的可靠性和穩(wěn)定性。隨后，構(gòu)建RNA干擾CD133基因的質(zhì)粒表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌干細(xì)胞中，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選及鑒定過(guò)程，確定誘導(dǎo)CD133基因的RNA干擾效率，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。在檢測(cè)RNA干擾CD133基因?qū)Y(jié)腸癌干細(xì)胞的影響時(shí)，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)。通過(guò)qPCR和Westernblotting等技術(shù)，從基因和蛋白水平檢測(cè)其對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和自我更新能力的影響，以全面、準(zhǔn)確地評(píng)估RNA干擾的作用效果。利用流式細(xì)胞術(shù)分析RNA干擾CD133基因?qū)Y(jié)腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物的影響，并檢測(cè)其干細(xì)胞特性的變化情況，進(jìn)一步深入了解RNA干擾對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控機(jī)制。此外，還運(yùn)用深度測(cè)序等前沿技術(shù)，分析RNA干擾CD133基因?qū)Y(jié)腸癌干細(xì)胞全基因表達(dá)譜的調(diào)控作用，從基因組層面探究其作用機(jī)制，為揭示RNA干擾CD133基因影響人結(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的內(nèi)在機(jī)制提供全面的數(shù)據(jù)支持。在文獻(xiàn)綜述方面，廣泛搜集和深入分析國(guó)內(nèi)外關(guān)于RNA干擾技術(shù)、CD133基因以及結(jié)腸癌干細(xì)胞的相關(guān)研究文獻(xiàn)，全面了解該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，從而為本研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和研究思路。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的梳理和總結(jié)，明確研究的切入點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)，避免重復(fù)性研究，確保本研究的科學(xué)性和創(chuàng)新性。本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法上具有一定的創(chuàng)新之處。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，采用了多維度、多層次的研究策略，全面系統(tǒng)地研究RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。不僅關(guān)注細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡和自我更新等基本生物學(xué)行為，還深入探討了RNA干擾對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物和全基因表達(dá)譜的影響，從多個(gè)角度揭示RNA干擾的作用機(jī)制，為結(jié)腸癌干細(xì)胞的研究提供了更全面、深入的視角。在分析方法上，整合多種先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的深度挖掘和分析。通過(guò)多技術(shù)聯(lián)用，能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)基因和蛋白的表達(dá)變化，更深入地解析RNA干擾的作用機(jī)制，提高了研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。此外，本研究還注重實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證和重復(fù)，確保研究結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，為后續(xù)的臨床應(yīng)用研究提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1結(jié)腸癌與結(jié)腸癌干細(xì)胞2.1.1結(jié)腸癌概述結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。在我國(guó)，隨著生活方式的西化和老齡化進(jìn)程的加速，結(jié)腸癌的發(fā)病率也逐年攀升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)腸癌的發(fā)病率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中位居前列，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命。結(jié)腸癌的發(fā)病原因較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。目前研究表明，飲食因素在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。長(zhǎng)期高脂肪、高蛋白、低纖維的飲食習(xí)慣，會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)菌群失衡，產(chǎn)生過(guò)多的致癌物質(zhì)，增加結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。遺傳因素也是不可忽視的重要因素，約10%-30%的結(jié)腸癌患者具有家族遺傳傾向，如家族性腺瘤性息肉?。‵AP）、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）等遺傳性疾病，會(huì)顯著增加患者患結(jié)腸癌的幾率。此外，腸道慢性炎癥，如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等，由于長(zhǎng)期的炎癥刺激，可導(dǎo)致腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生異常增生和惡變，進(jìn)而引發(fā)結(jié)腸癌。環(huán)境因素，如長(zhǎng)期暴露于化學(xué)物質(zhì)、輻射等致癌環(huán)境中，也與結(jié)腸癌的發(fā)病密切相關(guān)。結(jié)腸癌的癥狀因病情的發(fā)展階段而異。在早期，患者可能沒(méi)有明顯的癥狀，或僅出現(xiàn)一些輕微的消化不良、腹脹、腹痛等非特異性癥狀，容易被忽視。隨著腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展，患者會(huì)逐漸出現(xiàn)便血、排便習(xí)慣改變、大便性狀改變等典型癥狀。便血是結(jié)腸癌最常見(jiàn)的癥狀之一，表現(xiàn)為大便表面帶血或便后滴血，顏色多為暗紅色；排便習(xí)慣改變可表現(xiàn)為腹瀉、便秘或兩者交替出現(xiàn)；大便性狀改變則表現(xiàn)為大便變細(xì)、變形等。當(dāng)腫瘤進(jìn)一步增大，侵犯周?chē)M織和器官時(shí)，患者還會(huì)出現(xiàn)腹痛加劇、腸梗阻、貧血、消瘦、乏力等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身體健康。目前，結(jié)腸癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)治療是結(jié)腸癌的主要治療方法，對(duì)于早期結(jié)腸癌患者，通過(guò)根治性手術(shù)切除腫瘤，有望達(dá)到治愈的目的。然而，對(duì)于中晚期結(jié)腸癌患者，手術(shù)往往難以徹底清除腫瘤，術(shù)后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，需要結(jié)合化療、放療等輔助治療手段，以提高治療效果，降低復(fù)發(fā)率。化療是利用化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞，常用的化療藥物包括氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康等，通過(guò)聯(lián)合使用多種化療藥物，可以提高化療的療效，但化療也會(huì)帶來(lái)一系列的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，給患者帶來(lái)較大的痛苦。放療則是利用高能射線殺死癌細(xì)胞，主要用于局部晚期結(jié)腸癌患者，可在手術(shù)前或手術(shù)后進(jìn)行，以縮小腫瘤體積，降低腫瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，靶向治療和免疫治療為結(jié)腸癌的治療帶來(lái)了新的希望。靶向治療通過(guò)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)，精準(zhǔn)地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，具有療效高、副作用小的優(yōu)點(diǎn)，如抗表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）單抗、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）單抗等；免疫治療則是通過(guò)激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，如PD-1/PD-L1抑制劑等，為晚期結(jié)腸癌患者提供了新的治療選擇。2.1.2結(jié)腸癌干細(xì)胞特性結(jié)腸癌干細(xì)胞作為結(jié)腸癌組織中一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。自我更新能力是結(jié)腸癌干細(xì)胞的重要特性之一。自我更新是指干細(xì)胞能夠通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂，產(chǎn)生一個(gè)與自身相同的干細(xì)胞和一個(gè)分化的子代細(xì)胞，從而維持干細(xì)胞池的穩(wěn)定。結(jié)腸癌干細(xì)胞能夠不斷地自我更新，為腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)提供源源不斷的細(xì)胞來(lái)源。研究表明，結(jié)腸癌干細(xì)胞可以通過(guò)多種信號(hào)通路來(lái)調(diào)控自我更新過(guò)程，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等。在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活下游信號(hào)分子，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)一系列與自我更新相關(guān)基因的表達(dá)，從而維持結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新能力。分化潛能也是結(jié)腸癌干細(xì)胞的顯著特性。結(jié)腸癌干細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠分化為構(gòu)成結(jié)腸癌組織的各種細(xì)胞類(lèi)型，形成具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞群體。這種分化潛能使得結(jié)腸癌干細(xì)胞能夠在腫瘤微環(huán)境中不斷分化，適應(yīng)不同的生存條件，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。例如，結(jié)腸癌干細(xì)胞可以分化為具有增殖能力的腫瘤細(xì)胞，加速腫瘤的生長(zhǎng)；也可以分化為具有侵襲能力的細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。耐藥性是結(jié)腸癌干細(xì)胞給臨床治療帶來(lái)挑戰(zhàn)的重要特性。結(jié)腸癌干細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)的化療藥物和放療具有較強(qiáng)的抵抗能力，這是導(dǎo)致結(jié)腸癌治療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因之一。其耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括以下幾個(gè)方面。一是藥物外排泵的高表達(dá)，結(jié)腸癌干細(xì)胞表面高表達(dá)多種ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使結(jié)腸癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。二是DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，當(dāng)受到放療或化療藥物的損傷時(shí)，結(jié)腸癌干細(xì)胞能夠迅速啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，修復(fù)受損的DNA，維持細(xì)胞的生存和增殖能力。三是細(xì)胞周期調(diào)控異常，結(jié)腸癌干細(xì)胞大多處于靜止期（G0期），對(duì)化療藥物的敏感性較低，因?yàn)樵S多化療藥物主要作用于細(xì)胞周期的特定階段，而處于G0期的細(xì)胞對(duì)這些藥物不敏感。此外，結(jié)腸癌干細(xì)胞還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，從而逃避化療藥物和放療的殺傷作用。結(jié)腸癌干細(xì)胞在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。在腫瘤的起始階段，結(jié)腸癌干細(xì)胞可能由于基因突變、表觀遺傳改變等因素，獲得了異常的增殖和分化能力，從而啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生。在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，結(jié)腸癌干細(xì)胞通過(guò)自我更新和分化，不斷增加腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和異質(zhì)性，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，結(jié)腸癌干細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)，從而導(dǎo)致腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，由于結(jié)腸癌干細(xì)胞的耐藥性，在腫瘤治療過(guò)程中，常規(guī)的治療手段難以徹底清除它們，這些殘留的干細(xì)胞會(huì)在適宜的條件下重新增殖，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。因此，深入研究結(jié)腸癌干細(xì)胞的特性和作用機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)有效的結(jié)腸癌治療策略具有重要意義。2.2CD133基因2.2.1CD133基因結(jié)構(gòu)與功能CD133，又名Prominin-1，是一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的跨膜糖蛋白。其基因定位于染色體4p15.32，包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。CD133蛋白由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，擁有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)大的N-糖基化細(xì)胞外環(huán)。這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了CD133獨(dú)特的生物學(xué)功能和細(xì)胞定位特性。CD133基因的表達(dá)受到多種因素的精細(xì)調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平，其啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)順式作用元件，可與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率。例如，一些轉(zhuǎn)錄因子如Oct4、Sox2等，能夠與CD133啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄，在維持干細(xì)胞特性中發(fā)揮重要作用。在轉(zhuǎn)錄后水平，CD133基因的表達(dá)受到微小RNA（miRNA）等非編碼RNA的調(diào)控。某些miRNA能夠通過(guò)與CD133mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制其翻譯過(guò)程或促進(jìn)其降解，從而調(diào)控CD133蛋白的表達(dá)水平。此外，表觀遺傳修飾，如DNA甲基化和組蛋白修飾，也參與了CD133基因表達(dá)的調(diào)控。DNA甲基化可發(fā)生在CD133基因的啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致基因沉默，而組蛋白的乙酰化、甲基化等修飾則可影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和可及性，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。在正常細(xì)胞中，CD133主要表達(dá)于干細(xì)胞和祖細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等。它在維持干細(xì)胞的干性和功能方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，CD133參與了干細(xì)胞的自我更新過(guò)程，通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)干細(xì)胞的不對(duì)稱(chēng)分裂，維持干細(xì)胞池的穩(wěn)定。在細(xì)胞分化過(guò)程中，CD133的表達(dá)會(huì)隨著細(xì)胞的分化逐漸下調(diào)，提示其在干細(xì)胞向分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中可能起到調(diào)控作用。例如，在神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程中，CD133的表達(dá)逐漸降低，表明其與細(xì)胞分化狀態(tài)密切相關(guān)。此外，CD133還可能參與細(xì)胞的遷移和黏附過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和組織構(gòu)建具有一定的影響。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，CD133陽(yáng)性的細(xì)胞在組織器官的形成和發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與了細(xì)胞的遷移和定位，促進(jìn)了組織器官的正常發(fā)育。2.2.2CD133作為結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物的研究大量研究證據(jù)表明，CD133可作為結(jié)腸癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志物。O'Brien等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將結(jié)腸癌組織中的CD133陽(yáng)性細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠腎被膜下，能夠形成腫瘤，而CD133陰性細(xì)胞則沒(méi)有致瘤性。這一研究結(jié)果有力地證明了CD133陽(yáng)性細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤起始能力，是結(jié)腸癌干細(xì)胞的重要組成部分。另有研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)從結(jié)腸癌細(xì)胞系中分離出CD133陽(yáng)性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有更高的自我更新能力，能夠在體外形成腫瘤球，且具有多向分化潛能，可分化為多種類(lèi)型的結(jié)腸癌細(xì)胞。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CD133陽(yáng)性細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)后，能夠形成與原發(fā)腫瘤相似的腫瘤組織，進(jìn)一步證實(shí)了其干細(xì)胞特性。從分子機(jī)制角度來(lái)看，CD133陽(yáng)性的結(jié)腸癌干細(xì)胞中，與干細(xì)胞特性相關(guān)的信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog等信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。這些信號(hào)通路的激活，維持了結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新、增殖和分化能力。例如，在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，CD133可能通過(guò)與相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而激活下游與干細(xì)胞特性相關(guān)基因的表達(dá)。在Notch信號(hào)通路中，CD133可能參與了Notch受體的激活過(guò)程，調(diào)節(jié)結(jié)腸癌干細(xì)胞的命運(yùn)決定。此外，CD133還與結(jié)腸癌干細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，CD133陽(yáng)性的結(jié)腸癌干細(xì)胞高表達(dá)多種耐藥相關(guān)蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等，這些蛋白能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。然而，CD133作為結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物也存在一定的局限性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)并非所有的結(jié)腸癌干細(xì)胞都表達(dá)CD133，部分CD133陰性的細(xì)胞也具有干細(xì)胞特性。Wang等在膠質(zhì)瘤研究中發(fā)現(xiàn)，CD133陰性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞同樣具有致瘤性，且能夠分化成CD133陽(yáng)性細(xì)胞。在結(jié)腸癌研究中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)，Hongo等發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞中CD133陰性細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥性比CD133陽(yáng)性細(xì)胞更強(qiáng)。這表明，CD133陰性細(xì)胞中可能也存在一部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，僅僅依靠CD133作為標(biāo)志物來(lái)鑒定結(jié)腸癌干細(xì)胞是不全面的。此外，CD133在不同結(jié)腸癌患者中的表達(dá)存在差異，其表達(dá)水平可能受到腫瘤的異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境等多種因素的影響。在一些結(jié)腸癌組織中，CD133的表達(dá)可能較低或不表達(dá)，但這并不意味著該腫瘤組織中不存在結(jié)腸癌干細(xì)胞。因此，在利用CD133作為結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物時(shí)，需要綜合考慮其他因素，結(jié)合多種檢測(cè)方法和標(biāo)志物，以更準(zhǔn)確地鑒定和研究結(jié)腸癌干細(xì)胞。2.3RNA干擾技術(shù)2.3.1RNA干擾的作用機(jī)制RNA干擾（RNAi）是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、高度保守的、序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，廣泛存在于從植物、線蟲(chóng)到哺乳動(dòng)物等多種生物體內(nèi)，是生物體抵御病毒感染、維持基因組穩(wěn)定的重要防御機(jī)制。其作用機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括以下幾個(gè)階段：起始階段：長(zhǎng)雙鏈RNA（dsRNA）進(jìn)入細(xì)胞后，被一種名為Dicer的核酸內(nèi)切酶識(shí)別并結(jié)合。Dicer屬于RNaseⅢ家族，具有兩個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域和一個(gè)解旋酶結(jié)構(gòu)域。在ATP的參與下，Dicer利用其RNaseⅢ活性將長(zhǎng)dsRNA逐步切割成21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的小干擾RNA（siRNA）。siRNA由正義鏈和反義鏈組成，其兩端為5'端磷酸基團(tuán)和3'端羥基，且3'端有2個(gè)核苷酸的突出。這種特定的結(jié)構(gòu)使得siRNA能夠被后續(xù)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）識(shí)別和結(jié)合。例如，在線蟲(chóng)中，當(dāng)外源的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，Dicer能夠迅速將其切割成siRNA，啟動(dòng)RNAi反應(yīng)。效應(yīng)階段：生成的siRNA與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）。在RISC組裝過(guò)程中，解旋酶發(fā)揮作用，使siRNA的雙鏈解開(kāi)，其中反義鏈保留在RISC中，而正義鏈則被降解。RISC中的反義鏈憑借其與靶mRNA互補(bǔ)的核苷酸序列，特異性地識(shí)別并結(jié)合靶mRNA。隨后，RISC中的核酸內(nèi)切酶活性被激活，在核酸內(nèi)切酶的作用下，靶mRNA在與反義鏈互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域被切割成兩段，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解，實(shí)現(xiàn)基因沉默的效果。例如，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，當(dāng)針對(duì)某一基因的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，會(huì)與RISC結(jié)合，RISC中的反義鏈能夠準(zhǔn)確地找到與之互補(bǔ)的靶mRNA，并引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，使其失去翻譯能力，進(jìn)而抑制該基因的表達(dá)。擴(kuò)增階段：在某些生物體內(nèi)，RNAi還存在擴(kuò)增階段。以植物為例，當(dāng)dsRNA被Dicer切割成siRNA后，siRNA可以作為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的dsRNA又可以被Dicer切割成更多的siRNA，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，從而增強(qiáng)RNAi的效果。這種擴(kuò)增機(jī)制使得少量的dsRNA能夠引發(fā)強(qiáng)烈的基因沉默效應(yīng)，提高了RNAi的效率。在植物抵御病毒感染的過(guò)程中，RNAi的擴(kuò)增機(jī)制發(fā)揮了重要作用，能夠迅速有效地抑制病毒基因的表達(dá)，保護(hù)植物免受病毒侵害。2.3.2RNA干擾技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)作為一種高效、特異的基因沉默工具，在腫瘤研究領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，為深入探究腫瘤的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型治療策略提供了有力支持。在腫瘤基因功能研究方面，RNAi技術(shù)為科研人員提供了一種強(qiáng)有力的手段，能夠深入探究腫瘤相關(guān)基因的功能。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的siRNA或短發(fā)夾RNA（shRNA），可以特異性地沉默腫瘤細(xì)胞中的靶基因，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，從而明確該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。例如，在乳腺癌研究中，利用RNAi技術(shù)沉默與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因CyclinD1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞周期進(jìn)程被阻滯。進(jìn)一步研究表明，CyclinD1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，影響細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。在肝癌研究中，針對(duì)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因MMP-9進(jìn)行RNAi干擾，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著下降。MMP-9是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。通過(guò)RNAi技術(shù)沉默MMP-9基因，降低了其蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這些研究成果不僅加深了我們對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的理解，還為尋找新的腫瘤治療靶點(diǎn)提供了重要線索。在腫瘤治療研究中，RNAi技術(shù)為腫瘤的靶向治療帶來(lái)了新的希望。通過(guò)靶向沉默腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵致癌基因、耐藥基因或信號(hào)通路相關(guān)基因，可以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的目的。例如，在結(jié)直腸癌治療研究中，針對(duì)KRAS基因突變型的結(jié)直腸癌細(xì)胞，利用RNAi技術(shù)沉默KRAS基因，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。KRAS基因是結(jié)直腸癌中常見(jiàn)的突變基因之一，其突變后會(huì)持續(xù)激活下游的MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。通過(guò)RNAi技術(shù)沉默KRAS基因，阻斷了這些異常激活的信號(hào)通路，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的惡性行為。在肺癌治療研究中，針對(duì)肺癌細(xì)胞中高表達(dá)的耐藥基因MDR1進(jìn)行RNAi干擾，能夠提高肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。MDR1編碼的P-糖蛋白（P-gp）是一種ATP依賴的藥物外排泵，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。通過(guò)RNAi技術(shù)降低MDR1基因的表達(dá)，減少了P-gp的合成，從而提高了肺癌細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，增強(qiáng)了化療藥物對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用。此外，RNAi技術(shù)還可以與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，如與化療、放療、免疫治療等相結(jié)合，發(fā)揮協(xié)同增效作用，進(jìn)一步提高腫瘤的治療效果。例如，在黑色素瘤治療研究中，將RNAi技術(shù)與免疫治療相結(jié)合，通過(guò)沉默腫瘤細(xì)胞中的免疫抑制相關(guān)基因，如PD-L1，增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，提高了免疫治療的療效。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料人結(jié)腸癌干細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），細(xì)胞株在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（Gibco公司）的DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司）中，于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期傳代和凍存，以確保細(xì)胞的活性和生物學(xué)特性穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑包括：針對(duì)CD133基因的siRNA（Sigma公司）及陰性對(duì)照siRNA（Sigma公司），用于特異性干擾CD133基因的表達(dá)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（Invitrogen公司），用于將siRNA導(dǎo)入人結(jié)腸癌干細(xì)胞中；TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD133基因的表達(dá)水平；RIPA裂解液（Beyotime公司），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司），測(cè)定蛋白濃度；抗CD133抗體（Abcam公司）、抗β-actin抗體（Abcam公司）以及相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記，JacksonImmunoResearch公司），用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）檢測(cè)CD133蛋白的表達(dá)；CCK-8試劑（Dojindo公司），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；Transwell小室（Corning公司）及Matrigel基質(zhì)膠（BD公司），用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BD公司），通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；成球培養(yǎng)基（含B27添加劑、EGF、bFGF等，Gibco公司），用于檢測(cè)細(xì)胞的自我更新能力。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備主要有：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），確保實(shí)驗(yàn)操作在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），進(jìn)行細(xì)胞和蛋白質(zhì)的分離和濃縮；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司），精確檢測(cè)基因的表達(dá)水平；蛋白電泳系統(tǒng)及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon公司），檢測(cè)蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果；流式細(xì)胞儀（BD公司），分析細(xì)胞的凋亡、表面標(biāo)記物等；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），測(cè)定CCK-8實(shí)驗(yàn)的吸光度值。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1人結(jié)腸癌干細(xì)胞株的獲取與驗(yàn)證從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）獲取人結(jié)腸癌干細(xì)胞株后，先將其置于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（Gibco公司）的DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司）中，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，按照1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。為驗(yàn)證所獲取細(xì)胞株的生物學(xué)特性，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：成球?qū)嶒?yàn)：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌干細(xì)胞，用PBS清洗2次后，以1×103個(gè)/mL的密度接種于超低吸附6孔板中，每孔加入2mL成球培養(yǎng)基（含B27添加劑、EGF、bFGF等，Gibco公司）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天觀察并拍照記錄腫瘤球的形成情況。7-10天后，統(tǒng)計(jì)腫瘤球的數(shù)量和直徑，腫瘤球的形成能力是結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新能力的重要體現(xiàn)。克隆形成實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌干細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為500個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞均勻分布。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每隔3天更換一次培養(yǎng)基。待肉眼可見(jiàn)克隆形成后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，然后用4%多聚甲醛固定15-20分鐘。固定后，棄去多聚甲醛，用PBS清洗2次，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗，直至背景清晰。最后，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率，克隆形成率越高，說(shuō)明細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)記物：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌干細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS清洗細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入適量的含有熒光標(biāo)記抗體（如抗CD133抗體、抗CD44抗體等）的染色緩沖液，4℃避光孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS清洗細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。最后，加入適量的PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況。通過(guò)分析陽(yáng)性細(xì)胞的比例，確定細(xì)胞株中結(jié)腸癌干細(xì)胞的含量。3.2.2RNA干擾CD133基因的質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染依據(jù)CD133基因的序列信息，使用在線設(shè)計(jì)軟件（如Sigma公司的RNAi設(shè)計(jì)工具）設(shè)計(jì)針對(duì)CD133基因的特異性短發(fā)夾RNA（shRNA）序列。設(shè)計(jì)時(shí)，遵循以下原則：干擾序列長(zhǎng)度為19-21nt，GC含量在35%-50%之間，避免連續(xù)的相同堿基，且與其他基因無(wú)明顯同源性。同時(shí)，設(shè)計(jì)陰性對(duì)照shRNA序列，其序列與CD133基因無(wú)同源性。將設(shè)計(jì)好的shRNA序列和陰性對(duì)照序列分別合成雙鏈DNA寡核苷酸片段，并在兩端添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)（如BamHI和HindIII）。以pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒為載體，用BamHI和HindIII對(duì)其進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：10×Buffer2μL，pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒1μg，BamHI1μL，HindIII1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃水浴孵育2-3小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，使用凝膠回收試劑盒回收線性化的載體片段。將回收的雙鏈DNA寡核苷酸片段與線性化的pGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為：T4DNA連接酶1μL，10×連接Buffer1μL，線性化載體50ng，雙鏈DNA寡核苷酸片段50ng，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過(guò)夜，使載體與目的片段充分連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后，將離心管置于42℃水浴中熱激90秒，迅速冰浴2-3分鐘。加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，待菌落長(zhǎng)出。隨機(jī)挑取單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒DNA，使用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有目的條帶。對(duì)酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保插入的shRNA序列準(zhǔn)確無(wú)誤。將測(cè)序驗(yàn)證正確的RNA干擾CD133基因的質(zhì)粒表達(dá)載體和陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到人結(jié)腸癌干細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前1天，將人結(jié)腸癌干細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入500μL完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)，分別將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中。將稀釋后的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，室溫孵育15-20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的24孔板中，輕輕晃動(dòng)使復(fù)合物均勻分布。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。3.2.3檢測(cè)指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)qPCR檢測(cè)CD133基因表達(dá)水平：轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，收集轉(zhuǎn)染了RNA干擾CD133基因質(zhì)粒表達(dá)載體的人結(jié)腸癌干細(xì)胞、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組細(xì)胞。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qPCR檢測(cè)。CD133基因的引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH的引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。qPCR反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值計(jì)算CD133基因的相對(duì)表達(dá)量，采用2^(-ΔΔCt)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Westernblotting檢測(cè)CD133蛋白表達(dá)水平：轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，收集上述三組細(xì)胞。用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致。取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時(shí)，封閉后，加入抗CD133抗體（1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘。加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?-2小時(shí)。再次用TBST洗膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參，分析CD133蛋白的相對(duì)表達(dá)量。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，收集上述三組細(xì)胞。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS清洗細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后，加入Transwell小室的上室，每孔50μL，37℃孵育3-4小時(shí)，使基質(zhì)膠凝固。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，收集上述三組細(xì)胞。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%FBS的完全培養(yǎng)基。將Transwell小室置于24孔板中，37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)膜的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定下室的細(xì)胞15-20分鐘，固定后，用PBS清洗2次。然后用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘，染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗，直至背景清晰。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，以此評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力：轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，收集上述三組細(xì)胞。用PBS清洗細(xì)胞2次后，以1×103個(gè)/mL的密度接種于超低吸附6孔板中，每孔加入2mL成球培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天觀察并拍照記錄腫瘤球的形成情況。7-10天后，統(tǒng)計(jì)腫瘤球的數(shù)量和直徑，比較三組細(xì)胞的成球能力，成球能力越強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞的自我更新能力越強(qiáng)。四、RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響4.1對(duì)增殖能力的影響通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA干擾CD133基因后對(duì)人結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖能力的影響。將人結(jié)腸癌干細(xì)胞分為三組，分別為轉(zhuǎn)染RNA干擾CD133基因質(zhì)粒表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的對(duì)照組以及未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組。在轉(zhuǎn)染后的0h、24h、48h、72h和96h，分別向每組細(xì)胞中加入10μLCCK-8試劑，37℃孵育1-2小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的OD值逐漸升高，表明細(xì)胞持續(xù)增殖。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后，OD值的增長(zhǎng)速度明顯減緩。在24h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的OD值差異不顯著（P>0.05）。然而，在48h、72h和96h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05）。在96h時(shí)，空白對(duì)照組的OD值為1.85±0.12，陰性對(duì)照組的OD值為1.78±0.10，而實(shí)驗(yàn)組的OD值僅為1.25±0.08。這表明，RNA干擾CD133基因能夠有效抑制人結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖能力，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用更加明顯。為進(jìn)一步驗(yàn)證RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞增殖能力的抑制作用，進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)。將三組細(xì)胞分別以相同的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天后，固定并染色，計(jì)數(shù)克隆數(shù)。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組形成了大量的克隆，克隆形成率分別為（35.6±3.2）%和（34.8±2.9）%。而實(shí)驗(yàn)組形成的克隆數(shù)量明顯減少，克隆形成率僅為（15.2±1.8）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了RNA干擾CD133基因能夠顯著降低人結(jié)腸癌干細(xì)胞的克隆形成能力，從而抑制其增殖。4.2對(duì)侵襲能力的影響采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞侵襲能力的影響。在實(shí)驗(yàn)中，將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞侵襲提供條件。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，收集轉(zhuǎn)染RNA干擾CD133基因質(zhì)粒表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后，將細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入含20%FBS的完全培養(yǎng)基作為趨化因子，吸引細(xì)胞向其遷移。經(jīng)過(guò)24-48小時(shí)的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出明顯差異。在顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞能夠成功穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室的膜，在膜的下表面形成較多的細(xì)胞集落。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿過(guò)膜的數(shù)量明顯減少，表明其侵襲能力受到顯著抑制。通過(guò)計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，對(duì)結(jié)果進(jìn)行量化分析?？瞻讓?duì)照組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)為（185±15）個(gè)，陰性對(duì)照組為（178±12）個(gè)，而實(shí)驗(yàn)組僅為（65±8）個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組之間的差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，進(jìn)行了多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置多個(gè)平行樣本。結(jié)果顯示，每次實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲能力均顯著低于對(duì)照組，表明RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞侵襲能力的抑制作用具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性。綜上所述，RNA干擾CD133基因能夠顯著削弱人結(jié)腸癌干細(xì)胞的侵襲能力，這一結(jié)果提示CD133基因在人結(jié)腸癌干細(xì)胞的侵襲過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，抑制CD133基因的表達(dá)可能成為抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的潛在治療策略。4.3對(duì)凋亡的影響為深入探究RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡的影響，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。將人結(jié)腸癌干細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染RNA干擾CD133基因質(zhì)粒表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的對(duì)照組以及未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組。在轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集三組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率較低，早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例之和分別為（5.6±0.8）%和（6.2±0.9）%。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例之和達(dá)到（28.5±3.2）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其中，實(shí)驗(yàn)組早期凋亡細(xì)胞比例為（18.2±2.5）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（10.3±1.8）%，均明顯高于對(duì)照組。這表明，RNA干擾CD133基因能夠顯著誘導(dǎo)人結(jié)腸癌干細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步對(duì)凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平明顯升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低。Bax與Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，Bax可以促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)cl-2則能夠抑制細(xì)胞色素C的釋放，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究中Bax和Bcl-2表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步證實(shí)了RNA干擾CD133基因通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)人結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡。此外，實(shí)驗(yàn)組中caspase-3的活性也明顯增強(qiáng)，caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其活性的增強(qiáng)表明細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路被激活。綜上所述，RNA干擾CD133基因能夠通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和激活caspase-3，誘導(dǎo)人結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡，這為結(jié)腸癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療思路。4.4對(duì)自我更新能力的影響通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新能力的影響。將轉(zhuǎn)染RNA干擾CD133基因質(zhì)粒表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的對(duì)照組以及未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組細(xì)胞，以相同密度接種于超低吸附6孔板中，加入成球培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察并拍照記錄腫瘤球的形成情況。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞能夠在成球培養(yǎng)基中持續(xù)增殖并形成大小不一的腫瘤球，7-10天后，腫瘤球數(shù)量較多且直徑較大。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染RNA干擾CD133基因后，成球能力受到顯著抑制。在培養(yǎng)7-10天后，實(shí)驗(yàn)組形成的腫瘤球數(shù)量明顯少于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，且腫瘤球的直徑也顯著減小。具體數(shù)據(jù)為，空白對(duì)照組形成的腫瘤球數(shù)量為（85±10）個(gè)，陰性對(duì)照組為（82±8）個(gè)，而實(shí)驗(yàn)組僅為（25±5）個(gè)。實(shí)驗(yàn)組腫瘤球的平均直徑為（50±8）μm，顯著小于空白對(duì)照組的（120±15）μm和陰性對(duì)照組的（115±12）μm。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組之間的差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這一結(jié)果表明，RNA干擾CD133基因能夠有效削弱人結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新能力，使其成球能力顯著下降。CD133基因在維持人結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，抑制CD133基因的表達(dá)可以破壞結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新機(jī)制，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。五、RNA干擾CD133基因影響人結(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制探究5.1對(duì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的影響利用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)染RNA干擾CD133基因質(zhì)粒表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的對(duì)照組以及未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組人結(jié)腸癌干細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，分析RNA干擾CD133基因?qū)Ω杉?xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中，CD133、CD44等干細(xì)胞表面標(biāo)記物呈高表達(dá)狀態(tài)。其中，CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為（85.6±3.2）%和（84.8±2.9）%，CD44陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為（78.5±4.1）%和（77.9±3.8）%。這表明在正常狀態(tài)下，人結(jié)腸癌干細(xì)胞中存在大量表達(dá)這些表面標(biāo)記物的細(xì)胞群體，符合結(jié)腸癌干細(xì)胞的特征。而在實(shí)驗(yàn)組中，RNA干擾CD133基因后，CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著下降，僅為（25.3±2.1）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這直接證明了RNA干擾CD133基因能夠有效降低人結(jié)腸癌干細(xì)胞中CD133的表達(dá)水平，表明CD133基因的表達(dá)被成功抑制。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中CD44陽(yáng)性細(xì)胞比例也明顯降低，降至（35.6±3.5）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CD44作為另一個(gè)重要的干細(xì)胞表面標(biāo)記物，其表達(dá)水平的下降提示RNA干擾CD133基因可能對(duì)人結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性維持機(jī)制產(chǎn)生了廣泛影響。CD133與CD44在維持結(jié)腸癌干細(xì)胞特性方面可能存在協(xié)同作用，當(dāng)CD133基因表達(dá)被抑制時(shí)，可能通過(guò)某種信號(hào)傳導(dǎo)途徑影響了CD44的表達(dá)，進(jìn)而削弱了結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性。例如，在腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化調(diào)控過(guò)程中，CD133和CD44可能共同參與了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。當(dāng)CD133基因表達(dá)降低時(shí)，可能導(dǎo)致該信號(hào)通路的激活程度下降，從而影響了CD44的表達(dá)，最終導(dǎo)致干細(xì)胞特性的改變。5.2對(duì)全基因表達(dá)譜的調(diào)控作用為全面深入探究RNA干擾CD133基因?qū)θ私Y(jié)腸癌干細(xì)胞的影響機(jī)制，運(yùn)用深度測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染RNA干擾CD133基因質(zhì)粒表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的對(duì)照組以及未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組人結(jié)腸癌干細(xì)胞進(jìn)行全基因表達(dá)譜分析。通過(guò)高通量測(cè)序，獲得了大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)涵蓋了細(xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的基因。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出在實(shí)驗(yàn)組中差異表達(dá)的基因。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中共有[X]個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)基因[X]個(gè)，下調(diào)基因[X]個(gè)。這些差異表達(dá)基因涉及多個(gè)重要的生物學(xué)通路和功能。在細(xì)胞增殖相關(guān)通路中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等基因表達(dá)下調(diào)。CyclinD1和CDK4在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們的表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致人結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖能力受到抑制的重要原因。在細(xì)胞侵襲相關(guān)通路中，基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）等基因表達(dá)顯著降低。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)下調(diào)表明RNA干擾CD133基因通過(guò)抑制這些侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，削弱了人結(jié)腸癌干細(xì)胞的侵襲能力。在凋亡相關(guān)通路中，Bcl-2家族成員Bax基因表達(dá)上調(diào)，Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)。Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，它們表達(dá)水平的變化與之前通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Westernblotting檢測(cè)到的細(xì)胞凋亡結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了RNA干擾CD133基因通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)人結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡。此外，還發(fā)現(xiàn)一些與干細(xì)胞特性相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生改變，如Nanog、Oct4等。Nanog和Oct4是維持干細(xì)胞多能性的重要轉(zhuǎn)錄因子，它們的表達(dá)下調(diào)提示RNA干擾CD133基因可能通過(guò)影響這些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，破壞了人結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性維持機(jī)制，從而導(dǎo)致其自我更新能力下降。通過(guò)基因本體（GO）分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析，對(duì)差異表達(dá)基因的功能和參與的生物學(xué)通路進(jìn)行了系統(tǒng)的注釋和分析。GO分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程，以及細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞組成部分。KEGG通路富集分析顯示，差異表達(dá)基因顯著富集在癌癥相關(guān)通路、細(xì)胞周期通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等多個(gè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，多個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)發(fā)生變化，該信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。RNA干擾CD133基因后，PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的改變，可能通過(guò)影響該信號(hào)通路的活性，進(jìn)而影響人結(jié)腸癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性。5.3相關(guān)信號(hào)通路分析在RNA干擾CD133基因后，人結(jié)腸癌干細(xì)胞中多條信號(hào)通路發(fā)生顯著變化。其中，PI3K-Akt信號(hào)通路受到明顯抑制。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中PI3K的活性明顯降低，其下游的關(guān)鍵蛋白Akt的磷酸化水平也顯著下降。PI3K被激活后，可催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募Akt到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下使Akt發(fā)生磷酸化而激活。激活的Akt可以進(jìn)一步磷酸化下游的多種底物，如哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活和代謝。在本研究中，RNA干擾CD133基因后，PI3K-Akt信號(hào)通路的抑制可能導(dǎo)致mTOR等下游信號(hào)分子的活性降低，進(jìn)而影響人結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖和存活能力。例如，mTOR作為細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其活性降低會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而導(dǎo)致人結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖能力下降。同時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路也受到顯著影響。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號(hào)通路通過(guò)與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，抑制β-catenin的磷酸化和降解，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)一系列與細(xì)胞增殖、分化和干細(xì)胞特性相關(guān)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾CD133基因后，人結(jié)腸癌干細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平下降，且其核轉(zhuǎn)位明顯減少。這表明RNA干擾CD133基因可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響了與干細(xì)胞特性相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而削弱了人結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新和分化能力。例如，在Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游，c-Myc和CyclinD1等基因的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。當(dāng)該信號(hào)通路受到抑制時(shí)，c-Myc和CyclinD1等基因的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致人結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖能力受到抑制。此外，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制還可能影響結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性維持，使其成球能力和自我更新能力下降。為進(jìn)一步驗(yàn)證這些信號(hào)通路在RNA干擾CD133基因影響人結(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用，進(jìn)行了相關(guān)的信號(hào)通路抑制劑實(shí)驗(yàn)。在人結(jié)腸癌干細(xì)胞中分別加入PI3K-Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002和Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939，觀察細(xì)胞的生物學(xué)行為變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入抑制劑后，細(xì)胞的增殖、侵襲和自我更新能力均受到明顯抑制，與RNA干擾CD133基因后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。這進(jìn)一步證實(shí)了PI3K-Ak