O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼：表達(dá)機(jī)制、免疫原性及應(yīng)用前景的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義口蹄疫（Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-MouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動物疫病，在我國被規(guī)定為一類動物疫病。FMDV宿主范圍廣泛，主要感染牛、豬、羊等偶蹄動物，患病動物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位會出現(xiàn)水皰，破潰后形成爛斑，嚴(yán)重影響動物的生長、繁殖和生產(chǎn)性能，導(dǎo)致幼畜死亡，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，口蹄疫還會嚴(yán)重影響家畜及畜產(chǎn)品的流通和貿(mào)易活動，對國家和地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成負(fù)面影響。FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，其基因組為正向、單鏈RNA。根據(jù)病毒的抗原性差異，F(xiàn)MDV可分為A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1型7個血清型，各血清型之間無交叉保護(hù)反應(yīng)。在我國，主要流行的血清型為O型、A型和亞洲1型（2021年7月1日后已停止生產(chǎn)銷售亞洲1型疫苗）。其中，O型口蹄疫病毒流行范圍廣、危害大，是我國口蹄疫防控的重點(diǎn)對象。O型口蹄疫病毒根據(jù)VP1基因和流行地區(qū)可分為多個拓?fù)湫停缰袊停–ATHAY）、中東-南亞型（ME-SA）、東南亞型（SEA）等。緬甸98株（Mya-98）屬于東南亞型，自2010年初期開始在我國大規(guī)模引起豬發(fā)病，現(xiàn)已成為豬口蹄疫的主要流行毒株。Mya-98譜系病毒具有傳染性強(qiáng)、宿主廣泛、傳播速度快等特點(diǎn)，給我國的口蹄疫防控工作帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。對O型口蹄疫病毒緬甸98株的研究具有重要的理論和實(shí)際意義。在理論方面，深入研究該毒株的分子生物學(xué)特性、遺傳進(jìn)化規(guī)律等，有助于揭示口蹄疫病毒的致病機(jī)制和進(jìn)化機(jī)制，豐富對病毒的認(rèn)識。在實(shí)際應(yīng)用方面，通過對緬甸98株空衣殼的表達(dá)及免疫原性分析，可為研發(fā)高效、安全的口蹄疫疫苗提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。目前，疫苗免疫是控制和預(yù)防口蹄疫的主要手段，但現(xiàn)有疫苗在使用中存在一些問題，如對變異毒株的保護(hù)力不足等。因此，研究緬甸98株空衣殼的免疫原性，篩選出具有良好免疫原性的抗原，對于開發(fā)新型疫苗、提高疫苗的免疫效果具有重要意義。同時，本研究也可為口蹄疫的診斷、監(jiān)測和防控提供新的方法和思路，有助于有效控制口蹄疫的傳播和流行，保障我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展。1.2O型口蹄疫病毒概述O型口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，是引發(fā)口蹄疫的主要病原體之一。其病毒粒子呈大致的圓形或六角形，直徑約為20-25nm，無囊膜結(jié)構(gòu)。病毒基因組為正向、單鏈RNA，全長約8.5kb，依次由5’非編碼區(qū)（5’UTR）、開放閱讀框（ORF）和3’非編碼區(qū)（3’UTR）組成。其中，5’UTR長約1300bp，含有VPg二級結(jié)構(gòu)、poly（C）區(qū)段和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等，對啟動多聚蛋白的翻譯和病毒的復(fù)制起著關(guān)鍵作用；ORF約6.5kb，編碼一個多聚蛋白，該多聚蛋白可裂解成4個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP4），這些結(jié)構(gòu)蛋白共同形成病毒衣殼，以及10個非結(jié)構(gòu)蛋白；3’UTR長約90nt，含有與負(fù)鏈RNA合成有關(guān)的順式作用元件。依據(jù)病毒的抗原性差異，口蹄疫病毒可分為A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1型7個血清型，各血清型之間無交叉保護(hù)反應(yīng)。O型口蹄疫病毒在全球范圍內(nèi)廣泛流行，是最為常見且危害較大的血清型之一。在我國，O型口蹄疫病毒長期存在且流行態(tài)勢復(fù)雜。根據(jù)VP1基因和流行地區(qū)，O型口蹄疫病毒又可分為多個拓?fù)湫停缰袊停–ATHAY）、中東-南亞型（ME-SA）、東南亞型（SEA）等。2010年初期，東南亞型中的緬甸98株（Mya-98）在我國開始大規(guī)模引起豬發(fā)病，此后逐漸成為豬口蹄疫的主要流行毒株。在此之前，我國O型口蹄疫病毒的流行毒株類型多樣，不同拓?fù)湫偷牟《驹诓煌瑫r期和地區(qū)呈現(xiàn)出不同的流行特點(diǎn)。例如，中國型（CATHAY）中的舊豬毒主要在1970-1993年間流行，基本都是豬發(fā)病，代表毒株有OZK93、OR80等；新豬毒-1主要在1992-2005年間流行，田間除豬發(fā)病外，也有牛發(fā)病的病例，代表毒株如TAW97、ON92等。而緬甸98株（Mya-98）的出現(xiàn)，改變了我國豬口蹄疫的流行格局。該毒株具有傳染性強(qiáng)、宿主廣泛、傳播速度快等特點(diǎn)，能夠感染牛、豬、羊等多種偶蹄動物。自其在我國流行以來，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引發(fā)了多起疫情。如2010年，我國多個省份均發(fā)生了豬O型口蹄疫疫情，包括廣東省廣州市白云區(qū)、深圳市龍崗區(qū)，甘肅省蘭州市榆中縣、天水市，江西省贛州市等地，感染豬只數(shù)量眾多，均進(jìn)行了撲殺處理。此后，每年仍有不同程度的疫情發(fā)生，持續(xù)威脅著我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展。1.3緬甸98株研究現(xiàn)狀自2010年緬甸98株（Mya-98）在我國大規(guī)模引起豬發(fā)病并成為豬口蹄疫主要流行毒株以來，眾多學(xué)者圍繞該毒株開展了多方面的研究。在病毒分子生物學(xué)特性方面，對其基因組序列進(jìn)行了深入分析。研究發(fā)現(xiàn)，Mya-98毒株的VP1基因具有獨(dú)特的序列特征，與其他拓?fù)湫投局甏嬖诿黠@差異。通過對不同地區(qū)分離的Mya-98毒株的VP1基因序列比對，揭示了其在傳播過程中的遺傳變異規(guī)律，如在某些關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生的氨基酸突變，可能與病毒的毒力、抗原性改變相關(guān)。在流行病學(xué)研究中，對Mya-98毒株的傳播途徑、宿主范圍和流行趨勢進(jìn)行了廣泛調(diào)查。結(jié)果表明，該毒株不僅能通過直接接觸感染牛、豬、羊等偶蹄動物，還可通過空氣、飼料、飲水等間接途徑傳播。其在我國的流行呈現(xiàn)出一定的地域特征，在南方地區(qū)的流行較為頻繁，且傳播速度較快。同時，研究還發(fā)現(xiàn)Mya-98毒株對不同年齡段和品種的豬易感性存在差異，仔豬和育肥豬的感染率相對較高。在疫苗研發(fā)方面，針對Mya-98毒株篩選了多種疫苗候選毒株，并進(jìn)行了免疫效果評價。例如，O/XJ/10-11株等被認(rèn)為是具有良好免疫原性的候選毒株。通過動物實(shí)驗(yàn)，比較了不同疫苗對Mya-98毒株的免疫保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)部分疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體，對同源毒株和部分異源毒株的攻擊具有一定的保護(hù)作用。但現(xiàn)有疫苗在使用中仍存在一些問題，如對變異毒株的保護(hù)力不足，部分疫苗免疫后抗體產(chǎn)生慢、持續(xù)期短等。在空衣殼表達(dá)及免疫原性分析方面，已有研究嘗試?yán)貌煌谋磉_(dá)系統(tǒng)來表達(dá)Mya-98毒株的空衣殼。例如，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了Mya-98毒株的衣殼蛋白，但存在蛋白表達(dá)量低、包涵體形成等問題。在免疫原性分析上，雖然初步驗(yàn)證了表達(dá)的衣殼蛋白具有一定的抗原性，能刺激動物產(chǎn)生抗體，但對于空衣殼的免疫原性與完整病毒的差異，以及如何進(jìn)一步提高空衣殼的免疫原性等方面的研究還相對較少。不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的空衣殼在免疫原性上的差異機(jī)制尚未完全明確，缺乏系統(tǒng)性的研究來全面評估空衣殼的免疫原性及其影響因素。因此，深入開展O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼表達(dá)及免疫原性分析具有重要的研究價值和實(shí)際意義，有望為研發(fā)更高效的口蹄疫疫苗提供新的思路和方法。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料毒株：O型口蹄疫病毒緬甸98株（Mya-98）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫國家參考實(shí)驗(yàn)室保存并提供。該毒株是本研究的核心材料，用于后續(xù)的基因提取、空衣殼表達(dá)等實(shí)驗(yàn)，其準(zhǔn)確的來源和保存狀態(tài)對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。細(xì)胞：BHK-21細(xì)胞（幼倉鼠腎細(xì)胞）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。BHK-21細(xì)胞具有生長迅速、易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，在口蹄疫病毒研究中廣泛應(yīng)用，是病毒培養(yǎng)和蛋白表達(dá)的常用細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)中，BHK-21細(xì)胞用于病毒的擴(kuò)增以及空衣殼表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后的表達(dá)宿主，為病毒的增殖和蛋白表達(dá)提供適宜的環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動物：6-8周齡的SPF（無特定病原體）雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。小鼠在實(shí)驗(yàn)動物房中按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)，自由采食和飲水，環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%。SPF級別的BALB/c小鼠免疫狀態(tài)穩(wěn)定，個體差異較小，可用于后續(xù)的免疫原性分析實(shí)驗(yàn)，通過對小鼠進(jìn)行免疫接種，檢測小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而評估O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼的免疫原性。試劑：TRIzol試劑購自Invitrogen公司，用于提取病毒的總RNA，其高效的裂解和RNA分離能力確保了高質(zhì)量RNA的獲取。PrimeScriptRT-reagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PremixTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI、T4DNA連接酶等均購自TaKaRa公司，這些試劑在基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，DNA聚合酶用于PCR擴(kuò)增目的基因片段，限制性內(nèi)切酶用于切割載體和目的基因，T4DNA連接酶用于連接目的基因和載體。質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司，能夠高效、快速地提取和回收質(zhì)粒及DNA片段，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司，用于與空衣殼蛋白混合制備免疫原，增強(qiáng)免疫效果。HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測抗體，其高特異性和靈敏度保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。其他常規(guī)試劑如***、異丙醇、瓊脂糖等均為國產(chǎn)分析純試劑，滿足實(shí)驗(yàn)的基本需求。儀器：PCR儀（型號為Bio-RadT100）購自Bio-Rad公司，用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其精確的溫度控制和穩(wěn)定的性能確保了PCR反應(yīng)的高效性和準(zhǔn)確性。凝膠成像系統(tǒng)（型號為Bio-RadGelDocXR+）購自Bio-Rad公司，用于觀察和分析瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶，能夠清晰地顯示DNA片段的大小和濃度。高速冷凍離心機(jī)（型號為Eppendorf5424R）購自Eppendorf公司，可用于細(xì)胞和病毒的離心分離、RNA和蛋白質(zhì)的提取等操作，其高速和低溫條件保證了生物分子的活性和完整性。恒溫培養(yǎng)箱（型號為ThermoScientificHeracell150i）購自ThermoFisherScientific公司，用于細(xì)胞的培養(yǎng)和病毒的增殖，能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和二氧化碳濃度。酶標(biāo)儀（型號為ThermoScientificMultiskanFC）購自ThermoFisherScientific公司，用于ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測吸光度值，從而定量分析樣品中的抗原或抗體含量。此外，還使用了移液器、渦旋振蕩器、水浴鍋等常規(guī)實(shí)驗(yàn)室儀器，確保實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和便利性。2.2空衣殼表達(dá)方法基因克隆：利用TRIzol試劑從O型口蹄疫病毒緬甸98株中提取總RNA。按照PrimeScriptRT-reagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中已公布的O型口蹄疫病毒緬甸98株的基因組序列，設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增編碼空衣殼蛋白的基因片段。引物設(shè)計(jì)時，在上下游引物的5’端分別引入限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI的識別位點(diǎn)，以方便后續(xù)的載體構(gòu)建。引物序列經(jīng)BLAST比對驗(yàn)證，確保其特異性。使用PremixTaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL的PremixTaq、1μL的上游引物（10μM）、1μL的下游引物（10μM）、2μL的cDNA模板以及8.5μL的ddH?O。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，確認(rèn)是否得到預(yù)期大小的基因片段。將目的基因片段從瓊脂糖凝膠中切下，使用Omega公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，按照試劑盒說明書操作，確保回收的DNA片段純度和濃度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。載體構(gòu)建：選用真核表達(dá)載體pFastBac1，用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI對其進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為20μL，包含1μg的pFastBac1載體、2μL的10×Buffer、1μL的BamHI、1μL的XhoI以及14μL的ddH?O，37℃水浴酶切3h。酶切后的載體經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用凝膠回收試劑盒回收線性化的載體片段。將回收的目的基因片段與線性化的pFastBac1載體按照3:1的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為10μL，包含5μL的2×T4DNALigaseBuffer、1μL的T4DNA連接酶、3μL的目的基因片段和1μL的線性化載體，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物加入到50μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。取200μL菌液涂布于含氨芐青霉素（終濃度為100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用Omega公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定和PCR鑒定篩選出陽性重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保目的基因正確插入到載體中，且無堿基突變。重組病毒制備：將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)。轉(zhuǎn)座反應(yīng)體系為50μL，包含1μL的重組質(zhì)粒、5μL的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞以及44μL的SOC培養(yǎng)基。輕輕混勻后，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL的SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)4h。取200μL菌液涂布于含卡那霉素（終濃度為50μg/mL）、慶大霉素（終濃度為50μg/mL）、四環(huán)素（終濃度為12.5μg/mL）和X-Gal（終濃度為40μg/mL）、IPTG（終濃度為0.5mM）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，接種到含上述三種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取重組桿粒Bacmid，通過PCR鑒定確認(rèn)重組桿粒構(gòu)建成功。將重組桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的sf9昆蟲細(xì)胞中，使用CellfectinIIReagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24h，將sf9細(xì)胞以1×10?個/mL的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的Grace’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染時，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，將重組桿粒Bacmid與CellfectinIIReagent脂質(zhì)體混合，室溫孵育20min后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48-72h后觀察細(xì)胞病變情況，收集含有重組桿狀病毒的上清液，即為P1代病毒。將P1代病毒以1:100的比例接種到新的sf9細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)72h后收集P2代病毒，測定病毒滴度。空衣殼表達(dá)與純化：將P2代重組桿狀病毒以MOI（感染復(fù)數(shù)）為5的比例接種到對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞中，進(jìn)行空衣殼蛋白的表達(dá)。接種后，將細(xì)胞置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h觀察細(xì)胞形態(tài)變化。在感染后72-96h，收集細(xì)胞培養(yǎng)物。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)物在4℃、8000r/min條件下離心15min，去除細(xì)胞碎片。上清液通過0.45μm的濾膜過濾，進(jìn)一步去除雜質(zhì)。采用Ni-NTA親和層析柱對空衣殼蛋白進(jìn)行純化。首先用平衡緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，20mM咪唑，pH7.4）平衡Ni-NTA親和層析柱，然后將過濾后的上清液緩慢上樣。上樣結(jié)束后，用含有50mM咪唑的洗滌緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，50mM咪唑，pH7.4）洗滌層析柱，去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。最后用含有250mM咪唑的洗脫緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，250mM咪唑，pH7.4）洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。將洗脫得到的空衣殼蛋白溶液通過透析袋（截留分子量為10kDa）在PBS緩沖液（pH7.4）中進(jìn)行透析，去除咪唑等雜質(zhì)，透析液在4℃條件下更換3-4次，每次透析時間為2-3h。透析后的空衣殼蛋白溶液經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blot鑒定，確認(rèn)其純度和特異性。2.3免疫原性分析方法抗體檢測：采用間接ELISA方法檢測小鼠血清中的特異性抗體。首先，將純化后的空衣殼蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST（PBS中含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3min。然后，用5%脫脂奶粉的PBST溶液封閉酶標(biāo)板，每孔200μL，37℃孵育1h。洗滌后，加入經(jīng)倍比稀釋的小鼠免疫血清，每孔100μL，37℃孵育1h。再次洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（用5%脫脂奶粉的PBST溶液按1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育45min。最后，洗滌后加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色15-20min。加入2M***終止液，每孔50μL，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值（OD450）。以O(shè)D450值大于陰性對照均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算抗體效價，抗體效價以能檢測到陽性反應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)表示。通過檢測不同時間點(diǎn)小鼠血清中的抗體水平，分析空衣殼蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的動態(tài)變化規(guī)律，評估其免疫原性。動物免疫實(shí)驗(yàn)：將6-8周齡的SPF雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠每只肌肉注射100μg純化后的空衣殼蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合的乳化液，對照組小鼠每只肌肉注射等量的PBS與弗氏完全佐劑的乳化液。首次免疫后第14天，進(jìn)行第二次免疫，實(shí)驗(yàn)組小鼠注射100μg空衣殼蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合的乳化液，對照組注射等量的PBS與弗氏不完全佐劑的乳化液。在首次免疫后的第0、7、14、21、28天，分別采集小鼠血液，分離血清，用于抗體檢測。通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠的抗體產(chǎn)生情況，以及實(shí)驗(yàn)組小鼠不同時間點(diǎn)的抗體水平變化，全面評估空衣殼蛋白對小鼠的免疫原性，觀察其能否有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)：在第二次免疫后的第14天，對實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。用O型口蹄疫病毒緬甸98株對小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒，攻毒劑量為100LD50（半數(shù)致死量）。攻毒后，每天觀察小鼠的臨床癥狀，記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況，觀察周期為14天。根據(jù)小鼠的發(fā)病癥狀（如精神萎靡、食欲不振、體重下降、出現(xiàn)水皰等）和死亡數(shù)量，計(jì)算攻毒保護(hù)率。攻毒保護(hù)率=（對照組死亡小鼠數(shù)-實(shí)驗(yàn)組死亡小鼠數(shù)）/對照組死亡小鼠數(shù)×100%。通過攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，直接驗(yàn)證空衣殼蛋白免疫小鼠后對同源病毒攻擊的保護(hù)效果，直觀反映空衣殼蛋白的免疫原性強(qiáng)弱以及能否為小鼠提供有效的免疫保護(hù)。三、O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼的表達(dá)3.1基因克隆與載體構(gòu)建結(jié)果利用TRIzol試劑成功從O型口蹄疫病毒緬甸98株中提取到總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約1.2kb處出現(xiàn)了清晰明亮的條帶（圖1），與預(yù)期擴(kuò)增的編碼空衣殼蛋白的基因片段大小一致。將該基因片段從瓊脂糖凝膠中回收，其純度經(jīng)核酸蛋白分析儀測定，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明回收的基因片段純度較高，無蛋白質(zhì)和酚等雜質(zhì)污染，濃度為150ng/μL，滿足后續(xù)載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)的要求。選用真核表達(dá)載體pFastBac1，用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI對其進(jìn)行雙酶切。酶切后的載體經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，成功回收得到線性化的載體片段，其大小約為5.3kb（圖2）。將回收的目的基因片段與線性化的pFastBac1載體按照3:1的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h后，平板上長出了多個單菌落。挑取單菌落接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜后，提取重組質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，在約5.3kb處出現(xiàn)載體條帶，在約1.2kb處出現(xiàn)目的基因條帶（圖3），表明目的基因已成功插入到載體中。隨機(jī)選取3個雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank中已公布的O型口蹄疫病毒緬甸98株的空衣殼蛋白基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，核苷酸序列一致性達(dá)到99.8%，僅有2個堿基發(fā)生同義突變，不影響氨基酸序列的編碼。這進(jìn)一步證實(shí)了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，為后續(xù)的重組病毒制備及空衣殼表達(dá)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。3.2重組病毒的制備與鑒定將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)，轉(zhuǎn)座后將菌液涂布于含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素和X-Gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。平板上出現(xiàn)了白色和藍(lán)色菌落，白色菌落為發(fā)生轉(zhuǎn)座的重組桿粒Bacmid。隨機(jī)挑取5個白色菌落，接種到含上述三種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜后提取重組桿粒Bacmid。以重組桿粒Bacmid為模板，使用M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL的PremixTaq、1μL的M13上游引物（10μM）、1μL的M13下游引物（10μM）、2μL的重組桿粒Bacmid模板以及8.5μL的ddH?O。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，5個重組桿粒Bacmid均擴(kuò)增出約3.5kb的條帶（圖4），與預(yù)期大小一致，表明重組桿粒構(gòu)建成功。將重組桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的sf9昆蟲細(xì)胞中，使用CellfectinIIReagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48-72h，在顯微鏡下觀察到sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，如細(xì)胞變圓、皺縮、脫落等，表明重組桿狀病毒成功感染sf9細(xì)胞。收集含有重組桿狀病毒的上清液，即為P1代病毒。將P1代病毒以1:100的比例接種到新的sf9細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)72h后收集P2代病毒。采用終點(diǎn)稀釋法測定P2代病毒的滴度，結(jié)果顯示，P2代病毒滴度為1×10?TCID??/mL，表明獲得了高滴度的重組桿狀病毒，為后續(xù)的空衣殼表達(dá)提供了充足的病毒來源。3.3空衣殼的表達(dá)與純化效果將P2代重組桿狀病毒以MOI為5的比例接種到對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞中進(jìn)行空衣殼蛋白表達(dá)。在感染后72-96h，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)離心、過濾等初步處理后，采用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化。通過SDS-PAGE電泳對純化前后的樣品進(jìn)行分析（圖5）。結(jié)果顯示，在純化前的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中，可見多條蛋白條帶，表明存在多種雜質(zhì)蛋白。經(jīng)過Ni-NTA親和層析柱純化后，在約30kDa處出現(xiàn)了一條單一且清晰的蛋白條帶，與預(yù)期的空衣殼蛋白大小一致，表明成功純化得到了空衣殼蛋白。對純化后的空衣殼蛋白進(jìn)行定量分析，采用BCA蛋白定量試劑盒測定其濃度，結(jié)果顯示，每升細(xì)胞培養(yǎng)物可獲得約5mg的純化空衣殼蛋白，表達(dá)產(chǎn)量較高，能夠滿足后續(xù)免疫原性分析等實(shí)驗(yàn)的需求。為進(jìn)一步驗(yàn)證純化后空衣殼蛋白的特異性，進(jìn)行了Western-blot鑒定。以兔抗O型口蹄疫病毒多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體作為二抗。結(jié)果表明（圖6），在約30kDa處出現(xiàn)了特異性的雜交條帶，與SDS-PAGE電泳結(jié)果一致，且背景清晰，無非特異性條帶出現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)了純化得到的蛋白為O型口蹄疫病毒緬甸98株的空衣殼蛋白，且純度較高。綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)的方法成功實(shí)現(xiàn)了O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼的高效表達(dá)與純化，為后續(xù)深入研究其免疫原性奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。四、O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼的免疫原性分析4.1抗體檢測結(jié)果通過間接ELISA方法對實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠在首次免疫后的第0、7、14、21、28天采集的血清進(jìn)行特異性抗體檢測，結(jié)果如表1和圖7所示。表1小鼠免疫后不同時間血清抗體效價組別免疫后0天免疫后7天免疫后14天免疫后21天免疫后28天實(shí)驗(yàn)組陰性1:1001:4001:16001:3200對照組陰性陰性陰性陰性陰性在免疫后0天，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠血清抗體均為陰性，表明小鼠在免疫前未受到O型口蹄疫病毒的感染。免疫后7天，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中檢測到特異性抗體，抗體效價達(dá)到1:100，說明空衣殼蛋白已開始刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。隨著時間的推移，抗體水平逐漸升高。免疫后14天，抗體效價上升至1:400。首次免疫后第14天進(jìn)行第二次免疫，使用空衣殼蛋白與弗氏不完全佐劑的乳化液加強(qiáng)免疫，這一舉措顯著增強(qiáng)了小鼠的免疫反應(yīng)。免疫后21天，抗體效價大幅提高至1:1600。到免疫后28天，抗體效價進(jìn)一步升高至1:3200。而對照組小鼠在整個免疫過程中，血清抗體始終為陰性，說明PBS與弗氏佐劑的乳化液不能刺激小鼠產(chǎn)生針對O型口蹄疫病毒的特異性抗體。從抗體水平的動態(tài)變化可以看出，O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼具有良好的免疫原性，能夠有效地刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。在初次免疫后，抗體水平呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，且在加強(qiáng)免疫后，抗體水平顯著提高。這表明加強(qiáng)免疫對于增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答具有重要作用，能夠促使小鼠產(chǎn)生更高水平的抗體，為后續(xù)抵抗病毒感染提供更有力的免疫保護(hù)。4.2動物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果在第二次免疫后的第14天，對實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，用O型口蹄疫病毒緬甸98株以100LD50的劑量進(jìn)行腹腔注射攻毒，攻毒后每天密切觀察小鼠的臨床癥狀，記錄發(fā)病和死亡情況，觀察周期為14天。攻毒后的前3天，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠外觀上均無明顯異常，活動、飲食正常。從第4天開始，對照組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡的癥狀，行動遲緩，對周圍刺激反應(yīng)遲鈍。部分小鼠開始出現(xiàn)食欲不振，采食量明顯下降。第5-6天，對照組中部分病情較重的小鼠體重開始下降，平均體重下降約5-10%。與此同時，對照組中部分小鼠的口腔、足部等部位開始出現(xiàn)水皰，水皰直徑約1-3mm，水皰周圍皮膚紅腫，部分水皰破潰后形成糜爛面。隨著病情的發(fā)展，到第7-8天，對照組小鼠的水皰癥狀更加明顯，水皰數(shù)量增多，部分小鼠的水皰融合成較大的潰瘍面，疼痛明顯，導(dǎo)致小鼠行動困難。此時，對照組小鼠的死亡情況開始出現(xiàn)，陸續(xù)有小鼠死亡，累計(jì)死亡3只。到攻毒后第10天，對照組小鼠死亡數(shù)量增加至5只，存活的小鼠也表現(xiàn)出嚴(yán)重的病態(tài)，精神極度萎靡，幾乎不進(jìn)食，體重進(jìn)一步下降，平均體重下降約15-20%。在攻毒后的14天觀察期結(jié)束時，對照組小鼠累計(jì)死亡7只，死亡率達(dá)到70%。而實(shí)驗(yàn)組小鼠在攻毒后，整體表現(xiàn)明顯優(yōu)于對照組。僅在第5-6天，有2只小鼠出現(xiàn)輕微的精神不振和食欲不振癥狀，但持續(xù)時間較短，在第7-8天癥狀逐漸緩解。這2只小鼠的體重略有下降，下降幅度約3-5%。在整個觀察期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組小鼠均未出現(xiàn)水皰、潰瘍等典型的口蹄疫癥狀。攻毒后第14天，實(shí)驗(yàn)組小鼠僅死亡1只，死亡率為10%。根據(jù)小鼠的發(fā)病癥狀和死亡數(shù)量，計(jì)算攻毒保護(hù)率。實(shí)驗(yàn)組的攻毒保護(hù)率=（對照組死亡小鼠數(shù)-實(shí)驗(yàn)組死亡小鼠數(shù)）/對照組死亡小鼠數(shù)×100%=（7-1）/7×100%≈85.71%。結(jié)果表明，O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼免疫小鼠后，能夠?yàn)樾∈筇峁┹^高水平的免疫保護(hù)，有效降低小鼠在同源病毒攻擊下的發(fā)病率和死亡率。這進(jìn)一步證明了該空衣殼具有良好的免疫原性，能夠刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，從而對病毒感染起到抵御作用。4.3攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果攻毒后，對照組小鼠在第4天便陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振等癥狀，行動遲緩，對周圍刺激反應(yīng)遲鈍。從第5-6天開始，部分小鼠體重下降，口腔、足部等部位出現(xiàn)水皰，水皰周圍皮膚紅腫，部分水皰破潰后形成糜爛面。隨著病程進(jìn)展，水皰癥狀愈發(fā)嚴(yán)重，水皰數(shù)量增多且融合成較大潰瘍面，小鼠疼痛明顯，行動困難。從第7-8天起，對照組小鼠開始出現(xiàn)死亡，累計(jì)死亡3只。至攻毒后第10天，死亡數(shù)量增加至5只。在14天觀察期結(jié)束時，對照組小鼠累計(jì)死亡7只，死亡率高達(dá)70%。實(shí)驗(yàn)組小鼠在攻毒后的表現(xiàn)與對照組形成鮮明對比。僅在第5-6天，有2只小鼠出現(xiàn)輕微精神不振和食欲不振，但持續(xù)時間較短，第7-8天癥狀便逐漸緩解。這2只小鼠體重略有下降，下降幅度約3-5%。在整個觀察期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組小鼠均未出現(xiàn)水皰、潰瘍等典型口蹄疫癥狀。攻毒后第14天，實(shí)驗(yàn)組僅死亡1只小鼠，死亡率為10%。通過計(jì)算攻毒保護(hù)率，能更直觀地評估空衣殼的免疫保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)組的攻毒保護(hù)率=（對照組死亡小鼠數(shù)-實(shí)驗(yàn)組死亡小鼠數(shù)）/對照組死亡小鼠數(shù)×100%=（7-1）/7×100%≈85.71%。較高的攻毒保護(hù)率表明，O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼免疫小鼠后，能夠激發(fā)小鼠機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，從而為小鼠提供高水平的免疫保護(hù)，顯著降低小鼠在同源病毒攻擊下的發(fā)病率和死亡率。這充分證實(shí)了該空衣殼具有良好的免疫原性，可作為潛在的疫苗候選抗原，為研發(fā)高效的口蹄疫疫苗提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、討論5.1空衣殼表達(dá)的影響因素在本研究中，成功實(shí)現(xiàn)了O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼的表達(dá)，這一過程受到多種因素的綜合影響。基因因素在空衣殼表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。O型口蹄疫病毒緬甸98株的基因組具有獨(dú)特的序列特征，尤其是編碼空衣殼蛋白的基因片段。其基因序列的準(zhǔn)確性和完整性直接關(guān)系到空衣殼蛋白的正確表達(dá)。若基因在擴(kuò)增或克隆過程中發(fā)生突變，如堿基缺失、替換或插入，可能導(dǎo)致密碼子改變，從而影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列，使空衣殼蛋白無法正常折疊和組裝，進(jìn)而降低表達(dá)量或影響其免疫原性。例如，在某些病毒基因表達(dá)研究中，當(dāng)關(guān)鍵基因位點(diǎn)發(fā)生突變時，病毒蛋白的表達(dá)量顯著下降，且蛋白結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常。此外，基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率也受到基因本身的啟動子、增強(qiáng)子等調(diào)控元件的影響。本研究中使用的特異性引物對空衣殼蛋白基因的擴(kuò)增至關(guān)重要，引物的設(shè)計(jì)是否合理，包括其與模板的特異性結(jié)合能力、退火溫度的適配性等，都會影響基因擴(kuò)增的效率，進(jìn)而影響后續(xù)空衣殼的表達(dá)。載體的選擇和構(gòu)建是影響空衣殼表達(dá)的重要因素之一。本研究選用真核表達(dá)載體pFastBac1，它具有高效的啟動子和復(fù)制起始位點(diǎn)，能夠在昆蟲細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)。載體的構(gòu)建過程涉及到多個關(guān)鍵步驟，如限制性內(nèi)切酶的選擇和使用、目的基因與載體的連接效率等。若限制性內(nèi)切酶對載體和目的基因的切割不完全，可能導(dǎo)致連接失敗或出現(xiàn)錯誤連接，影響重組質(zhì)粒的構(gòu)建。在連接反應(yīng)中，目的基因與載體的摩爾比、連接酶的活性以及反應(yīng)條件等都會影響連接效率。合適的摩爾比能夠提高目的基因插入載體的成功率，若比例不當(dāng)，可能導(dǎo)致載體自連或目的基因多拷貝插入，影響空衣殼蛋白的表達(dá)。此外，載體上的標(biāo)簽序列也可能對空衣殼蛋白的表達(dá)和純化產(chǎn)生影響。帶有合適標(biāo)簽的載體，如His標(biāo)簽，便于后續(xù)利用親和層析柱進(jìn)行蛋白純化，但標(biāo)簽的存在也可能影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能，需要在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行優(yōu)化。細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件對空衣殼表達(dá)有著顯著影響。本研究采用sf9昆蟲細(xì)胞作為表達(dá)宿主，sf9細(xì)胞具有生長迅速、易于培養(yǎng)、對重組桿狀病毒感染敏感等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞的生長狀態(tài)直接影響空衣殼的表達(dá)。處于對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞代謝旺盛，能夠?yàn)橹亟M桿狀病毒的感染和空衣殼蛋白的表達(dá)提供充足的物質(zhì)和能量。若細(xì)胞生長不良，如受到污染、營養(yǎng)缺乏或培養(yǎng)環(huán)境不適宜，會導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，降低對病毒的感染能力，從而影響空衣殼蛋白的表達(dá)。培養(yǎng)條件中的溫度、pH值、溶解氧等參數(shù)也至關(guān)重要。昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的適宜溫度一般為27℃左右，溫度過高或過低都會影響細(xì)胞的生長和病毒的感染效率。pH值應(yīng)控制在合適的范圍內(nèi)，如6.2-6.4，偏離這個范圍可能導(dǎo)致細(xì)胞生理功能異常。溶解氧的供應(yīng)要充足，以滿足細(xì)胞代謝和病毒復(fù)制的需求。此外，培養(yǎng)基的成分也會影響空衣殼的表達(dá)。培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的種類和含量，如氨基酸、維生素、糖類等，都會影響細(xì)胞的生長和蛋白表達(dá)。添加適量的生長因子和激素，可能有助于提高細(xì)胞的生長速度和空衣殼蛋白的表達(dá)量。5.2免疫原性的影響因素空衣殼的結(jié)構(gòu)完整性是影響其免疫原性的關(guān)鍵因素。完整的空衣殼能夠模擬天然病毒的結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出與天然病毒相似的抗原表位，從而有效地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。若空衣殼在表達(dá)、純化或儲存過程中結(jié)構(gòu)遭到破壞，如衣殼蛋白的降解、組裝異常等，會導(dǎo)致抗原表位的暴露或構(gòu)象改變，進(jìn)而影響其與免疫細(xì)胞表面受體的結(jié)合，降低免疫原性。研究表明，某些病毒空衣殼在高溫或極端pH條件下儲存時，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，免疫原性顯著降低。在本研究中，通過嚴(yán)格控制空衣殼的表達(dá)和純化條件，確保獲得的空衣殼結(jié)構(gòu)完整，為其良好的免疫原性提供了保障。但在實(shí)際應(yīng)用中，仍需進(jìn)一步研究空衣殼在不同儲存條件下的穩(wěn)定性，以及結(jié)構(gòu)變化對免疫原性的影響機(jī)制，以優(yōu)化儲存和運(yùn)輸條件。免疫劑量對空衣殼的免疫原性有著顯著影響。在一定范圍內(nèi)，隨著免疫劑量的增加，機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答也會增強(qiáng)。足夠的免疫劑量能夠提供充足的抗原刺激，激活更多的免疫細(xì)胞，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生和免疫記憶細(xì)胞的形成。然而，當(dāng)免疫劑量過高時，可能會引發(fā)免疫耐受，導(dǎo)致機(jī)體對空衣殼的免疫應(yīng)答減弱。這是因?yàn)檫^高的抗原劑量會使免疫細(xì)胞過度活化，進(jìn)而引發(fā)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，抑制免疫應(yīng)答。例如，在一些疫苗研究中，當(dāng)抗原劑量超過一定閾值時，抗體產(chǎn)生水平不再升高，甚至出現(xiàn)下降趨勢。在本研究中，選擇了100μg的空衣殼蛋白作為免疫劑量，通過動物實(shí)驗(yàn)證明該劑量能夠有效地刺激小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，且未出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象。但對于不同動物模型和實(shí)際應(yīng)用場景，還需要進(jìn)一步優(yōu)化免疫劑量，以達(dá)到最佳的免疫效果。免疫途徑的選擇會影響空衣殼的免疫原性。常見的免疫途徑包括肌肉注射、皮下注射、滴鼻、口服等，不同的免疫途徑具有不同的特點(diǎn)和優(yōu)勢。肌肉注射是本研究采用的免疫途徑，肌肉組織中血管豐富，免疫細(xì)胞較多，能夠迅速將抗原遞呈給免疫系統(tǒng)，激發(fā)全身性的免疫應(yīng)答。皮下注射也能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，且操作相對簡便。滴鼻免疫可誘導(dǎo)呼吸道黏膜產(chǎn)生特異性抗體，在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。口服免疫則具有操作方便、易于大規(guī)模應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，但抗原在胃腸道中可能會受到消化酶的降解，影響免疫效果。研究表明，對于某些病毒疫苗，滴鼻免疫能夠在呼吸道黏膜局部產(chǎn)生較高水平的IgA抗體，提供更好的黏膜免疫保護(hù)；而肌肉注射則主要誘導(dǎo)全身性的IgG抗體產(chǎn)生。在口蹄疫疫苗的研究中，不同免疫途徑對免疫效果的影響也有相關(guān)報(bào)道。因此，在開發(fā)口蹄疫空衣殼疫苗時，需要綜合考慮疫苗的特點(diǎn)、動物的生理特性和免疫需求等因素，選擇合適的免疫途徑，以提高空衣殼的免疫原性。佐劑的使用是增強(qiáng)空衣殼免疫原性的重要手段。佐劑能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。本研究中使用了弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，弗氏完全佐劑中含有卡介苗等成分，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答；弗氏不完全佐劑則主要增強(qiáng)體液免疫。佐劑的作用機(jī)制主要包括增強(qiáng)抗原的滯留和釋放、激活免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答類型等。例如，一些佐劑能夠吸附抗原，延長抗原在體內(nèi)的存在時間，持續(xù)刺激免疫細(xì)胞；另一些佐劑可以激活巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞，增強(qiáng)其對抗原的攝取、加工和遞呈能力。不同類型的佐劑對空衣殼免疫原性的增強(qiáng)效果存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，一些新型佐劑如納米佐劑、核酸佐劑等，具有更好的免疫增強(qiáng)效果和安全性。在未來的研究中，可以進(jìn)一步探索新型佐劑在口蹄疫空衣殼疫苗中的應(yīng)用，優(yōu)化佐劑配方，以提高空衣殼的免疫原性和疫苗的整體性能。5.3與其他疫苗的比較將O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼疫苗與傳統(tǒng)疫苗和其他新型疫苗進(jìn)行比較，有助于全面評估其優(yōu)勢與不足，為疫苗的進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用提供參考。傳統(tǒng)口蹄疫疫苗主要包括滅活疫苗和弱毒疫苗。滅活疫苗是將病毒經(jīng)物理或化學(xué)方法滅活后，加入佐劑制成。其優(yōu)點(diǎn)是安全性高，不易發(fā)生毒力返強(qiáng)的風(fēng)險。在大規(guī)模應(yīng)用中，能夠有效預(yù)防口蹄疫的傳播，對控制疫情起到了重要作用。然而，滅活疫苗也存在一些缺點(diǎn)。生產(chǎn)過程中需要大量培養(yǎng)活病毒，存在病毒泄漏的安全隱患。且滅活疫苗的免疫效果受病毒滅活程度的影響較大，若滅活不完全，可能導(dǎo)致動物感染；若滅活過度，則會降低免疫原性。此外，滅活疫苗需要多次免疫才能產(chǎn)生較好的免疫效果，免疫成本較高。例如，牛O型口蹄疫滅活疫苗需要對成年牛肌肉注射3毫升，1歲以下犢牛肌肉注射2毫升，免疫持續(xù)期為6個月，且需定期加強(qiáng)免疫。弱毒疫苗是通過將強(qiáng)毒毒株在非易感動物身上反復(fù)傳代，使其毒力減弱而獲得。弱毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)是免疫原性強(qiáng)，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，免疫持續(xù)期相對較長。在一些地區(qū)的口蹄疫防控中，弱毒疫苗發(fā)揮了重要作用。但其存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險，可能導(dǎo)致動物發(fā)病，對畜牧業(yè)造成損失。獲得毒力弱且免疫原性良好的弱毒毒株較為困難，這限制了弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)疫苗相比，O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼疫苗具有一定的優(yōu)勢。空衣殼疫苗不含有病毒核酸，不存在毒力返強(qiáng)和病毒泄漏的風(fēng)險，安全性更高。在生產(chǎn)過程中，無需培養(yǎng)活病毒，降低了生產(chǎn)過程中的生物安全風(fēng)險。空衣殼疫苗能夠模擬天然病毒的結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出與天然病毒相似的抗原表位，具有良好的免疫原性。本研究中的空衣殼疫苗免疫小鼠后，能夠刺激小鼠產(chǎn)生較高水平的抗體，并對同源病毒攻擊提供較高的保護(hù)率。然而，空衣殼疫苗也存在一些不足之處。目前其生產(chǎn)工藝還不夠成熟，表達(dá)產(chǎn)量相對較低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。與傳統(tǒng)滅活疫苗相比，空衣殼疫苗的免疫持續(xù)期可能較短，需要進(jìn)一步研究優(yōu)化免疫程序和佐劑配方，以提高其免疫效果和免疫持續(xù)期。在新型疫苗方面，DNA疫苗是近年來研究的熱點(diǎn)之一。DNA疫苗是將編碼病毒抗原的基因直接導(dǎo)入動物細(xì)胞內(nèi)，通過動物自身的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原，從而激發(fā)免疫應(yīng)答。DNA疫苗具有抗原性強(qiáng)、能激發(fā)機(jī)體的全面免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)，且生產(chǎn)過程相對簡單，成本較低。其免疫效果受到基因?qū)胄省⒈磉_(dá)水平等因素的影響，在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些技術(shù)難題需要解決。活載體疫苗也是新型疫苗的一種，通常采用非致病性微生物作載體構(gòu)建重組體制備多價聯(lián)苗。如皰疹病毒、腺病毒、痘病毒等可作為載體。活載體疫苗能夠同時表達(dá)多種抗原，具有良好的免疫效果。但載體本身可能會引起免疫反應(yīng)，影響疫苗的安全性和免疫效果。與這些新型疫苗相比，O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢。空衣殼疫苗的抗原結(jié)構(gòu)與天然病毒相似，能夠更有效地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。而DNA疫苗和活載體疫苗在抗原表達(dá)和呈遞過程中，可能會受到多種因素的影響，導(dǎo)致免疫效果不穩(wěn)定。空衣殼疫苗不含有載體，避免了載體引起的免疫反應(yīng)和潛在風(fēng)險。但空衣殼疫苗在大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用方面還需要進(jìn)一步完善，如提高表達(dá)產(chǎn)量、優(yōu)化生產(chǎn)工藝等，以降低成本，提高其市場競爭力。5.4研究的創(chuàng)新點(diǎn)與局限性本研究具有一定的創(chuàng)新點(diǎn)。在空衣殼表達(dá)方面，采用了桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼。該系統(tǒng)相較于傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，具有蛋白翻譯后修飾功能更完善的優(yōu)勢，能夠使表達(dá)的空衣殼蛋白更接近天然病毒的結(jié)構(gòu)和功能，從而可能具有更好的免疫原性。在載體構(gòu)建過程中，通過優(yōu)化引物設(shè)計(jì)和酶切連接條件，提高了重組質(zhì)粒的構(gòu)建效率和準(zhǔn)確性，為后續(xù)的重組病毒制備和空衣殼表達(dá)奠定了良好基礎(chǔ)。在免疫原性分析中，不僅檢測了小鼠血清中的抗體水平，還進(jìn)行了攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，全面評估了空衣殼的免疫原性。這種綜合的評估方法能夠更直觀地反映空衣殼對動物的免疫保護(hù)效果，為疫苗的研發(fā)提供了更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究也存在一些局限性。實(shí)驗(yàn)動物模型方面，選用了6-8周齡的SPF雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫原性分析。小鼠雖然是常用的實(shí)驗(yàn)動物，但其免疫反應(yīng)與牛、豬等口蹄疫自然宿主存在一定差異。小鼠的免疫系統(tǒng)相對簡單，對病毒的免疫應(yīng)答模式可能無法完全模擬牛、豬等動物的真實(shí)情況。因此，后續(xù)研究需要進(jìn)一步采用牛、豬等自然宿主進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以更準(zhǔn)確地評估空衣殼在實(shí)際應(yīng)用中的免疫原性和免疫保護(hù)效果。免疫程序的優(yōu)化方面，本研究采用的免疫程序相對簡單，僅進(jìn)行了兩次免疫。對于實(shí)際應(yīng)用中的疫苗免疫程序，可能需要根據(jù)不同動物種類、年齡、免疫途徑等因素進(jìn)行更深入的優(yōu)化。不同動物對疫苗的免疫應(yīng)答存在差異，需要探索最佳的免疫劑量、免疫次數(shù)和免疫間隔時間，以達(dá)到最佳的免疫效果。應(yīng)用推廣方面，目前空衣殼疫苗還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，距離實(shí)際應(yīng)用還有一定距離。在大規(guī)模生產(chǎn)工藝方面，需要進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)和純化工藝，提高空衣殼的表達(dá)產(chǎn)量和純度，降低生產(chǎn)成本。還需要開展更多的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證疫苗在不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖環(huán)境下的安全性和有效性，為疫苗的推廣應(yīng)用提供充分的科學(xué)依據(jù)。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼展開，在表達(dá)及免疫原性分析方面取得了一系列成果。通過精心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)流程，成功實(shí)現(xiàn)了該毒株空衣殼的表達(dá)與純化。在基因克隆環(huán)節(jié)，利用TRIzol試劑從O型口蹄疫病毒緬甸98株中高效提取總RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。依據(jù)GenBank中公布的基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，成功獲得了編碼空衣殼蛋白的基因片段。隨后，將該基因片段與真核表達(dá)載體pFastBac1進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過對重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證，確認(rèn)目的基因已正確插入載體，且序列一致性高。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)，成功構(gòu)建重組桿粒Bacmid。經(jīng)PCR鑒定后，將重組桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲細(xì)胞，成功制備出重組桿狀病毒。對重組桿狀病毒進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了高滴度的P2代病毒。利用P2代病毒感染sf9細(xì)胞，成功表達(dá)出空衣殼蛋白，并通過Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳和Western-blot鑒定結(jié)果表明，純化后的空衣殼蛋白純度高、特異性強(qiáng)，每升細(xì)胞培養(yǎng)物可獲得約5mg的純化空衣殼蛋白，表達(dá)產(chǎn)量能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。在免疫原性分析方面，通過動物免疫實(shí)驗(yàn)和攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，全面評估了空衣殼的免疫原性。將純化后的空衣殼蛋白免疫BALB/c小鼠，利用間接ELISA方法檢測小鼠血清中的特異性抗體。結(jié)果顯示，空衣殼蛋白能夠有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，抗體水平隨時間推移逐漸升高。在首次免疫后7天，小鼠血清中即可檢測到特異性抗體，效價為1:100。首次免疫后第14天進(jìn)行第二次免疫，抗體效價在免疫后21天大幅提高至1:1600，免疫后28天進(jìn)一步升高至1:3200。而對照組小鼠在整個免疫過程中血清抗體始終為陰性。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用O型口蹄疫病毒緬甸98株對免疫后的小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒，對照組小鼠在攻毒后陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、體重下降、水皰等典型口蹄疫癥狀，死亡率高達(dá)70%。而實(shí)驗(yàn)組小鼠僅2只出現(xiàn)輕微精神不振和食欲不振，且持續(xù)時間短，在整個觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)典型口蹄疫癥狀，死亡率僅為10%。實(shí)驗(yàn)組的攻毒保護(hù)率約為85.71%，表明空衣殼免疫小鼠后能夠?yàn)樾∈筇峁┹^高水平的免疫保護(hù)，有效降低小鼠在同源病毒攻擊下的發(fā)病率和死亡率，充分證明了O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼具有良好的免疫原性。6.2研究展望未來針對O型口蹄疫病毒緬甸98株空衣殼的研究可從以下幾個關(guān)鍵方向展開。在表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化方面，盡管本研究采用的桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)取得了一定成果，但仍有提升空間。后續(xù)可深入研究不同昆蟲細(xì)胞系對空衣殼表達(dá)的影響，如Sf21細(xì)胞、HighFive細(xì)胞等，比較它們在空衣殼蛋白表達(dá)量、蛋白修飾和裝配效率等方面的差異，篩選出最適合空衣殼表達(dá)的細(xì)胞系。探索新型表達(dá)載體和表達(dá)策略，如開發(fā)具有更強(qiáng)啟動子和更高表達(dá)效率的載體，優(yōu)化載體的元件設(shè)計(jì)，提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。研究共表達(dá)伴侶蛋白或輔助因子對空衣殼表達(dá)的促進(jìn)作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白折疊和裝配環(huán)境，提高空衣殼的表達(dá)產(chǎn)量和質(zhì)量。在免疫原性提升研究中，進(jìn)一步優(yōu)化免疫程序是關(guān)鍵。根據(jù)不同動物種類、年齡、免疫途徑等因素，設(shè)計(jì)多組免疫實(shí)驗(yàn)，探索最佳的免疫劑量、免疫次數(shù)和免疫間隔時間。針對牛、豬等口蹄疫自然宿主，研究不同免疫程序?qū)γ庖咝Ч挠绊懀€性化的免疫方案。研究新型佐劑的應(yīng)用，如納米佐劑、核酸