miR-584在結(jié)直腸癌中的抑癌角色與機(jī)制探究：從細(xì)胞增殖調(diào)控到臨床應(yīng)用前景一、引言1.1研究背景結(jié)直腸癌（ColorectalCancer，CRC）是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。近年來(lái)，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)193萬(wàn)，死亡病例數(shù)達(dá)93.5萬(wàn)，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第三位和第二位。在中國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率也不容樂(lè)觀，已成為我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存期，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管目前手術(shù)、化療、放療及靶向治療等綜合治療手段在一定程度上提高了結(jié)直腸癌患者的生存率，但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高結(jié)直腸癌的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有重要意義。近年來(lái)，非編碼RNA（non-codingRNA，ncRNA）在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注。非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）、環(huán)狀RNA（circularRNA，circRNA）等。它們雖不直接參與蛋白質(zhì)的編碼合成，卻在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslatedregion，3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。越來(lái)越多的研究表明，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，多種miRNA的表達(dá)水平發(fā)生改變，如miR-21、miR-143、miR-145等，它們通過(guò)調(diào)控不同的信號(hào)通路和靶基因，影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。這些發(fā)現(xiàn)提示miRNA在結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。miR-584作為miRNA家族的一員，已被報(bào)道在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。在乳腺癌中，miR-584通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移；在肝癌中，miR-584的低表達(dá)與腫瘤的惡性程度及不良預(yù)后相關(guān)。然而，miR-584在結(jié)直腸癌中的研究相對(duì)較少，其表達(dá)水平、生物學(xué)功能及作用機(jī)制尚不完全清楚。因此，深入研究miR-584在結(jié)直腸癌中的作用及機(jī)制，不僅有助于進(jìn)一步揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響及其潛在作用機(jī)制。通過(guò)一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)miR-584在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性；運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)改變結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-584的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響；進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和蛋白質(zhì)免疫印跡等方法，篩選和驗(yàn)證miR-584的靶基因，闡明其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論方面來(lái)看，深入研究miR-584在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，豐富人們對(duì)非編碼RNA在腫瘤中作用的認(rèn)識(shí)，為結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路和理論依據(jù)。從臨床應(yīng)用角度而言，若能明確miR-584在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能及其相關(guān)分子機(jī)制，有望將其開(kāi)發(fā)為結(jié)直腸癌早期診斷的新型生物標(biāo)志物，提高結(jié)直腸癌的早期診斷率；同時(shí)，以miR-584及其靶基因作為潛在治療靶點(diǎn)，為結(jié)直腸癌的治療提供新的策略和方法，如開(kāi)發(fā)基于miRNA的靶向治療藥物，這將為改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后、提高患者生存率和生活質(zhì)量帶來(lái)新的希望。二、結(jié)直腸癌與miR-584概述2.1結(jié)直腸癌的流行病學(xué)與發(fā)病機(jī)制結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)都具有較高的發(fā)病率和死亡率。近年來(lái)，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出不同程度的變化趨勢(shì)，且在不同地區(qū)、不同人群中存在顯著差異。從全球范圍來(lái)看，根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)193萬(wàn)，死亡病例數(shù)達(dá)93.5萬(wàn)，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第三位和第二位。在過(guò)去的幾十年間，結(jié)直腸癌的發(fā)病率總體呈上升趨勢(shì)，這可能與全球人口老齡化、生活方式改變（如高熱量、高脂肪、低纖維飲食，運(yùn)動(dòng)量減少等）以及環(huán)境因素等多種因素有關(guān)。例如，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，越來(lái)越多的人攝入過(guò)多的加工肉類(lèi)和紅肉，而膳食纖維的攝入不足，這可能增加了結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在中國(guó)，結(jié)直腸癌同樣是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。2020年，中國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例約55.5萬(wàn)，死亡病例約28.6萬(wàn)，發(fā)病數(shù)躍居第二位，僅次于肺癌。且在過(guò)去的20年間，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持持續(xù)上升的趨勢(shì)。我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病具有一定的特點(diǎn)，如發(fā)病年齡相較于歐美國(guó)家要提前5-8年，45歲以上人群是高發(fā)人群。同時(shí)，城市地區(qū)的發(fā)病率略高于農(nóng)村地區(qū)，這可能與城市居民生活節(jié)奏快、壓力大、飲食習(xí)慣西化等因素有關(guān)。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素以及生活方式等多個(gè)方面，目前尚未完全明確，但通常認(rèn)為是多種因素共同作用導(dǎo)致細(xì)胞遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變，進(jìn)而引發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。遺傳因素：約20%-30%的結(jié)直腸癌患者具有遺傳背景。一些遺傳性綜合征與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，如家族性腺瘤性息肉病（FAP），這是一種常染色體顯性遺傳病，由腺瘤性息肉病coli（APC）基因突變引起，患者的結(jié)直腸內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量腺瘤性息肉，若不及時(shí)治療，幾乎100%會(huì)發(fā)展為結(jié)直腸癌；林奇綜合征（Lynchsyndrome），又稱遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC），主要由錯(cuò)配修復(fù)基因（如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等）突變導(dǎo)致，患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。此外，一些常見(jiàn)的遺傳變異也可能增加個(gè)體對(duì)結(jié)直腸癌的易感性，雖然它們單獨(dú)作用時(shí)風(fēng)險(xiǎn)增加幅度較小，但多個(gè)變異的累積效應(yīng)不容忽視。環(huán)境因素：環(huán)境因素在結(jié)直腸癌的發(fā)病中起著重要作用。飲食因素是關(guān)鍵的環(huán)境因素之一，長(zhǎng)期攝入高脂肪、高蛋白、低纖維素的食物，會(huì)改變腸道微生態(tài)環(huán)境，增加腸道內(nèi)有害代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，刺激腸道黏膜，從而增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。例如，紅肉和加工肉類(lèi)在腸道內(nèi)被細(xì)菌分解后會(huì)產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，如N-亞硝基化合物、雜環(huán)胺等，這些物質(zhì)具有致癌性。相反，富含膳食纖維的食物能夠促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，減少有害物質(zhì)在腸道內(nèi)的停留時(shí)間，降低結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，吸煙、飲酒等不良生活習(xí)慣也與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)。吸煙會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，產(chǎn)生大量自由基，損傷細(xì)胞DNA，從而增加癌變的可能性；過(guò)量飲酒會(huì)影響肝臟的代謝功能，干擾腸道內(nèi)的正常生理過(guò)程，也可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。腸道炎癥：慢性腸道炎癥是結(jié)直腸癌的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等炎癥性腸病，由于腸道黏膜長(zhǎng)期處于炎癥狀態(tài)，免疫細(xì)胞持續(xù)浸潤(rùn)，釋放大量炎癥因子，這些炎癥因子會(huì)刺激腸道上皮細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生基因突變和表觀遺傳改變，增加患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)研究，患有潰瘍性結(jié)腸炎10年以上的患者，結(jié)直腸癌的累積發(fā)病率可達(dá)2%-5%，患病20年以上的患者，累積發(fā)病率可高達(dá)12%-15%。其他因素：年齡也是結(jié)直腸癌發(fā)病的一個(gè)重要因素，隨著年齡的增長(zhǎng)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸升高，這可能與細(xì)胞老化、基因突變積累以及免疫功能下降等因素有關(guān)。性別方面，男性患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)略高于女性，具體機(jī)制尚不完全清楚，可能與激素水平、生活方式差異等因素有關(guān)。此外，肥胖、糖尿病等代謝性疾病也被認(rèn)為與結(jié)直腸癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，肥胖患者體內(nèi)脂肪組織分泌的多種脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素等，會(huì)影響細(xì)胞的增殖、凋亡和代謝過(guò)程，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展；糖尿病患者長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂，增加氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，也可能增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。盡管目前對(duì)于結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，且手術(shù)、化療、放療及靶向治療等綜合治療手段在一定程度上提高了結(jié)直腸癌患者的生存率，但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此，深入探索結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，對(duì)于提高結(jié)直腸癌的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。2.2microRNA的生物學(xué)特性及功能microRNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子，長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸。它們?cè)谏矬w內(nèi)廣泛存在，從低等生物如果蠅、線蟲(chóng)，到高等哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)，都有miRNA的表達(dá)。miRNA具有高度的保守性，在不同物種間，許多miRNA的序列和功能都具有相似性。例如，在人類(lèi)和小鼠中，部分miRNA的序列一致性可高達(dá)90%以上，這表明miRNA在生物進(jìn)化過(guò)程中扮演著重要且保守的角色，其功能對(duì)于維持生物體的正常生理活動(dòng)至關(guān)重要。miRNA的生成是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過(guò)程。首先，在細(xì)胞核內(nèi)，RNA聚合酶II或III以DNA為模板轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)miRNA（primarymiRNA，pri-miRNA），pri-miRNA通常長(zhǎng)度可達(dá)幾千個(gè)核苷酸，具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)。接著，在微處理復(fù)合物（Microprocessorcomplex），即由Drosha酶和DGCR8蛋白組成的復(fù)合物作用下，pri-miRNA被切割成約70-100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的前體miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA在Exportin-5和Ran-GTP復(fù)合物的協(xié)助下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA會(huì)被Dicer酶進(jìn)一步切割，去除發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部，生成長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA。最后，雙鏈miRNA中的一條鏈會(huì)被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）中，成為成熟的miRNA，而另一條鏈則被降解。miRNA主要通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslatedregion，3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，其作用機(jī)制主要有以下兩種：翻譯抑制：當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，主要通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中，這種作用機(jī)制較為普遍。例如，miR-122是肝臟中高表達(dá)的一種miRNA，它可以通過(guò)與靶mRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制靶基因的翻譯，從而參與肝臟的脂質(zhì)代謝調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122的缺失會(huì)導(dǎo)致肝臟中脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)增加，進(jìn)而引起脂質(zhì)代謝紊亂。mRNA降解：若miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補(bǔ)配對(duì)（或幾乎完全互補(bǔ)），則會(huì)誘導(dǎo)靶mRNA的降解。這種機(jī)制在植物中更為常見(jiàn)。比如，在植物擬南芥中，miR-165/166可以與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致靶mRNA的降解，從而調(diào)控植物的器官發(fā)育。當(dāng)miR-165/166的表達(dá)異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致擬南芥的葉片和花器官發(fā)育出現(xiàn)畸形。此外，近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA在一些情況下可能參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過(guò)影響基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)等表觀遺傳修飾，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控。這種新的調(diào)控機(jī)制進(jìn)一步豐富了miRNA對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的方式。miRNA在細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖方面，miRNA可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖能力。例如，miR-17-92簇是一個(gè)由多個(gè)miRNA組成的基因簇，它在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。研究表明，miR-17-92簇可以通過(guò)靶向抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞分化過(guò)程中，miRNA同樣起著關(guān)鍵作用。以肌肉細(xì)胞分化為例，miR-1和miR-133是肌肉組織特異性表達(dá)的miRNA，它們?cè)诩∪饧?xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。miR-1可以通過(guò)抑制一些非肌肉特異性基因的表達(dá)，促進(jìn)肌肉細(xì)胞的分化；miR-133則可以通過(guò)靶向調(diào)控一些與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，抑制肌肉前體細(xì)胞的增殖，從而有利于細(xì)胞向肌肉細(xì)胞方向分化。此外，miRNA還參與細(xì)胞凋亡、代謝、免疫等多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。在細(xì)胞凋亡調(diào)控中，miR-34家族成員被廣泛研究，它們可以通過(guò)靶向調(diào)控Bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，miR-34家族成員的表達(dá)常常降低，導(dǎo)致抗凋亡基因過(guò)度表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也扮演著重要角色。許多miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平與正常組織相比存在顯著差異，它們可以作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用。如前面提到的miR-21，在多種腫瘤包括結(jié)直腸癌中高表達(dá)，它可以通過(guò)靶向抑制腫瘤抑制基因如PTEN等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；而一些miRNA如miR-143、miR-145在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，它們可以通過(guò)靶向調(diào)控一些癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，發(fā)揮抑癌作用。這些研究表明，miRNA有望成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的重要生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。2.3miR-584的研究現(xiàn)狀miR-584作為miRNA家族的重要成員，近年來(lái)在多個(gè)研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，尤其是在多種疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中，展現(xiàn)出獨(dú)特的調(diào)控作用。在心血管疾病方面，有研究表明miR-584在心肌梗死和心力衰竭等病癥中扮演關(guān)鍵角色。例如，在心肌梗死小鼠模型中，miR-584的表達(dá)水平顯著變化，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，影響心肌細(xì)胞的凋亡和存活，進(jìn)而參與心肌梗死后心臟功能的恢復(fù)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-584可以靶向抑制某些促凋亡基因的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞的凋亡，對(duì)心肌組織起到保護(hù)作用。在心力衰竭患者的心肌組織樣本中，也檢測(cè)到miR-584表達(dá)的異常，提示其可能作為心力衰竭診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域，miR-584與阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的關(guān)聯(lián)逐漸被揭示。以阿爾茨海默病為例，miR-584能夠通過(guò)調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白（APP）的代謝途徑，影響β-淀粉樣蛋白（Aβ）的生成和聚集。Aβ的異常聚集是阿爾茨海默病的重要病理特征之一，miR-584通過(guò)抑制APP向Aβ的轉(zhuǎn)化，減少Aβ的生成，從而延緩阿爾茨海默病的病理進(jìn)程。此外，在帕金森病模型中，miR-584對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的存活和功能維持具有重要作用，它可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響多巴胺的合成和釋放，進(jìn)而改善帕金森病的癥狀。在腫瘤研究方面，miR-584在多種惡性腫瘤中的功能和機(jī)制研究取得了一定進(jìn)展。在乳腺癌中，miR-584被證實(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-584可以靶向作用于一些與細(xì)胞增殖和遷移密切相關(guān)的基因，如某些細(xì)胞周期蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶等。通過(guò)抑制這些靶基因的表達(dá)，miR-584有效降低了乳腺癌細(xì)胞的增殖活性和遷移能力，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在肝癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-584的低表達(dá)與腫瘤的惡性程度及不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，miR-584可以通過(guò)調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路，影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，miR-584能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在結(jié)直腸癌的研究中，miR-584也開(kāi)始受到關(guān)注，但相關(guān)研究仍處于初步階段。已有研究檢測(cè)了結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中miR-584的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，miR-584在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，同樣觀察到miR-584表達(dá)降低的現(xiàn)象。關(guān)于miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，有研究表明過(guò)表達(dá)miR-584可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-584mimics的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活性明顯低于對(duì)照組細(xì)胞。此外，miR-584還被報(bào)道能夠影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-584后，結(jié)直腸癌細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠和Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，表明miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有抑制作用。盡管目前對(duì)miR-584在結(jié)直腸癌中的研究取得了一定成果，但仍存在諸多研究空白。在作用機(jī)制方面，雖然已初步確定miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為有影響，但具體的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明。miR-584的靶基因眾多，除了已報(bào)道的少數(shù)靶基因外，還有哪些關(guān)鍵靶基因參與其調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，以及這些靶基因之間如何相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，仍有待深入研究。在臨床應(yīng)用方面，miR-584作為結(jié)直腸癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力尚未得到充分挖掘。雖然其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)異常已被發(fā)現(xiàn)，但能否將其作為一種獨(dú)立的診斷標(biāo)志物用于臨床早期診斷，以及如何將其與現(xiàn)有診斷方法相結(jié)合，提高診斷的準(zhǔn)確性和特異性，還需要大量的臨床樣本驗(yàn)證和深入的臨床研究。在治療靶點(diǎn)研究方面，如何基于miR-584開(kāi)發(fā)有效的治療策略，如設(shè)計(jì)針對(duì)miR-584的激動(dòng)劑或拮抗劑，以及如何解決這些藥物的遞送和安全性等問(wèn)題，都是亟待解決的難題。三、miR-584在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)分析3.1材料與方法3.1.1結(jié)直腸癌組織樣本收集本研究共收集了[X]例結(jié)直腸癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，所有患者均于[具體醫(yī)院名稱]接受手術(shù)治療，術(shù)前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療。標(biāo)本采集后迅速置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩；颊吣挲g范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為[平均年齡]歲，其中男性[男性例數(shù)]例，女性[女性例數(shù)]例。詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，用于后續(xù)的相關(guān)性分析。3.1.2細(xì)胞系來(lái)源及培養(yǎng)選用人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、LOVO、HCT116、HT29以及人正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞FHC作為研究對(duì)象。這些細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。SW480、LOVO、HCT116細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）進(jìn)行培養(yǎng)；HT29細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）培養(yǎng)；FHC細(xì)胞則在DMEM/F12培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.1.3RNA提取采用TRIzol試劑（Invitrogen公司）提取結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中的總RNA。具體步驟如下：取適量的組織樣本或細(xì)胞，加入1mLTRIzol試劑，充分勻漿裂解。室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。每1mLTRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育2-3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘，此時(shí)混合液體分為下層紅色酚氯仿相、中間層以及上層無(wú)色水相，RNA全部存在于水相中。小心吸取水相轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫孵育10分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘，可見(jiàn)管底部和側(cè)壁形成膠狀RNA沉淀。棄去上清液，用1mL75%乙醇（用DEPC處理水配制）洗滌RNA沉淀，混勻后4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘，避免過(guò)度干燥影響RNA溶解性。最后加入適量無(wú)RNA酶的水，用槍頭反復(fù)吹打，使RNA沉淀完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃冰箱備用。使用核酸檢測(cè)儀（NanoDrop2000，ThermoFisherScientific）測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A???/A???比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。3.1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以cDNA為模板，使用SYBRGreenMasterMix（Roche公司）進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-584的成熟序列及U6snRNA（內(nèi)參基因）序列，運(yùn)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-584上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；U6上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、上下游引物各0.8μL、2μLcDNA模板以及6.4μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2?ΔΔCt法計(jì)算miR-584的相對(duì)表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方法，旨在準(zhǔn)確檢測(cè)miR-584在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，為后續(xù)深入研究其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)對(duì)收集的[X]例結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，分析miR-584在其中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-584的相對(duì)表達(dá)量為[X1]，顯著低于癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)量[X2]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖1A）。在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、LOVO、HCT116、HT29以及人正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞FHC中，同樣采用qRT-PCR檢測(cè)miR-584的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞FHC相比，miR-584在各結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。其中，在SW480細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為[X3]，LOVO細(xì)胞中為[X4]，HCT116細(xì)胞中為[X5]，HT29細(xì)胞中為[X6]，而在FHC細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為[X7]（圖1B）。為進(jìn)一步分析miR-584表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，將患者的臨床病理資料，包括腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，與miR-584的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-584的低表達(dá)與腫瘤的大小、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在腫瘤直徑≥5cm的患者中，miR-584的相對(duì)表達(dá)量為[X8]，明顯低于腫瘤直徑<5cm患者的相對(duì)表達(dá)量[X9]（P<0.05）；在低分化結(jié)直腸癌患者中，miR-584的相對(duì)表達(dá)量為[X10]，顯著低于中高分化患者的相對(duì)表達(dá)量[X11]（P<0.05）；TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者，miR-584的相對(duì)表達(dá)量為[X12]，明顯低于Ⅰ-Ⅱ期患者的相對(duì)表達(dá)量[X13]（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，miR-584的相對(duì)表達(dá)量為[X14]，顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的相對(duì)表達(dá)量[X15]（P<0.05）（表1）。綜上所述，miR-584在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的腫瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，提示miR-584可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。[此處插入圖1，展示結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中miR-584的表達(dá)水平，A為組織中表達(dá)水平對(duì)比圖，B為細(xì)胞系中表達(dá)水平對(duì)比圖]表1miR-584表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析（表格內(nèi)容為對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)）臨床病理參數(shù)例數(shù)miR-584相對(duì)表達(dá)量P值腫瘤大小≥5cm[X16][X8]<0.05<5cm[X17][X9]分化程度低分化[X18][X10]<0.05中高分化[X19][X11]TNM分期Ⅲ-Ⅳ期[X20][X12]<0.05Ⅰ-Ⅱ期[X21][X13]淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有[X22][X14]<0.05無(wú)[X23][X15]3.3結(jié)果討論本研究通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中miR-584的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-584在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與患者的腫瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。這一結(jié)果與已有研究報(bào)道相符，進(jìn)一步證實(shí)了miR-584在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。miR-584在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的低表達(dá)提示其可能作為一種抑癌基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，抑癌基因的表達(dá)下調(diào)或功能缺失往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)等。miR-584低表達(dá)可能使得其對(duì)下游靶基因的抑制作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路的異常激活，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。已有研究表明，miR-584可以通過(guò)靶向調(diào)控多種基因和信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等過(guò)程。例如，在乳腺癌中，miR-584通過(guò)靶向作用于細(xì)胞周期蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶等基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移；在肝癌中，miR-584能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，推測(cè)在結(jié)直腸癌中，miR-584也可能通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制發(fā)揮抑癌作用，但其具體的靶基因和信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步深入研究。關(guān)于miR-584表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析中，結(jié)果顯示miR-584的低表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤直徑≥5cm的患者、低分化患者、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其miR-584的表達(dá)水平均顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組。這表明miR-584的表達(dá)水平可能與結(jié)直腸癌的腫瘤進(jìn)展和惡性程度相關(guān)。隨著腫瘤的增大、分化程度降低、分期進(jìn)展以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性程度逐漸增加，而miR-584的表達(dá)水平則進(jìn)一步降低。這提示miR-584可能在結(jié)直腸癌的腫瘤發(fā)展過(guò)程中起到抑制腫瘤進(jìn)展的作用，其低表達(dá)可能促進(jìn)了結(jié)直腸癌的惡化。然而，在實(shí)際研究中，也可能存在一些因素影響miR-584表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。一方面，樣本量的大小可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究雖然收集了一定數(shù)量的病例樣本，但在某些亞組分析中，樣本量相對(duì)較少，這可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果的可靠性受到一定影響。例如，在分析miR-584表達(dá)與某些少見(jiàn)病理類(lèi)型或特殊臨床特征的相關(guān)性時(shí)，由于樣本量有限，可能無(wú)法準(zhǔn)確揭示兩者之間的真實(shí)關(guān)系。另一方面，個(gè)體差異也是一個(gè)重要因素。不同患者之間存在遺傳背景、生活習(xí)慣、基礎(chǔ)疾病等多方面的差異，這些因素可能干擾miR-584的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。例如，某些患者可能存在其他基因的突變或多態(tài)性，這些遺傳變異可能影響miR-584的表達(dá)調(diào)控，或者與miR-584協(xié)同作用，共同影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，從而使miR-584表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系變得復(fù)雜。此外，腫瘤組織的異質(zhì)性也不容忽視。腫瘤組織中不同區(qū)域的細(xì)胞在基因表達(dá)、代謝活性等方面可能存在差異，這可能導(dǎo)致在檢測(cè)miR-584表達(dá)水平時(shí)，由于取材部位的不同而產(chǎn)生偏差，進(jìn)而影響與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-584在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，且與患者的臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，提示其在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的抑癌作用。但在研究過(guò)程中，樣本量、個(gè)體差異和腫瘤組織異質(zhì)性等因素可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，未來(lái)需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，綜合考慮多種因素，深入研究miR-584在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和潛在的靶點(diǎn)。四、miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的功能影響4.1過(guò)表達(dá)miR-584對(duì)細(xì)胞增殖的影響4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為深入探究過(guò)表達(dá)miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)選用前期研究中miR-584表達(dá)水平較低且具有代表性的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480作為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)前，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染是實(shí)現(xiàn)miR-584過(guò)表達(dá)的關(guān)鍵步驟。將HCT116和SW480細(xì)胞分別以每孔[X]×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約為60%-70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染試劑選用脂質(zhì)體Lipofectamine3000（Invitrogen公司），該試劑具有較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，能夠有效將外源核酸導(dǎo)入細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-584mimics（購(gòu)自RiboBio公司，序列經(jīng)過(guò)優(yōu)化，確保能夠有效模擬內(nèi)源性miR-584的功能），對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒（miR-NCmimics，同樣購(gòu)自RiboBio公司，其序列與miR-584無(wú)關(guān)，作為陰性對(duì)照用于排除非特異性干擾）。具體轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照脂質(zhì)體Lipofectamine3000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：首先，將適量的miR-584mimics或miR-NCmimics分別與200μLOpti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）輕輕混勻，得到核酸稀釋液；同時(shí)，將適量的脂質(zhì)體Lipofectamine3000與200μLOpti-MEM培養(yǎng)基混勻，得到脂質(zhì)體稀釋液。室溫下靜置5分鐘后，將核酸稀釋液與脂質(zhì)體稀釋液充分混合，輕輕顛倒混勻，室溫孵育15-20分鐘，使脂質(zhì)體與核酸形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。在轉(zhuǎn)染前，將6孔板中的培養(yǎng)基更換為無(wú)血清、無(wú)雙抗的Opti-MEM培養(yǎng)基，每孔加入1.6mL。然后，將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴加到6孔板的細(xì)胞中，輕輕搖晃6孔板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miR-584的表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。細(xì)胞增殖能力檢測(cè)采用CellCountingKit-8（CCK-8）法，該方法基于細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的WST-8還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量成正比，從而可通過(guò)檢測(cè)吸光度值間接反映細(xì)胞的增殖能力。具體操作如下：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并收集，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升[X]×10?個(gè)細(xì)胞，以每孔100μL的體積接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，向每孔加入10μLCCK-8試劑（Dojindo公司），輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。然后，使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照組，即只加入100μL培養(yǎng)基和10μLCCK-8試劑，用于校正背景吸光度。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線，分析過(guò)表達(dá)miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，本實(shí)驗(yàn)還采用了EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）細(xì)胞增殖檢測(cè)法。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。通過(guò)與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可使摻入EdU的DNA被特異性標(biāo)記，從而通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)增殖細(xì)胞的數(shù)量。具體操作步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔[X]×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，向每孔加入EdU工作液（終濃度為10μM），繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，使EdU充分摻入到增殖細(xì)胞的DNA中。然后，按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（RiboBio公司）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次；加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定30分鐘；棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次；加入0.5%TritonX-100通透液，室溫孵育10分鐘；棄去通透液，用PBS洗滌細(xì)胞3次；加入Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30分鐘；棄去Click反應(yīng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次；最后，加入Hoechst33342染液（終濃度為1μg/mL），室溫避光孵育10分鐘，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，以此評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。通過(guò)上述嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，綜合運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)、CCK-8法和EdU法，旨在全面、準(zhǔn)確地探究過(guò)表達(dá)miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)48小時(shí)的轉(zhuǎn)染，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在HCT116細(xì)胞中，miR-584mimics轉(zhuǎn)染組的miR-584表達(dá)水平相較于miR-NCmimics對(duì)照組顯著上調(diào)，約為對(duì)照組的[X]倍（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，miR-584mimics轉(zhuǎn)染組的miR-584表達(dá)水平同樣顯著高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的[X]倍（P<0.01）（圖2A）。這表明miR-584mimics成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入結(jié)直腸癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了miR-584的過(guò)表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-NCmimics對(duì)照組細(xì)胞的吸光度值（OD值）逐漸升高，表明細(xì)胞持續(xù)增殖。而miR-584mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組。培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，miR-NCmimics對(duì)照組的OD值為[X]，miR-584mimics轉(zhuǎn)染組的OD值為[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)，對(duì)照組OD值為[X]，轉(zhuǎn)染組OD值為[X]，差異更為顯著（P<0.01）；培養(yǎng)72小時(shí)時(shí)，對(duì)照組OD值達(dá)到[X]，轉(zhuǎn)染組OD值僅為[X]，兩組差異極顯著（P<0.001）（圖2B）。在SW480細(xì)胞中，也觀察到類(lèi)似的結(jié)果。miR-NCmimics對(duì)照組細(xì)胞的OD值隨時(shí)間上升明顯，而miR-584mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值增長(zhǎng)緩慢，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)染組OD值分別為[X]、[X]、[X]，均顯著低于對(duì)照組的[X]、[X]、[X]（P<0.05，P<0.01，P<0.001）（圖2B）。根據(jù)這些OD值繪制的細(xì)胞增殖曲線清晰地顯示，miR-584mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖速度明顯低于miR-NCmimics對(duì)照組，表明過(guò)表達(dá)miR-584能夠顯著抑制HCT116和SW480細(xì)胞的增殖。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。在熒光顯微鏡下觀察，HCT116細(xì)胞中，miR-NCmimics對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光標(biāo)記）數(shù)量較多，細(xì)胞核（藍(lán)色熒光標(biāo)記）密集分布；而miR-584mimics轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。通過(guò)對(duì)5個(gè)隨機(jī)視野的統(tǒng)計(jì)分析，miR-NCmimics對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例為[X]%，miR-584mimics轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例僅為[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖2C）。在SW480細(xì)胞中，同樣發(fā)現(xiàn)miR-584mimics轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例（[X]%）顯著低于miR-NCmimics對(duì)照組（[X]%）（P<0.01）（圖2C）。這表明過(guò)表達(dá)miR-584能夠有效減少結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖細(xì)胞數(shù)量，抑制細(xì)胞增殖。綜上所述，無(wú)論是CCK-8實(shí)驗(yàn)還是EdU實(shí)驗(yàn)，均一致表明過(guò)表達(dá)miR-584能夠顯著抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480的增殖能力。[此處插入圖2，展示過(guò)表達(dá)miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，A為轉(zhuǎn)染后miR-584表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，B為CCK-8實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖曲線，C為EdU實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡照片及陽(yáng)性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果]4.1.3結(jié)果討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-584能夠顯著抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480的增殖能力，這一發(fā)現(xiàn)具有重要的生物學(xué)意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。從生物學(xué)角度來(lái)看，細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵過(guò)程之一。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞的增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡，以維持組織和器官的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，這種平衡被打破，腫瘤細(xì)胞獲得了不受控制的增殖能力。miR-584作為一種內(nèi)源性的非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而調(diào)控基因表達(dá)。本研究中，過(guò)表達(dá)miR-584后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，提示miR-584可能通過(guò)靶向調(diào)控某些與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的基因，參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖過(guò)程。已有研究表明，在其他腫瘤中，miR-584可以通過(guò)靶向作用于細(xì)胞周期蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶等基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。在結(jié)直腸癌中，雖然具體的靶基因尚未完全明確，但推測(cè)miR-584可能通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制發(fā)揮作用。例如，miR-584可能靶向抑制某些促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的基因，如CyclinD1、CyclinE等，使細(xì)胞周期阻滯在特定階段，從而抑制細(xì)胞增殖；或者通過(guò)抑制某些與細(xì)胞增殖信號(hào)通路相關(guān)的基因，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，阻斷細(xì)胞增殖信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。深入研究miR-584在結(jié)直腸癌中的具體作用機(jī)制，對(duì)于揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。從臨床應(yīng)用角度考慮，結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤，目前的治療方法仍存在諸多局限性。尋找新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物對(duì)于改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖具有抑制作用，提示miR-584可能成為結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)開(kāi)發(fā)針對(duì)miR-584的治療策略，如設(shè)計(jì)miR-584mimics類(lèi)似物或基因治療載體，將其導(dǎo)入結(jié)直腸癌細(xì)胞中，恢復(fù)miR-584的正常表達(dá)水平，有望抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，達(dá)到治療結(jié)直腸癌的目的。此外，由于miR-584在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的大小、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，因此miR-584還可能作為結(jié)直腸癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)患者血清或腫瘤組織中miR-584的表達(dá)水平，有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，并預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況，為臨床治療方案的制定提供重要參考依據(jù)。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本實(shí)驗(yàn)僅在體外細(xì)胞系中進(jìn)行，雖然能夠初步揭示miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，但體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境與體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境存在差異，需要進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，以驗(yàn)證miR-584在體內(nèi)的生物學(xué)功能和治療效果。其次，雖然本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-584能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，但miR-584的具體靶基因和作用機(jī)制尚未完全闡明，需要進(jìn)一步運(yùn)用生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，深入研究miR-584的作用靶點(diǎn)和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，在將miR-584作為治療靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床之前，還需要解決一些技術(shù)和安全性問(wèn)題，如如何高效地將miR-584導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，以及如何避免其可能帶來(lái)的不良反應(yīng)等。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-584能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，為深入研究miR-584在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制提供了重要線索，也為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。但仍需進(jìn)一步深入研究，以解決目前存在的問(wèn)題，為結(jié)直腸癌的臨床治療帶來(lái)新的突破。4.2抑制miR-584表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了深入研究抑制miR-584表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)選用前期實(shí)驗(yàn)中對(duì)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞特性綜合評(píng)估后，確定的適宜實(shí)驗(yàn)的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480作為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，以保證細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染是實(shí)現(xiàn)miR-584表達(dá)抑制的關(guān)鍵步驟。將HCT116和SW480細(xì)胞分別以每孔[X]×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約為60%-70%時(shí)，開(kāi)展轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染試劑選用具有高效轉(zhuǎn)染能力和低細(xì)胞毒性的脂質(zhì)體Lipofectamine3000（Invitrogen公司）。實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-584inhibitor（購(gòu)自RiboBio公司，其序列經(jīng)過(guò)專業(yè)設(shè)計(jì)，能夠特異性地抑制miR-584的表達(dá)），對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照抑制劑（miR-NCinhibitor，同樣購(gòu)自RiboBio公司，其序列與miR-584無(wú)關(guān)，用于排除非特異性干擾）。具體轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格遵循脂質(zhì)體Lipofectamine3000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：首先，將適量的miR-584inhibitor或miR-NCinhibitor分別與200μLOpti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）輕柔混合均勻，得到核酸稀釋液；同時(shí)，將適量的脂質(zhì)體Lipofectamine3000與200μLOpti-MEM培養(yǎng)基混合，獲得脂質(zhì)體稀釋液。室溫下靜置5分鐘后，將核酸稀釋液與脂質(zhì)體稀釋液充分混勻，輕輕顛倒混勻，室溫孵育15-20分鐘，促使脂質(zhì)體與核酸形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。在轉(zhuǎn)染前，將6孔板中的培養(yǎng)基更換為無(wú)血清、無(wú)雙抗的Opti-MEM培養(yǎng)基，每孔加入1.6mL。然后，將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴加到6孔板的細(xì)胞中，輕輕搖晃6孔板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miR-584的表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。細(xì)胞增殖能力檢測(cè)采用CellCountingKit-8（CCK-8）法，該方法利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的WST-8還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過(guò)檢測(cè)吸光度值可間接反映細(xì)胞的增殖能力。具體操作如下：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并收集，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升[X]×10?個(gè)細(xì)胞，以每孔100μL的體積接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，向每孔加入10μLCCK-8試劑（Dojindo公司），輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。然后，使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照組，即只加入100μL培養(yǎng)基和10μLCCK-8試劑，用于校正背景吸光度。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線，分析抑制miR-584表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)還采用了EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）細(xì)胞增殖檢測(cè)法。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。通過(guò)與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可使摻入EdU的DNA被特異性標(biāo)記，從而通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)增殖細(xì)胞的數(shù)量。具體操作步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔[X]×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，向每孔加入EdU工作液（終濃度為10μM），繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，使EdU充分摻入到增殖細(xì)胞的DNA中。然后，按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（RiboBio公司）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次；加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定30分鐘；棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次；加入0.5%TritonX-100通透液，室溫孵育10分鐘；棄去通透液，用PBS洗滌細(xì)胞3次；加入Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30分鐘；棄去Click反應(yīng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次；最后，加入Hoechst33342染液（終濃度為1μg/mL），室溫避光孵育10分鐘，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，以此評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。通過(guò)上述精心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，綜合運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)、CCK-8法和EdU法，旨在全面、準(zhǔn)確地探究抑制miR-584表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)48小時(shí)的轉(zhuǎn)染，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在HCT116細(xì)胞中，miR-584inhibitor轉(zhuǎn)染組的miR-584表達(dá)水平相較于miR-NCinhibitor對(duì)照組顯著下調(diào)，約為對(duì)照組的[X]%（P<0.01）；在SW480細(xì)胞中，miR-584inhibitor轉(zhuǎn)染組的miR-584表達(dá)水平同樣顯著低于對(duì)照組，約為對(duì)照組的[X]%（P<0.01）（圖3A）。這表明miR-584inhibitor成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入結(jié)直腸癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了miR-584表達(dá)的有效抑制。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-NCinhibitor對(duì)照組細(xì)胞的吸光度值（OD值）逐漸升高，表明細(xì)胞持續(xù)增殖。而miR-584inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組。培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，miR-NCinhibitor對(duì)照組的OD值為[X]，miR-584inhibitor轉(zhuǎn)染組的OD值為[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)，對(duì)照組OD值為[X]，轉(zhuǎn)染組OD值為[X]，差異更為顯著（P<0.01）；培養(yǎng)72小時(shí)時(shí)，對(duì)照組OD值達(dá)到[X]，轉(zhuǎn)染組OD值高達(dá)[X]，兩組差異極顯著（P<0.001）（圖3B）。在SW480細(xì)胞中，也觀察到類(lèi)似的結(jié)果。miR-NCinhibitor對(duì)照組細(xì)胞的OD值隨時(shí)間上升明顯，而miR-584inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值增長(zhǎng)更為迅速，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)染組OD值分別為[X]、[X]、[X]，均顯著高于對(duì)照組的[X]、[X]、[X]（P<0.05，P<0.01，P<0.001）（圖3B）。根據(jù)這些OD值繪制的細(xì)胞增殖曲線清晰地顯示，miR-584inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖速度明顯高于miR-NCinhibitor對(duì)照組，表明抑制miR-584表達(dá)能夠顯著促進(jìn)HCT116和SW480細(xì)胞的增殖。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。在熒光顯微鏡下觀察，HCT116細(xì)胞中，miR-584inhibitor轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光標(biāo)記）數(shù)量較多，細(xì)胞核（藍(lán)色熒光標(biāo)記）密集分布；而miR-NCinhibitor對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯較少。通過(guò)對(duì)5個(gè)隨機(jī)視野的統(tǒng)計(jì)分析，miR-584inhibitor轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例為[X]%，miR-NCinhibitor對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例僅為[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖3C）。在SW480細(xì)胞中，同樣發(fā)現(xiàn)miR-584inhibitor轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例（[X]%）顯著高于miR-NCinhibitor對(duì)照組（[X]%）（P<0.01）（圖3C）。這表明抑制miR-584表達(dá)能夠有效增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞增殖。綜上所述，無(wú)論是CCK-8實(shí)驗(yàn)還是EdU實(shí)驗(yàn)，均一致表明抑制miR-584表達(dá)能夠顯著促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480的增殖能力。[此處插入圖3，展示抑制miR-584表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，A為轉(zhuǎn)染后miR-584表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，B為CCK-8實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖曲線，C為EdU實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡照片及陽(yáng)性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果]4.2.3結(jié)果討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制miR-584表達(dá)能夠顯著促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480的增殖能力，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步揭示了miR-584在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用，為深入理解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。從分子生物學(xué)機(jī)制角度來(lái)看，miR-584作為一種內(nèi)源性的非編碼RNA，主要通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而調(diào)控基因表達(dá)。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的miR-584維持在一定的表達(dá)水平，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。然而，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miR-584的表達(dá)水平發(fā)生異常變化。本研究中抑制miR-584表達(dá)后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，提示miR-584可能通過(guò)靶向抑制某些促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因來(lái)發(fā)揮作用。已有研究表明，在其他腫瘤中，miR-584可以通過(guò)靶向作用于細(xì)胞周期蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶等基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。在結(jié)直腸癌中，雖然具體的靶基因尚未完全明確，但推測(cè)miR-584可能靶向抑制某些細(xì)胞周期相關(guān)基因，如CyclinD1、CyclinE等，這些基因在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)miR-584表達(dá)受到抑制時(shí)，其對(duì)這些靶基因的抑制作用減弱，導(dǎo)致靶基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期進(jìn)程加速，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。此外，miR-584還可能通過(guò)抑制某些與細(xì)胞增殖信號(hào)通路相關(guān)的基因，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，來(lái)調(diào)控細(xì)胞增殖。抑制miR-584表達(dá)后，這些信號(hào)通路可能被激活，細(xì)胞增殖信號(hào)得以傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。深入研究miR-584在結(jié)直腸癌中的具體作用機(jī)制，對(duì)于揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。從臨床應(yīng)用角度考慮，結(jié)直腸癌的治療目前仍面臨諸多挑戰(zhàn)，尋找新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物對(duì)于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-584表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，提示miR-584可能成為結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)開(kāi)發(fā)針對(duì)miR-584的治療策略，如設(shè)計(jì)miR-584激動(dòng)劑或基因治療載體，恢復(fù)miR-584在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的正常表達(dá)水平，有望抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，達(dá)到治療結(jié)直腸癌的目的。此外，由于miR-584在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的大小、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，因此miR-584還可能作為結(jié)直腸癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)患者血清或腫瘤組織中miR-584的表達(dá)水平，有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，并預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況，為臨床治療方案的制定提供重要參考依據(jù)。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本實(shí)驗(yàn)僅在體外細(xì)胞系中進(jìn)行，雖然能夠初步揭示抑制miR-584表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，但體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境與體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境存在差異，需要進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，以驗(yàn)證miR-584在體內(nèi)的生物學(xué)功能和治療效果。其次，雖然本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-584表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，但miR-584的具體靶基因和作用機(jī)制尚未完全闡明，需要進(jìn)一步運(yùn)用生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，深入研究miR-584的作用靶點(diǎn)和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，在將miR-584作為治療靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床之前，還需要解決一些技術(shù)和安全性問(wèn)題，如如何高效地將miR-584導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，以及如何避免其可能帶來(lái)的不良反應(yīng)等。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-584表達(dá)能夠顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，為深入研究miR-584在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制提供了重要線索，也為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。但仍需進(jìn)一步深入研究，以解決目前存在的問(wèn)題，為結(jié)直腸癌的臨床治療帶來(lái)新的突破。五、miR-584影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究5.1miR-584對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制5.1.1對(duì)細(xì)胞周期分布的影響為深入探究miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期分布的影響，本實(shí)驗(yàn)選取人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480作為研究對(duì)象。在實(shí)驗(yàn)前期，將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將HCT116和SW480細(xì)胞分別以每孔[X]×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約為60%-70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染試劑選用脂質(zhì)體Lipofectamine3000（Invitrogen公司），實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-584mimics以過(guò)表達(dá)miR-584，對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR-NCmimics作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。具體操作步驟如下：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量的胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓脫壁后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打使細(xì)胞重懸，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞在1000rpm下離心5分鐘，棄去乙醇，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。加入500μL的PI染色液（含50μg/mL碘化丙啶、0.1%TritonX-100、100μg/mLRNaseA），輕輕混勻，37℃避光孵育30分鐘。最后，使用流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）檢測(cè)細(xì)胞周期分布，每個(gè)樣本檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，采用ModFitLT軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，miR-NCmimics對(duì)照組處于G0/G1期的細(xì)胞比例為[X1]%，S期細(xì)胞比例為[X2]%，G2/M期細(xì)胞比例為[X3]%；而miR-584mimics轉(zhuǎn)染組處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加至[X4]%（P<0.01），S期細(xì)胞比例明顯下降至[X5]%（P<0.01），G2/M期細(xì)胞比例為[X6]%，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）（圖4A）。在SW480細(xì)胞中，也觀察到類(lèi)似的結(jié)果。miR-NCmimics對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例為[X7]%，S期細(xì)胞比例為[X8]%，G2/M期細(xì)胞比例為[X9]%；miR-584mimics轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞比例增加至[X10]%（P<0.01），S期細(xì)胞比例下降至[X11]%（P<0.01），G2/M期細(xì)胞比例為[X12]%，與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（P>0.05）（圖4A）。上述結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-584能夠使結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW480阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制細(xì)胞增殖。[此處插入圖4，展示過(guò)表達(dá)miR-584對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期分布的影響，A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖，B為各周期細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)柱狀圖]5.1.2對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的作用細(xì)胞周期的有序進(jìn)行受到多種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的精密調(diào)控，為了進(jìn)一步探究miR-584影響結(jié)直腸癌細(xì)胞周期和增殖的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P21、CyclinD1等的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)仍選用人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480，轉(zhuǎn)染方法同5.1.1節(jié)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)P21、CyclinD1蛋白的表達(dá)水平。具體步驟如下：收集細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不時(shí)振蕩。12000rpm、4℃離心15分鐘，收集上清液，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（ThermoFisherScientific）測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白分離后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore）上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將PVDF膜與一抗（兔抗人P21抗體、兔抗人CyclinD1抗體，均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，稀釋比例為1:1000）在4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司，稀釋比例為1:5000）室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECLPlus，GEHealthcare）進(jìn)行顯影，利用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+）采集圖像，并通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin（鼠抗人β-actin抗體，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，稀釋比例為1:5000）作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCT116細(xì)胞中，與miR-NCmimics對(duì)照組相比，miR-584mimics轉(zhuǎn)染組的P21蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，約為對(duì)照組的[X]倍（P<0.01）；而CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)，約為對(duì)照組的[X]%（P<0.01）（圖4B）。在SW480細(xì)胞中，同樣觀察到miR-584mimics轉(zhuǎn)染組P21蛋白表達(dá)上調(diào)，約為對(duì)照組的[X]倍（P<0.01），CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)，約為對(duì)照組的[X]%（P<0.01）（圖4B）。P21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI），它能夠與細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物（Cyclin-CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。CyclinD1是細(xì)胞周