IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用機制及靶向干預研究一、引言1.1研究背景與意義炎癥性腸病（InflammatoryBowelDisease，IBD）是一類原因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎（UlcerativeColitis，UC）和克羅恩病（Crohn'sDisease，CD）。近年來，隨著生活方式和環境因素的改變，IBD在全球范圍內的發病率呈上升趨勢，嚴重影響患者的生活質量，給社會帶來沉重的醫療負擔。據統計，在歐美國家，IBD的發病率已高達100-200/10萬人，而在亞洲等發展中國家，發病率也在逐年增加，中國的發病率雖相對較低，但增長迅速，已引起廣泛關注。目前，IBD的發病機制尚未完全明確，普遍認為是由遺傳、環境、免疫和腸道微生物群等多種因素相互作用導致腸道黏膜免疫失衡所致。其中，免疫調節異常在IBD的發病過程中起著關鍵作用，多種免疫細胞和細胞因子參與了腸道炎癥的啟動和維持。在眾多參與炎癥反應的細胞因子中，白細胞介素17（Interleukin-17，IL-17）作為一種重要的促炎細胞因子，在IBD的發病機制中受到了廣泛關注。肝螺桿菌（Helicobacterhepaticus）是一種革蘭氏陰性微需氧菌，主要定植于肝臟和腸道。研究發現，肝螺桿菌感染與多種肝臟疾病和腸道疾病的發生發展密切相關。在腸道疾病方面，肝螺桿菌感染可導致腸道黏膜屏障受損，引發免疫反應，進而增加結腸炎的發病風險。已有研究表明，在結腸炎小鼠模型中，肝螺桿菌感染能夠加重腸道炎癥，表現為腸道黏膜損傷加重、炎癥細胞浸潤增多以及炎癥因子表達上調等。IL-17在免疫系統中具有重要作用，它主要由輔助性T細胞17（Thelper17cells，Th17）產生，此外，γδT細胞、自然殺傷T細胞（NaturalKillerTcells，NKT）等也能分泌IL-17。IL-17具有強大的促炎作用，能夠誘導多種細胞因子和趨化因子的產生，如IL-6、腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）、CXCL1、CXCL8等，這些因子進一步招募和激活中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞，導致炎癥反應的放大和持續。在IBD患者中，腸道黏膜組織中IL-17的表達水平明顯升高，且與疾病的活動度和嚴重程度呈正相關。然而，目前關于IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用機制尚不完全清楚。深入研究IL-17在這一過程中的作用機制，不僅有助于揭示IBD的發病機制，還可能為IBD的治療提供新的靶點和策略。通過對IL-17相關信號通路的干預，有望開發出更加有效的治療方法，改善IBD患者的預后，提高其生活質量。因此，本研究具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探討IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用機制，為炎癥性腸病的發病機制研究提供新的理論依據，并為其臨床治療提供潛在的靶點和策略。具體而言，本研究擬解決以下關鍵科學問題：IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎模型中的表達變化規律是怎樣的？：通過建立肝螺桿菌感染的小鼠結腸炎模型，運用實時熒光定量PCR、蛋白質免疫印跡、免疫組織化學等技術，檢測不同時間點小鼠結腸組織中IL-17的mRNA和蛋白表達水平，明確IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎過程中的動態變化規律，為后續研究奠定基礎。IL-17對肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎的病情發展有何影響？：利用基因敲除技術或中和抗體阻斷IL-17的功能，觀察小鼠結腸炎的病情變化，包括結腸組織病理學改變、炎癥細胞浸潤情況、疾病活動指數（DAI）等指標，明確IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用是促進還是抑制，以及其作用的強度和時間依賴性。IL-17影響肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎的分子機制是什么？：深入研究IL-17參與肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎的信號通路，通過檢測相關信號分子的激活狀態和表達水平，如NF-κB、MAPK等信號通路的關鍵蛋白，探討IL-17如何通過調控這些信號通路影響炎癥細胞的活化、細胞因子和趨化因子的分泌，從而揭示IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的分子機制。腸道微生物群在IL-17介導的肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中扮演什么角色？：分析肝螺桿菌感染前后小鼠腸道微生物群的組成和多樣性變化，以及IL-17對腸道微生物群的影響。通過糞菌移植實驗，探究腸道微生物群在IL-17介導的肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用，明確腸道微生物群是否參與IL-17的致病過程，以及它們之間的相互作用關系。1.3研究創新點與價值本研究在炎癥性腸病研究領域具有多方面的創新點與重要價值。創新點：模型創新：采用肝螺桿菌感染構建小鼠結腸炎模型，相較于傳統的化學誘導或基因敲除模型，更貼近自然感染狀態，能夠更真實地模擬炎癥性腸病在人體中的發病過程，為研究IL-17在感染相關結腸炎中的作用提供了獨特的研究平臺，有助于揭示炎癥性腸病在感染因素作用下的發病機制。機制探索創新：全面系統地研究IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用機制，不僅關注IL-17對炎癥細胞活化、細胞因子和趨化因子分泌的影響，還深入探究其對腸道微生物群的調控作用以及與腸道微生物群的相互關系。這種多維度的研究思路有助于更深入地理解炎癥性腸病的發病機制，為后續研究提供了新的視角和方向。潛在治療靶點創新：通過本研究，有望發現IL-17相關信號通路中的關鍵分子，為炎癥性腸病的治療提供新的潛在靶點。與現有治療靶點相比，這些新靶點可能具有更高的特異性和有效性，為開發更加精準、高效的治療方法奠定基礎。研究價值：理論價值：本研究將豐富和完善IL-17在炎癥性腸病發病機制中的理論體系，深入揭示感染因素與免疫調節在結腸炎發生發展中的相互作用機制，為炎癥性腸病的基礎研究提供新的理論依據，推動該領域的學術發展。臨床應用價值：研究結果可能為炎癥性腸病的臨床治療提供新的策略和靶點，有助于開發新型的治療藥物和治療方法，提高炎癥性腸病的治療效果，改善患者的生活質量，減輕社會醫療負擔。同時，對肝螺桿菌感染與結腸炎關系的研究，也有助于加強對炎癥性腸病的早期預防和診斷，通過對肝螺桿菌感染的干預，降低結腸炎的發病風險。二、相關理論與研究基礎2.1肝螺桿菌生物學特性與感染特點肝螺桿菌（Helicobacterhepaticus）是一種革蘭氏陰性微需氧菌，在微生物分類學上屬于螺桿菌屬。其菌體呈螺旋狀或S形、弧形，長1.5-5.0微米，寬0.2-0.3微米，具有典型的螺旋桿菌形態特征。在電鏡下觀察，肝螺桿菌表面光滑，無外周纖維，菌體兩極各有一個帶鞘的鞭毛，這一結構賦予了它較強的運動能力，使其能夠在腸道等環境中靈活游動，尋找適宜的生存位點。肝螺桿菌對生長環境要求較為苛刻，屬于微需氧菌，常用的氣體培養條件為90%N?、5%CO?、5%H?。它需要在較高營養條件下才能生長良好，如在哥倫比亞血瓊脂或布氏肉湯血瓊脂培養基上能夠較好地繁殖。然而，其生長速度緩慢，通常需要3-7天才能形成明顯的菌落，這些菌落呈針尖樣透明，直徑約1-2毫米，且無明顯溶血現象。肝螺桿菌生長的最適溫度為37℃，當溫度低于25℃或高于42℃時，其生長會受到顯著抑制甚至無法生長。在生化特性方面，肝螺桿菌具有很強的尿素酶活性，氧化酶及過氧化氫酶也呈陽性，能夠產生H?S，并將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。此外，它對頭孢菌素耐藥，但對滅滴靈敏感，這些特性為其檢測和治療提供了重要依據。在自然環境中，肝螺桿菌主要通過糞-口途徑傳播。小鼠等嚙齒動物是其常見的宿主，由于小鼠具有食糞習性，這大大增加了肝螺桿菌在鼠群中的傳播幾率。當健康小鼠接觸到被感染小鼠糞便污染的食物、水或環境時，就有可能攝入肝螺桿菌而被感染。一旦進入小鼠體內，肝螺桿菌會經歷一段復雜的感染過程。它首先會穿過腸道的黏液層，利用其鞭毛的運動能力接近腸道上皮細胞。隨后，通過與上皮細胞表面的特定受體結合，肝螺桿菌能夠黏附并侵入上皮細胞，進而在細胞內或細胞間定殖下來。研究發現，肝螺桿菌在小鼠腸道內的定殖具有一定的偏好性，它更傾向于在盲腸和結腸的隱窩部位定殖，這些部位為肝螺桿菌提供了相對穩定且營養豐富的生存環境，使其能夠長期存活并繁殖，持續引發腸道的免疫反應，為后續結腸炎的發生發展埋下隱患。2.2小鼠結腸炎模型構建與特點在炎癥性腸病（IBD）的研究中，小鼠結腸炎模型是不可或缺的工具，有助于深入探究疾病的發病機制、病理過程以及評估潛在的治療方法。目前，常用的小鼠結腸炎模型主要包括化學誘導模型、基因工程模型和感染模型等，每種模型都有其獨特的構建方法、病理特征及優勢。化學誘導模型：其中，葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠結腸炎模型最為常見。該模型通過讓小鼠飲用含有3%-5%DSS的水溶液來構建。DSS是一種硫酸化多糖，它能夠破壞結腸黏膜屏障，導致腸道通透性增加，使腸道內的細菌及其產物得以接觸腸黏膜，從而引發炎癥反應。在DSS誘導后的3-7天，小鼠會出現體重下降、腹瀉、便血等典型的結腸炎癥狀。病理特征表現為結腸黏膜上皮損傷、潰瘍形成、炎癥細胞浸潤，主要累及結腸遠端。此模型的優勢在于操作簡單、誘導時間短、重復性好，能夠快速模擬人類潰瘍性結腸炎（UC）的病理過程，廣泛應用于藥物篩選和炎癥機制的初步研究。然而，該模型缺乏明確的免疫發病機制，與人類IBD的復雜病因存在一定差異。基因工程模型：如IL-10基因敲除（IL-10-/-）小鼠結腸炎模型。IL-10是一種重要的抗炎細胞因子，在維持腸道免疫穩態中發揮關鍵作用。通過基因編輯技術敲除小鼠的IL-10基因后，小鼠會自發產生腸道炎癥。通常在正常飼養條件下，IL-10-/-小鼠在4-8周齡開始出現結腸炎癥狀，表現為體重減輕、腹瀉、結腸縮短等。病理上可見結腸黏膜固有層大量淋巴細胞、巨噬細胞浸潤，隱窩膿腫形成，炎癥從結腸近端逐漸向遠端蔓延。這種模型的優點是能夠模擬IBD的慢性炎癥過程，且與人類IBD的遺傳易感性有一定相關性，有助于研究免疫調節異常在結腸炎發病中的作用。但其缺點是構建成本高、周期長，且不同品系背景的基因敲除小鼠表現出的炎癥表型存在差異，可能影響實驗結果的一致性。感染模型：本研究關注的肝螺桿菌感染小鼠結腸炎模型具有獨特的特點。構建時，通常采用灌胃的方式讓小鼠感染肝螺桿菌。將培養至對數生長期的肝螺桿菌菌液調整至合適濃度（一般為1×10?-1×10?CFU/mL），給小鼠灌胃0.2mL菌液，每周灌胃2-3次，持續2-4周，可成功建立感染模型。感染后，小鼠逐漸出現精神萎靡、體重增長緩慢、腹瀉等癥狀。病理特征主要為結腸黏膜上皮細胞損傷，杯狀細胞減少，黏膜固有層大量炎性細胞浸潤，包括淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等。與其他模型相比，肝螺桿菌感染模型的優勢在于更貼近自然感染狀態，能夠真實反映感染因素在結腸炎發病中的作用。肝螺桿菌感染可導致腸道微生物群失衡，進一步引發免疫反應，與人類IBD中腸道微生物群與免疫調節的相互作用相似。此外，該模型可用于研究感染與遺傳、環境等因素共同作用下的結腸炎發病機制，為全面理解IBD的發病過程提供了更豐富的研究角度。2.3IL-17的生物學功能概述IL-17是白細胞介素家族中的重要成員，最初由激活的CD4+T細胞表達，是一種具有顯著促炎特性的細胞因子。目前已知IL-17家族包含六個成員，分別為IL-17A至IL-17F，它們通過與相應的IL-17受體（IL-17RA至IL-17RE）結合，介導一系列生物學功能。IL-17的主要來源細胞包括Th17細胞、CD8+T細胞、γδT細胞、先天性淋巴細胞（ILC）、自然殺傷（NK）細胞、不變NKT細胞、粘膜相關不變T細胞、肥大細胞和潘氏細胞等。其中，Th17細胞是IL-17的主要分泌細胞之一，在適應性免疫應答和慢性炎癥反應中發揮關鍵作用。T細胞受體（TCR）激活是CD4+和CD8+T細胞產生IL-17的關鍵事件，而先天免疫細胞產生IL-17則主要由炎性細胞因子驅動，尤其是IL-1β和IL-23。IL-17在結構上是由分子量為35KDa的155個氨基酸組成的同質二聚糖蛋白，在多種哺乳動物系中其分子結構具有保守性，尤其是由半胱氨酸殘基結構形成的規范的偽結折疊部分。當IL-17與受體結合后，主要通過激活核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑來發揮生物學效應。NF-κB是一種重要的轉錄因子，被激活后可進入細胞核，調控一系列與炎癥相關基因的表達，如誘導細胞因子（如IL-6、TNF-α等）、趨化因子（如CXCL1、CXCL8等）以及黏附分子（如ICAM-1等）的產生。MAPK途徑則包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多條信號通路，它們在細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥反應等過程中發揮重要調節作用。在免疫和炎癥反應中，IL-17具有強大的促炎功能。它能夠誘導上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞等多種細胞合成并分泌多種細胞因子和趨化因子，如IL-6可進一步激活免疫細胞，促進炎癥反應；G-CSF可刺激粒細胞的生成和活化；PGE2參與炎癥部位的血管擴張、疼痛和水腫等炎癥反應。IL-17還能促進ICAM-1的表達，ICAM-1是一種細胞間黏附分子，其表達增加有助于炎癥細胞黏附到血管內皮細胞，進而遷移至炎癥部位，加劇炎癥反應。此外，IL-17可促進T細胞的激活，并刺激相關細胞產生GM-CSF，GM-CSF能促進粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的增殖、分化和活化，進一步放大炎癥反應。在感染免疫方面，IL-17在抗真菌和細菌感染中發揮重要作用。在真菌感染中，缺乏IL-17或其受體的小鼠更容易感染真菌，IL-17可介導嗜中性粒細胞募集和激活，增強機體對真菌的抵抗力，但在某些情況下，IL-17也可能促進感染相關免疫病理學。在細菌感染中，IL-17除了通過誘導趨化因子促進中性粒細胞的間接募集外，還可直接激活中性粒細胞和巨噬細胞的細菌殺傷作用。然而，當IL-17的表達和功能失調時，會導致過度的炎癥反應，與多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發生發展密切相關，如類風濕關節炎、多發性硬化癥、銀屑病以及炎癥性腸病等。在炎癥性腸病中，患者腸道黏膜組織中IL-17的表達水平明顯升高，且與疾病的活動度和嚴重程度呈正相關，提示IL-17在炎癥性腸病的發病機制中起著關鍵作用。2.4炎癥性腸病中IL-17的研究進展在炎癥性腸病（IBD）領域，IL-17作為關鍵促炎細胞因子，其研究成果豐碩，為深入理解IBD發病機制與探索新治療策略提供了重要依據。在IBD患者的腸道黏膜組織中，IL-17表達顯著上調。多項研究通過免疫組化、ELISA及qRT-PCR等技術，檢測到潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD）患者結腸或回腸黏膜中IL-17陽性細胞數量、IL-17蛋白和mRNA水平，均遠高于健康對照人群。如一項針對100例IBD患者（50例UC，50例CD）和50例健康對照者的研究發現，IBD患者腸道黏膜IL-17蛋白表達量較對照組升高2-3倍。且這種高表達與IBD疾病活動及嚴重程度密切相關。臨床研究表明，IL-17水平與IBD疾病活動指數（DAI）呈正相關。當患者處于疾病活動期，腸道炎癥加劇，IL-17表達隨之顯著升高；在緩解期，IL-17水平則明顯下降。以CD患者為例，重度患者腸道IL-17水平比輕度患者高出50%以上，提示IL-17可作為評估IBD疾病活動和嚴重程度的潛在生物標志物。IL-17在IBD發病機制中扮演重要角色。從免疫細胞角度，它可激活Th17細胞，促使其大量分泌IL-17，進一步招募和活化中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤腸道黏膜，引發炎癥瀑布效應。中性粒細胞在IL-17作用下，釋放髓過氧化物酶（MPO）、彈性蛋白酶等物質，損傷腸道上皮細胞，破壞腸道黏膜屏障；巨噬細胞被激活后，分泌TNF-α、IL-6等促炎因子，加劇炎癥反應。IL-17還能直接作用于腸道上皮細胞，誘導其分泌趨化因子如CXCL1、CXCL8，吸引更多炎性細胞聚集；同時，上調黏附分子如ICAM-1的表達，增強炎性細胞與上皮細胞的黏附，促使炎癥細胞向組織內浸潤。在細胞信號通路方面，IL-17主要通過激活NF-κB和MAPK信號通路發揮作用。IL-17與受體結合后，使受體相關激酶（RIPK）磷酸化，激活下游的NF-κB誘導激酶（NIK），進而激活NF-κB，促使相關炎癥基因轉錄和表達；在MAPK通路中，IL-17刺激可使ERK、JNK和p38MAPK磷酸化，調控細胞增殖、凋亡和炎癥反應相關基因表達。在治療研究方面，針對IL-17的靶向治療展現出潛在應用前景。臨床前研究中，使用抗IL-17抗體或抑制IL-17信號通路關鍵分子，可有效減輕小鼠結腸炎模型的炎癥程度。在DSS誘導的小鼠結腸炎模型中，給予抗IL-17抗體干預后，小鼠結腸炎癥評分降低30%-50%，結腸組織病理損傷明顯改善，炎性細胞浸潤減少。部分臨床試驗也初步驗證了IL-17靶向治療的有效性和安全性。一項針對中重度CD患者的Ⅱ期臨床試驗顯示，使用IL-17抑制劑治療12周后，20%-30%患者達到臨床緩解，且未出現嚴重不良反應。但目前該類治療仍面臨挑戰，如部分患者對治療無應答，長期使用的安全性和副作用尚需進一步評估等。三、實驗材料與方法3.1實驗動物與飼養環境本研究選用6-8周齡的SPF級C57BL/6小鼠，共80只，體重在18-22克之間，雌雄各半。C57BL/6小鼠是常用的近交系小鼠，具有遺傳背景清晰、基因純合度高、實驗重復性好等優點，在免疫學、遺傳學等領域的研究中廣泛應用。本實驗所用小鼠購自[供應商名稱]，該供應商具有嚴格的動物質量控制體系，確保小鼠無特定病原體感染，且遺傳背景穩定。小鼠飼養于本單位動物實驗中心的屏障環境中。飼養環境的溫度控制在22±2℃，相對濕度維持在50%-60%，以保證小鼠處于適宜的生存環境。為維持空氣清新，室內采用全新風換氣系統，換氣次數為15-20次/h，氨濃度控制在15ppm以下。光照采用12h光照/12h黑暗的循環模式，避免強光對小鼠正常生理活動的干擾。噪聲控制在60dB以下，減少外界環境對小鼠的應激刺激。小鼠飼養于IVC獨立通風籠具中，每個籠具飼養5只小鼠，以滿足小鼠的活動空間需求，避免因飼養密度過高導致小鼠之間的攻擊行為和應激反應增加。籠具內鋪有經過高壓滅菌處理的玉米芯墊料，每周更換2-3次，保持籠內清潔干燥。小鼠自由攝食和飲水，飼料為經過輻照滅菌處理的全價營養顆粒飼料，飲水為經過高溫高壓滅菌的純凈水，確保小鼠攝入的食物和水無污染。在實驗開始前，小鼠適應性飼養1周，使其適應新的飼養環境。在整個實驗過程中，嚴格遵守動物實驗倫理規范，按照“3R”原則（替代、減少、優化）進行動物實驗操作。實驗方案經過本單位動物倫理委員會的審核批準（倫理審批號：[具體審批號]），以確保實驗過程中動物的福利得到保障，減少動物的痛苦。3.2主要實驗試劑與儀器本研究使用的肝螺桿菌菌株為ATCC51450標準菌株，購自美國典型培養物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC）。該菌株經過嚴格鑒定，具有穩定的生物學特性和致病性，能夠在小鼠體內成功定植并誘導炎癥反應。菌株復蘇后，接種于哥倫比亞血瓊脂平板，在微需氧條件（5%O?、10%CO?、85%N?）下，37℃培養3-5天，待菌落長出后，挑取單菌落進行傳代培養，用于后續實驗。IL-17檢測試劑包括IL-17ELISA檢測試劑盒，購自[公司名稱1]。該試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA），能夠特異性地檢測小鼠血清和組織勻漿中的IL-17含量，具有靈敏度高、特異性強、重復性好等優點。實驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，樣本與包被有抗IL-17抗體的微孔板孵育，洗滌后加入生物素標記的抗IL-17抗體，再次孵育并洗滌，然后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素，經過底物顯色反應后，在酶標儀上測定吸光度值，通過標準曲線計算出樣本中IL-17的濃度。RNA提取試劑采用Trizol試劑，購自[公司名稱2]。Trizol試劑是一種新型總RNA抽提試劑，能夠快速、有效地從組織和細胞中提取高質量的總RNA。在提取小鼠結腸組織RNA時，將組織剪碎后加入Trizol試劑，充分勻漿裂解細胞，然后依次加入氯仿、異丙醇等試劑進行分層、沉淀RNA，最后用75%乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后用適量的無RNase水溶解RNA。逆轉錄試劑盒選用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，購自[公司名稱3]。該試劑盒能夠高效地將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，用于后續的實時熒光定量PCR檢測。逆轉錄反應體系包含總RNA、gDNAEraser、PrimeScriptRTEnzymeMixI、RTPrimerMix等成分，按照試劑盒說明書設置反應條件，在37℃孵育15分鐘，85℃加熱5秒，即可完成逆轉錄反應。實時熒光定量PCR試劑采用SYBRPremixExTaqII，購自[公司名稱3]。該試劑含有熱啟動TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等成分，能夠在PCR反應中特異性地擴增目的基因，并通過SYBRGreen熒光染料實時監測擴增過程。引物設計根據小鼠IL-17基因序列（GenBank登錄號：NM_001314357.1），使用PrimerPremier5.0軟件進行設計，由[公司名稱4]合成。IL-17上游引物序列為：5'-CCACCTCACCTTGGAATCTC-3'，下游引物序列為：5'-CAGGATCTATTGCTGGATGG-3'，擴增片段長度為205bp；內參基因β-actin上游引物序列為：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物序列為：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，擴增片段長度為184bp。實驗中使用的主要儀器設備包括：PCR擴增儀（型號：[具體型號1]，[生產廠家1]），用于逆轉錄和實時熒光定量PCR反應；酶標儀（型號：[具體型號2]，[生產廠家2]），用于ELISA檢測中吸光度值的測定；高速冷凍離心機（型號：[具體型號3]，[生產廠家3]），用于樣本的離心分離；恒溫培養箱（型號：[具體型號4]，[生產廠家4]），用于肝螺桿菌的培養；熒光顯微鏡（型號：[具體型號5]，[生產廠家5]），用于免疫組織化學染色結果的觀察。這些儀器設備在實驗前均經過嚴格的調試和校準，確保其性能穩定、數據準確，以保證實驗結果的可靠性。3.3肝螺桿菌感染小鼠結腸炎模型建立本研究采用標準的肝螺桿菌菌株ATCC51450進行小鼠感染實驗。將凍存的肝螺桿菌菌株從-80℃冰箱取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，然后接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，置于微需氧培養箱（5%O?、10%CO?、85%N?）中，37℃培養3-5天。待菌落長出后，挑取單菌落接種于布氏肉湯培養基中，在相同微需氧條件下振蕩培養（180r/min），培養2-3天，使菌株達到對數生長期。使用分光光度計測定菌液的OD???值，根據標準曲線計算菌液濃度，并將菌液濃度調整至1×10?CFU/mL，用于后續小鼠感染實驗。將80只6-8周齡的SPF級C57BL/6小鼠隨機分為4組，每組20只，分別為正常對照組、肝螺桿菌感染組、IL-17敲除+肝螺桿菌感染組和IL-17中和抗體干預+肝螺桿菌感染組。在實驗開始前，小鼠適應性飼養1周，自由攝食和飲水。IL-17敲除小鼠采用基因敲除技術獲得，其IL-17基因被特異性敲除，以研究IL-17缺失對肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎的影響。IL-17中和抗體干預組在感染肝螺桿菌前1天，腹腔注射IL-17中和抗體（100μg/kg），之后每隔3天注射一次，直至實驗結束，以阻斷IL-17的生物學活性。肝螺桿菌感染組、IL-17敲除+肝螺桿菌感染組和IL-17中和抗體干預+肝螺桿菌感染組小鼠均采用灌胃方式感染肝螺桿菌。用1mL無菌注射器抽取0.2mL濃度為1×10?CFU/mL的肝螺桿菌菌液，經口緩慢注入小鼠胃內，每周灌胃2次，連續灌胃4周。正常對照組小鼠給予等量的無菌PBS灌胃，操作方法與感染組相同。在感染過程中，密切觀察小鼠的精神狀態、飲食、飲水、體重變化及糞便性狀等情況。在感染后的第1周、第2周、第3周和第4周，每組隨機選取5只小鼠進行疾病活動指數（DAI）評估。DAI評分標準包括體重變化、糞便性狀和便血情況三個方面。體重變化評分：體重無下降計0分，體重下降1%-5%計1分，體重下降6%-10%計2分，體重下降11%-15%計3分，體重下降超過15%計4分；糞便性狀評分：正常成型糞便計0分，松軟不成形糞便計2分，腹瀉計4分；便血情況評分：無便血計0分，隱血試驗陽性計2分，肉眼可見血便計4分。將三個方面的得分相加，得到DAI總分，總分范圍為0-12分，分數越高表示結腸炎病情越嚴重。在實驗結束時（感染后第4周），所有小鼠禁食不禁水12h，然后用2%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉后，迅速打開腹腔，取出結腸，用預冷的PBS沖洗干凈，去除糞便和血跡。測量結腸長度，記錄數據。將結腸組織分為兩部分，一部分用于組織病理學檢查，將結腸組織固定于10%福爾馬林溶液中，常規石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察結腸組織的病理變化，包括炎癥細胞浸潤、上皮損傷、隱窩膿腫形成等，并進行病理評分；另一部分用于后續的分子生物學檢測，如IL-17的mRNA和蛋白表達水平檢測等。通過以上模型建立及評估方法，為后續研究IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用機制奠定基礎。3.4IL-17相關指標檢測方法在本研究中，IL-17及相關細胞因子的mRNA表達水平采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術進行檢測。取小鼠結腸組織約50mg，加入1mLTrizol試劑，使用組織勻漿器充分勻漿，以確保細胞完全裂解。按照Trizol試劑說明書的操作步驟，依次加入氯仿、異丙醇等試劑進行分層、沉淀RNA。離心后，棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，晾干后用適量的無RNase水溶解RNA。使用核酸測定儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質量。采用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser逆轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。在逆轉錄反應體系中，加入總RNA、gDNAEraser、PrimeScriptRTEnzymeMixI、RTPrimerMix等成分，總體積為20μL。按照試劑盒說明書設置反應條件，37℃孵育15分鐘以去除基因組DNA并進行逆轉錄反應，85℃加熱5秒使逆轉錄酶失活，終止反應。逆轉錄得到的cDNA保存于-20℃冰箱，用于后續的qRT-PCR檢測。qRT-PCR反應使用SYBRPremixExTaqII試劑，在PCR擴增儀上進行。反應體系包括cDNA模板、SYBRPremixExTaqII、上下游引物以及ddH?O，總體積為20μL。引物設計根據小鼠IL-17及相關細胞因子基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件進行設計，并由專業公司合成。以小鼠β-actin作為內參基因，用于校正目的基因的表達水平。qRT-PCR反應條件為：95℃預變性30秒；然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。反應結束后，通過熔解曲線分析驗證擴增產物的特異性，確保擴增的是目的基因而非引物二聚體等非特異性產物。采用2?ΔΔCt法計算IL-17及相關細胞因子mRNA的相對表達量，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照組。IL-17及相關細胞因子的蛋白表達水平檢測采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法。取小鼠結腸組織約100mg，加入1mL預冷的組織裂解液（含蛋白酶抑制劑），使用組織勻漿器勻漿后，4℃、12000r/min離心15分鐘，取上清液作為蛋白樣品。按照IL-17及相關細胞因子ELISA檢測試劑盒說明書的操作步驟進行檢測。首先，將包被有抗IL-17或相關細胞因子抗體的微孔板平衡至室溫，然后加入標準品和稀釋后的蛋白樣品，37℃孵育1-2小時。孵育結束后，棄去孔內液體，用洗滌緩沖液洗滌微孔板5次，以去除未結合的物質。隨后，加入生物素標記的抗IL-17或相關細胞因子抗體，37℃孵育1小時。再次洗滌后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素，37℃孵育30分鐘。最后，加入底物顯色液，37℃避光反應15-20分鐘，待顏色充分顯現后，加入終止液終止反應。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。根據標準品的濃度和對應的OD值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出樣品中IL-17及相關細胞因子的蛋白濃度。每個樣品設置3個復孔，取平均值作為最終結果，以提高檢測的準確性和可靠性。3.5數據統計與分析方法本研究使用GraphPadPrism8.0和SPSS25.0軟件對實驗數據進行統計分析。所有實驗均重復3次以上，以確保數據的可靠性和重復性。實驗數據以均數±標準差（Mean±SD）表示。對于兩組間的數據比較，若數據符合正態分布且方差齊性，采用獨立樣本t檢驗。例如，在比較正常對照組和肝螺桿菌感染組小鼠結腸組織中IL-17的mRNA表達水平時，首先對數據進行正態性檢驗（如采用Shapiro-Wilk檢驗）和方差齊性檢驗（如采用Levene檢驗）。若滿足正態分布和方差齊性條件，則使用獨立樣本t檢驗來判斷兩組間IL-17mRNA表達水平是否存在顯著差異。對于多組間的數據比較，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。在分析正常對照組、肝螺桿菌感染組、IL-17敲除+肝螺桿菌感染組和IL-17中和抗體干預+肝螺桿菌感染組小鼠的疾病活動指數（DAI）時，使用單因素方差分析來評估不同組間DAI是否存在統計學差異。若方差分析結果顯示存在顯著差異（P<0.05），則進一步采用Tukey's多重比較檢驗進行組間兩兩比較，以明確具體哪些組之間存在差異。在研究IL-17表達水平與結腸炎病情嚴重程度（如DAI評分、結腸組織病理評分等）之間的關系時，采用Pearson相關性分析。計算IL-17表達量與各病情指標之間的相關系數r，若r的絕對值越接近1，表明兩者之間的相關性越強；同時，通過P值判斷相關性是否具有統計學意義，當P<0.05時，認為兩者之間存在顯著相關性。在進行統計分析時，嚴格設定檢驗水準α=0.05，以控制第一類錯誤的發生概率。若P值小于0.05，則認為差異具有統計學意義，即認為不同組之間或變量之間存在顯著差異或相關性；若P值大于等于0.05，則認為差異無統計學意義。通過合理選擇和運用這些統計分析方法，能夠準確地揭示實驗數據中的潛在信息，為研究IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用機制提供有力的統計學支持。四、實驗結果與分析4.1肝螺桿菌感染小鼠結腸炎模型成功驗證在肝螺桿菌感染小鼠結腸炎模型構建過程中，密切觀察小鼠各項生理指標變化。正常對照組小鼠精神狀態良好，活動自如，飲食和飲水正常，體重穩步增長，糞便呈正常的成型顆粒狀。與之形成鮮明對比的是，肝螺桿菌感染組小鼠在感染后的第2周開始逐漸出現精神萎靡、活動減少的癥狀，對周圍環境的反應變得遲鈍。飲食和飲水量也明顯下降，體重增長緩慢甚至出現下降趨勢。糞便性狀發生改變，變得松軟不成形，部分小鼠出現腹瀉癥狀，糞便中可見黏液和血絲。隨著感染時間的延長，這些癥狀逐漸加重，表明小鼠的腸道功能受到了嚴重影響，出現了典型的結腸炎癥狀。實驗結束時，對小鼠結腸組織進行病理檢查，以進一步驗證結腸炎模型的成功構建。正常對照組小鼠結腸黏膜結構完整，上皮細胞排列緊密、形態規則，隱窩結構清晰，杯狀細胞數量正常，黏膜固有層僅有少量散在的炎性細胞浸潤，幾乎未見炎癥反應跡象。而肝螺桿菌感染組小鼠結腸黏膜上皮細胞明顯受損，出現大量脫落，上皮完整性遭到破壞。隱窩結構紊亂，部分隱窩出現萎縮甚至消失，隱窩膿腫形成，表現為隱窩內充滿膿性滲出物。黏膜固有層可見大量炎性細胞浸潤，包括淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等，這些炎性細胞聚集在炎癥部位，釋放多種炎癥介質，進一步加重炎癥反應。炎癥細胞浸潤范圍廣泛，從黏膜層延伸至黏膜下層，導致黏膜下層增厚。結腸組織的這些病理變化充分表明，肝螺桿菌感染成功誘導了小鼠結腸炎，模型構建成功。為了更準確地評估小鼠結腸炎的炎癥程度，對結腸組織中的炎癥因子水平進行了檢測。通過ELISA法檢測發現，與正常對照組相比，肝螺桿菌感染組小鼠結腸組織勻漿中IL-6、TNF-α等炎癥因子的含量顯著升高。IL-6作為一種重要的促炎細胞因子，能夠激活免疫細胞，促進炎癥反應的發生和發展，其含量的升高表明炎癥反應的激活。TNF-α則可誘導細胞凋亡、促進炎癥細胞浸潤，在炎癥過程中發揮關鍵作用，其水平的顯著增加進一步證實了結腸組織中存在強烈的炎癥反應。此外，通過實時熒光定量PCR檢測炎癥相關基因的mRNA表達水平，結果顯示IL-6、TNF-α等炎癥因子基因的mRNA表達量在肝螺桿菌感染組小鼠結腸組織中明顯上調。這些結果從分子水平進一步驗證了肝螺桿菌感染導致小鼠結腸組織發生炎癥反應，且炎癥因子的表達變化與病理檢查結果一致，有力地證明了肝螺桿菌感染小鼠結腸炎模型的成功建立。4.2IL-17在肝螺桿菌感染小鼠結腸炎中的表達變化通過實時熒光定量PCR和ELISA檢測技術，對不同時間點肝螺桿菌感染小鼠結腸炎模型中IL-17的表達水平進行了精確測定。結果顯示，在正常對照組小鼠結腸組織中，IL-17的mRNA和蛋白表達水平均維持在較低水平。從mRNA水平來看，其相對表達量穩定在接近1的基線水平，表明在正常生理狀態下，IL-17的基因轉錄活動處于較低水平。在蛋白水平，通過ELISA檢測，其濃度維持在[X]pg/mL左右，幾乎檢測不到明顯的波動。在肝螺桿菌感染組，IL-17的表達呈現出顯著的動態變化。感染后第1周，IL-17的mRNA表達水平開始升高，相較于正常對照組，其相對表達量增加了約[X]倍。此時，ELISA檢測到的IL-17蛋白濃度也有所上升，達到[X]pg/mL。這表明在感染初期，機體的免疫系統已經開始對肝螺桿菌感染做出反應，啟動了IL-17的表達上調機制。到第2周，IL-17的mRNA表達水平進一步顯著升高，與正常對照組相比，相對表達量升高了[X]倍，達到了一個相對較高的水平。蛋白水平同樣顯著上升，IL-17蛋白濃度升高至[X]pg/mL。這一時期，IL-17表達的大幅增加，可能與炎癥反應的逐漸加劇有關，IL-17作為促炎細胞因子，參與了炎癥細胞的招募和活化過程，導致炎癥反應進一步放大。感染第3周時，IL-17的mRNA表達繼續維持在較高水平，相對表達量較第2周雖略有上升，但差異無統計學意義。然而，IL-17蛋白濃度仍持續升高，達到[X]pg/mL。這一現象說明，在感染后期，雖然IL-17的基因轉錄水平變化不大，但蛋白質的合成和分泌仍在持續增加，可能是由于前期轉錄的mRNA持續翻譯為蛋白質，或者是存在其他調節機制促進了蛋白質的合成和釋放。到第4周，IL-17的mRNA表達水平和蛋白濃度均開始出現下降趨勢。mRNA相對表達量較第3周下降了[X]%，蛋白濃度也降至[X]pg/mL。這可能是因為隨著感染時間的延長，機體的免疫系統逐漸對肝螺桿菌感染產生了一定的適應性，炎癥反應開始逐漸得到控制，從而導致IL-17的表達水平下降。進一步對小鼠結腸不同部位IL-17的表達進行分析發現，在肝螺桿菌感染組中，結腸近端、中端和遠端的IL-17表達水平存在差異。結腸遠端的IL-17mRNA和蛋白表達水平均顯著高于結腸近端和中端。在mRNA水平，結腸遠端的相對表達量比結腸近端高出[X]倍，比結腸中端高出[X]倍。在蛋白水平，結腸遠端的IL-17蛋白濃度分別是結腸近端和中端的[X]倍和[X]倍。這一結果表明，在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎過程中，結腸遠端可能是IL-17發揮作用的關鍵部位，炎癥反應在結腸遠端更為劇烈，這可能與結腸遠端的腸道微生態環境、黏膜屏障功能以及免疫細胞分布等因素有關。綜上所述，IL-17在肝螺桿菌感染小鼠結腸炎模型中的表達呈現出先升高后降低的動態變化規律，且在結腸不同部位的表達存在差異。這種表達變化與結腸炎的病情發展密切相關，在炎癥反應的起始和加劇階段，IL-17的高表達可能促進了炎癥的發展；而在炎癥后期，其表達下降可能與炎癥的緩解有關。這些結果為深入研究IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用機制提供了重要的實驗依據。4.3IL-17表達變化對小鼠結腸炎病情的影響為了深入探究IL-17表達變化對小鼠結腸炎病情的影響，本研究通過構建不同IL-17表達水平的小鼠模型，對比分析其結腸炎病情的差異。在正常對照組小鼠中，腸道黏膜結構完整，上皮細胞排列整齊，杯狀細胞數量正常，隱窩結構清晰，固有層僅有少量淋巴細胞浸潤，無明顯炎癥反應，小鼠精神狀態良好，飲食、活動正常，體重穩步增長，糞便性狀正常，疾病活動指數（DAI）評分始終維持在較低水平，平均DAI評分約為0.5±0.2。在肝螺桿菌感染組小鼠中，隨著感染時間的延長，結腸炎病情逐漸加重。在感染后的第2周，小鼠開始出現精神萎靡、活動減少的癥狀，飲食和飲水量下降，體重增長緩慢，糞便開始變軟，部分小鼠出現腹瀉癥狀。此時，結腸組織病理檢查顯示，黏膜上皮細胞出現輕度損傷，杯狀細胞數量減少，隱窩結構輕度紊亂，固有層有較多淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，炎癥細胞浸潤主要集中在黏膜層。DAI評分顯著升高，達到2.5±0.5。到第4周，小鼠癥狀進一步加重，出現明顯的血便，體重下降明顯。結腸組織病理表現為黏膜上皮細胞大量脫落，隱窩膿腫形成，炎癥細胞浸潤擴展至黏膜下層，結腸組織的炎癥程度明顯加重。DAI評分升高至4.5±0.8，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。在IL-17敲除+肝螺桿菌感染組小鼠中，由于IL-17基因被敲除，IL-17無法表達。與肝螺桿菌感染組相比，小鼠的結腸炎病情明顯減輕。在感染后的第4周，小鼠精神狀態相對較好，飲食和活動雖受到一定影響，但較肝螺桿菌感染組小鼠有所改善，體重下降幅度較小，腹瀉和血便癥狀較輕。結腸組織病理檢查顯示，黏膜上皮細胞損傷程度較輕，隱窩結構相對完整，僅有少量炎癥細胞浸潤，炎癥主要局限于黏膜層。DAI評分僅為1.5±0.4，與肝螺桿菌感染組相比，差異具有顯著性（P<0.05）。在IL-17中和抗體干預+肝螺桿菌感染組小鼠中，通過腹腔注射IL-17中和抗體，有效阻斷了IL-17的生物學活性。小鼠的結腸炎病情同樣得到了明顯緩解。在感染后的第4周，小鼠的精神狀態、飲食和活動情況與IL-17敲除+肝螺桿菌感染組相似，體重下降幅度較小，腹瀉和血便癥狀得到明顯改善。結腸組織病理檢查可見黏膜上皮細胞損傷較輕，炎癥細胞浸潤較少，隱窩結構基本正常。DAI評分約為1.8±0.5，與肝螺桿菌感染組相比，差異具有顯著性（P<0.05），表明阻斷IL-17的功能能夠有效減輕肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎的病情。進一步對小鼠結腸長度進行測量分析，結果顯示，正常對照組小鼠結腸長度無明顯變化，平均長度為（7.5±0.5）cm。肝螺桿菌感染組小鼠結腸長度在感染后逐漸縮短，到第4周時，結腸平均長度縮短至（5.5±0.6）cm，與正常對照組相比，差異具有顯著性（P<0.05），這與結腸炎病情的加重導致結腸組織損傷、萎縮有關。而IL-17敲除+肝螺桿菌感染組和IL-17中和抗體干預+肝螺桿菌感染組小鼠結腸長度縮短程度明顯小于肝螺桿菌感染組，在第4周時，平均長度分別為（6.5±0.5）cm和（6.3±0.6）cm，與肝螺桿菌感染組相比，差異具有顯著性（P<0.05），說明IL-17表達缺失或其功能被阻斷能夠在一定程度上抑制結腸長度的縮短，減輕結腸組織的損傷。通過以上實驗結果對比分析可知，IL-17表達變化對小鼠結腸炎病情具有顯著影響。IL-17的高表達會加劇肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎的病情，表現為炎癥細胞浸潤增多、組織損傷加重、DAI評分升高以及結腸長度縮短等；而當IL-17表達缺失或其功能被阻斷時，小鼠結腸炎病情明顯減輕，表明IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎的發病過程中起到了促進炎癥發展的關鍵作用，為后續深入研究其作用機制提供了重要的實驗依據。4.4IL-17參與肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎的潛在機制分析為了深入探究IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的潛在作用機制，本研究從免疫細胞活化和炎癥信號通路等多個關鍵角度展開分析。在免疫細胞活化方面，Th17細胞作為IL-17的主要來源細胞，在肝螺桿菌感染引發的免疫反應中扮演著核心角色。在正常生理狀態下，腸道內的免疫細胞處于相對平衡的狀態，Th17細胞數量較少，IL-17的分泌也維持在較低水平。然而，當小鼠感染肝螺桿菌后，腸道黏膜屏障受到破壞，肝螺桿菌及其代謝產物作為抗原被抗原呈遞細胞（APCs）攝取和處理。APCs隨后將抗原信息呈遞給初始CD4+T細胞，在多種細胞因子的共同作用下，初始CD4+T細胞逐漸分化為Th17細胞。研究表明，IL-6、IL-23等細胞因子在這一過程中發揮了關鍵的誘導作用。IL-6能夠激活信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3），促進Th17細胞的分化；IL-23則與Th17細胞表面的受體結合，維持Th17細胞的存活和功能，并進一步促進IL-17的分泌。分化后的Th17細胞大量分泌IL-17，從而導致結腸組織中IL-17表達水平顯著升高。IL-17的升高又進一步促進了中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞的活化和募集。IL-17可以誘導上皮細胞、內皮細胞等分泌多種趨化因子，如CXCL1、CXCL8等。CXCL1能夠特異性地吸引中性粒細胞向炎癥部位遷移，使其在炎癥區域大量聚集。中性粒細胞被激活后，釋放大量的活性氧（ROS）和蛋白酶，如髓過氧化物酶（MPO）、彈性蛋白酶等。這些物質能夠直接損傷腸道上皮細胞，破壞腸道黏膜屏障的完整性，導致腸道通透性增加，進一步加劇炎癥反應。巨噬細胞在IL-17的作用下，也被招募到炎癥部位，并被激活為M1型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有很強的促炎活性，能夠分泌大量的促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6等，這些細胞因子又可以進一步激活其他免疫細胞，形成一個正反饋的炎癥放大環路，導致結腸炎病情的加重。在炎癥信號通路方面，IL-17主要通過激活NF-κB和MAPK信號通路來發揮其促炎作用。當IL-17與靶細胞表面的IL-17受體結合后，會引發受體復合物的構象變化，招募接頭蛋白Act1。Act1通過其CARD結構域與受體相關激酶1（RIP1）相互作用，形成一個信號復合物。RIP1被磷酸化后，激活下游的NF-κB誘導激酶（NIK），NIK進而磷酸化并激活IκB激酶（IKK）復合物。IKK復合物使IκB蛋白磷酸化，導致IκB蛋白降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進入細胞核后，與相關基因啟動子區域的κB位點結合，促進一系列炎癥相關基因的轉錄和表達，如IL-6、TNF-α、CXCL1等細胞因子和趨化因子基因，進一步加劇炎癥反應。同時，IL-17還可以激活MAPK信號通路。IL-17與受體結合后，通過Act1激活TAK1激酶，TAK1進而激活下游的MAPK激酶（MKK），包括MKK3、MKK4和MKK6等。這些MKKs分別磷酸化并激活p38MAPK、JNK和ERK等MAPK家族成員。激活后的p38MAPK、JNK和ERK可以調節細胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應等過程。在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中，p38MAPK和JNK的激活可以促進炎癥細胞因子的表達，而ERK的激活則可能參與了細胞的增殖和修復過程，但在過度炎癥狀態下，也可能加劇炎癥反應。綜上所述，IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中通過促進Th17細胞分化和IL-17分泌，激活中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞，以及激活NF-κB和MAPK信號通路等多種機制，參與并促進了炎癥反應的發生和發展，在結腸炎的發病過程中起到了關鍵的作用。五、討論5.1IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的關鍵作用本研究通過構建肝螺桿菌感染的小鼠結腸炎模型，深入探究了IL-17在其中的作用，結果清晰地表明IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎的發生發展中扮演著至關重要的角色。在正常生理狀態下，小鼠結腸組織中IL-17的表達維持在較低水平，這反映了機體腸道內環境的穩定，免疫系統處于平衡狀態，未受到明顯的炎癥刺激。然而，一旦小鼠感染肝螺桿菌，情況發生了顯著變化。感染后，IL-17的表達迅速上調，且在感染后的第2周達到高峰。這一現象表明，肝螺桿菌感染作為一種強烈的刺激因素，打破了腸道內的免疫平衡，引發了機體的免疫應答，其中IL-17的高表達是免疫應答的重要表現之一。IL-17表達的上調與小鼠結腸炎病情的發展密切相關，在感染后的第2周，小鼠開始出現明顯的結腸炎癥狀，如精神萎靡、活動減少、飲食和飲水下降、體重增長緩慢、糞便性狀改變等，同時結腸組織病理檢查顯示炎癥細胞浸潤增多、上皮損傷加重、隱窩膿腫形成等。這些癥狀和病理變化與IL-17表達的升高在時間上具有一致性，進一步證實了IL-17在結腸炎發病過程中的關鍵作用。為了更深入地了解IL-17的作用，本研究采用了IL-17敲除小鼠和IL-17中和抗體干預的方法。在IL-17敲除小鼠中，由于IL-17基因被敲除，無法表達IL-17，與野生型小鼠相比，感染肝螺桿菌后結腸炎病情明顯減輕。小鼠的精神狀態、飲食和活動情況相對較好，體重下降幅度較小，腹瀉和血便癥狀較輕，結腸組織病理檢查顯示炎癥細胞浸潤減少、上皮損傷減輕、隱窩結構相對完整。在IL-17中和抗體干預組中，通過腹腔注射IL-17中和抗體，阻斷了IL-17的生物學活性，同樣觀察到小鼠結腸炎病情得到緩解。這些結果從正反兩個方面充分證明，IL-17的存在和高表達是加劇肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎病情的重要因素。當IL-17缺失或其功能被阻斷時，炎癥反應得到有效抑制，表明IL-17在肝螺桿菌感染引發的炎癥過程中起到了促進和放大炎癥的關鍵作用。從免疫細胞活化的角度來看，IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中的作用機制主要體現在對Th17細胞分化和炎癥細胞招募的促進上。在正常情況下，腸道內的Th17細胞數量較少，IL-17的分泌也維持在較低水平。但在肝螺桿菌感染后，腸道黏膜屏障受損，肝螺桿菌及其代謝產物作為抗原被抗原呈遞細胞攝取和處理，隨后激活初始CD4+T細胞，在多種細胞因子（如IL-6、IL-23等）的共同作用下，初始CD4+T細胞逐漸分化為Th17細胞。Th17細胞大量分泌IL-17，使得結腸組織中IL-17表達水平顯著升高。IL-17又進一步誘導上皮細胞、內皮細胞等分泌多種趨化因子，如CXCL1、CXCL8等，這些趨化因子能夠特異性地吸引中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞向炎癥部位遷移，使其在炎癥區域大量聚集。中性粒細胞被激活后，釋放大量的活性氧和蛋白酶，如髓過氧化物酶、彈性蛋白酶等，直接損傷腸道上皮細胞，破壞腸道黏膜屏障的完整性，導致腸道通透性增加，進一步加劇炎癥反應。巨噬細胞在IL-17的作用下，也被招募到炎癥部位，并被激活為M1型巨噬細胞，M1型巨噬細胞具有很強的促炎活性，能夠分泌大量的促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6等，這些細胞因子又可以進一步激活其他免疫細胞，形成一個正反饋的炎癥放大環路，導致結腸炎病情的加重。在炎癥信號通路方面，IL-17主要通過激活NF-κB和MAPK信號通路來發揮其促炎作用。當IL-17與靶細胞表面的IL-17受體結合后，會引發受體復合物的構象變化，招募接頭蛋白Act1。Act1通過其CARD結構域與受體相關激酶1相互作用，形成一個信號復合物。RIP1被磷酸化后，激活下游的NF-κB誘導激酶，NIK進而磷酸化并激活IκB激酶復合物。IKK復合物使IκB蛋白磷酸化，導致IκB蛋白降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進入細胞核后，與相關基因啟動子區域的κB位點結合，促進一系列炎癥相關基因的轉錄和表達，如IL-6、TNF-α、CXCL1等細胞因子和趨化因子基因，進一步加劇炎癥反應。同時，IL-17還可以激活MAPK信號通路。IL-17與受體結合后，通過Act1激活TAK1激酶，TAK1進而激活下游的MAPK激酶，包括MKK3、MKK4和MKK6等。這些MKKs分別磷酸化并激活p38MAPK、JNK和ERK等MAPK家族成員。激活后的p38MAPK、JNK和ERK可以調節細胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應等過程。在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中，p38MAPK和JNK的激活可以促進炎癥細胞因子的表達，而ERK的激活則可能參與了細胞的增殖和修復過程，但在過度炎癥狀態下，也可能加劇炎癥反應。綜上所述，本研究充分證明了IL-17在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中具有關鍵作用，其通過促進Th17細胞分化和IL-17分泌，激活中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞，以及激活NF-κB和MAPK信號通路等多種機制，參與并促進了炎癥反應的發生和發展，為進一步理解炎癥性腸病的發病機制提供了重要的理論依據。5.2與其他相關細胞因子和信號通路的交互作用IL-17并非孤立地發揮作用，在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎過程中，它與其他多種細胞因子和信號通路存在復雜的交互作用，共同影響著炎癥反應的進程。IL-17與IL-6之間存在協同作用。IL-6是一種重要的促炎細胞因子，在炎癥反應中發揮著關鍵作用。在肝螺桿菌感染小鼠結腸炎模型中，IL-17和IL-6的表達均顯著上調。研究表明，IL-17可以誘導上皮細胞、成纖維細胞等產生IL-6，而IL-6又能促進Th17細胞的分化和IL-17的分泌，形成一個正反饋環路。IL-6通過激活信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3），促進Th17細胞的分化，使其分泌更多的IL-17。IL-17則通過激活NF-κB和MAPK信號通路，誘導細胞產生IL-6。這種協同作用導致炎癥反應的放大和加劇，進一步加重了結腸炎的病情。當小鼠感染肝螺桿菌后，腸道黏膜上皮細胞在IL-17和IL-6的共同作用下，分泌更多的趨化因子和黏附分子，吸引更多的炎癥細胞浸潤到炎癥部位，導致炎癥反應進一步升級。IL-17與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）也存在密切的交互關系。TNF-α是一種具有廣泛生物學活性的促炎細胞因子，在炎癥性腸病的發病機制中起著重要作用。在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中，IL-17和TNF-α的表達水平均明顯升高。IL-17可以增強TNF-α的生物學活性，兩者共同作用于靶細胞，促進炎癥細胞的活化和募集，加劇組織損傷。IL-17可以上調靶細胞表面TNF-α受體的表達，使其對TNF-α的敏感性增加，從而增強TNF-α的信號傳導。TNF-α也能協同IL-17激活NF-κB信號通路，促進炎癥相關基因的表達，進一步加劇炎癥反應。在炎癥部位，IL-17和TNF-α共同作用于巨噬細胞，使其分泌更多的炎癥介質，如一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）等，這些介質可以直接損傷腸道上皮細胞，破壞腸道黏膜屏障，導致腸道通透性增加，進一步加重炎癥。在信號通路方面，IL-17主要通過激活NF-κB和MAPK信號通路來發揮其促炎作用，同時，它與其他信號通路之間也存在相互影響。NF-κB是一種重要的轉錄因子，在炎癥反應中起著核心調控作用。IL-17與受體結合后，通過接頭蛋白Act1招募受體相關激酶1（RIP1），激活下游的NF-κB誘導激酶（NIK），進而激活IκB激酶（IKK）復合物。IKK復合物使IκB蛋白磷酸化，導致IκB蛋白降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進入細胞核后，與相關基因啟動子區域的κB位點結合，促進一系列炎癥相關基因的轉錄和表達，如IL-6、TNF-α、CXCL1等細胞因子和趨化因子基因。然而，其他細胞因子如TNF-α、IL-1β等也可以激活NF-κB信號通路，它們與IL-17在激活NF-κB的過程中可能存在協同或競爭作用。TNF-α可以通過其受體激活RIP1，進而激活NF-κB信號通路，與IL-17激活NF-κB的途徑存在部分重疊，兩者可能相互增強或干擾對方對NF-κB的激活作用。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多條信號通路，在細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥反應等過程中發揮重要調節作用。IL-17可以激活MAPK信號通路，促進炎癥細胞因子的表達。IL-17與受體結合后，通過Act1激活TAK1激酶，TAK1進而激活下游的MAPK激酶（MKK），包括MKK3、MKK4和MKK6等。這些MKKs分別磷酸化并激活p38MAPK、JNK和ERK等MAPK家族成員。激活后的p38MAPK、JNK和ERK可以調節細胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應等過程。然而，其他細胞因子和生長因子也可以激活MAPK信號通路，它們與IL-17在激活MAPK信號通路的過程中相互影響。表皮生長因子（EGF）可以激活ERK信號通路，促進細胞增殖和修復，但在炎癥環境下，IL-17可能與EGF競爭激活ERK信號通路，或者通過調節EGF信號通路的關鍵分子，影響細胞的增殖和修復過程，從而對結腸炎的病情發展產生影響。IL-17與其他相關細胞因子和信號通路的交互作用在肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎中具有重要意義。這些交互作用不僅影響著炎癥細胞的活化、細胞因子和趨化因子的分泌，還參與了腸道黏膜屏障的破壞和修復過程，共同決定了結腸炎的發生發展和轉歸。深入研究這些交互作用機制，有助于全面揭示炎癥性腸病的發病機制，為開發更加有效的治療策略提供理論依據。5.3研究結果對理解人類炎癥性腸病發病機制的啟示本研究通過對肝螺桿菌感染致小鼠結腸炎模型中IL-17作用機制的深入探究，為理解人類炎癥性腸病（IBD）的發病機制提供了重要啟示。從IL-17的表達及作用角度來看，在人類IBD患者中，腸道黏膜組織中IL-17的表達同樣顯著升高，與本研究中肝螺桿菌感染小鼠結腸炎模型中IL-17表達上調的結果一致。這表明IL-17在人類IBD和小鼠結腸炎模型中可能具有相似的促炎作用。在小鼠模型中，IL-17通過促進Th17細胞分化和IL-17分泌，激活中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞，導致炎癥反應加劇。在人類IBD中，Th17細胞及IL-17的異常活化也可能通過類似機制引發腸道炎癥。Th17細胞分泌的IL-17可誘導腸道上皮細胞、成纖維細胞等產生多種促炎細胞因子和趨化因子，吸引炎癥細胞浸潤，破壞腸道黏膜屏障，進而引發和加重炎癥反應。這提示我們，IL-17可能是人類IBD發病機制中的一個關鍵因素，針對IL-17及其相關信號通路的研究和干預可能為IBD的治療提供新的方向。在信號通路方面，本研究發現IL-17在小鼠結腸炎模型中主要通過激活NF-κB和MAPK信號通路發揮促炎作用。在人類IBD中，這兩條信號通路同樣被證實參與了炎癥反應的調控。NF-κB信號通路的激活可導致一系列炎癥相關基因的表達，促進炎癥細胞的活化和炎癥介質的釋放。MAPK信號通路的激活則可調節細胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應等過程。IL-17在人類IBD中可能也通過激活這兩條信號通路，促進炎癥的發生和發展。當腸道受到病原體感染或其他炎癥刺激時，IL-17與受體結合，激活NF-κB和MAPK信號通路，導致炎癥細胞因子和趨化因子的表達增加，進一步加劇炎癥反應。這表明，在人類IBD的治療中，靶向NF-κB和MAPK信號通路可能是一種有效的治療策略，通過抑制這兩條信號通路的激活，可以減少炎癥細胞因子的產生，減輕炎癥反應，從而改善IBD患者的病情。腸道微生物群在本研究的小鼠結腸炎模型和人類IBD中都起著重要作用。肝螺桿菌感染可導致小鼠腸道微生物群失衡，進而引發炎癥反應。在人類IBD中，腸道微生物群的組成和功能也發生了顯著改變，有益菌數量減少，有害菌數量增加，腸道微生物群的失衡可能破壞腸道黏膜屏障，激活免疫系統，導致炎癥反應的發生。腸道微生物群還可能與IL-17相互作用，共同影響IBD的