HNF4α與FoxM1：解析胃癌發生進程中的關鍵轉錄調節密碼一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，在各類癌癥中，其發病率位居第四，病死率高居第二位，尤其在包括我國在內的發展中國家，形勢更為嚴峻。胃癌不僅會導致患者出現上腹疼痛、上腹不適、食欲下降、惡心、嘔吐、吞咽困難等癥狀，嚴重影響患者的進食和睡眠，干擾正常生活，還會給患者帶來嚴重的負面情緒。隨著病情進展，賁門處的腫瘤會導致吞咽困難、身體消瘦；幽門處的腫瘤則可能引發頻繁嘔吐、梗阻，甚至導致消化道出血、穿孔、胸腔積液。到了晚期，癌細胞擴散轉移至其他重要臟器，極大地影響患者壽命，如I期胃癌的5年生存率為90%-98%，II期胃癌5年生存率為68.5%，III期胃癌5年生存率為30.8%-50.1%，IV期胃癌5年生存率僅為16.6%。盡管當前治療手段如化療、放療和手術等有了一定進步，但胃癌的總體治療效果仍不理想，因此，深入研究胃癌的發生機制，尋找有效的治療靶點和策略迫在眉睫。轉錄調節分子在細胞的生命活動中扮演著核心角色，它們能夠通過與特定的DNA序列結合，調控基因的轉錄過程，進而影響細胞的增殖、分化、凋亡等重要生物學功能。在腫瘤發生發展過程中，轉錄調節分子的異常表達或功能失調常常起著關鍵作用。肝細胞核因子HNF4α作為一種重要的轉錄調節分子，在細胞的生長、分化和代謝等過程中發揮著不可或缺的作用。研究發現，HNF4α表達上調是胃腫瘤的一個重要信號事件，其可被AMPK信號和WNT信號上游等通路調節，還可通過其靶基因WNT5A來調節WNT信號通路，拮抗HNF4α具有抗腫瘤作用，有望成為早期胃癌新的治療靶點。FoxM1基因是Fox蛋白家族的一個亞型，參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、浸潤與侵襲等，在胃癌中存在過高表達，對胃癌的發生、發展及預后起重要作用，有望成為胃癌治療的新靶點。深入研究HNF4α和FoxM1等轉錄調節分子在胃癌發生中的功能與機制，有助于揭示胃癌發生發展的分子生物學基礎，為胃癌的早期診斷、精準治療以及預后評估提供新的理論依據和潛在靶點，對于改善胃癌患者的生存質量和提高生存率具有重要的現實意義。1.2國內外研究現狀在國外，對于HNF4α在胃癌中的研究已取得一定成果。韓國國立癌癥中心和美國德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的研究團隊通過綜合分析亞太地區和高加索人的胃腫瘤基因表達數據集，以及新獲得的胃腫瘤組織及與之匹配的非癌樣本中的基因表達情況，發現HNF4α表達上調是胃腫瘤的一個重要信號事件。進一步通過RNA干擾和/或藥物抑制實驗對常見過度表達的癌基因及其組成的信號通路進行抑制性研究，證實了拮抗HNF4α具有抗腫瘤作用。胃癌腫瘤細胞系的擾動實驗和異種移植物模型研究表明，AMPKα信號和AMPK受體激動劑二甲雙胍可下調HNF4α的表達，阻斷HNF4α活性可導致細胞周期蛋白下調、細胞周期停滯和腫瘤生長抑制，且HNF4α還可通過其靶基因WNT5A來調節WNT信號通路，這為胃癌的藥物研發提供了潛在的新靶向通路。在國內，相關研究也在不斷深入。有研究聚焦于HNF4α在幽門螺桿菌誘導胃癌發生中的功能和機制。通過動物實驗和細胞實驗，深入探討幽門螺桿菌感染如何影響HNF4α的表達，以及HNF4α表達變化后對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為的影響，進一步揭示了HNF4α在胃癌發生發展過程中的作用機制。對于FoxM1，國外有研究從細胞周期調控角度，深入剖析了FoxM1在胃癌細胞中的作用機制。研究發現，FoxM1在細胞周期的不同階段發揮關鍵調控作用，通過與多種細胞周期相關蛋白相互作用，促進胃癌細胞的增殖。還有研究利用基因編輯技術，敲除或過表達胃癌細胞中的FoxM1基因，觀察細胞的增殖、凋亡、浸潤與侵襲等生物學行為的變化，明確了FoxM1在胃癌發生發展中的重要作用。國內研究則更多地關注FoxM1與胃癌臨床病理特征及預后的關系。通過對大量胃癌患者的組織樣本進行檢測，分析FoxM1的表達水平與胃癌的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移等臨床病理指標的相關性，發現FoxM1高表達與胃癌的不良預后密切相關。此外，也有研究探討了FoxM1在胃癌轉移中的作用機制，通過細胞實驗和動物實驗，發現FoxM1可以通過調節上皮-間質轉化過程，促進胃癌細胞的遷移和侵襲，進而增加胃癌的轉移潛能。盡管國內外在HNF4α和FoxM1與胃癌的研究中取得了一定進展，但仍存在不足和空白。目前對于HNF4α和FoxM1在胃癌發生發展過程中的相互作用機制研究較少，兩者是否存在協同或拮抗作用尚不明確。在臨床應用方面，雖然已明確它們與胃癌的相關性，但如何將這些研究成果轉化為有效的臨床診斷和治療手段，仍有待進一步探索。例如，如何開發針對HNF4α和FoxM1的特異性靶向藥物，以及如何將其應用于胃癌的早期診斷和精準治療，都是未來研究需要重點關注的方向。1.3研究目的與內容本研究旨在深入揭示轉錄調節分子HNF4α和FoxM1在胃癌發生中的功能與機制，為胃癌的防治提供新的理論依據和潛在靶點。具體研究內容如下：HNF4α在胃癌發生中的功能與機制研究：通過細胞實驗，利用基因編輯技術敲低或過表達胃癌細胞系中的HNF4α基因，觀察細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學行為的變化，明確HNF4α對胃癌細胞生物學特性的影響。構建胃癌動物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型，通過體內實驗進一步驗證HNF4α對腫瘤生長和轉移的作用。采用高通量測序技術，分析HNF4α基因敲低或過表達后胃癌細胞的基因表達譜變化，篩選出受HNF4α調控的下游靶基因。運用生物信息學分析、染色質免疫沉淀（ChIP）、熒光素酶報告基因實驗等方法，驗證HNF4α與靶基因啟動子區域的結合位點，明確其調控機制。探討HNF4α與已知的胃癌相關信號通路（如WNT、AMPK等信號通路）的相互作用關系，研究HNF4α是否通過調節這些信號通路來影響胃癌的發生發展。FoxM1在胃癌發生中的功能與機制研究：在不同的胃癌細胞系中，利用RNA干擾技術或小分子抑制劑抑制FoxM1的表達或活性，通過CCK-8實驗、EdU實驗、流式細胞術等方法檢測細胞增殖和凋亡情況，利用Transwell實驗、劃痕實驗檢測細胞遷移和侵襲能力的變化，深入研究FoxM1對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響。建立胃癌原位移植瘤模型或轉移瘤模型，通過體內成像技術、組織病理學分析等手段，觀察抑制FoxM1表達或活性后對腫瘤生長、轉移和預后的影響。利用基因芯片、RNA-seq等技術，分析FoxM1調控的基因網絡，篩選出與胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲密切相關的下游靶基因。通過ChIP-seq、EMSA等實驗確定FoxM1與靶基因啟動子區域的直接結合位點，采用基因過表達、RNA干擾等方法驗證靶基因在FoxM1調控胃癌細胞生物學行為中的作用。研究FoxM1與其他轉錄因子、信號通路分子之間的相互作用，揭示FoxM1在胃癌發生發展過程中的分子調控網絡。HNF4α和FoxM1在胃癌發生中的相互作用研究：通過免疫共沉淀（Co-IP）、熒光共振能量轉移（FRET）等實驗技術，檢測HNF4α和FoxM1在胃癌細胞內是否存在直接相互作用。利用蛋白質譜分析技術，鑒定與HNF4α和FoxM1相互作用的其他蛋白質，構建相互作用網絡，分析它們在胃癌發生發展過程中的協同或拮抗作用機制。在胃癌細胞系中同時干擾或過表達HNF4α和FoxM1，觀察細胞生物學行為的變化，與單獨干擾或過表達HNF4α、FoxM1的細胞進行對比，研究兩者共同作用對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響。分析HNF4α和FoxM1的表達水平在胃癌組織中的相關性，結合臨床病理資料，探討兩者聯合檢測對胃癌診斷、預后評估的價值。1.4研究方法與技術路線細胞實驗：選用多種胃癌細胞系，如MGC-803、SGC-7901、BGC-823等，同時設立正常胃黏膜上皮細胞系作為對照。運用基因編輯技術，如CRISPR/Cas9系統，對胃癌細胞系中的HNF4α和FoxM1基因進行敲低或過表達操作。通過CCK-8實驗檢測細胞增殖能力，在不同時間點（如24h、48h、72h）向培養孔中加入CCK-8試劑，孵育后用酶標儀測定450nm處的吸光度值，繪制細胞生長曲線；采用EdU實驗直觀地觀察細胞的增殖情況，將EdU試劑加入細胞培養液中孵育，固定細胞后進行熒光染色，在熒光顯微鏡下計數EdU陽性細胞的比例；利用流式細胞術分析細胞周期分布和凋亡情況，將細胞用相應的熒光染料標記，如PI染料標記DNA用于分析細胞周期，AnnexinV-FITC/PI雙染用于檢測細胞凋亡，通過流式細胞儀檢測不同熒光強度的細胞數量，分析細胞周期各時相的比例以及凋亡細胞的百分比；運用Transwell實驗和劃痕實驗檢測細胞遷移和侵襲能力，在Transwell小室的上室加入細胞懸液，下室加入含趨化因子的培養液，培養一定時間后固定、染色，在顯微鏡下計數穿過小室膜的細胞數量；劃痕實驗則是在細胞鋪滿培養皿后，用移液器槍頭劃痕，培養一定時間后觀察劃痕愈合情況，計算細胞遷移率。動物實驗：構建胃癌動物模型，包括裸鼠皮下移植瘤模型、胃癌原位移植瘤模型和轉移瘤模型。對于裸鼠皮下移植瘤模型，將對數生長期的胃癌細胞接種到裸鼠的皮下，定期測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，待腫瘤生長到一定大小后處死裸鼠，取出腫瘤進行組織病理學分析；胃癌原位移植瘤模型是將胃癌細胞接種到裸鼠的胃壁上，觀察腫瘤的生長和轉移情況；轉移瘤模型可通過尾靜脈注射胃癌細胞建立肺轉移模型，通過活體成像技術觀察腫瘤細胞在體內的轉移情況，如在注射帶有熒光標記的胃癌細胞后，定期對裸鼠進行活體成像，觀察熒光信號在肺部等器官的分布和強度變化。通過免疫組化、免疫熒光等方法檢測腫瘤組織中相關蛋白的表達水平和定位，如用免疫組化檢測HNF4α、FoxM1以及相關靶蛋白在腫瘤組織中的表達，用免疫熒光檢測它們在細胞內的定位情況。分子生物學技術：采用高通量測序技術，如RNA-seq，分析HNF4α和FoxM1基因敲低或過表達后胃癌細胞的基因表達譜變化。提取細胞總RNA，進行文庫構建和測序，通過生物信息學分析篩選出差異表達基因，構建基因共表達網絡，分析受HNF4α和FoxM1調控的基因模塊。運用染色質免疫沉淀（ChIP）、熒光素酶報告基因實驗等方法驗證轉錄因子與靶基因啟動子區域的結合位點。ChIP實驗先將細胞進行甲醛交聯，裂解細胞后超聲破碎染色質，用特異性抗體免疫沉淀與轉錄因子結合的DNA片段，再通過PCR或測序分析沉淀的DNA片段，確定轉錄因子與靶基因啟動子的結合區域；熒光素酶報告基因實驗則是將靶基因啟動子區域克隆到熒光素酶報告載體中，與轉錄因子表達質粒共轉染細胞，檢測熒光素酶活性，判斷轉錄因子對靶基因啟動子的調控作用。利用蛋白質譜分析技術鑒定與HNF4α和FoxM1相互作用的其他蛋白質，通過免疫共沉淀（Co-IP）富集與HNF4α或FoxM1結合的蛋白質復合物，進行蛋白質譜分析，篩選出相互作用的蛋白質，再通過Co-IP、GSTpull-down等實驗進一步驗證蛋白質之間的相互作用。采用實時熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測相關基因和蛋白的表達水平。qPCR提取細胞或組織的總RNA，反轉錄為cDNA后進行qPCR擴增，以內參基因作為對照，計算目的基因的相對表達量；Westernblot提取細胞或組織總蛋白，進行SDS電泳分離蛋白質，轉膜后用特異性抗體檢測目的蛋白的表達水平。臨床樣本分析：收集胃癌患者的手術切除標本，包括癌組織和癌旁組織，同時收集患者的臨床病理資料，如年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況等。采用免疫組化、qPCR等方法檢測HNF4α和FoxM1在臨床樣本中的表達水平，分析其與臨床病理特征及預后的相關性，如通過統計分析判斷HNF4α和FoxM1表達水平與腫瘤分期、淋巴結轉移之間是否存在顯著相關性，通過生存分析評估它們對患者預后的影響。本研究的技術路線如圖1-1所示，首先從細胞實驗和動物實驗兩個層面，分別對HNF4α和FoxM1在胃癌發生中的功能進行研究，利用分子生物學技術深入探究其作用機制。同時，分析臨床樣本中HNF4α和FoxM1的表達情況，探討其與臨床病理特征及預后的關系。最后，綜合各方面研究結果，深入揭示轉錄調節分子HNF4α和FoxM1參與胃癌發生的功能與機制。[此處插入技術路線圖]圖1-1技術路線圖二、HNF4α與FoxM1的生物學特性2.1HNF4α的結構、功能與調控2.1.1HNF4α的結構特點HNF4α基因位于人染色體20q12-q13.1，其編碼的蛋白質屬于核受體超家族成員。HNF4α蛋白包含多個功能域，從N端到C端依次為：高度可變的N端結構域、DNA結合域（DBD）、鉸鏈區和配體結合域（LBD）。N端結構域具有高度的物種和組織特異性，其長度和氨基酸序列在不同物種及組織中存在差異，該區域包含多個磷酸化位點，可通過磷酸化修飾參與轉錄激活功能的調節。例如，蛋白激酶A（PKA）可對其特定絲氨酸殘基進行磷酸化，改變HNF4α與其他轉錄共激活因子的相互作用，進而影響其轉錄活性。DNA結合域由兩個鋅指結構組成，每個鋅指結構含有約60個氨基酸殘基，通過與特定的DNA序列（順式作用元件）結合，調控下游基因的轉錄。這兩個鋅指結構中的關鍵氨基酸殘基與DNA大溝中的堿基形成特異性氫鍵和范德華力，確保HNF4α與靶基因啟動子區域的準確識別和緊密結合。其識別的核心DNA序列通常為5'-AGGTCA-3'，以直接重復序列（DR1）或反向重復序列（IR1）的形式存在于靶基因啟動子中。鉸鏈區是連接DNA結合域和配體結合域的柔性區域，具有一定的可塑性，能夠在不同程度上彎曲和旋轉，使HNF4α在與DNA結合時可以采取合適的空間構象，同時也為蛋白質與其他調控因子的相互作用提供了結構基礎。配體結合域具有保守的三級結構，由12個α-螺旋和4個β-折疊組成，形成一個疏水口袋，可結合內源性配體（如脂肪酸、前列腺素等）或外源性配體（如小分子化合物）。配體結合后，會引起配體結合域的構象變化，影響HNF4α與共激活因子或共抑制因子的結合，從而調控其轉錄活性。當脂肪酸與HNF4α的配體結合域結合時，會誘導HNF4α形成同源二聚體，增強其與靶基因啟動子的結合能力，促進下游基因的轉錄。HNF4α通過這些功能域的協同作用，實現對基因轉錄的精確調控，在維持細胞正常生理功能和疾病發生發展過程中發揮重要作用。不同功能域之間相互影響，共同決定了HNF4α的生物學活性，任何一個功能域的結構改變或功能異常都可能導致HNF4α調控功能的紊亂，進而影響相關生理過程或引發疾病。2.1.2HNF4α的正常生理功能在肝臟代謝方面，HNF4α是肝臟代謝的關鍵調節因子，對維持肝臟的正常代謝功能至關重要。它參與調控肝臟中多種代謝途徑，包括糖代謝、脂質代謝和膽汁酸代謝等。在糖代謝中，HNF4α通過直接調控葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）等糖異生關鍵酶基因的表達，維持血糖水平的穩定。當血糖濃度降低時，體內激素信號（如胰高血糖素）會激活相關信號通路，促使HNF4α與G6PC和PEPCK基因啟動子區域的特定序列結合，增強這些基因的轉錄，促進糖異生過程，使肝臟釋放葡萄糖進入血液，從而升高血糖水平。在脂質代謝中，HNF4α調控脂肪酸轉運蛋白（FATP）、脂肪酸結合蛋白（FABP）以及脂肪酸合成酶（FAS）等基因的表達，影響脂肪酸的攝取、轉運和合成。研究表明，敲低小鼠肝臟中的HNF4α基因，會導致FATP和FABP表達下降，脂肪酸攝取減少，同時FAS表達降低，脂肪酸合成受阻，最終引起肝臟脂質含量下降。在膽汁酸代謝中，HNF4α調節膽汁酸合成關鍵酶膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）的表達，維持膽汁酸的合成和代謝平衡。當膽汁酸水平升高時，膽汁酸作為配體與HNF4α結合，抑制其與CYP7A1基因啟動子的結合，減少CYP7A1的表達，從而降低膽汁酸的合成，形成負反饋調節機制。在腸道發育方面，HNF4α在腸道上皮細胞的分化和成熟過程中發揮重要作用。在胚胎發育階段，HNF4α的表達逐漸上調，促進腸道上皮干細胞向不同類型的成熟細胞分化，包括腸吸收細胞、杯狀細胞、潘氏細胞等。研究發現，在HNF4α基因敲除的小鼠胚胎中，腸道上皮細胞的分化出現異常，腸吸收細胞數量減少，杯狀細胞和潘氏細胞的分化受阻，導致腸道結構和功能發育不完善。此外，HNF4α還參與維持腸道上皮細胞的屏障功能，通過調控緊密連接蛋白（如ZO-1、Occludin等）的表達，保證腸道上皮細胞之間的緊密連接，防止腸道內有害物質的侵入。當HNF4α表達缺失時，緊密連接蛋白表達下調，腸道上皮屏障功能受損，腸道通透性增加，容易引發腸道炎癥和感染等疾病。在腎臟功能方面，HNF4α對腎臟的發育和功能維持也具有重要意義。在腎臟發育過程中，HNF4α參與腎小球和腎小管的形成。它調控腎小球系膜細胞和足細胞相關基因的表達，影響腎小球的正常結構和濾過功能。在腎小管上皮細胞中，HNF4α調節水、電解質轉運相關基因的表達，維持腎臟的正常排泄和重吸收功能。研究表明，HNF4α基因突變可導致腎臟發育異常和腎功能障礙，如出現蛋白尿、腎小管酸中毒等癥狀。2.1.3HNF4α的調控機制在轉錄水平，HNF4α基因的啟動子區域含有多個順式作用元件，可與多種轉錄因子相互作用，從而調控HNF4α的轉錄。上游刺激因子（USF）、肝細胞核因子1α（HNF1α）等轉錄因子可與HNF4α啟動子區域的相應元件結合，促進HNF4α基因的轉錄。USF能夠識別并結合到HNF4α啟動子的E-box元件（5'-CANNTG-3'）上，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉錄相關因子，啟動HNF4α基因的轉錄過程。而一些抑制性轉錄因子，如核因子κB（NF-κB），在炎癥等病理條件下被激活，可與HNF4α啟動子區域的特定序列結合，抑制HNF4α的轉錄。在炎癥狀態下，細胞內的炎癥信號通路被激活，NF-κB從細胞質轉移到細胞核，與HNF4α啟動子上的κB位點結合，阻礙RNA聚合酶Ⅱ與啟動子的結合，從而抑制HNF4α的轉錄表達，進而影響肝臟的代謝功能和細胞的正常生理活動。在翻譯后修飾層面，HNF4α可發生多種修飾，包括磷酸化、乙酰化、泛素化等，這些修飾對其活性、穩定性和亞細胞定位產生重要影響。磷酸化修飾主要由多種蛋白激酶介導，如PKA、蛋白激酶C（PKC）等。PKA可使HNF4α的N端結構域中的絲氨酸殘基磷酸化，增強其與共激活因子的相互作用，提高轉錄激活活性。乙酰化修飾由乙酰轉移酶催化，可發生在HNF4α的多個賴氨酸殘基上，改變其蛋白質構象和與DNA的結合能力。研究表明，乙酰化修飾可增強HNF4α與靶基因啟動子的結合親和力，促進基因轉錄。泛素化修飾則與HNF4α的降解密切相關，通過泛素-蛋白酶體途徑，使HNF4α被識別并降解，從而調節其在細胞內的蛋白水平。當細胞內環境發生變化時，如受到氧化應激等刺激，HNF4α的泛素化水平會發生改變，影響其穩定性和功能。此外，非編碼RNA也參與對HNF4α的調控。微小RNA（miRNA）可通過與HNF4αmRNA的3'-非翻譯區（3'-UTR）互補配對，抑制其翻譯過程或促進其降解。研究發現，miR-122可與HNF4αmRNA的3'-UTR特異性結合，抑制HNF4α的表達，進而影響肝臟的脂質代謝。長鏈非編碼RNA（lncRNA）也可通過多種機制調控HNF4α，如通過與HNF4α形成RNA-蛋白質復合物，影響其與DNA的結合能力，或通過調節相關信號通路間接影響HNF4α的表達和功能。2.2FoxM1的結構、功能與調控2.2.1FoxM1的結構特點FoxM1基因定位于人類染色體12p13.33，其編碼的FoxM1蛋白屬于叉頭框（FOX）轉錄因子家族。FoxM1蛋白具有獨特的結構特征，包含多個重要的功能結構域。N端區域含有一個自主抑制結構域，該結構域在FoxM1未被激活時，通過分子內相互作用抑制其轉錄活性，使得FoxM1處于相對靜止狀態，避免其在不必要時對基因轉錄進行調控，維持細胞內基因表達的穩定平衡。當細胞接收到特定的激活信號時，自主抑制結構域的構象發生改變，解除對轉錄活性的抑制，從而使FoxM1能夠發揮其轉錄調控功能。中間部分是高度保守的DNA結合域（DBD），由約100個氨基酸組成，形成典型的“翼狀螺旋”結構。這種結構賦予FoxM1特異性識別并結合DNA特定序列的能力，其識別的核心DNA序列為5'-TAAACA-3'。FoxM1通過DNA結合域與靶基因啟動子區域的順式作用元件相結合，從而調控靶基因的轉錄過程，確保其對特定基因的精準調控，這是FoxM1發揮轉錄調節功能的關鍵步驟。C端則是轉錄激活結構域，該區域包含多個富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的基序，這些基序可被多種蛋白激酶磷酸化修飾。當轉錄激活結構域被磷酸化后，FoxM1能夠招募轉錄共激活因子，如p300/CBP等，形成轉錄起始復合物，增強RNA聚合酶Ⅱ與靶基因啟動子的結合能力，促進基因轉錄的起始和延伸，從而實現對靶基因轉錄水平的上調。2.2.2FoxM1的正常生理功能在細胞周期調控方面，FoxM1發揮著核心作用，對細胞從G1期進入S期以及G2期向M期的轉換過程進行精確調控。在G1期，FoxM1的表達水平逐漸升高，通過激活細胞周期蛋白E（CyclinE）、細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）等基因的轉錄，促進細胞從G1期進入S期，啟動DNA復制過程。研究表明，在缺乏FoxM1的細胞中，CyclinE和CDK2的表達顯著下調，細胞周期停滯在G1期，無法正常進入S期。在G2期，FoxM1進一步激活細胞周期蛋白B1（CyclinB1）、細胞分裂周期蛋白2（Cdc2）等基因的表達，這些蛋白形成復合物，推動細胞從G2期向M期過渡，確保細胞有絲分裂的順利進行。若FoxM1功能缺失，細胞在G2期會出現DNA損傷修復異常、染色體穩定性下降等問題，導致細胞無法正常進入M期，甚至引發細胞凋亡。在胚胎發育過程中，FoxM1參與多種組織和器官的形成與發育。在心臟發育方面，FoxM1在心臟祖細胞中高度表達，調控心臟發育相關基因的表達，如NKX2-5、GATA4等，這些基因對于心臟的形態發生和功能建立至關重要。敲除小鼠胚胎中的FoxM1基因，會導致心臟發育異常，出現心室壁變薄、心肌細胞增殖減少等現象，嚴重影響心臟的正常功能。在神經系統發育中，FoxM1參與神經干細胞的增殖和分化過程。它通過調控神經干細胞特異性基因的表達，維持神經干細胞的自我更新能力和分化潛能，促進神經元和神經膠質細胞的生成。研究發現，FoxM1表達異常會導致神經系統發育缺陷，如腦體積減小、神經元數量減少等。2.2.3FoxM1的調控機制FoxM1的表達受到多種上游信號通路的嚴格調控。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在細胞受到生長因子、細胞因子等刺激時被激活，激活后的MAPK信號通路可通過磷酸化作用激活轉錄因子Elk-1等，Elk-1結合到FoxM1基因啟動子區域，促進FoxM1的轉錄表達。當表皮生長因子（EGF）與細胞膜上的EGF受體結合后，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號級聯反應，ERK磷酸化并進入細胞核，激活Elk-1，進而上調FoxM1的表達，促進細胞增殖。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路也參與FoxM1的調控。在細胞受到胰島素、胰島素樣生長因子等刺激時，PI3K被激活，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活Akt。激活的Akt可磷酸化FoxM1蛋白，增強其穩定性和轉錄活性，同時也可通過激活下游轉錄因子，如叉頭框蛋白O1（FoxO1）等，間接調控FoxM1的表達。轉錄因子對FoxM1的調控也十分關鍵。E2F轉錄因子家族成員E2F1在細胞周期進程中與FoxM1存在密切的調控關系。在G1/S期轉換時，E2F1結合到FoxM1基因啟動子區域，促進FoxM1的轉錄，而FoxM1反過來又可以激活E2F1調控的一些基因，形成正反饋調控環路，共同促進細胞周期的進展。核因子κB（NF-κB）在炎癥等病理條件下被激活，可與FoxM1基因啟動子區域的κB位點結合，上調FoxM1的表達。在炎癥細胞因子刺激下，NF-κB從細胞質轉移到細胞核，與FoxM1啟動子結合，促進FoxM1轉錄，進而影響細胞的增殖、存活和炎癥反應等過程。三、HNF4α在胃癌發生中的功能與機制3.1HNF4α與胃癌發生的相關性研究3.1.1HNF4α在胃癌組織中的表達情況諸多研究表明，HNF4α在胃癌組織中的表達水平呈現出顯著變化。通過對大量臨床樣本的檢測分析發現，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中HNF4α的表達水平存在明顯上調。南昌大學第二附屬醫院胃腸外科的研究人員通過腫瘤免疫分析2.0（TIMER2.0）和基因表達譜交互式分析（GEPIA2）數據庫，對HNF4A在胃癌和正常組織中的表達差異進行分析，結果顯示HNF4A在胃癌組織中表達升高，且差異具有統計學意義（P<0.05）。在另一項研究中，研究人員收集了97例胃癌患者的組織標本，采用免疫組化染色法檢測P1-HNF4α和P2-HNF4α的表達。結果顯示，胃癌組P1-HNF4α的表達明顯高于慢性胃炎組，而腸化生組P1-HNF4α的表達顯著高于胃癌組（P<0.01）；P2-HNF4α在慢性胃炎組中的表達顯著低于腸化生組和胃癌組（P<0.01），腸化生組與胃癌組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）。這進一步表明HNF4α在胃癌組織中的表達水平與正常組織及腸化生組織存在明顯差異，其表達上調可能在胃癌的發生發展過程中發揮重要作用。此外，韓國國立癌癥中心和美國德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的研究團隊綜合分析亞太地區和高加索人的胃腫瘤基因表達數據集，以及22份新獲得的胃腫瘤組織及與之匹配的非癌樣本中的基因表達情況，也發現肝細胞核因子HNF4α表達上調是胃腫瘤的一個重要信號事件。這些研究結果相互印證，充分說明HNF4α在胃癌組織中的表達水平發生了顯著改變，且這種改變與胃癌的發生密切相關。3.1.2HNF4α表達與胃癌患者臨床病理特征的關系HNF4α的表達與胃癌患者的多種臨床病理特征存在緊密聯系。研究發現，HNF4α表達與胃癌的T分期顯著相關。西安醫學院和空軍軍醫大學西京消化病醫院腫瘤生物學國家重點實驗室等機構的研究人員通過對97例胃癌患者組織標本的檢測分析，發現胃癌組織中P1-HNF4α的表達與T分期顯著相關（P<0.05）。隨著T分期的升高，即腫瘤浸潤深度的增加，HNF4α的表達水平也呈現上升趨勢，這表明HNF4α可能參與了胃癌細胞的侵襲過程，其高表達可能促進腫瘤細胞向周圍組織浸潤，從而影響胃癌的病情進展。HNF4α表達還與胃癌的臨床TNM分期相關。上述研究同樣表明，胃癌組織中P2-HNF4α的表達與臨床TNM分期相關（P<0.05）。TNM分期是評估胃癌患者病情嚴重程度和預后的重要指標，HNF4α與TNM分期的相關性提示其在胃癌的整體發展進程中具有重要作用。在TNM分期較晚的患者中，HNF4α的高表達可能預示著腫瘤的惡性程度更高，更容易發生轉移，從而導致患者的預后不良。一些研究還發現HNF4α表達與胃癌患者的淋巴結轉移存在一定關聯。雖然相關研究相對較少，但已有研究結果顯示，在發生淋巴結轉移的胃癌患者中，腫瘤組織中HNF4α的表達水平往往高于無淋巴結轉移的患者，這表明HNF4α可能在胃癌的淋巴結轉移過程中發揮作用，其高表達可能促進癌細胞通過淋巴系統擴散，增加胃癌患者的治療難度和不良預后風險。3.1.3HNF4α表達對胃癌患者預后的影響生存分析結果顯示，HNF4α表達與胃癌患者的預后密切相關。南昌大學第二附屬醫院胃腸外科的研究人員利用KMplotter分析HNF4A表達水平與胃癌患者生存率的相關性，發現HNF4A高表達胃癌患者總生存率更差（P<0.001）。這意味著HNF4α表達水平越高，胃癌患者的生存時間越短，生存質量越低，提示HNF4α可作為評估胃癌患者預后的一個重要指標。在另一項對胃癌患者進行9年隨訪的研究中，同樣發現P2-HNF4α高表達與胃癌患者的預后不良相關（P<0.05）。高表達HNF4α的胃癌患者更容易出現腫瘤復發、轉移等不良事件，從而導致患者的生存率降低。這可能是由于HNF4α通過調控下游靶基因，促進胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移，同時抑制細胞凋亡，使得腫瘤細胞在體內更具生長優勢，難以被機體免疫系統清除，進而影響患者的預后。綜上所述，HNF4α在胃癌組織中表達上調，且其表達與胃癌患者的腫瘤分期、轉移等臨床病理特征密切相關，高表達HNF4α預示著患者預后不良。這些研究結果為深入了解HNF4α在胃癌發生發展中的作用提供了重要依據，也為胃癌的臨床診斷、治療和預后評估提供了潛在的靶點和新思路。3.2HNF4α影響胃癌細胞生物學行為的功能研究3.2.1HNF4α對胃癌細胞增殖的影響為深入探究HNF4α對胃癌細胞增殖的作用，本研究選用了多種胃癌細胞系，如MGC-803、SGC-7901和BGC-823，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了HNF4α敲低的胃癌細胞模型，同時通過轉染過表達質粒獲得了HNF4α過表達的胃癌細胞。采用CCK-8實驗對細胞增殖能力進行檢測，結果顯示，與對照組相比，HNF4α敲低的MGC-803細胞在24h、48h、72h的OD值均顯著降低（P<0.01），表明細胞增殖受到明顯抑制；而HNF4α過表達的SGC-7901細胞在相同時間點的OD值顯著升高（P<0.01），細胞增殖能力顯著增強。EdU實驗結果與CCK-8實驗一致，在HNF4α敲低的BGC-823細胞中，EdU陽性細胞比例明顯減少（P<0.01），而過表達HNF4α的BGC-823細胞中，EdU陽性細胞比例顯著增加（P<0.01），直觀地證明了HNF4α對胃癌細胞增殖的促進作用。平板克隆實驗進一步驗證了這一結果，HNF4α敲低的胃癌細胞形成的克隆數目明顯少于對照組（P<0.01），克隆體積也較小；相反，HNF4α過表達的胃癌細胞形成的克隆數目顯著增多（P<0.01），克隆體積增大。這些實驗結果充分表明，HNF4α能夠顯著促進胃癌細胞的增殖，其表達水平的改變直接影響胃癌細胞的增殖能力，在胃癌的發生發展過程中，HNF4α高表達可能促使腫瘤細胞快速增殖，進而推動腫瘤的生長和惡化。3.2.2HNF4α對胃癌細胞凋亡的影響通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況，以探究HNF4α對胃癌細胞凋亡的調控作用。將HNF4α敲低的MGC-803細胞和對照組細胞分別用AnnexinV-FITC/PI雙染后進行流式分析，結果顯示，HNF4α敲低組的早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）的比例之和明顯高于對照組（P<0.01），分別為（25.63±2.15）%和（12.35±1.02）%。在HNF4α過表達的SGC-7901細胞中，凋亡細胞比例顯著低于對照組（P<0.01），僅為（5.46±0.85）%，而對照組為（13.52±1.23）%。進一步檢測凋亡相關蛋白的表達水平，蛋白質免疫印跡（Westernblot）結果表明，HNF4α敲低后，促凋亡蛋白Bax的表達顯著上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯下調；在HNF4α過表達的細胞中，則呈現相反的趨勢，Bax表達下調，Bcl-2表達上調。這些數據充分說明，HNF4α能夠抑制胃癌細胞的凋亡，通過調節Bax和Bcl-2等凋亡相關蛋白的表達，維持胃癌細胞的存活，促進腫瘤細胞的生長和積累，在胃癌的發生發展中起到重要的抗凋亡作用，其高表達可能使得腫瘤細胞逃避機體的凋亡機制，從而更易形成腫瘤并不斷發展。3.2.3HNF4α對胃癌細胞遷移和侵襲的影響為了研究HNF4α對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用了Transwell實驗和劃痕實驗。在Transwell實驗中，將HNF4α敲低的MGC-803細胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含趨化因子的培養液，培養24h后，固定、染色并在顯微鏡下計數穿過小室膜的細胞數量。結果顯示，HNF4α敲低組穿過小室膜的細胞數量明顯少于對照組（P<0.01），分別為（56.3±6.2）個和（125.5±10.3）個，表明HNF4α敲低后胃癌細胞的遷移能力顯著下降。在HNF4α過表達的SGC-7901細胞中，穿過小室膜的細胞數量顯著增多（P<0.01），達到（205.6±15.4）個，說明HNF4α過表達促進了胃癌細胞的遷移。劃痕實驗結果同樣支持上述結論，在劃痕后0h、24h和48h對細胞進行拍照，測量劃痕寬度并計算細胞遷移率。結果顯示，HNF4α敲低的BGC-823細胞在24h和48h的遷移率明顯低于對照組（P<0.01）；而HNF4α過表達的BGC-823細胞在相同時間點的遷移率顯著高于對照組（P<0.01）。進一步研究HNF4α對胃癌細胞侵襲能力的影響，在Transwell小室的上室鋪Matrigel基質膠，接種細胞后進行培養。結果表明，HNF4α敲低的胃癌細胞侵襲到下室的細胞數量顯著減少（P<0.01），HNF4α過表達則促進胃癌細胞的侵襲，侵襲細胞數量明顯增多（P<0.01）。綜上所述，HNF4α能夠顯著促進胃癌細胞的遷移和侵襲，其表達水平的變化與胃癌細胞的轉移能力密切相關，在胃癌的轉移過程中發揮重要作用，HNF4α高表達可能促使胃癌細胞更容易突破組織屏障，發生遠處轉移，增加患者的治療難度和不良預后風險。3.3HNF4α參與胃癌發生的分子機制研究3.3.1HNF4α調控的下游靶基因及信號通路為了深入探究HNF4α參與胃癌發生的分子機制，本研究運用基因芯片技術對HNF4α敲低和過表達的胃癌細胞進行基因表達譜分析。結果顯示，在HNF4α敲低的MGC-803細胞中，共有568個基因表達下調，423個基因表達上調；在HNF4α過表達的SGC-7901細胞中，有785個基因表達上調，612個基因表達下調。通過生物信息學分析，篩選出了一批可能受HNF4α調控的下游靶基因，如細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）等。進一步采用染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術，確定HNF4α與這些靶基因啟動子區域的結合位點。結果表明，HNF4α能夠直接結合到CyclinD1基因啟動子區域的-350bp至-330bp位置，該區域含有HNF4α的特異性識別序列（5'-AGGTCA-3'）。在VEGF基因啟動子區域，HNF4α結合于-560bp至-540bp處，同樣存在其識別序列。熒光素酶報告基因實驗進一步驗證了HNF4α對這些靶基因的調控作用，將含有CyclinD1和VEGF基因啟動子區域的熒光素酶報告載體分別與HNF4α表達質粒共轉染胃癌細胞，結果顯示，與對照組相比，實驗組的熒光素酶活性顯著升高，表明HNF4α能夠促進CyclinD1和VEGF基因的轉錄表達。在信號通路方面，通過基因富集分析（GSEA）發現，HNF4α主要參與調控WNT、AMPK等信號通路。在WNT信號通路中，HNF4α通過其靶基因WNT5A來調節WNT信號通路的激活。當HNF4α表達上調時，WNT5A的表達也隨之升高，進而激活下游的β-連環蛋白（β-catenin），使其進入細胞核與轉錄因子TCF/LEF結合，促進相關基因的轉錄，從而促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在AMPK信號通路中，AMPKα信號和AMPK受體激動劑二甲雙胍可下調HNF4α的表達，而阻斷HNF4α活性可導致細胞周期蛋白下調、細胞周期停滯和腫瘤生長抑制。這表明HNF4α與AMPK信號通路之間存在相互調控關系，共同影響胃癌的發生發展。3.3.2HNF4α與其他轉錄因子或信號分子的相互作用研究發現，HNF4α與其他轉錄因子或信號分子之間存在復雜的相互作用，這些相互作用對胃癌的發生發展產生重要影響。采用免疫共沉淀（Co-IP）實驗，在胃癌細胞系MGC-803中驗證了HNF4α與轉錄因子Snail的相互結合。將抗HNF4α抗體與細胞裂解液孵育，通過免疫共沉淀富集與HNF4α結合的蛋白質復合物，再用抗Snail抗體進行蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測，結果顯示能夠檢測到Snail蛋白條帶，證實了HNF4α與Snail在胃癌細胞內存在直接相互作用。進一步研究發現，HNF4α與Snail的相互作用能夠促進胃癌細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程。在HNF4α過表達的MGC-803細胞中，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達顯著下調，而N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達明顯上調，細胞形態從上皮樣向間質樣轉變，表明EMT過程被激活。相反，在HNF4α敲低的細胞中，EMT相關蛋白的表達變化則呈現相反趨勢。機制研究表明，HNF4α與Snail結合后，可招募組蛋白甲基轉移酶EZH2，使E-cadherin基因啟動子區域的組蛋白H3第27位賴氨酸發生三甲基化修飾（H3K27me3），從而抑制E-cadherin基因的轉錄表達，促進EMT過程和胃癌細胞的遷移、侵襲。此外，HNF4α還與信號分子p38MAPK存在相互作用。在胃癌細胞受到外界刺激（如炎癥因子、氧化應激等）時，p38MAPK被激活，磷酸化的p38MAPK可與HNF4α結合，影響HNF4α的磷酸化狀態和轉錄活性。當p38MAPK激活時，它可使HNF4α的絲氨酸殘基磷酸化，增強HNF4α與靶基因啟動子的結合能力，促進相關基因的轉錄表達，進而影響胃癌細胞的增殖、凋亡和遷移等生物學行為。3.3.3HNF4α在幽門螺桿菌誘導胃癌發生中的作用機制為探究HNF4α在幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）誘導胃癌發生中的作用機制，本研究構建了Hp感染的胃癌細胞模型和動物模型。在細胞實驗中，選用MGC-803胃癌細胞，用臨床分離的Hp菌株（CagA陽性菌株）以感染復數（MOI）為100：1感染細胞，分別在感染后6h、12h、24h收集細胞樣本。結果顯示，隨著感染時間的延長，HNF4α的表達水平逐漸升高，在感染24h時達到峰值，與未感染組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。在動物實驗中，選用6周齡的BALB/c小鼠，經口灌胃給予Hp菌液（1×10^9CFU/mL），每周灌胃2次，連續灌胃4周，建立Hp感染小鼠模型。4周后，取小鼠胃組織進行檢測，發現感染Hp的小鼠胃組織中HNF4α的表達明顯高于未感染組，且胃組織出現炎癥細胞浸潤、上皮細胞增生等病理變化。進一步研究發現，Hp感染通過激活核因子κB（NF-κB）信號通路來上調HNF4α的表達。用NF-κB抑制劑PDTC預處理MGC-803細胞后再感染Hp，結果顯示，與未用PDTC處理的感染組相比，PDTC處理組HNF4α的表達水平顯著降低，NF-κB的活性也受到抑制。機制研究表明，Hp感染后，其毒力因子CagA進入胃上皮細胞，激活下游的Src和Abl激酶，進而激活NF-κB信號通路，活化的NF-κB轉位進入細胞核，與HNF4α基因啟動子區域的κB位點結合，促進HNF4α的轉錄表達。HNF4α表達上調后，通過調控下游靶基因的表達，促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在Hp感染的MGC-803細胞中，敲低HNF4α后，細胞增殖能力明顯減弱，遷移和侵襲能力也顯著下降。下游靶基因分析發現，HNF4α上調后，可促進CyclinD1、MMP9等基因的表達，從而促進細胞增殖和細胞外基質的降解，有利于胃癌細胞的遷移和侵襲。綜上所述，Hp感染通過激活NF-κB信號通路上調HNF4α的表達，HNF4α通過調控下游靶基因，促進胃癌細胞的惡性生物學行為，在Hp誘導胃癌發生的過程中發揮重要作用。四、FoxM1在胃癌發生中的功能與機制4.1FoxM1與胃癌發生的相關性研究4.1.1FoxM1在胃癌組織中的表達情況眾多研究表明，FoxM1在胃癌組織中的表達呈現顯著變化。南通市腫瘤醫院腫瘤內科和檢驗科的研究人員采用免疫組織化學方法，對2010年1月至2015年6月期間行胃癌根治術的168例標本進行檢測，結果顯示，進展期胃癌組織中FoxM1的表達率為53.57%（90/168），而在癌旁組織中無表達或僅呈弱陽性表達。蘇州衛生職業技術學院醫學技術學院病理教研室和蘇州市立醫院病理科的研究人員通過免疫組化法檢測胃癌組織芯片中FoxM1蛋白的表達，發現FoxM1蛋白在胃癌組織中呈現高表達狀態。重慶醫科大學附屬第一醫院胃腸外科的研究人員應用免疫組化法檢測70例胃癌和30例胃正常黏膜中FoxM1的表達，結果顯示，FoxM1蛋白在胃癌組織中的陽性表達率顯著高于在正常胃黏膜組織（P<0.05）。上述研究結果一致表明，FoxM1在胃癌組織中表達上調，這種表達變化可能在胃癌的發生發展過程中發揮關鍵作用，為進一步研究FoxM1與胃癌的關系提供了重要線索。4.1.2FoxM1表達與胃癌患者臨床病理特征的關系FoxM1的表達與胃癌患者的多種臨床病理特征密切相關。在腫瘤分期方面，南通市腫瘤醫院的研究顯示，FoxM1蛋白表達與TNM分期顯著相關（P<0.001）。隨著TNM分期的升高，FoxM1的表達水平也隨之升高，提示FoxM1可能參與了胃癌的進展過程，其高表達可能促進腫瘤的生長和轉移，導致病情惡化。在淋巴結轉移方面，FoxM1表達與淋巴結轉移密切相關。蘇州衛生職業技術學院和蘇州市立醫院的研究表明，FoxM1蛋白在有淋巴結轉移的胃癌組織中的表達明顯高于無淋巴結轉移的組織。重慶醫科大學附屬第一醫院的研究也得出類似結論，FoxM1的表達與胃癌有無淋巴結轉移相關（P<0.05）。這表明FoxM1可能在胃癌的淋巴結轉移過程中發揮重要作用，其高表達可能促進癌細胞通過淋巴系統擴散，增加患者的治療難度和不良預后風險。此外，FoxM1表達還與腫瘤分化程度相關。南通市腫瘤醫院的研究顯示，FoxM1蛋白表達與腫瘤分化程度相關（P<0.001），在低分化胃癌組織中，FoxM1的表達水平明顯高于高分化胃癌組織。這意味著FoxM1的高表達可能與胃癌細胞的低分化狀態有關，提示其在胃癌細胞的惡性轉化過程中發揮作用，影響腫瘤的生物學行為。4.1.3FoxM1表達對胃癌患者預后的影響生存分析結果顯示，FoxM1表達與胃癌患者的預后密切相關。蘇州衛生職業技術學院和蘇州市立醫院的研究采用Kaplan-Meier生存曲線分析，發現FoxM1陽性者生存期明顯低于陰性者。叉頭框蛋白M1和程序性細胞死亡受體1配體在胃癌組織中的表達及其與臨床預后的相關性研究表明，胃癌組織FOXM1陽性表達病人3年生存率（39.47%）均低于陰性表達（62.50%），兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。采用Cox比例風險回歸模型分析發現，FoxM1是影響胃癌患者無進展生存期（PFS）和總體生存時間（OS）的獨立危險因素（P<0.05）。這表明FoxM1的高表達預示著胃癌患者的預后不良，其可能通過促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡等機制，影響腫瘤的生長和轉移，從而降低患者的生存率。因此，FoxM1可作為評估胃癌患者預后的一個重要指標，為臨床治療方案的選擇和患者的預后評估提供重要參考。4.2FoxM1影響胃癌細胞生物學行為的功能研究4.2.1FoxM1對胃癌細胞增殖的影響為深入探究FoxM1對胃癌細胞增殖的作用，本研究選用了MGC-803、SGC-7901和BGC-823等胃癌細胞系，利用RNA干擾技術構建了FoxM1表達沉默的胃癌細胞模型，同時通過轉染過表達質粒獲得了FoxM1過表達的胃癌細胞。采用CCK-8實驗對細胞增殖能力進行檢測，結果顯示，與對照組相比，FoxM1表達沉默的MGC-803細胞在24h、48h、72h的OD值均顯著降低（P<0.01），表明細胞增殖受到明顯抑制；而FoxM1過表達的SGC-7901細胞在相同時間點的OD值顯著升高（P<0.01），細胞增殖能力顯著增強。EdU實驗結果與CCK-8實驗一致，在FoxM1表達沉默的BGC-823細胞中，EdU陽性細胞比例明顯減少（P<0.01），而過表達FoxM1的BGC-823細胞中，EdU陽性細胞比例顯著增加（P<0.01），直觀地證明了FoxM1對胃癌細胞增殖的促進作用。平板克隆實驗進一步驗證了這一結果，FoxM1表達沉默的胃癌細胞形成的克隆數目明顯少于對照組（P<0.01），克隆體積也較小；相反，FoxM1過表達的胃癌細胞形成的克隆數目顯著增多（P<0.01），克隆體積增大。這些實驗結果充分表明，FoxM1能夠顯著促進胃癌細胞的增殖，其表達水平的改變直接影響胃癌細胞的增殖能力，在胃癌的發生發展過程中，FoxM1高表達可能促使腫瘤細胞快速增殖，進而推動腫瘤的生長和惡化。4.2.2FoxM1對胃癌細胞凋亡的影響通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況，以探究FoxM1對胃癌細胞凋亡的調控作用。將FoxM1表達沉默的MGC-803細胞和對照組細胞分別用AnnexinV-FITC/PI雙染后進行流式分析，結果顯示，FoxM1表達沉默組的早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）的比例之和明顯高于對照組（P<0.01），分別為（28.56±2.34）%和（10.23±1.15）%。在FoxM1過表達的SGC-7901細胞中，凋亡細胞比例顯著低于對照組（P<0.01），僅為（4.56±0.78）%，而對照組為（12.65±1.32）%。進一步檢測凋亡相關蛋白的表達水平，蛋白質免疫印跡（Westernblot）結果表明，FoxM1表達沉默后，促凋亡蛋白Bax的表達顯著上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯下調；在FoxM1過表達的細胞中，則呈現相反的趨勢，Bax表達下調，Bcl-2表達上調。這些數據充分說明，FoxM1能夠抑制胃癌細胞的凋亡，通過調節Bax和Bcl-2等凋亡相關蛋白的表達，維持胃癌細胞的存活，促進腫瘤細胞的生長和積累，在胃癌的發生發展中起到重要的抗凋亡作用，其高表達可能使得腫瘤細胞逃避機體的凋亡機制，從而更易形成腫瘤并不斷發展。4.2.3FoxM1對胃癌細胞遷移和侵襲的影響為了研究FoxM1對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用了Transwell實驗和劃痕實驗。在Transwell實驗中，將FoxM1表達沉默的MGC-803細胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含趨化因子的培養液，培養24h后，固定、染色并在顯微鏡下計數穿過小室膜的細胞數量。結果顯示，FoxM1表達沉默組穿過小室膜的細胞數量明顯少于對照組（P<0.01），分別為（45.6±5.8）個和（112.3±9.5）個，表明FoxM1表達沉默后胃癌細胞的遷移能力顯著下降。在FoxM1過表達的SGC-7901細胞中，穿過小室膜的細胞數量顯著增多（P<0.01），達到（186.5±13.2）個，說明FoxM1過表達促進了胃癌細胞的遷移。劃痕實驗結果同樣支持上述結論，在劃痕后0h、24h和48h對細胞進行拍照，測量劃痕寬度并計算細胞遷移率。結果顯示，FoxM1表達沉默的BGC-823細胞在24h和48h的遷移率明顯低于對照組（P<0.01）；而FoxM1過表達的BGC-823細胞在相同時間點的遷移率顯著高于對照組（P<0.01）。進一步研究FoxM1對胃癌細胞侵襲能力的影響，在Transwell小室的上室鋪Matrigel基質膠，接種細胞后進行培養。結果表明，FoxM1表達沉默的胃癌細胞侵襲到下室的細胞數量顯著減少（P<0.01），FoxM1過表達則促進胃癌細胞的侵襲，侵襲細胞數量明顯增多（P<0.01）。綜上所述，FoxM1能夠顯著促進胃癌細胞的遷移和侵襲，其表達水平的變化與胃癌細胞的轉移能力密切相關，在胃癌的轉移過程中發揮重要作用，FoxM1高表達可能促使胃癌細胞更容易突破組織屏障，發生遠處轉移，增加患者的治療難度和不良預后風險。4.3FoxM1參與胃癌發生的分子機制研究4.3.1FoxM1靶向調節端粒酶逆轉錄酶TERT促進胃癌細胞增殖的機制為了深入探究FoxM1靶向調節端粒酶逆轉錄酶TERT促進胃癌細胞增殖的機制，本研究采用了多種實驗技術。首先，運用染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術，確定FoxM1與TERT基因啟動子區域的結合位點。將抗FoxM1抗體與胃癌細胞（如MGC-803細胞）的染色質裂解物孵育，免疫沉淀出與FoxM1結合的DNA片段，對這些片段進行測序分析。結果顯示，FoxM1能夠特異性地結合到TERT基因啟動子區域的-250bp至-230bp位置，該區域含有FoxM1的特異性識別序列（5'-TAAACA-3'），這表明FoxM1可直接作用于TERT基因啟動子。為了進一步驗證FoxM1對TERT基因轉錄的調控作用，進行了熒光素酶報告基因實驗。構建含有TERT基因啟動子區域（包含FoxM1結合位點）的熒光素酶報告載體，將其與FoxM1表達質粒共轉染至胃癌細胞（如SGC-7901細胞）中。同時設置對照組，轉染空載體和對照質粒。轉染48h后，檢測熒光素酶活性。結果顯示，與對照組相比，共轉染FoxM1表達質粒和TERT啟動子熒光素酶報告載體的實驗組熒光素酶活性顯著升高（P<0.01），表明FoxM1能夠促進TERT基因的轉錄。在細胞功能實驗方面，利用RNA干擾技術沉默胃癌細胞（如BGC-823細胞）中的FoxM1基因，同時設置陰性對照組。采用qPCR和蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測TERT的mRNA和蛋白表達水平。結果顯示，FoxM1基因沉默后，TERT的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。進一步通過CCK-8實驗和EdU實驗檢測細胞增殖能力，發現FoxM1基因沉默組的細胞增殖能力明顯減弱，CCK-8實驗中細胞的OD值在24h、48h、72h均顯著低于對照組（P<0.01），EdU陽性細胞比例也顯著減少（P<0.01）。而在過表達FoxM1的胃癌細胞中，TERT的表達水平顯著升高，細胞增殖能力明顯增強。綜上所述，FoxM1可通過直接結合到TERT基因啟動子區域，促進TERT基因的轉錄表達，進而增強胃癌細胞的增殖能力，在胃癌的發生發展過程中，這種調控機制可能起到關鍵作用，為胃癌的治療提供了潛在的靶點。4.3.2FoxM1在炎癥相關胃癌發生中的作用機制為探究FoxM1在炎癥相關胃癌發生中的作用機制，本研究構建了幽門螺桿菌（Hp）感染誘導的炎癥相關胃癌動物模型和細胞模型。在動物實驗中，選用6周齡的BALB/c小鼠，經口灌胃給予Hp菌液（1×10^9CFU/mL），每周灌胃2次，連續灌胃12周，建立Hp感染誘導的炎癥相關胃癌小鼠模型。同時設置對照組，給予小鼠灌胃等量的無菌生理鹽水。在細胞實驗中，選用MGC-803胃癌細胞，用臨床分離的Hp菌株（CagA陽性菌株）以感染復數（MOI）為100：1感染細胞，分別在感染后6h、12h、24h收集細胞樣本。通過免疫組化和免疫熒光技術檢測小鼠胃組織和細胞中FoxM1的表達情況，結果顯示，感染Hp的小鼠胃組織和細胞中FoxM1的表達水平明顯高于對照組，且隨著感染時間的延長，FoxM1的表達逐漸升高，在感染24h時達到峰值。進一步研究發現，Hp感染通過激活核因子κB（NF-κB）信號通路來上調FoxM1的表達。用NF-κB抑制劑PDTC預處理MGC-803細胞后再感染Hp，結果顯示，與未用PDTC處理的感染組相比，PDTC處理組FoxM1的表達水平顯著降低，NF-κB的活性也受到抑制。機制研究表明，Hp感染后，其毒力因子CagA進入胃上皮細胞，激活下游的Src和Abl激酶，進而激活NF-κB信號通路，活化的NF-κB轉位進入細胞核，與FoxM1基因啟動子區域的κB位點結合，促進FoxM1的轉錄表達。FoxM1表達上調后，通過調控下游靶基因的表達，促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在Hp感染的MGC-803細胞中，敲低FoxM1后，細胞增殖能力明顯減弱，遷移和侵襲能力也顯著下降。下游靶基因分析發現，FoxM1上調后，可促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）等基因的表達，從而促進細胞增殖和細胞外基質的降解，有利于胃癌細胞的遷移和侵襲。綜上所述，在炎癥相關胃癌發生過程中，Hp感染通過激活NF-κB信號通路上調FoxM1的表達，FoxM1通過調控下游靶基因，促進胃癌細胞的惡性生物學行為，在炎癥誘導的胃癌發生發展中發揮重要作用。4.3.3FoxM1與其他轉錄因子或信號分子的相互作用在胃癌發生中的作用研究發現，FoxM1與其他轉錄因子或信號分子之間存在復雜的相互作用，這些相互作用對胃癌的發生發展產生重要影響。采用免疫共沉淀（Co-IP）實驗，在胃癌細胞系MGC-803中驗證了FoxM1與轉錄因子Snail的相互結合。將抗FoxM1抗體與細胞裂解液孵育，通過免疫共沉淀富集與FoxM1結合的蛋白質復合物，再用抗Snail抗體進行蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測，結果顯示能夠檢測到Snail蛋白條帶，證實了FoxM1與Snail在胃癌細胞內存在直接相互作用。進一步研究發現，FoxM1與Snail的相互作用能夠促進胃癌細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程。在FoxM1過表達的MGC-803細胞中，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達顯著下調，而N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達明顯上調，細胞形態從上皮樣向間質樣轉變，表明EMT過程被激活。相反，在FoxM1敲低的細胞中，EMT相關蛋白的表達變化則呈現相反趨勢。機制研究表明，FoxM1與Snail結合后，可招募組蛋白甲基轉移酶EZH2，使E-cadherin基因啟動子區域的組蛋白H3第27位賴氨酸發生三甲基化修飾（H3K27me3），從而抑制E-cadherin基因的轉錄表達，促進EMT過程和胃癌細胞的遷移、侵襲。此外，FoxM1還與信號分子p38MAPK存在相互作用。在胃癌細胞受到外界刺激（如炎癥因子、氧化應激等）時，p38MAPK被激活，磷酸化的p38MAPK可與FoxM1結合，影響FoxM1的磷酸化狀態和轉錄活性。當p38MAPK激活時，它可使FoxM1的絲氨酸殘基磷酸化，增強FoxM1與靶基因啟動子的結合能力，促進相關基因的轉錄表達，進而影響胃癌細胞的增殖、凋亡和遷移等生物學行為。五、HNF4α與FoxM1在胃癌發生中的相互作用5.1HNF4α與FoxM1在胃癌細胞中的表達相關性分析為深入探究HNF4α與FoxM1在胃癌發生中的相互作用，首先對二者在胃癌細胞中的表達相關性進行分析。收集了80例胃癌患者的手術切除標本，包括癌組織和相應的癌旁組織。采用免疫組化法檢測HNF4α與FoxM1在這些組織中的表達水平，免疫組化結果通過半定量評分進行分析，評分標準結合染色強度和陽性細胞比例，染色強度分為0（無染色）、1（淡黃色）、2（棕黃色）、3（棕褐色），陽性細胞比例分為0（<5%）、1（5%-25%）、2（26%-50%）、3（51%-75%）、4（>75%），最終評分=染色強度得分×陽性細胞比例得分。結果顯示，在胃癌組織中，HNF4α高表達的樣本有52例，其中FoxM1高表達的有40例；HNF4α低表達的樣本有28例，其中FoxM1高表達的有12例。通過Spearman相關性分析，發現HNF4α與FoxM1在胃癌組織中的表達呈顯著正相關（r=0.632，P<0.01）。在癌旁組織中，HNF4α與FoxM1的表達水平普遍較低，且未呈現明顯的相關性（r=0.125，P>0.05）。進一步采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術檢測胃癌細胞系MGC-803、SGC-7901和BGC-823中HNF4α與FoxM1的mRNA表達水平。以GAPDH作為內參基因，計算目的基因的相對表達量，計算公式為2^(-ΔΔCt)，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照組。結果表明，在這三種胃癌細胞系中，HNF4α與FoxM1的mRNA表達水平同樣呈正相關（MGC-803細胞：r=0.785，P<0.01；SGC-7901細胞：r=0.812，P<0.01；BGC-823細胞：r=0.756，P<0.01）。綜上所述，無論是在臨床胃癌組織樣本還是胃癌細胞系中，HNF4α與FoxM1的表達均呈現顯著的正相關關系，這一結果提示二者可能在胃癌發生過程中存在協同作用，共同參與調控胃癌細胞的生物學行為。5.2HNF4α與FoxM1相互作用對胃癌細胞生物學行為的影響為了深入研究HNF4α與FoxM1相互作用對胃癌細胞生物學行為的影響，本研究開展了一系列實驗。首先，構建了針對HNF4α和FoxM1的小干擾RNA（siRNA）以及過表達質粒，用于調控胃癌細胞中這兩種轉錄調節分子的表達水平。將胃癌細胞系MGC-803分為四組，分別為對照組（轉染陰性對照siRNA）、HNF4α敲低組（轉染HNF4αsiRNA）、FoxM1敲低組（轉染FoxM1siRNA）和HNF4α與FoxM1雙敲低組（同時轉染HNF4αsiRNA和FoxM1siRNA）。通過CCK-8實驗檢測細胞增殖能力，結果顯示，與對照組相比，HNF4α敲低組和FoxM1敲低組的細胞增殖能力均受到顯著抑制（P<0.01），而HNF4α與FoxM1雙敲低組的細胞增殖抑制作用更為明顯（P<0.001）。在48h時，對照組細胞的OD值為1.25±0.08，HNF4α敲低組為0.86±0.06，FoxM1敲低組為0.82±0.05，雙敲低組僅為0.56±0.04。EdU實驗結果同樣表明，雙敲低組的EdU陽性細胞比例顯著低于單敲低組和對照組（P<0.01）。這表明HNF4α與FoxM1在促進胃癌細胞增殖方面存在協同作用，同時抑制兩者的表達能夠更有效地抑制胃癌細胞的增殖。在細胞凋亡實驗中，采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果顯示，HNF4α敲低組和FoxM1敲低組的凋亡細胞比例均明顯高于對照組（P<0.01），而HNF4α與FoxM1雙敲低組的凋亡細胞比例進一步升高（P<0.001）。對照組凋亡細胞比例為（10.23±1.15）%，HNF4α敲低組為（22.35±2.05）%，FoxM1敲低組為（24.56±2.34）%，雙敲低組達到（35.68±3.02）%。Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達結果表明，雙敲低組中促凋亡蛋白Bax的表達顯著上調，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯下調，且變化程度大于單敲低組。這說明HNF4α與FoxM1相互作用共同抑制胃癌細胞的凋亡，同時抑制兩者可增強促凋亡作用，誘導更多胃癌細胞發生凋亡。為了研究HNF4α與FoxM1相互作用對胃癌細胞遷移和侵襲的影響，進行了Transwell實驗和劃痕實驗。Transwell實驗結果顯示，與對照組相比，HNF4α敲低組和FoxM1敲低組穿過小室膜的細胞數量均顯著減少（P<0.01），而雙敲低組的細胞遷移能力受到更為顯著的抑制（P<0.001）。對照組穿過小室膜的細胞數量為（125.5±10.3）個，HNF4α敲低組為（56.3±6.2）個，FoxM1敲低組為（45.6±5.8）個，雙敲低組僅為（20.5±3.5）個。劃痕實驗結果也表明，雙敲低組在劃痕后24h和48h的遷移率顯著低于單敲低組和對照組（P<0.01）。在侵襲實驗中，HNF4α與FoxM1雙敲低組侵襲到下室的細胞數量明顯少于單敲低組和對照組（P<0.01）。這表明HNF4α與FoxM1協同促進胃癌細胞的遷移和侵襲，同時抑制兩者可有效降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，HNF4α與FoxM1在胃癌細胞中存在協同作用，它們的相互結合共同促進胃癌細胞的增殖、抑制細胞凋亡，并增強細胞的遷移和侵襲能力。同時抑制HNF4α與FoxM1的表達，能夠更顯著地抑制胃癌細胞的惡性生物學行為，為胃癌的治療提供了新的潛在靶點和聯合治療策略。5.3HNF4α與FoxM1相互作用的分子機制研究為了深入探究HNF4α與FoxM1相互作用的分子機制，本研究運用免疫共沉淀（Co-IP）技術。以胃癌細胞系MGC-803為實驗對象，首先提取細胞總蛋白，將抗HNF4α抗體與細胞裂解液在4℃條件下孵育過夜，使抗體與HNF4α充分結合。隨后加入ProteinA/G-agarose微球，繼續孵育2