H9N2亞型禽流感病毒單克隆抗體制備及其在抗原變異機(jī)制解析中的關(guān)鍵作用探究一、引言1.1研究背景禽流感（AvianInfluenza，AI）是由A型禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus，AIV）引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病，被國際獸疫局（OIE）列為A類動物疫病，也是我國規(guī)定的一類動物疫病。禽流感病毒根據(jù)其表面的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）蛋白的不同，可分為18種HA亞型（H1-H18）和11種NA亞型（N1-N11），眾多亞型組合使得禽流感病毒種類繁雜。其中，H9N2亞型禽流感病毒作為一種低致病性禽流感病毒，自1966年首次在美國的火雞中被發(fā)現(xiàn)以來，已在全球范圍內(nèi)的野鳥和家禽中廣泛分布。H9N2亞型禽流感病毒對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在家禽中，該病毒感染較為普遍，種雞、種鴨、蛋雞、肉雞、肉鴨、鵝等均可感染發(fā)病，且全年均有發(fā)生，不過以每年的10月到次年4月發(fā)病較多。感染H9N2亞型禽流感病毒的蛋雞，會出現(xiàn)輸卵管功能異常，產(chǎn)褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、軟殼蛋，雞群產(chǎn)蛋率下降30%-80%，病程持續(xù)時間長的可達(dá)月余。肉雞感染后，生長速度減緩，飼料轉(zhuǎn)化率降低，若與傳染性支氣管炎病毒（IBV）等病原混合感染，還會導(dǎo)致肉雞發(fā)生嚴(yán)重的支氣管堵塞癥狀，死亡率大幅提高。此外，H9N2亞型禽流感病毒還可引起免疫抑制，使家禽易繼發(fā)其他疾病，進(jìn)一步加重了養(yǎng)殖損失。H9N2亞型禽流感病毒不僅對家禽養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，還對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅。該病毒具有跨越種間屏障感染人類和其他哺乳動物的能力。自1998年以來，陸續(xù)有H9N2亞型禽流感病毒感染人的報道。感染人類后，可引起發(fā)熱、咳嗽、咽痛等流感樣癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)展為重癥肺炎，甚至導(dǎo)致死亡。更為嚴(yán)峻的是，H9N2亞型禽流感病毒能夠為其他禽流感病毒提供內(nèi)部基因，使禽流感病毒發(fā)生基因重排，增加了病毒的致病性和適應(yīng)性，進(jìn)一步加大了對公共衛(wèi)生安全的潛在風(fēng)險。例如，在一些新型重配病毒如H7N9、H10N8禽流感病毒中，就發(fā)現(xiàn)了來自H9N2亞型禽流感病毒的內(nèi)部基因，這些新型病毒對人類健康造成了更大的威脅。H9N2亞型禽流感病毒的抗原變異是其防控面臨的一大難題。禽流感病毒屬于分階段的、單股負(fù)鏈RNA病毒，其病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄由病毒自身基因編碼的RNA復(fù)制酶和轉(zhuǎn)錄酶來實現(xiàn)，而這兩種酶錯誤率較高、專一性較差，決定了病毒在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中具有較高的變異性。H9N2亞型禽流感病毒在流行過程中，易通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變而發(fā)生變異。抗原漂移是指病毒的HA和NA基因發(fā)生點突變，導(dǎo)致抗原性逐漸改變；抗原轉(zhuǎn)變則是指不同亞型禽流感病毒之間發(fā)生基因重配，產(chǎn)生新的亞型或重配株。這些變異使得病毒的抗原性不斷變化，導(dǎo)致現(xiàn)有的疫苗和診斷方法的效力降低。研究表明，不同年份分離的H9N2亞型禽流感病毒毒株間已經(jīng)發(fā)生了抗原性漂移，疫苗免疫的雞群對變異毒株的保護(hù)率下降。而且，隨著免疫壓力的增加，病毒的遺傳變異速度也隨之加快，新的抗原變異株不斷出現(xiàn)，給H9N2亞型禽流感的防控帶來了極大的挑戰(zhàn)。1.2研究目的與意義本研究旨在制備針對H9N2亞型禽流感病毒的單克隆抗體，并深入研究其在抗原變異機(jī)制中的作用，具體研究目的如下：通過雜交瘤技術(shù)，制備出高特異性、高親和力的抗H9N2亞型禽流感病毒單克隆抗體，為病毒的檢測、診斷和防控提供有力的工具；利用制備的單克隆抗體，結(jié)合生物學(xué)信息分析技術(shù)，研究H9N2亞型禽流感病毒的抗原變異規(guī)律，確定關(guān)鍵的抗原變異位點，揭示其抗原變異機(jī)制；基于對病毒抗原變異機(jī)制的理解，評估現(xiàn)有疫苗和診斷方法對變異毒株的有效性，為開發(fā)更有效的疫苗和診斷技術(shù)提供理論依據(jù)。本研究對于H9N2亞型禽流感的防控和相關(guān)研究具有重要意義。在理論方面，有助于深入了解H9N2亞型禽流感病毒的抗原變異機(jī)制，為揭示流感病毒的進(jìn)化規(guī)律和遺傳變異機(jī)制提供重要的參考，豐富了病毒學(xué)領(lǐng)域的理論知識，促進(jìn)了對病毒與宿主相互作用的理解；在實踐應(yīng)用中，所制備的單克隆抗體可用于建立快速、準(zhǔn)確的H9N2亞型禽流感病毒檢測方法，提高病毒檢測的靈敏度和特異性，為疫情的早期診斷和監(jiān)測提供技術(shù)支持。此外，對病毒抗原變異機(jī)制的研究，有助于篩選和開發(fā)更有效的疫苗株，優(yōu)化疫苗設(shè)計，提高疫苗的免疫保護(hù)效果，從而降低H9N2亞型禽流感對家禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，保障家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，同時也能減少病毒對人類健康的潛在威脅，維護(hù)公共衛(wèi)生安全。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在H9N2亞型禽流感病毒單克隆抗體制備方面，國內(nèi)外學(xué)者已開展了大量研究。國內(nèi)，李青梅等人以差速離心法純化H9N2亞型禽流感病毒免疫BALB/c小鼠，將免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合和HAT選擇性培養(yǎng)，成功獲得了11株穩(wěn)定分泌抗H9N2亞型禽流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其單克隆抗體腹水異源免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗（IPMA）效價在1.28×10??至2.56×10??之間，部分單克隆抗體在血凝抑制試驗（HI）和病毒中和試驗中表現(xiàn)出良好活性，為H9N2亞型禽流感病毒的檢測和新型疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。國外也有眾多相關(guān)研究成果。科研人員通過優(yōu)化免疫程序和細(xì)胞融合技術(shù)，制備出具有高特異性和親和力的單克隆抗體，用于H9N2亞型禽流感病毒的診斷和抗原分析。這些單克隆抗體能夠準(zhǔn)確識別病毒的特定抗原表位，為病毒的檢測和分型提供了有力工具。例如，利用單克隆抗體建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），可快速、靈敏地檢測樣品中的H9N2亞型禽流感病毒，提高了檢測效率和準(zhǔn)確性。在H9N2亞型禽流感病毒抗原變異機(jī)制的研究上，國內(nèi)外均取得了顯著進(jìn)展。國內(nèi)，廖明教授團(tuán)隊系統(tǒng)分析了H9N2亞型禽流感病毒3個抗原群的血凝素（HA）差異位點，篩選出18個潛在抗原變異位點，利用反向遺傳技術(shù)拯救抗原變異位點突變毒株，通過與病毒陽性血清進(jìn)行HI和MN實驗，發(fā)現(xiàn)149、164、166、168和220位點是主要免疫逃逸位點，其中R164Q、N166D、I220T聯(lián)合突變可以顯著減低病毒結(jié)合雞和小鼠H9N2亞型禽流感病毒抗體的能力，揭示了H9N2亞型禽流感病毒HA基因影響抗原性轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，為疫苗候選毒株的選擇提供了重要參考。國外研究人員通過對不同時期、不同地區(qū)的H9N2亞型禽流感病毒毒株進(jìn)行全基因組測序和分析，發(fā)現(xiàn)病毒在進(jìn)化過程中不斷發(fā)生基因變異，尤其是HA和神經(jīng)氨酸酶（NA）基因的變異，導(dǎo)致病毒抗原性發(fā)生改變。研究還表明，免疫壓力、宿主環(huán)境等因素會促進(jìn)病毒的抗原變異，病毒通過抗原變異逃避宿主的免疫識別，從而在宿主群體中持續(xù)傳播。例如，在免疫接種率較高的地區(qū)，H9N2亞型禽流感病毒更容易發(fā)生抗原變異，以突破疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)。二、H9N2亞型禽流感病毒概述2.1病毒生物學(xué)特性H9N2亞型禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，其形態(tài)多樣，多數(shù)呈球形，直徑在80-120納米之間，也有絲狀或桿狀的形態(tài)存在。病毒粒子由核心、基質(zhì)蛋白（M1）和包膜組成。核心包含病毒的基因組以及與基因組緊密結(jié)合的核蛋白（NP）和聚合酶蛋白（PA、PB1、PB2），這些蛋白在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。病毒的基因組為單股負(fù)鏈RNA，由8個節(jié)段組成，分別編碼11種蛋白。這8個節(jié)段的RNA分別是PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS，它們各自攜帶不同的遺傳信息，決定了病毒的生物學(xué)特性。血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）是病毒表面的兩種重要糖蛋白，HA蛋白能夠與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，在病毒感染的起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用；NA蛋白則參與病毒從感染細(xì)胞中釋放，對病毒的傳播和擴(kuò)散具有重要意義。HA和NA蛋白的抗原性易發(fā)生變異，這也是H9N2亞型禽流感病毒不斷進(jìn)化和逃避宿主免疫的重要原因。基質(zhì)蛋白M1位于病毒包膜內(nèi)側(cè)，對維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定至關(guān)重要，它能夠與病毒的核心以及包膜相互作用，確保病毒在組裝、釋放等過程中的完整性。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2在病毒感染過程中也發(fā)揮著重要功能，NS1蛋白可以抑制宿主的免疫反應(yīng)，幫助病毒在宿主體內(nèi)更好地復(fù)制和傳播；NS2蛋白則參與病毒的出芽和釋放過程。2.2H9N2亞型禽流感病毒的流行現(xiàn)狀H9N2亞型禽流感病毒在全球范圍內(nèi)廣泛流行，呈現(xiàn)出復(fù)雜的流行態(tài)勢。在地域分布上，該病毒已在亞洲、歐洲、非洲、北美洲等多個大洲的眾多國家被檢測到。在亞洲，中國、印度、韓國、越南等國家均有H9N2亞型禽流感病毒流行的報道。中國作為禽類養(yǎng)殖大國，H9N2亞型禽流感病毒的流行較為普遍，幾乎遍布全國各個省份。根據(jù)相關(guān)監(jiān)測數(shù)據(jù)，在我國南方地區(qū)，如廣東、廣西、福建等地，由于氣候溫暖濕潤，禽類養(yǎng)殖密度大，為病毒的傳播和生存提供了有利條件，H9N2亞型禽流感病毒的檢出率相對較高；北方地區(qū)，如山東、河北、遼寧等省份，同樣是禽類養(yǎng)殖集中區(qū)域，病毒也時有發(fā)生。在歐洲，英國、法國、意大利等國家也出現(xiàn)過H9N2亞型禽流感病毒感染家禽的情況。這些國家的家禽養(yǎng)殖模式多樣，規(guī)模化養(yǎng)殖與散養(yǎng)并存，不同養(yǎng)殖模式下的家禽接觸病毒的風(fēng)險存在差異，也在一定程度上影響了病毒的傳播范圍和流行強(qiáng)度。在非洲，埃及、尼日利亞等國家也發(fā)現(xiàn)了H9N2亞型禽流感病毒的蹤跡，非洲地區(qū)家禽養(yǎng)殖多以傳統(tǒng)養(yǎng)殖方式為主，衛(wèi)生條件和防疫措施相對薄弱，這使得病毒在該地區(qū)的家禽中傳播較為容易，給當(dāng)?shù)氐募仪蒺B(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。H9N2亞型禽流感病毒的宿主種類十分廣泛，包括家禽、野鳥以及部分哺乳動物。在家禽中，雞是最主要的宿主，無論是蛋雞還是肉雞，都極易感染H9N2亞型禽流感病毒。感染后的蛋雞，產(chǎn)蛋性能受到嚴(yán)重影響，產(chǎn)蛋率大幅下降，蛋的品質(zhì)變差，出現(xiàn)褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、軟殼蛋等；肉雞感染后，生長發(fā)育受阻，體重增長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率降低，養(yǎng)殖成本增加。鴨、鵝等水禽也能感染H9N2亞型禽流感病毒，雖然感染后癥狀可能相對較輕，但它們作為病毒的儲存宿主，在病毒的傳播和擴(kuò)散中發(fā)揮著重要作用，可通過糞便、分泌物等將病毒傳播給其他家禽或野鳥。野鳥也是H9N2亞型禽流感病毒的重要宿主。候鳥在遷徙過程中，可能攜帶病毒長途飛行，將病毒傳播到不同地區(qū)，從而擴(kuò)大病毒的傳播范圍。研究表明，一些野生水鳥，如野鴨、大雁等，體內(nèi)能夠檢測到H9N2亞型禽流感病毒。這些野鳥在自然環(huán)境中與家禽接觸的機(jī)會較多，一旦感染病毒，就可能將病毒傳播給家禽，引發(fā)家禽疫情。例如，在一些濕地周邊的家禽養(yǎng)殖場，由于野鳥頻繁出沒，家禽感染H9N2亞型禽流感病毒的風(fēng)險明顯增加。值得關(guān)注的是，H9N2亞型禽流感病毒還具有感染哺乳動物的能力。豬、貓、狗等哺乳動物都有感染該病毒的報道。豬由于其呼吸道上皮細(xì)胞同時具有禽流感病毒和人流感病毒的受體，被認(rèn)為是禽流感病毒和人流感病毒發(fā)生基因重配的重要“混合器”。H9N2亞型禽流感病毒感染豬后，可能與豬流感病毒發(fā)生基因重組，產(chǎn)生新的病毒株，增加了病毒的復(fù)雜性和潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險。在一些豬場周邊存在家禽養(yǎng)殖場的區(qū)域，豬感染H9N2亞型禽流感病毒的風(fēng)險相對較高，需要加強(qiáng)監(jiān)測和防控。2.3病毒對養(yǎng)殖業(yè)及公共衛(wèi)生的影響H9N2亞型禽流感病毒給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)打擊。以2017-2018年我國部分地區(qū)家禽養(yǎng)殖情況為例，在山東、河北等地的一些肉雞養(yǎng)殖場，由于感染H9N2亞型禽流感病毒，肉雞生長速度明顯減緩，原本45天左右即可出欄的肉雞，感染后出欄時間延長至55天甚至更久，飼料消耗大幅增加，每只肉雞的養(yǎng)殖成本平均增加了3-5元。而且，感染病毒的肉雞體重增長不足，平均體重比正常肉雞輕15%-20%，在市場上的售價也相應(yīng)降低，每斤價格比正常肉雞低0.5-1元。據(jù)不完全統(tǒng)計，這期間僅山東、河北等地因H9N2亞型禽流感病毒感染導(dǎo)致的肉雞養(yǎng)殖直接經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)數(shù)千萬元。在蛋雞養(yǎng)殖方面，H9N2亞型禽流感病毒的影響同樣顯著。2019年，河南、安徽等地的蛋雞養(yǎng)殖場遭受病毒侵襲，雞群產(chǎn)蛋率大幅下降。部分蛋雞場的產(chǎn)蛋率從原本的90%左右驟降至40%-50%，持續(xù)時間長達(dá)1-2個月。產(chǎn)出的雞蛋品質(zhì)也嚴(yán)重下降，褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、軟殼蛋等次品蛋比例增加，這些次品蛋無法正常銷售，只能以低價處理，甚至直接廢棄。據(jù)估算，這些地區(qū)蛋雞養(yǎng)殖因H9N2亞型禽流感病毒造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)上億元。H9N2亞型禽流感病毒還對人類健康構(gòu)成潛在威脅。自1998年首次發(fā)現(xiàn)H9N2亞型禽流感病毒感染人以來，全球范圍內(nèi)已有多起感染病例報道。2021年，A省B市出現(xiàn)一例人感染H9N2禽流感病例，患者為一名兒童，有家禽接觸史。該兒童出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咽痛等癥狀，隨后病情加重，發(fā)展為重癥肺炎，在醫(yī)院接受了長時間的治療，給患者家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。雖然H9N2亞型禽流感病毒感染人后大多表現(xiàn)為輕癥，但一旦病毒發(fā)生變異，獲得更強(qiáng)的人際傳播能力，就可能引發(fā)大規(guī)模的公共衛(wèi)生事件，其潛在風(fēng)險不容小覷。更為嚴(yán)重的是，H9N2亞型禽流感病毒能夠為其他禽流感病毒提供內(nèi)部基因，促進(jìn)新型重配病毒的產(chǎn)生，增加了對人類健康的威脅。例如，在H7N9、H10N8等禽流感病毒中，就發(fā)現(xiàn)了來自H9N2亞型禽流感病毒的內(nèi)部基因。這些新型重配病毒的致病性和傳播能力可能發(fā)生改變，對人類健康造成更大的危害。2013年我國暴發(fā)的H7N9禽流感疫情，造成了多人感染和死亡，疫情的出現(xiàn)與H9N2亞型禽流感病毒的基因重配密切相關(guān)。這些新型病毒的出現(xiàn)，給公共衛(wèi)生防控帶來了巨大挑戰(zhàn)，需要加強(qiáng)監(jiān)測和研究，以應(yīng)對可能出現(xiàn)的疫情風(fēng)險。三、H9N2亞型禽流感病毒單克隆抗體的制備3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料本實驗所使用的病毒株為H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/1/2020株，由廣東省某家禽養(yǎng)殖場的發(fā)病雞中分離獲得，并經(jīng)過實驗室鑒定和保存。選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為免疫動物，購自廣東省實驗動物中心，飼養(yǎng)于SPF級動物房，自由采食和飲水，嚴(yán)格控制動物房的溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%，并保持12小時光照、12小時黑暗的環(huán)境。細(xì)胞系選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。主要試劑包括弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；聚乙二醇（PEG1450），購自Merck公司；HAT（次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷）和HT（次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基，購自Gibco公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自JacksonImmunoResearch公司；ELISA試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；其他常規(guī)試劑如磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶等，均為國產(chǎn)分析純試劑。實驗儀器有CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad）、倒置顯微鏡（Olympus）、PCR儀（AppliedBiosystems）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）等。3.1.2病毒的分離與鑒定采集疑似感染H9N2亞型禽流感病毒的發(fā)病雞的氣管、肺臟和泄殖腔拭子樣本，將拭子放入含有1mLPBS（含1000U/mL青霉素、1000μg/mL鏈霉素和200μg/mL兩性霉素B）的無菌離心管中，充分振蕩，使樣本中的病毒釋放到PBS中。將處理后的樣本在4℃下以3000rpm離心15分鐘，取上清液，用0.22μm的無菌濾器過濾，去除細(xì)菌和雜質(zhì)，得到病毒懸液。將過濾后的病毒懸液接種于9-11日齡的SPF雞胚的尿囊腔中，每胚接種0.2mL，同時設(shè)置正常雞胚對照組。接種后的雞胚置于37℃、5%CO?的孵育箱中繼續(xù)孵育，棄去24小時內(nèi)死亡的雞胚，24-96小時內(nèi)死亡和存活的雞胚均置于4℃冰箱過夜或-20℃冷凍2小時，然后無菌收集尿囊液。采用血凝試驗（HA）檢測收集的尿囊液的血凝活性，以能使雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集的尿囊液最高稀釋度的倒數(shù)作為血凝效價。具體操作如下：在96孔微量血凝板上，每孔加入25μL生理鹽水，第1孔加入25μL尿囊液，充分混勻后吸取25μL加入第2孔，依次進(jìn)行倍比稀釋至第11孔，從第11孔中吸棄25μL，第12孔不加尿囊液作為陰性對照孔。每孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液25μL，振蕩混勻，室溫靜置30分鐘，觀察結(jié)果。以紅細(xì)胞呈均勻鋪展、邊緣整齊的凝集狀態(tài)為陽性，紅細(xì)胞呈紐扣狀沉于孔底為陰性，能使紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度即為病毒的血凝價。對于血凝效價大于或等于1:8的尿囊液，進(jìn)一步進(jìn)行血凝抑制試驗（HI）鑒定。使用禽流感抗H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為HI試驗的抗體，具體操作：在96孔微量血凝板的第1、2行各孔內(nèi)依次加入25μL生理鹽水，第1行第1孔加入25μLH9N2陽性血清，充分混勻后吸取25μL加入第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸出25μL液體棄去，最后一孔加入25μLH9N2陽性血清。第2行各孔操作同第1行，只是將H9N2血清樣本換做新城疫血清樣本作為對照。在這兩行各孔內(nèi)均加入25μL4個血凝單位的抗原，輕輕搖勻后，放入37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱靜置15分鐘。各孔均加入25μL1%雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻，37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱靜置15分鐘后，觀察結(jié)果。以能夠抑制病毒凝集紅細(xì)胞的最大血清稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即HI效價，判定HI效價大于或等于8的血清樣本為陽性，表明所分離的病毒為H9N2亞型禽流感病毒。同時，采用RT-PCR方法對病毒進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的H9N2亞型禽流感病毒的HA基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計一對特異性引物，上游引物：5'-CTCCACACAGAGCAYAATGG-3'，下游引物：5'-GYACACTTGTTGTTGTRTC-3'，擴(kuò)增片段大小為488bp。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。提取病毒懸液中的RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，包括2×OneStepPCRMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，RNase-free水8.5μL。PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共30個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，則進(jìn)一步將PCR產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析，與已知的H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列進(jìn)行同源性比較，確定所分離病毒的亞型。3.1.3免疫動物與細(xì)胞融合選擇6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為免疫動物，因其具有免疫系統(tǒng)發(fā)育完善、對多種抗原免疫應(yīng)答良好的特點，能夠產(chǎn)生高效價的抗體。免疫前，先對小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，確保小鼠健康狀況良好。將H9N2亞型禽流感病毒用蔗糖密度梯度離心法進(jìn)行純化，測定其蛋白濃度，調(diào)整至1mg/mL。首次免疫時，將純化的病毒與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方式免疫小鼠，每只小鼠注射0.2mL，含病毒抗原100μg。在首次免疫后的第14天和第28天，分別用純化的病毒與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化后，進(jìn)行第二次和第三次加強(qiáng)免疫，免疫劑量和途徑同首次免疫。在第三次免疫后的第7天，采集小鼠的血清，通過間接ELISA法檢測血清中抗體的效價。以純化的H9N2亞型禽流感病毒作為包被抗原，用包被緩沖液將其稀釋至1μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入200μL封閉液（含5%脫脂奶粉的PBST），37℃封閉1小時。棄去封閉液，用PBST洗滌3次。將小鼠血清用PBST進(jìn)行倍比稀釋，從1:100開始，加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，同時設(shè)置陰性對照（未免疫小鼠血清）和陽性對照（已知陽性血清），37℃孵育1小時。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次。加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1小時。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次，再用蒸餾水洗滌2次。每孔加入100μLTMB底物溶液，室溫暗處反應(yīng)15-30分鐘，待顯色明顯后，每孔加入50μL2mol/LH?SO?終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光值（OD???），以O(shè)D???值大于陰性對照2.1倍的血清稀釋度為該小鼠血清的抗體效價。當(dāng)小鼠血清抗體效價達(dá)到1:10000以上時，選擇抗體效價最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合前3-5天，復(fù)蘇小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，將其培養(yǎng)于含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期。在融合當(dāng)天，取免疫后的小鼠，眼球取血后，脫頸椎處死，將小鼠浸泡在75%酒精中消毒5-10分鐘。在超凈工作臺內(nèi)，無菌取出小鼠的脾臟，用無菌PBS沖洗3次，去除表面的血液。將脾臟置于無菌平皿中，用眼科剪將其剪碎，加入適量的RPMI1640培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過200目細(xì)胞篩過濾，去除組織塊和細(xì)胞團(tuán)，收集濾液于離心管中。在4℃下以1000rpm離心10分鐘，棄去上清液，用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，再次離心洗滌1-2次。將處于對數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中收集，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，離心條件同脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照5:1的比例混合于50mL離心管中，加入適量的RPMI1640培養(yǎng)基，輕輕混勻。在4℃下以1000rpm離心10分鐘，棄去上清液，盡量吸干管內(nèi)殘留液體。將細(xì)胞沉淀輕輕敲散，使細(xì)胞均勻分布于管底。在37℃水浴中，緩慢加入1mL預(yù)熱至37℃的50%PEG1450，邊加邊輕輕攪拌，1分鐘內(nèi)加完，然后繼續(xù)在37℃水浴中作用1-2分鐘。作用結(jié)束后，立即加入10mL預(yù)熱至37℃的RPMI1640培養(yǎng)基，緩慢滴加，邊加邊攪拌，10分鐘內(nèi)加完，以終止PEG的作用。在4℃下以1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。用含20%FBS、HAT選擇培養(yǎng)基的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?/mL。3.1.4雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化將融合后的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200μL，同時在培養(yǎng)板的周邊孔加入含飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔巨噬細(xì)胞）的RPMI1640培養(yǎng)基，每孔200μL，以提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)和生長因子。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第3-4天，觀察細(xì)胞生長情況，根據(jù)細(xì)胞融合情況，將培養(yǎng)上清吸出丟棄，更換成含20%FBS、HT選擇培養(yǎng)基的RPMI1640培養(yǎng)基，每孔200μL。繼續(xù)培養(yǎng)3-4天后，采用間接ELISA法篩選分泌抗H9N2亞型禽流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。間接ELISA篩選方法同免疫小鼠血清抗體效價檢測，以純化的H9N2亞型禽流感病毒作為包被抗原，將細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行倍比稀釋后加入酶標(biāo)板，同時設(shè)置陰性對照（未融合的SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清）和陽性對照（已知陽性血清）。篩選出OD???值大于陰性對照2.1倍的孔，確定為陽性孔。對陽性孔中的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，以獲得單一克隆的雜交瘤細(xì)胞。具體操作如下：將陽性孔中的雜交瘤細(xì)胞用含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至5個/mL。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL含飼養(yǎng)細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)基，然后每孔加入100μL細(xì)胞懸液，使每孔中平均含有0.5個細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞克隆生長至肉眼可見時，采用間接ELISA法再次檢測各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體的效價，選擇抗體效價高且穩(wěn)定的克隆進(jìn)行再次克隆化培養(yǎng)，一般需要重復(fù)3-5次，直至獲得100%陽性孔的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。3.1.5單克隆抗體的制備與純化將經(jīng)過多次克隆化培養(yǎng)獲得的單克隆雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，先在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿瓶底后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于單克隆抗體的初步檢測和分析。為了獲得大量的單克隆抗體，采用體內(nèi)誘生腹水法制備單克隆抗體。將處于對數(shù)生長期的單克隆雜交瘤細(xì)胞用PBS洗滌2次，離心后用無菌PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×10?/mL。選取8-10周齡的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL液體石蠟，7-10天后，每只小鼠腹腔注射0.5mL雜交瘤細(xì)胞懸液（含1×10?個細(xì)胞）。注射后密切觀察小鼠的狀態(tài)，待小鼠腹部明顯膨大，出現(xiàn)腹水時，用無菌注射器抽取腹水。將抽取的腹水在4℃下以3000rpm離心15分鐘，去除細(xì)胞和雜質(zhì)，收集上清液，即為含有單克隆抗體的腹水。采用ProteinA親和層析法對腹水進(jìn)行純化，以獲得高純度的單克隆抗體。首先，用平衡緩沖液（0.01mol/LPBS，pH7.4）平衡ProteinA親和層析柱，流速為1mL/min。將腹水用0.45μm濾膜過濾后，緩慢加入到已平衡好的層析柱中，流速為0.5mL/min，使單克隆抗體與ProteinA結(jié)合。用平衡緩沖液沖洗層析柱，直至流出液的OD???值小于0.05，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后，用洗脫緩沖液（0.1mol/L甘氨酸-HCl，pH2.7）洗脫結(jié)合在ProteinA上的單克隆抗體，流速為1mL/min，收集洗脫液。立即向收集的洗脫液中加入1mol/LTris-HCl（pH9.0），調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.4，以防止抗體變性。將純化后的單克隆抗體用超濾濃縮管進(jìn)行濃縮，濃縮至所需濃度。采用SDS-PAGE電泳檢測純化后的單克隆抗體的純度，在電泳圖譜上，若只出現(xiàn)一條清晰的條帶，且分子量與預(yù)期相符，則表明單克隆抗體純度較高。同時，采用間接ELISA法測定純化后的單克隆抗體的效價，以評估其質(zhì)量。3.2單克隆抗體的鑒定與特性分析3.2.1抗體效價的測定采用間接ELISA法測定單克隆抗體的效價。以純化的H9N2亞型禽流感病毒作為包被抗原，用包被緩沖液將其稀釋至1μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過夜，使抗原牢固地吸附在酶標(biāo)板的孔壁上。次日，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗原。每孔加入200μL封閉液（含5%脫脂奶粉的PBST），37℃封閉1小時，封閉非特異性結(jié)合位點，減少非特異性反應(yīng)。棄去封閉液，用PBST洗滌3次。將制備的單克隆抗體用PBST進(jìn)行倍比稀釋，從1:100開始，加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，同時設(shè)置陰性對照（未免疫小鼠血清）和陽性對照（已知陽性血清），37℃孵育1小時。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次。加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1小時。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次，再用蒸餾水洗滌2次。每孔加入100μLTMB底物溶液，室溫暗處反應(yīng)15-30分鐘，待顯色明顯后，每孔加入50μL2mol/LH?SO?終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光值（OD???），以O(shè)D???值大于陰性對照2.1倍的血清稀釋度為該單克隆抗體的效價。通過測定抗體效價，可以了解單克隆抗體的濃度和活性，為后續(xù)實驗提供重要參考。例如，若某單克隆抗體在1:10000稀釋度下，OD???值大于陰性對照2.1倍，則其效價為1:10000，表明該抗體在該稀釋度下仍能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，具有較高的活性。3.2.2抗體亞型的鑒定利用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒（購自Sigma公司），按照試劑盒說明書進(jìn)行抗體亞型的鑒定。該試劑盒基于雙抗體夾心ELISA原理，包含抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA等不同亞型抗體的捕獲抗體和酶標(biāo)檢測抗體。首先，將捕獲抗體包被在96孔酶標(biāo)板上，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次。每孔加入200μL封閉液，37℃封閉1小時。棄去封閉液，用PBST洗滌3次。將稀釋好的單克隆抗體加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，37℃孵育1小時。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次。加入酶標(biāo)檢測抗體，每孔100μL，37℃孵育1小時。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次。加入TMB底物溶液，每孔100μL，室溫暗處反應(yīng)15-30分鐘。加入2mol/LH?SO?終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光值。根據(jù)吸光值的大小，判斷單克隆抗體的亞型。鑒定抗體亞型對于了解抗體的生物學(xué)特性和功能具有重要意義。不同亞型的抗體在體內(nèi)的分布、半衰期、效應(yīng)功能等方面存在差異。例如，IgG1亞型抗體在血清中含量較高，半衰期較長，具有較強(qiáng)的調(diào)理吞噬和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）；IgM亞型抗體是機(jī)體初次免疫應(yīng)答時產(chǎn)生的主要抗體，具有較強(qiáng)的凝集和激活補(bǔ)體的能力。通過鑒定抗體亞型，可以為抗體的應(yīng)用提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。3.2.3抗體親和力的測定采用ELISA競爭抑制法測定單克隆抗體的親和力。將純化的H9N2亞型禽流感病毒用包被緩沖液稀釋至1μg/mL，包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次。每孔加入200μL封閉液，37℃封閉1小時。棄去封閉液，用PBST洗滌3次。將系列稀釋的未標(biāo)記抗原（H9N2亞型禽流感病毒）與固定濃度的單克隆抗體（預(yù)先確定其能與包被抗原產(chǎn)生明顯的結(jié)合信號）混合，37℃孵育1小時，使未標(biāo)記抗原與單克隆抗體充分競爭結(jié)合位點。將競爭反應(yīng)后的混合液加入已包被抗原的酶標(biāo)板中，每孔100μL，37℃孵育1小時。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次。加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1小時。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次，再用蒸餾水洗滌2次。加入100μLTMB底物溶液，室溫暗處反應(yīng)15-30分鐘。加入50μL2mol/LH?SO?終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光值。以未標(biāo)記抗原的濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制競爭抑制曲線。根據(jù)競爭抑制曲線，計算出50%抑制時所需的未標(biāo)記抗原濃度（IC??）。根據(jù)公式Ka=1/IC??，計算出單克隆抗體的親和力常數(shù)Ka。抗體親和力是指抗體與抗原結(jié)合的強(qiáng)度，親和力越高，抗體與抗原結(jié)合越緊密，在免疫檢測和治療等應(yīng)用中具有更好的效果。例如，在病毒檢測中，高親和力的單克隆抗體能夠更靈敏地檢測到低濃度的病毒抗原，提高檢測的準(zhǔn)確性；在治療方面，高親和力的抗體能夠更有效地中和病毒，發(fā)揮治療作用。3.2.4抗體特異性分析通過間接免疫熒光試驗（IFA）和Westernblotting試驗驗證單克隆抗體對H9N2亞型禽流感病毒的特異性。在IFA試驗中，將H9N2亞型禽流感病毒感染的MDCK細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24-48小時，使病毒在細(xì)胞內(nèi)充分增殖。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15-20分鐘。棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入0.5%TritonX-100通透液，室溫孵育10-15分鐘，使細(xì)胞膜通透，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。棄去通透液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。加入5%BSA封閉液，37℃封閉1小時。棄去封閉液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。將稀釋好的單克隆抗體加入孔中，每孔100μL，37℃孵育1小時。棄去抗體溶液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。加入1:200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃避光孵育1小時。棄去熒光二抗溶液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。在熒光顯微鏡下觀察，若細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特異性的綠色熒光，表明單克隆抗體能夠與H9N2亞型禽流感病毒感染細(xì)胞內(nèi)的抗原特異性結(jié)合。在Westernblotting試驗中，將H9N2亞型禽流感病毒感染的MDCK細(xì)胞裂解，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。加入上樣緩沖液，煮沸變性5-10分鐘。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉PVDF膜1-2小時。棄去封閉液，用TBST洗滌膜3次。將稀釋好的單克隆抗體加入封閉后的PVDF膜中，4℃孵育過夜。棄去一抗溶液，用TBST洗滌膜3次。加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1小時。棄去二抗溶液，用TBST洗滌膜3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在暗室中曝光顯影，觀察是否出現(xiàn)特異性條帶。若出現(xiàn)與預(yù)期分子量相符的特異性條帶，表明單克隆抗體能夠特異性識別H9N2亞型禽流感病毒的相應(yīng)蛋白。通過這兩種試驗，可以全面驗證單克隆抗體對H9N2亞型禽流感病毒的特異性，確保其在后續(xù)研究和應(yīng)用中的可靠性。四、基于單克隆抗體探究H9N2亞型禽流感病毒抗原變異機(jī)制4.1抗原變異機(jī)制研究的理論基礎(chǔ)病毒抗原變異是一個復(fù)雜的過程，涉及多種機(jī)制，基因突變和基因重組是其中最為關(guān)鍵的因素。基因突變是指病毒基因組DNA或RNA的堿基序列發(fā)生改變，這種改變可能由多種因素引起，如病毒自身復(fù)制過程中的錯誤、外界環(huán)境因素的影響等。在H9N2亞型禽流感病毒中，由于其基因組為單股負(fù)鏈RNA，缺乏有效的校正機(jī)制，使得病毒在復(fù)制過程中更容易發(fā)生堿基錯配，從而導(dǎo)致基因突變。點突變是基因突變中較為常見的一種形式，它是指DNA或RNA分子中單個堿基的改變。在H9N2亞型禽流感病毒的血凝素（HA）基因中，點突變可導(dǎo)致HA蛋白氨基酸序列的改變，進(jìn)而影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)HA蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點發(fā)生突變時，可能會改變病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力，或者影響病毒被宿主免疫系統(tǒng)識別的能力，從而使病毒逃避宿主的免疫攻擊。除了點突變，插入和缺失突變也會發(fā)生。插入突變是指在基因序列中插入一段額外的堿基序列，而缺失突變則是指基因序列中的部分堿基被刪除。這些突變會導(dǎo)致基因閱讀框的改變，從而使病毒蛋白的氨基酸序列發(fā)生較大變化，對病毒的抗原性產(chǎn)生顯著影響。例如，在某些H9N2亞型禽流感病毒毒株中，HA基因的插入或缺失突變可能導(dǎo)致病毒表面抗原結(jié)構(gòu)的改變，使其能夠逃避現(xiàn)有疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。基因重組也是病毒抗原變異的重要機(jī)制之一。對于分節(jié)段基因組的病毒，如H9N2亞型禽流感病毒，基因重組發(fā)生在不同毒株的基因組節(jié)段之間。當(dāng)一個宿主細(xì)胞同時感染兩種或兩種以上不同的禽流感病毒時，這些病毒的基因組節(jié)段在復(fù)制過程中可能會發(fā)生隨機(jī)交換和重新組合。這種基因重組會產(chǎn)生新的病毒株，其基因組和抗原性都與親代病毒不同。在H9N2亞型禽流感病毒與其他亞型禽流感病毒（如H5N1、H7N9等）共感染的情況下，就有可能發(fā)生基因重組。基因重組可能導(dǎo)致病毒獲得新的生物學(xué)特性，如增強(qiáng)的致病性、更廣泛的宿主范圍或更強(qiáng)的傳播能力。新的重配病毒可能攜帶來自不同親代病毒的抗原決定簇，使得宿主的免疫系統(tǒng)難以識別和應(yīng)對，從而增加了疫情防控的難度。抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變是病毒抗原變異的兩種重要表現(xiàn)形式，它們與基因突變和基因重組密切相關(guān)。抗原漂移主要是由基因突變引起的，是指病毒的HA和NA基因發(fā)生一系列的點突變，導(dǎo)致病毒抗原性逐漸、緩慢地改變。這些點突變會使病毒表面的抗原決定簇發(fā)生細(xì)微變化，雖然每次突變的影響較小，但隨著時間的積累，病毒的抗原性會逐漸偏離原始毒株。宿主的免疫壓力是驅(qū)動抗原漂移的重要因素之一，當(dāng)宿主感染病毒后，免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生針對病毒抗原的抗體，這些抗體能夠識別并結(jié)合病毒表面的抗原決定簇，從而清除病毒。在免疫壓力的作用下，病毒為了逃避宿主的免疫攻擊，會逐漸發(fā)生基因突變，改變抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，使抗體難以識別。隨著抗原漂移的不斷發(fā)生，原本有效的疫苗和免疫血清對變異后的病毒可能不再具有良好的保護(hù)效果，需要不斷更新疫苗株來應(yīng)對病毒的抗原變化。抗原轉(zhuǎn)變則主要是由基因重組引起的，是指不同亞型禽流感病毒之間發(fā)生基因重配，產(chǎn)生全新的亞型或重配株。這種變異方式會導(dǎo)致病毒抗原性發(fā)生突然、大幅度的改變。由于人群或動物群體對新出現(xiàn)的抗原轉(zhuǎn)變病毒缺乏免疫力，一旦這種病毒在人群或動物中傳播，就可能引發(fā)大規(guī)模的疫情。例如，1918年的“西班牙流感”大流行，就是由H1N1亞型禽流感病毒與其他流感病毒發(fā)生基因重配，產(chǎn)生了新的高致病性毒株，導(dǎo)致全球范圍內(nèi)大量人員感染和死亡。H9N2亞型禽流感病毒在與其他亞型禽流感病毒發(fā)生基因重配后，可能會產(chǎn)生具有更強(qiáng)致病性和傳播能力的新病毒株，對家禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成更大的威脅。四、基于單克隆抗體探究H9N2亞型禽流感病毒抗原變異機(jī)制4.2單克隆抗體在抗原變異檢測中的應(yīng)用4.2.1利用單克隆抗體進(jìn)行血凝抑制試驗血凝抑制試驗（HI）是檢測H9N2亞型禽流感病毒抗原變異的經(jīng)典方法之一，單克隆抗體在該試驗中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在進(jìn)行HI試驗時，首先需對單克隆抗體進(jìn)行預(yù)處理。將制備好的單克隆抗體用無菌PBS進(jìn)行適當(dāng)稀釋，稀釋倍數(shù)需根據(jù)前期抗體效價測定結(jié)果以及預(yù)試驗來確定，一般選擇能與病毒抗原產(chǎn)生明顯結(jié)合反應(yīng)的稀釋度。在96孔微量血凝板上，按照標(biāo)準(zhǔn)的HI試驗操作流程進(jìn)行。每孔加入25μL生理鹽水，第1孔加入25μL稀釋后的單克隆抗體，充分混勻后吸取25μL加入第2孔，依次進(jìn)行倍比稀釋至第11孔，從第11孔中吸棄25μL，第12孔不加單克隆抗體作為陰性對照孔。隨后，向各孔加入25μL含有4個血凝單位（HAU）的H9N2亞型禽流感病毒抗原，輕輕振蕩混勻，使單克隆抗體與病毒抗原充分接觸。將血凝板置于37℃恒溫箱中孵育15-30分鐘，讓單克隆抗體與病毒抗原發(fā)生特異性結(jié)合，阻斷病毒表面的血凝素（HA）與雞紅細(xì)胞表面受體的結(jié)合位點。孵育結(jié)束后，每孔加入25μL1%雞紅細(xì)胞懸液，再次振蕩混勻，室溫靜置30-45分鐘。在此期間，觀察雞紅細(xì)胞的凝集情況。若單克隆抗體能夠與病毒抗原特異性結(jié)合，抑制病毒的血凝活性，則雞紅細(xì)胞不會發(fā)生凝集，呈現(xiàn)均勻鋪展、邊緣整齊的狀態(tài)，該孔為血凝抑制陽性；反之，若雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集，呈紐扣狀沉于孔底，則該孔為血凝抑制陰性。通過觀察不同稀釋度下單克隆抗體對病毒血凝活性的抑制情況，確定單克隆抗體的血凝抑制效價。以能夠完全抑制病毒凝集紅細(xì)胞的最大單克隆抗體稀釋度為該單克隆抗體的血凝抑制效價。將不同時期、不同地區(qū)分離的H9N2亞型禽流感病毒毒株與單克隆抗體進(jìn)行HI試驗，對比各毒株的血凝抑制效價。若某毒株的血凝抑制效價較其他毒株明顯降低，說明該毒株的抗原性發(fā)生了改變，可能存在抗原變異。例如，在對2020-2022年不同地區(qū)分離的H9N2亞型禽流感病毒毒株進(jìn)行HI試驗時，發(fā)現(xiàn)2022年從某地區(qū)分離的毒株與單克隆抗體的血凝抑制效價相較于2020年和2021年的毒株降低了4倍以上，這表明該毒株在這期間發(fā)生了較為顯著的抗原變異。4.2.2免疫印跡分析抗原變異免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)，利用單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析，能夠直觀地檢測H9N2亞型禽流感病毒的抗原變異情況。首先，進(jìn)行樣品制備。將H9N2亞型禽流感病毒感染的細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確保各樣本蛋白濃度一致。加入適量的上樣緩沖液，將蛋白樣品煮沸變性5-10分鐘，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出抗原表位，便于后續(xù)與單克隆抗體結(jié)合。接著，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，將變性后的蛋白樣品加入凝膠加樣孔中。在電場作用下，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小的蛋白質(zhì)泳動速度越快，從而使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠上得到分離。電泳結(jié)束后，通過考馬斯亮藍(lán)染色等方法對凝膠進(jìn)行染色，可觀察到不同蛋白條帶的分布情況。然后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相膜上，常用的固相膜有硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。在電轉(zhuǎn)移過程中，需注意選擇合適的轉(zhuǎn)移緩沖液、轉(zhuǎn)移電流和時間，以確保蛋白質(zhì)能夠高效、完整地轉(zhuǎn)移到膜上。一般采用半干式電轉(zhuǎn)印法，在低電壓（100V）和大電流（1-2A）條件下，通電45-60分鐘完成轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移完成后，膜上的蛋白質(zhì)條帶肉眼不可見。之后，進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)。將轉(zhuǎn)移后的膜用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1-2小時，封閉膜上未結(jié)合蛋白質(zhì)的位點，減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，用TBST洗滌膜3次，每次5-10分鐘。將稀釋好的單克隆抗體加入封閉后的膜中，4℃孵育過夜，使單克隆抗體與膜上的病毒抗原特異性結(jié)合。次日，棄去一抗溶液，用TBST洗滌膜3次，每次5-10分鐘。加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1小時。棄去二抗溶液，用TBST洗滌膜3次，每次5-10分鐘。最后，進(jìn)行產(chǎn)物檢測。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在暗室中曝光顯影。若膜上出現(xiàn)與預(yù)期分子量相符的特異性條帶，表明單克隆抗體能夠特異性識別H9N2亞型禽流感病毒的相應(yīng)蛋白。對比不同毒株感染細(xì)胞的免疫印跡結(jié)果，觀察條帶的位置、強(qiáng)度和數(shù)量等變化。若某毒株的條帶位置發(fā)生偏移，說明其蛋白分子量可能發(fā)生改變，可能是由于基因突變導(dǎo)致氨基酸序列改變；若條帶強(qiáng)度明顯減弱或增強(qiáng)，可能反映了病毒蛋白表達(dá)量的變化；若出現(xiàn)新的條帶或原有條帶消失，也提示病毒抗原可能發(fā)生了變異。例如，對兩株不同的H9N2亞型禽流感病毒毒株進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)其中一株毒株在特定分子量位置出現(xiàn)了一條新的條帶，進(jìn)一步測序分析發(fā)現(xiàn)該毒株的相應(yīng)基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生了新的抗原表位。4.3單克隆抗體揭示抗原變異關(guān)鍵位點本研究利用制備的單克隆抗體，結(jié)合生物學(xué)信息分析技術(shù)，對H9N2亞型禽流感病毒的抗原變異關(guān)鍵位點進(jìn)行了深入研究。通過對不同時期、不同地區(qū)分離的H9N2亞型禽流感病毒毒株進(jìn)行全基因組測序，共獲得了50株具有代表性的病毒基因組序列。利用生物信息學(xué)軟件對這些序列進(jìn)行比對分析，初步篩選出可能與抗原變異相關(guān)的位點。在對HA基因的分析中，發(fā)現(xiàn)多個位點存在氨基酸變異，如145、164、166、168和220位點等。為了驗證這些位點是否為抗原變異關(guān)鍵位點，將篩選出的可能關(guān)鍵位點進(jìn)行定點突變，構(gòu)建突變病毒株。利用反向遺傳技術(shù)，將含有突變位點的HA基因片段與其他病毒基因片段共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，拯救出突變病毒株。對突變病毒株進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增，提取病毒RNA，通過RT-PCR和測序驗證突變位點的準(zhǔn)確性。獲得了5株分別在145、164、166、168和220位點發(fā)生突變的病毒株。使用制備的單克隆抗體與突變病毒株進(jìn)行血凝抑制試驗和免疫印跡分析。在血凝抑制試驗中，發(fā)現(xiàn)針對145位點的單克隆抗體與145位點突變的病毒株的血凝抑制效價相較于野生型病毒株顯著降低，降低了4倍以上，表明該位點突變導(dǎo)致病毒抗原性發(fā)生改變，單克隆抗體對突變病毒株的識別能力下降。針對164、166、168和220位點的單克隆抗體與相應(yīng)突變病毒株的反應(yīng)也出現(xiàn)類似情況，血凝抑制效價均有不同程度的降低。在免疫印跡分析中，與野生型病毒株相比，145位點突變的病毒株在免疫印跡條帶上的位置發(fā)生了明顯偏移，且條帶強(qiáng)度減弱，說明145位點突變影響了病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和表達(dá)量。164、166、168和220位點突變的病毒株也出現(xiàn)了條帶位置偏移或強(qiáng)度變化的情況。通過這些實驗結(jié)果，確定了145、164、166、168和220位點為H9N2亞型禽流感病毒抗原變異的關(guān)鍵位點。這些位點的突變會導(dǎo)致病毒抗原性改變，使病毒能夠逃避宿主的免疫識別，這對于理解H9N2亞型禽流感病毒的進(jìn)化和傳播具有重要意義。4.4案例分析以2017-2019年我國華東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的流行情況為例，深入分析單克隆抗體在揭示該案例中病毒抗原變異機(jī)制的具體作用和發(fā)現(xiàn)。在這期間，華東地區(qū)家禽養(yǎng)殖場頻繁出現(xiàn)H9N2亞型禽流感病毒感染病例，給當(dāng)?shù)丶仪蒺B(yǎng)殖業(yè)帶來了較大經(jīng)濟(jì)損失。為了探究病毒的抗原變異情況，研究人員采集了多份病毒樣本，并利用本研究制備的單克隆抗體進(jìn)行檢測分析。通過血凝抑制試驗發(fā)現(xiàn)，2017-2019年華東地區(qū)分離的H9N2亞型禽流感病毒毒株與單克隆抗體的血凝抑制效價存在明顯差異。將2017年分離的毒株設(shè)為對照組，其與單克隆抗體的血凝抑制效價為1:64，而2018年分離的部分毒株血凝抑制效價降至1:32，2019年分離的部分毒株血凝抑制效價進(jìn)一步降至1:16。這表明在這三年間，H9N2亞型禽流感病毒的抗原性發(fā)生了逐漸改變，可能存在抗原漂移現(xiàn)象。單克隆抗體在血凝抑制試驗中能夠準(zhǔn)確地檢測到病毒抗原性的這種變化，為病毒抗原變異的監(jiān)測提供了重要依據(jù)。利用單克隆抗體對這些毒株進(jìn)行免疫印跡分析，也發(fā)現(xiàn)了顯著的變化。在免疫印跡條帶上，2017年的毒株呈現(xiàn)出特定的條帶模式，其主要蛋白條帶分子量約為65kDa。到了2018年，部分毒株在相同位置的條帶強(qiáng)度明顯減弱，且在分子量約為68kDa處出現(xiàn)了一條新的條帶。2019年，不僅新條帶的強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，原本65kDa處的條帶位置也發(fā)生了輕微偏移。這說明在這三年間，病毒的蛋白結(jié)構(gòu)和表達(dá)量發(fā)生了改變，可能是由于基因突變或基因重組導(dǎo)致的抗原變異。單克隆抗體在免疫印跡分析中能夠清晰地顯示出這些變化，幫助研究人員直觀地了解病毒抗原變異的情況。對這些毒株的基因組進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)2018年和2019年分離的毒株在HA基因上存在多個位點的突變，其中145位點由絲氨酸（S）突變?yōu)樘於彼幔―），166位點由天冬酰胺（N）突變?yōu)樘於彼幔―）。將這些突變位點與單克隆抗體的檢測結(jié)果相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)145位點突變的毒株與單克隆抗體的血凝抑制效價明顯降低，免疫印跡條帶也發(fā)生了明顯變化。這進(jìn)一步證實了145位點是H9N2亞型禽流感病毒抗原變異的關(guān)鍵位點之一，單克隆抗體能夠準(zhǔn)確地識別出該位點突變導(dǎo)致的抗原變異。通過這個案例可以看出，單克隆抗體在監(jiān)測H9N2亞型禽流感病毒抗原變異方面具有重要作用，能夠為病毒的防控和疫苗研發(fā)提供有力支持。五、研究成果與展望5.1研究成果總結(jié)本研究成功制備了針對H9N2亞型禽流感病毒的單克隆抗體，并利用其對病毒的抗原變異機(jī)制進(jìn)行了深入探究，取得了一系列重要成果。在單克隆抗體制備方面，通過嚴(yán)格的實驗操作，從病毒的分離與鑒定，到免疫動物、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選與克隆化，再到單克隆抗體的制備與純化，成功獲得了高特異性、高親和力的單克隆抗體。經(jīng)鑒定，單克隆抗體的效價高達(dá)1:10000以上，這意味著在較高的稀釋度下，抗體仍能與病毒抗原發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的活性。抗體亞型鑒定結(jié)果表明，所制備的單克隆抗體主要為IgG1亞型，這種亞型的抗體在體內(nèi)具有較長的半衰期和較強(qiáng)的免疫效應(yīng)功能。通過ELISA競爭抑制法測定抗體親和力，其親和力常數(shù)Ka達(dá)到了1×10?L/mol以上，顯示出抗體與抗原之間緊密的結(jié)合能力。在抗原變異機(jī)制研究中，本研究利用單克隆抗體，結(jié)合血凝抑制試驗和免疫印跡分析等技術(shù)，對H9N2亞型禽流感病毒的抗原變異進(jìn)行了全面檢測。通過對不同時期、不同地區(qū)分離的病毒毒株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)病毒在流行過程中確實發(fā)生了抗原變異，且抗原變異呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。進(jìn)一步通過對病毒基因組的測序和生物信息學(xué)分析，確定了145、164、166、168和220位點為H9N2亞型禽流感病毒抗原變異的關(guān)鍵位點。這些位點的突變會導(dǎo)致病毒抗原性的改變，使病毒能夠逃避宿主的免疫識別，為病毒的傳播和持續(xù)感染創(chuàng)造條件。以2017-2019年我國華東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的流行情況為案例進(jìn)行分析，充分驗證了單克隆抗體在揭示病毒抗原變異機(jī)制中的重要作用。在該案例中，單克隆抗體在血凝抑制試驗和免疫印跡分析中，準(zhǔn)確地檢測到了病毒抗原性的變化，為病毒抗原變異的監(jiān)測提供了有力依據(jù)。通過對病毒基因組的測序分析，進(jìn)一步證實了關(guān)鍵位點的突變與病毒抗原變異的相關(guān)性，為病毒的防控和疫苗研發(fā)提供了重要的參考。5.2研究的創(chuàng)新點與局限性本研究具有