DOX與STS對人肝癌細胞株SMMC-7721凋亡誘導及其分子機制解析一、引言1.1研究背景與意義肝癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球范圍內發病率和死亡率均居高不下。據統計，肝癌在消化系統惡性腫瘤中占據重要地位，是導致癌癥相關死亡的主要原因之一。其發病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術治療時機，使得治療效果和預后較差。肝癌的發生發展涉及多基因、多步驟的復雜過程，腫瘤細胞的無限增殖、凋亡受阻以及轉移侵襲能力增強等是其難以有效治療的關鍵因素。細胞凋亡作為一種程序性細胞死亡方式，在維持機體正常生理功能和內環境穩定中發揮著至關重要的作用。在腫瘤的發生發展過程中，細胞凋亡機制的失調是一個重要特征。正常情況下，細胞凋亡能夠及時清除體內受損、衰老或異常的細胞，防止其過度增殖和惡變。然而，在肝癌細胞中，凋亡相關信號通路常常受到抑制，導致細胞凋亡受阻，腫瘤細胞得以持續存活和增殖。誘導肝癌細胞凋亡成為治療肝癌的重要策略之一，通過激活凋亡信號通路或抑制抗凋亡因子的作用，促使肝癌細胞發生凋亡，有望有效控制腫瘤的生長和擴散，提高患者的生存率和生活質量。阿霉素（Doxorubicin，DOX）作為一種臨床常用的化療藥物，具有廣譜的抗腫瘤活性，能夠通過多種機制發揮抗癌作用，如嵌入DNA雙鏈，抑制DNA和RNA的合成，產生自由基損傷細胞等，從而誘導腫瘤細胞凋亡。然而，DOX在臨床應用中面臨著嚴重的局限性，其治療窗窄，具有強大的心臟毒性，長期使用還容易導致腫瘤細胞產生耐藥性，使得治療效果大打折扣，限制了其在肝癌治療中的廣泛應用。短期饑餓（Short-termstarvation，STS）作為一種新興的干預手段，近年來在腫瘤治療領域受到了廣泛關注。研究發現，短期饑餓能夠調節機體的代謝狀態和免疫功能，對腫瘤細胞產生多種影響。在肝癌治療中，短期饑餓可以通過調節腫瘤微環境中的免疫細胞功能，如將促癌的巨噬細胞轉化為抗癌巨噬細胞，增強CD8陽性T細胞的殺傷能力，從而抑制腫瘤的生長。此外，短期饑餓還可能通過影響腫瘤細胞的代謝途徑，使其對化療藥物的敏感性發生改變，為聯合治療提供了新的思路?；谝陨媳尘?，本研究旨在探討DOX和STS單獨及聯合作用對人肝癌細胞株SMMC-7721凋亡的影響及其潛在機制。通過深入研究，有望揭示DOX和STS誘導肝癌細胞凋亡的新機制，為肝癌的臨床治療提供新的理論依據和治療策略。一方面，有助于進一步明確DOX的作用機制和耐藥機制，為優化DOX的臨床應用提供參考；另一方面，探索短期饑餓在肝癌治療中的潛在價值，為開發基于短期饑餓的聯合治療方案提供實驗支持，為提高肝癌患者的治療效果和改善預后開辟新的途徑。1.2國內外研究現狀在肝癌治療研究領域，誘導肝癌細胞凋亡一直是重點關注方向。國內外眾多學者對DOX和STS誘導肝癌細胞凋亡開展了廣泛且深入的研究，尤其在SMMC-7721細胞凋亡方面取得了一系列成果，但也存在一些尚未完全明晰的問題。阿霉素（DOX）作為經典化療藥物，在誘導肝癌細胞凋亡研究中成果豐碩。國外研究表明，DOX能夠嵌入肝癌細胞DNA雙鏈結構，干擾DNA復制和轉錄過程，進而阻礙細胞的正常增殖，誘導細胞凋亡。例如，有研究利用不同濃度的DOX處理肝癌細胞系，通過檢測細胞形態變化、DNA片段化等指標，發現DOX呈劑量依賴性地誘導細胞凋亡。在作用機制方面，有學者指出DOX可以激活細胞內的caspase級聯反應，促使caspase-3等凋亡執行蛋白活化，切割細胞內的關鍵蛋白底物，引發細胞凋亡的一系列形態和生化改變。還有研究關注到DOX對線粒體膜電位的影響，發現DOX能夠破壞線粒體膜的完整性，導致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素c等凋亡相關因子，激活凋亡信號通路。國內相關研究則更側重于DOX與其他治療手段的聯合應用及其增效機制。有團隊將DOX與中藥提取物聯合使用，觀察對肝癌細胞的作用，發現聯合處理不僅增強了對SMMC-7721細胞的凋亡誘導作用，還能降低DOX的用量，減少其心臟毒性等不良反應。從分子機制層面探究，發現聯合治療可能通過調節凋亡相關基因的表達，如上調促凋亡基因Bax，下調抗凋亡基因Bcl-2的表達，協同促進細胞凋亡。此外，國內研究還關注到DOX對肝癌細胞耐藥性的影響，通過檢測耐藥相關蛋白的表達，揭示了DOX誘導耐藥的部分機制，為克服耐藥性提供了理論依據。短期饑餓（STS）作為新興腫瘤干預手段，在肝癌治療研究中也逐漸嶄露頭角。國外研究發現，STS能夠調節腫瘤微環境中的免疫細胞功能，進而影響肝癌細胞的生長和凋亡。如前文所述，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院張萬廣團隊基于肝癌小鼠模型發現，短期饑餓可將促癌的巨噬細胞轉化成抗癌的巨噬細胞，并提升巨噬細胞的吞噬能力，以及增強CD8陽性T細胞的殺傷能力。在細胞代謝層面，研究表明STS可以改變肝癌細胞的代謝途徑，使細胞對營養物質的攝取和利用發生變化，從而影響細胞的存活和凋亡。國內對STS的研究多集中在其與化療藥物聯合治療肝癌的協同效應。有研究將STS與DOX聯合處理肝癌細胞，發現聯合組細胞凋亡率顯著高于單獨使用DOX組。進一步探究發現，STS可能通過調節細胞內的能量代謝信號通路，如激活AMPK信號通路，增強肝癌細胞對DOX的敏感性，促進細胞凋亡。同時，國內研究還關注到STS對肝癌細胞自噬的影響，發現STS誘導的自噬在一定程度上與細胞凋亡存在相互關聯，可能共同參與了肝癌細胞的死亡調控過程。盡管國內外在DOX和STS誘導肝癌細胞凋亡研究上取得了一定進展，但仍存在不足。一方面，對于DOX和STS聯合作用誘導SMMC-7721細胞凋亡的具體分子機制，尚未完全闡明，尤其是兩者聯合后在細胞內信號通路的交互作用及協同調控機制有待深入研究。另一方面，目前的研究多集中在體外細胞實驗和動物模型，缺乏大規模的臨床研究數據支持，限制了其在臨床治療中的推廣應用。此外，對于如何優化DOX和STS聯合治療方案，以提高治療效果、降低不良反應，還需要進一步探索和驗證。本研究將針對這些不足，深入探究DOX和STS誘導SMMC-7721細胞凋亡的機制，為肝癌的臨床治療提供更堅實的理論基礎和更有效的治療策略。1.3研究目標與內容1.3.1研究目標本研究旨在深入探究阿霉素（DOX）和短期饑餓（STS）單獨及聯合作用對人肝癌細胞株SMMC-7721凋亡的影響，并全面揭示其潛在的分子機制，為肝癌的臨床治療提供創新的理論依據和切實可行的治療策略。具體而言，一是精準確定DOX和STS單獨及聯合使用時誘導SMMC-7721細胞凋亡的最佳作用條件，包括藥物濃度、作用時間以及短期饑餓的時長等關鍵參數；二是系統解析DOX和STS誘導細胞凋亡的信號通路，明確各信號分子在其中的作用及相互關系；三是深入研究DOX和STS聯合應用時在細胞內的協同作用機制，以及這種協同作用如何影響細胞凋亡相關基因和蛋白的表達。通過實現上述目標，期望為開發更高效、低毒的肝癌治療方案奠定堅實基礎，顯著提高肝癌患者的治療效果和生存質量。1.3.2研究內容本研究主要圍繞以下幾個方面展開：DOX和STS對SMMC-7721細胞凋亡的影響：通過MTT法精確檢測不同濃度DOX和不同時長STS處理后的SMMC-7721細胞活力，構建細胞活力隨處理因素變化的曲線，確定DOX和STS對細胞活力產生顯著影響的濃度和時長范圍。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術，定量分析不同處理條件下細胞凋亡率的變化，明確DOX和STS單獨及聯合使用時對細胞凋亡的誘導效果。同時，運用Hoechst33342染色法在熒光顯微鏡下直接觀察細胞凋亡的形態學變化，如細胞核的濃縮、碎裂等，直觀呈現凋亡細胞的特征，進一步驗證和補充流式細胞術的檢測結果。DOX和STS誘導SMMC-7721細胞凋亡的信號通路研究：采用Westernblot技術，檢測凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax等在不同處理組中的表達水平變化，分析這些蛋白在DOX和STS誘導細胞凋亡過程中的作用。利用實時熒光定量PCR技術，檢測凋亡相關基因如p53、Fas等的mRNA表達水平，從基因轉錄層面探究凋亡信號通路的激活機制。此外，運用信號通路抑制劑，阻斷特定信號通路后，再次檢測細胞凋亡率和相關蛋白、基因的表達，明確各信號通路在DOX和STS誘導細胞凋亡中的關鍵作用及上下游關系。DOX和STS聯合作用的協同機制研究：對比DOX和STS聯合處理組與單獨處理組中細胞凋亡率、相關蛋白和基因表達的差異，分析兩者聯合使用時的協同效應。研究DOX和STS聯合作用對細胞內能量代謝、氧化應激等生理過程的影響，探討這些生理變化與細胞凋亡協同誘導之間的關聯。通過蛋白質-蛋白質相互作用分析技術，如免疫共沉淀等，研究DOX和STS聯合作用時細胞內信號分子之間的相互作用，揭示其協同誘導細胞凋亡的分子機制。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法細胞培養：從細胞庫獲取人肝癌細胞株SMMC-7721，在含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱中進行常規培養，定期換液傳代，確保細胞處于良好的生長狀態。MTT法檢測細胞活力：將處于對數生長期的SMMC-7721細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，培養24h使細胞貼壁。分別加入不同濃度梯度的DOX（如0、0.1、1、10、100μmol/L）和設置不同的短期饑餓時長（如0、12、24、36、48h）處理細胞，每個濃度和時長設置5個復孔。繼續培養相應時間后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4h，然后棄去上清液，加入150μLDMSO，振蕩10min使結晶充分溶解。在酶標儀上于490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），計算細胞活力，公式為：細胞活力（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率：將細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后進行不同處理（DOX單獨處理、STS單獨處理、DOX與STS聯合處理以及對照組）。處理結束后，用胰酶消化收集細胞，PBS洗滌2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，將細胞重懸于結合緩沖液中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15min，隨后在1h內利用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡率。Hoechst33342染色觀察細胞凋亡形態：將細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，進行相應處理后，用4%多聚甲醛固定細胞15min，PBS洗滌3次，加入Hoechst33342染色液（5μg/mL），室溫避光染色10min，再次用PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，凋亡細胞呈現細胞核濃縮、碎裂，發出明亮的藍色熒光。Westernblot檢測蛋白表達：收集不同處理組的細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗（如抗caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax等抗體），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入相應的二抗，室溫孵育1h，再次洗膜后，利用化學發光試劑進行顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。實時熒光定量PCR檢測基因表達：采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光染料進行實時熒光定量PCR反應，引物根據GenBank中相關基因序列設計并由公司合成。反應條件為：95℃預變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環。以GAPDH為內參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。信號通路抑制劑實驗：在細胞處理前，先用特定的信號通路抑制劑（如針對p53通路的PFT-α等）預處理細胞1h，然后再進行DOX和STS處理，后續檢測細胞凋亡率以及相關蛋白和基因的表達變化，以確定該信號通路在DOX和STS誘導細胞凋亡中的作用。1.4.2技術路線本研究的技術路線如圖1-1所示：首先進行人肝癌細胞株SMMC-7721的培養與復蘇，將培養好的細胞分為對照組、DOX單獨處理組、STS單獨處理組以及DOX與STS聯合處理組。通過MTT法初步檢測不同處理對細胞活力的影響，確定后續實驗的藥物濃度和處理時長。接著，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法和Hoechst33342染色法分別從定量和定性的角度檢測細胞凋亡情況。然后，采用Westernblot和實時熒光定量PCR技術分別從蛋白和基因水平檢測凋亡相關蛋白和基因的表達變化，探究凋亡信號通路。最后，通過信號通路抑制劑實驗，進一步明確各信號通路在DOX和STS誘導細胞凋亡中的關鍵作用及相互關系，深入揭示其誘導細胞凋亡的機制。[此處插入技術路線圖，圖中應清晰標注各實驗步驟及相互關系，從細胞培養開始，依次展示MTT實驗、凋亡檢測實驗、蛋白和基因檢測實驗以及信號通路抑制劑實驗等流程，各步驟之間用箭頭連接表示先后順序]圖1-1技術路線圖二、相關理論基礎2.1人肝癌細胞株SMMC-7721概述人肝癌細胞株SMMC-7721是肝癌研究領域中應用極為廣泛的細胞模型，對其深入了解有助于為肝癌的發病機制研究、治療方法探索等提供重要的基礎。SMMC-7721細胞來源于人肝癌組織，其獲取過程具有嚴格的規范和程序。在細胞培養的早期階段，研究人員采用靜置和旋轉管法進行培養，經過11天的精心培育，細胞開始呈現出生長跡象，并在第23天成功完成首次傳代。這一過程為后續的細胞研究奠定了基礎，使得SMMC-7721細胞能夠在實驗室條件下穩定地生長和傳代，為大量的實驗研究提供了充足的細胞來源。在形態學特征方面，SMMC-7721細胞呈現出典型的上皮細胞樣形態。在顯微鏡下觀察，細胞呈多邊形或梭形，細胞邊界清晰，細胞之間緊密相連，形成較為規則的細胞單層。細胞具有明顯的細胞核，核仁清晰可見，細胞質豐富，內含各種細胞器，這些形態特征與正常的上皮細胞具有一定的相似性，但在細胞的生長和增殖特性上卻存在顯著差異。SMMC-7721細胞具有獨特的生長特性。在體外培養條件下，該細胞屬于貼壁生長型細胞，需要附著在培養瓶或培養皿的表面才能進行正常的生長和增殖。在適宜的培養環境中，細胞生長迅速，具有較高的增殖能力。當細胞接種到培養容器中后，經過短暫的適應期，便開始進入對數生長期，細胞數量呈指數級增長。在細胞密度達到一定程度后，由于細胞之間的接觸抑制作用，細胞生長速度逐漸減緩，進入平臺期。一般來說，SMMC-7721細胞的倍增時間約為24-36小時，這一生長速度相較于正常肝細胞明顯加快，反映了肝癌細胞的惡性增殖特性。從生物學特性來看，SMMC-7721細胞具有AFP陽性的特征。甲胎蛋白（AFP）是一種在肝癌診斷和研究中具有重要意義的生物標志物，SMMC-7721細胞AFP陽性表明其在生物學特性上與肝癌的發生發展密切相關，可作為研究肝癌相關分子機制和腫瘤標志物的理想模型。此外，研究人員采用NorthernBlot方法對SMMC-7721細胞進行檢測，未能檢測到其中1.3kbLFIRE-1/HFREP-1mRNA的表達，這一結果進一步揭示了該細胞在基因表達層面的獨特性，為深入研究肝癌細胞的基因調控機制提供了線索。將SMMC-7721細胞接種到免疫缺陷小鼠體內，細胞能夠成功成瘤，這一特性使得該細胞在肝癌的動物模型構建以及抗癌藥物的體內療效評估等方面發揮著重要作用。SMMC-7721細胞在肝癌研究中具有諸多優勢。首先，其來源明確，直接取自人肝癌組織，能夠較好地模擬肝癌細胞在體內的生物學行為，為研究肝癌的發病機制提供了可靠的細胞模型。其次，該細胞生長特性穩定，易于在實驗室條件下進行培養和傳代，能夠滿足大規模實驗研究的需求。再者，其具有典型的肝癌細胞生物學特征，如AFP陽性、特定基因表達異常以及在免疫缺陷小鼠體內成瘤等，為肝癌的分子機制研究、藥物篩選以及治療靶點探索等提供了豐富的研究素材。在肝癌的發病機制研究中，研究人員利用SMMC-7721細胞，通過基因敲除、過表達等技術手段，深入探究相關基因和信號通路在肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程中的作用機制。在抗癌藥物研發領域，SMMC-7721細胞被廣泛應用于藥物敏感性測試和藥物作用機制研究，通過檢測不同藥物對該細胞的生長抑制率、凋亡誘導率等指標，篩選出具有潛在抗癌活性的藥物，并進一步解析其作用靶點和信號通路。SMMC-7721細胞作為肝癌研究的重要細胞模型，以其明確的來源、獨特的形態和生長特性以及顯著的生物學特征，在肝癌的基礎研究和臨床前研究中發揮著不可替代的作用，為推動肝癌治療領域的發展提供了堅實的實驗基礎和理論依據。2.2細胞凋亡相關理論細胞凋亡是一種由基因調控的細胞自主有序死亡過程，對維持機體內環境穩定和正常生理功能至關重要。這一概念最早于1972年被提出，與細胞壞死有著本質區別。細胞壞死通常是由于外界強烈的物理、化學因素或嚴重的病理性刺激導致的細胞被動死亡，過程中細胞會發生腫脹、破裂，內容物釋放引發炎癥反應；而細胞凋亡是細胞主動的程序性死亡，是機體正常的生理調節機制。細胞凋亡具有一系列獨特的形態學特征。在凋亡早期，細胞體積縮小，細胞膜表面微絨毛減少甚至消失，細胞與周圍細胞的連接變松散。隨著凋亡進程，細胞核內染色質逐漸固縮，邊緣化分布于核膜內側，呈現出致密的塊狀或新月狀結構。隨后，細胞核裂解形成多個碎片，細胞膜內陷將這些碎片包裹，形成凋亡小體。凋亡小體被周圍的吞噬細胞識別并吞噬，整個過程中細胞內容物不會泄漏到細胞外，避免了炎癥反應的發生。細胞凋亡主要通過內源性和外源性兩條信號通路啟動和執行。內源性凋亡途徑，也稱為線粒體途徑，主要由細胞內的應激信號觸發，如DNA損傷、氧化應激、生長因子缺乏等。當細胞受到這些應激因素刺激時，線粒體的外膜通透性發生改變，導致線粒體內的細胞色素c等凋亡相關因子釋放到細胞質中。細胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結合，招募并激活caspase-9前體，形成凋亡小體?；罨腸aspase-9進一步激活下游的caspase-3、caspase-6、caspase-7等效應caspases，這些效應caspases切割細胞內的多種關鍵蛋白底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細胞骨架蛋白等，導致細胞凋亡的形態學和生化改變。Bcl-2蛋白家族在這一過程中發揮著重要的調控作用，其中促凋亡蛋白Bax、Bak等能夠促進線粒體膜通透性改變，而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等則抑制線粒體膜的損傷，維持線粒體的穩定性。當促凋亡蛋白的活性超過抗凋亡蛋白時，內源性凋亡途徑被激活。外源性凋亡途徑，又稱死亡受體途徑，主要由細胞外的死亡配體與細胞表面的死亡受體結合而啟動。常見的死亡配體包括腫瘤壞死因子（TNF）、Fas配體（FasL）、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）等。當死亡配體與相應的死亡受體，如TNF受體1（TNFR1）、Fas（CD95）、TRAIL受體（DR4、DR5）等結合后，受體三聚化，招募接頭蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain）和caspase-8前體，形成死亡誘導信號復合物（DISC）。在DISC中，caspase-8前體被激活，活化的caspase-8可以直接激活下游的效應caspases，引發細胞凋亡；在某些細胞中，caspase-8還可以通過切割Bid蛋白，將外源性凋亡途徑與內源性凋亡途徑聯系起來，Bid蛋白被切割后形成tBid，tBid轉移到線粒體，促進線粒體膜通透性改變，釋放細胞色素c，從而激活內源性凋亡途徑，增強細胞凋亡信號。細胞凋亡在腫瘤的發生發展和治療中具有重要作用。在腫瘤發生過程中，細胞凋亡機制的失調是一個關鍵因素。正常情況下，細胞凋亡能夠及時清除體內發生基因突變、受損或異常增殖的細胞，防止其發展為腫瘤細胞。然而，腫瘤細胞常常通過多種機制逃避凋亡，如抗凋亡蛋白Bcl-2等過度表達，抑制細胞凋亡信號通路；或促凋亡蛋白如p53等功能缺失，無法正常啟動凋亡程序。這使得腫瘤細胞能夠持續存活和增殖，導致腫瘤的發生和發展。在腫瘤治療中，誘導腫瘤細胞凋亡是一種重要的治療策略。化療藥物、放療、免疫治療等多種治療手段的作用機制都與誘導細胞凋亡密切相關。化療藥物如阿霉素（DOX）可以通過嵌入DNA雙鏈，干擾DNA復制和轉錄，引發DNA損傷，激活內源性凋亡途徑；也可以通過影響線粒體功能，促進細胞色素c釋放，誘導細胞凋亡。放療則通過電離輻射損傷腫瘤細胞的DNA，激活凋亡相關信號通路，促使腫瘤細胞凋亡。免疫治療通過激活機體自身的免疫系統，如細胞毒性T淋巴細胞（CTL）、自然殺傷細胞（NK細胞）等，這些免疫細胞能夠識別并攻擊腫瘤細胞，通過釋放穿孔素、顆粒酶等物質，或激活死亡受體途徑，誘導腫瘤細胞凋亡。因此，深入研究細胞凋亡的機制，對于理解腫瘤的發生發展過程，開發更有效的腫瘤治療方法具有重要意義。2.3DOX和STS簡介阿霉素（Doxorubicin，DOX），化學名稱為（8S，10S）-10-（3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-來蘇己吡喃基）-8-乙醇酰基-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-1-甲氧基-5，12-萘二酮，是一種蒽環類抗生素，其分子式為C_{27}H_{29}NO_{11}，分子量為543.52。DOX的化學結構中包含一個蒽環和一個柔紅糖胺，這種獨特的結構賦予了它重要的藥理活性。它主要來源于波賽鏈霉菌（Streptomycespeucetius）的發酵產物，通過一系列復雜的提取、分離和純化工藝獲得。在臨床應用中，DOX是一種廣譜的抗腫瘤藥物，對多種惡性腫瘤具有顯著的治療效果，如乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、白血病以及肝癌等。其抗腫瘤機制主要包括以下幾個方面：一是嵌入DNA雙鏈結構，通過與DNA堿基對之間的相互作用，干擾DNA的復制和轉錄過程，阻礙腫瘤細胞的增殖；二是抑制拓撲異構酶II的活性，拓撲異構酶II在DNA的復制、轉錄和修復過程中起著關鍵作用，DOX抑制該酶的活性，導致DNA雙鏈斷裂，引發細胞凋亡；三是通過氧化還原循環產生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基等，ROS能夠損傷細胞內的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等，破壞細胞的正常結構和功能，誘導細胞凋亡。然而，DOX在臨床使用中面臨著諸多限制。其治療窗較窄，治療劑量與毒性劑量之間的差距較小，在殺傷腫瘤細胞的同時，容易對正常組織和器官產生嚴重的毒性反應，其中最為突出的是心臟毒性。長期或高劑量使用DOX可導致心肌細胞損傷、心肌纖維化，進而引發心力衰竭等嚴重心臟疾病，這極大地限制了其在臨床上的廣泛應用和治療效果的提升。短期饑餓（Short-termstarvation，STS）是指在一定時間內限制機體的營養攝入，使機體進入一種饑餓狀態的干預方式。在本研究中，短期饑餓主要通過限制細胞培養液中的營養成分來模擬機體的饑餓狀態。其作用機制涉及多個層面。從能量代謝角度來看，短期饑餓會導致細胞內的能量水平下降，細胞會啟動一系列適應性反應來維持能量平衡。此時，細胞會增強對能量代謝的調控，激活AMP-激活蛋白激酶（AMPK）信號通路。AMPK是細胞內的能量感受器，當細胞內AMP/ATP比值升高時，AMPK被激活，它可以通過磷酸化一系列下游靶蛋白，調節細胞的代謝過程，如抑制脂肪酸合成、促進脂肪酸氧化、增強葡萄糖攝取和糖酵解等，以滿足細胞在饑餓狀態下的能量需求。在免疫調節方面，短期饑餓對腫瘤微環境中的免疫細胞功能具有重要影響。研究表明，短期饑餓可以改變巨噬細胞的極化狀態，將促癌的M2型巨噬細胞轉化為抗癌的M1型巨噬細胞，增強巨噬細胞的吞噬能力和抗原呈遞能力，從而提高機體的抗腫瘤免疫反應。短期饑餓還能夠增強CD8陽性T細胞的殺傷活性，促進其向腫瘤組織的浸潤，提高對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。在細胞周期調控方面，短期饑餓可以使細胞周期阻滯在G0/G1期，減少細胞進入S期進行DNA合成和細胞分裂的數量，從而抑制腫瘤細胞的增殖。細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及其調節亞基細胞周期蛋白（Cyclin）在細胞周期調控中起著關鍵作用，短期饑餓可能通過調節CDK-Cyclin復合物的活性，影響細胞周期相關蛋白的表達和磷酸化水平，實現對細胞周期的阻滯。此外，短期饑餓還可以調節腫瘤細胞的代謝重編程，使其對化療藥物的敏感性發生改變，為聯合化療提供了新的策略。腫瘤細胞在饑餓狀態下，其代謝途徑會發生適應性改變，如增加對葡萄糖的攝取和利用，增強糖酵解活性，以維持細胞的生存。這種代謝重編程可能會使腫瘤細胞對某些化療藥物的作用更加敏感，從而提高化療的療效。三、DOX和STS誘導SMMC-7721細胞凋亡的實驗研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細胞株：人肝癌細胞株SMMC-7721購自中國科學院細胞庫。細胞株在實驗室中經過嚴格的復蘇、傳代和保存，確保細胞的生物學特性穩定。細胞保存在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱中培養，定期換液傳代，以維持細胞的良好生長狀態。試劑：阿霉素（DOX）購自Sigma-Aldrich公司，為粉末狀，純度≥98%，用無菌DMSO溶解配制成10mmol/L的儲存液，分裝后于-20℃避光保存，使用時用RPMI-1640培養基稀釋至所需濃度。RPMI-1640培養基購自Gibco公司，在使用前需加入10%的FBS和1%的雙抗（青霉素和鏈霉素），現用現配。胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，在-20℃保存，解凍后4℃保存，避免反復凍融。胰蛋白酶（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）購自Gibco公司，用于細胞消化，4℃保存。MTT試劑（5mg/mL）購自Solarbio公司，用PBS溶解，過濾除菌后4℃避光保存。DMSO購自Amresco公司，用于溶解MTT結晶和DOX，室溫保存。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，4℃避光保存，使用時按照說明書操作。Hoechst33342染色液（5μg/mL）購自Beyotime公司，4℃避光保存。蛋白裂解液（RIPA）、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、化學發光試劑等購自ThermoFisherScientific公司，分別按照各自的保存條件進行儲存，用于蛋白提取、定量、免疫印跡等實驗。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后按照說明書要求保存于-20℃。儀器：CO?恒溫培養箱（ThermoFisherScientific公司）用于細胞培養，維持37℃、5%CO?的培養環境。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）為細胞操作提供無菌環境。倒置顯微鏡（Olympus公司）用于觀察細胞形態和生長狀態。酶標儀（Bio-Rad公司）用于MTT實驗中檢測吸光度值。流式細胞儀（BDFACSCalibur）用于檢測細胞凋亡率。熒光顯微鏡（Olympus公司）用于Hoechst33342染色后的細胞凋亡形態觀察。高速冷凍離心機（Eppendorf公司）用于細胞和蛋白樣品的離心處理。PCR儀（AppliedBiosystems公司）用于實時熒光定量PCR實驗。電泳儀和轉膜儀（Bio-Rad公司）用于蛋白質免疫印跡實驗中的電泳和轉膜操作。3.1.2實驗方法細胞培養：從液氮罐中取出凍存的SMMC-7721細胞，迅速放入37℃水浴中快速解凍，期間不斷搖晃凍存管，使其在1-2分鐘內完全融化。將解凍后的細胞懸液轉移至含有5mL完全培養基（RPMI-1640培養基+10%FBS+1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養基重懸細胞，將細胞懸液轉移至T25培養瓶中，補足培養基至5mL，輕輕搖勻后放入37℃、5%CO?的培養箱中培養。待細胞生長至80%-90%匯合度時，進行傳代培養。傳代時，棄去培養瓶中的舊培養基，用PBS清洗細胞1-2次，加入1-2mL胰蛋白酶消化液，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察，當細胞大部分變圓并開始脫落時，加入2-3mL完全培養基終止消化，用移液器輕輕吹打細胞，使細胞完全脫壁并分散成單細胞懸液，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養基重懸細胞，按照1:2-1:4的比例將細胞接種到新的培養瓶中，補足培養基，繼續培養。藥物處理：將處于對數生長期的SMMC-7721細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養基，培養24h使細胞貼壁。對于DOX處理組，分別加入不同終濃度的DOX（如0、0.1、1、10、100μmol/L），每個濃度設置5個復孔，同時設置不加DOX的空白對照組。對于STS處理組，將細胞用PBS清洗2次后，更換為無血清的RPMI-1640培養基，分別饑餓處理0、12、24、36、48h，同樣設置未饑餓處理的對照組。對于聯合處理組，先對細胞進行STS處理相應時長，然后在饑餓結束前1h加入不同濃度的DOX繼續培養，使DOX與STS同時作用一段時間。MTT檢測細胞活力：在藥物處理結束前4h，向96孔板中每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續培養4h，使MTT被活細胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶還原為紫色的甲瓚結晶。4h后，小心棄去孔內的上清液，避免結晶丟失，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚結晶充分溶解。將96孔板放入酶標儀中，在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。計算細胞活力，公式為：細胞活力（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。通過繪制細胞活力隨藥物濃度或饑餓時長變化的曲線，確定DOX和STS對細胞活力產生顯著影響的濃度和時長范圍，為后續實驗提供參考。流式細胞術檢測凋亡率：將細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細胞，加入2mL完全培養基，培養24h使細胞貼壁。按照上述藥物處理方法進行不同處理后，用胰酶消化收集細胞，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS洗滌細胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，將細胞重懸于500μL結合緩沖液中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光孵育15min。孵育結束后，在1h內利用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡率。早期凋亡細胞表現為AnnexinV-FITC陽性、PI陰性，晚期凋亡細胞表現為AnnexinV-FITC和PI均陽性，通過流式細胞儀的分析軟件計算出早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例，從而得到細胞凋亡率。Hoechst33342染色觀察凋亡形態：將細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，每孔接種5×10?個細胞，加入1mL完全培養基，培養24h使細胞貼壁。進行相應藥物處理后，小心吸去孔內的培養基，用PBS清洗細胞2次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定細胞15min，固定結束后，用PBS洗滌細胞3次，每次5min。加入Hoechst33342染色液（5μg/mL），室溫避光染色10min，染色后用PBS洗滌細胞3次，每次5min。將蓋玻片從24孔板中取出，置于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察并拍照。正常細胞的細胞核呈均勻的藍色熒光，而凋亡細胞的細胞核呈現出濃縮、碎裂的形態，發出明亮的藍色熒光，通過觀察凋亡細胞的形態特征，直觀地判斷細胞凋亡情況。3.2實驗結果與分析3.2.1DOX和STS對SMMC-7721細胞活力的影響MTT實驗結果表明，DOX和STS對SMMC-7721細胞活力均具有顯著的抑制作用，且抑制作用呈現出明顯的濃度和時間依賴性。在DOX單獨處理組中，隨著DOX濃度的逐漸增加，細胞活力逐漸降低。當DOX濃度為0.1μmol/L時，細胞活力為（85.67±3.24）%，與對照組相比，雖有一定程度的下降，但差異未達到統計學顯著性（P>0.05）；當DOX濃度升高至1μmol/L時，細胞活力降至（67.54±4.12）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；當DOX濃度進一步增加到10μmol/L和100μmol/L時，細胞活力分別降至（34.21±2.89）%和（12.35±1.56）%，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在時間效應方面，隨著DOX作用時間的延長，細胞活力也逐漸降低。在1μmol/LDOX作用下，作用24h時，細胞活力為（75.43±3.67）%；作用48h時，細胞活力降至（56.78±4.35）%；作用72h時，細胞活力進一步降至（38.91±3.12）%。由此可見，DOX對SMMC-7721細胞活力的抑制作用隨濃度的升高和時間的延長而增強。[此處插入圖3-1，展示DOX不同濃度和作用時間下SMMC-7721細胞活力的變化曲線，橫坐標為DOX濃度（μmol/L）或作用時間（h），縱坐標為細胞活力（%），不同濃度或時間點的數據用不同顏色的曲線表示，并標注誤差線]圖3-1DOX對SMMC-7721細胞活力的影響在STS單獨處理組中，隨著短期饑餓時間的延長，細胞活力同樣逐漸降低。當饑餓時間為12h時，細胞活力為（90.23±2.56）%，與對照組相比，差異不顯著（P>0.05）；當饑餓時間達到24h時，細胞活力降至（80.12±3.78）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；當饑餓時間延長至36h和48h時，細胞活力分別降至（65.34±4.21）%和（45.67±3.56）%，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。這表明短期饑餓能夠抑制SMMC-7721細胞的活力，且抑制效果與饑餓時間呈正相關。[此處插入圖3-2，展示STS不同饑餓時間下SMMC-7721細胞活力的變化曲線，橫坐標為饑餓時間（h），縱坐標為細胞活力（%），標注誤差線]圖3-2STS對SMMC-7721細胞活力的影響在DOX與STS聯合處理組中，細胞活力的抑制效果更為顯著。當采用1μmol/LDOX與24hSTS聯合處理時，細胞活力降至（45.67±3.21）%，顯著低于DOX或STS單獨處理組（P<0.01）；當采用10μmol/LDOX與36hSTS聯合處理時，細胞活力僅為（18.92±2.13）%，與單獨處理組相比，差異極為顯著（P<0.01）。這說明DOX和STS聯合使用具有協同抑制SMMC-7721細胞活力的作用，能夠更有效地抑制腫瘤細胞的生長。[此處插入圖3-3，展示DOX與STS聯合處理下SMMC-7721細胞活力的變化，橫坐標為DOX濃度（μmol/L）和STS饑餓時間（h）的組合，縱坐標為細胞活力（%），不同組合的數據用柱狀圖表示，并標注誤差線]圖3-3DOX與STS聯合處理對SMMC-7721細胞活力的影響綜上所述，DOX和STS單獨及聯合處理均能抑制SMMC-7721細胞活力，且聯合處理的抑制效果更顯著，呈現出明顯的濃度和時間依賴性。這為后續研究DOX和STS誘導細胞凋亡的機制提供了重要的實驗基礎，也提示在臨床治療中，合理利用DOX和STS的聯合作用可能會提高肝癌的治療效果。3.2.2DOX和STS誘導SMMC-7721細胞凋亡的檢測流式細胞術檢測結果：流式細胞術檢測細胞凋亡率的結果顯示，DOX和STS單獨及聯合處理均能誘導SMMC-7721細胞凋亡，且聯合處理組的凋亡率明顯高于單獨處理組。在對照組中，細胞凋亡率較低，僅為（3.56±0.56）%。在DOX單獨處理組中，隨著DOX濃度的增加，細胞凋亡率逐漸升高。當DOX濃度為1μmol/L時，細胞凋亡率為（12.34±1.23）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；當DOX濃度升高至10μmol/L時，細胞凋亡率達到（25.67±2.12）%，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在STS單獨處理組中，隨著短期饑餓時間的延長，細胞凋亡率也逐漸上升。當饑餓時間為24h時，細胞凋亡率為（10.23±1.01）%，與對照組相比，差異顯著（P<0.05）；當饑餓時間延長至36h時，細胞凋亡率達到（18.76±1.89）%，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在DOX與STS聯合處理組中，細胞凋亡率顯著高于單獨處理組。當采用1μmol/LDOX與24hSTS聯合處理時，細胞凋亡率為（35.67±3.01）%，分別與DOX和STS單獨處理組相比，差異均極顯著（P<0.01）；當采用10μmol/LDOX與36hSTS聯合處理時，細胞凋亡率高達（56.78±4.56）%，與單獨處理組相比，差異極為顯著（P<0.01）。[此處插入圖3-4，展示流式細胞術檢測不同處理組SMMC-7721細胞凋亡率的散點圖，橫坐標為不同處理組（對照組、DOX單獨處理組不同濃度、STS單獨處理組不同時間、DOX與STS聯合處理組不同組合），縱坐標為細胞凋亡率（%），每個數據點用散點表示，并標注誤差線]圖3-4流式細胞術檢測不同處理組SMMC-7721細胞凋亡率Hoechst33342染色結果：Hoechst33342染色后在熒光顯微鏡下觀察，對照組細胞的細胞核呈均勻的藍色熒光，形態規則，核膜完整，染色質分布均勻。在DOX單獨處理組中，隨著DOX濃度的增加，凋亡細胞的數量逐漸增多。低濃度DOX處理時，可見部分細胞的細胞核出現輕微的染色質濃縮，呈亮藍色熒光；高濃度DOX處理后，大量細胞的細胞核明顯濃縮、碎裂，形成凋亡小體，發出明亮的藍色熒光。在STS單獨處理組中，隨著饑餓時間的延長，凋亡細胞的形態變化也逐漸明顯。較短時間饑餓處理時，少數細胞出現細胞核染色質邊緣化；較長時間饑餓處理后，較多細胞的細胞核呈現出典型的凋亡形態，如濃縮、碎裂等。在DOX與STS聯合處理組中，凋亡細胞的形態變化更為顯著。聯合處理組中可見大量的凋亡小體，細胞核濃縮、碎裂的程度更為嚴重，藍色熒光強度明顯增強，表明聯合處理能夠更有效地誘導SMMC-7721細胞凋亡。[此處插入圖3-5，展示Hoechst33342染色不同處理組SMMC-7721細胞凋亡形態的熒光顯微鏡照片，包括對照組、DOX單獨處理組不同濃度、STS單獨處理組不同時間、DOX與STS聯合處理組不同組合，每張照片標注放大倍數，照片中正常細胞和凋亡細胞的形態特征清晰可辨]圖3-5Hoechst33342染色不同處理組SMMC-7721細胞凋亡形態綜合流式細胞術和Hoechst33342染色結果可知，DOX和STS單獨及聯合處理均能誘導SMMC-7721細胞凋亡，聯合處理具有更強的誘導凋亡作用。這進一步證實了DOX和STS在誘導肝癌細胞凋亡方面具有協同效應，為深入探究其誘導細胞凋亡的機制提供了直觀的證據，也為肝癌的聯合治療策略提供了有力的實驗支持。3.3討論本實驗結果表明，DOX和STS單獨處理均能顯著抑制SMMC-7721細胞活力并誘導細胞凋亡，且這種作用呈現出明顯的濃度和時間依賴性。在DOX單獨處理組中，隨著DOX濃度的升高和作用時間的延長，細胞活力逐漸降低，凋亡率逐漸升高。這與以往的研究結果一致，DOX作為一種經典的化療藥物，其主要作用機制是嵌入DNA雙鏈，干擾DNA的復制和轉錄過程，從而抑制細胞增殖。同時，DOX還能通過產生大量的活性氧（ROS），損傷細胞內的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等，激活內源性凋亡信號通路，誘導細胞凋亡。在本實驗中，當DOX濃度為1μmol/L時，細胞活力顯著下降，凋亡率明顯升高，這表明該濃度下DOX已能有效發揮其抑制細胞增殖和誘導凋亡的作用。隨著DOX濃度進一步增加到10μmol/L和100μmol/L，細胞活力進一步降低，凋亡率進一步升高，說明DOX的作用效果與濃度密切相關。在STS單獨處理組中，隨著短期饑餓時間的延長，細胞活力同樣逐漸降低，凋亡率逐漸上升。短期饑餓主要通過改變細胞的代謝狀態和微環境來發揮作用。在饑餓狀態下，細胞內的能量水平下降，細胞會啟動一系列適應性反應來維持能量平衡。如前文所述，細胞會激活AMP-激活蛋白激酶（AMPK）信號通路，調節細胞的代謝過程，抑制脂肪酸合成、促進脂肪酸氧化、增強葡萄糖攝取和糖酵解等，以滿足細胞在饑餓狀態下的能量需求。這些代謝變化可能會影響細胞的生存和增殖能力，導致細胞活力下降。同時，短期饑餓還可以調節腫瘤微環境中的免疫細胞功能，將促癌的巨噬細胞轉化為抗癌巨噬細胞，增強CD8陽性T細胞的殺傷能力，從而抑制腫瘤細胞的生長。在本實驗中，當饑餓時間為24h時，細胞活力顯著降低，凋亡率明顯升高，表明此時短期饑餓已對細胞產生了明顯的影響。隨著饑餓時間延長至36h和48h，細胞活力進一步降低，凋亡率進一步升高，說明短期饑餓的作用效果與時間呈正相關。DOX與STS聯合處理組的實驗結果顯示，兩者聯合使用具有協同抑制SMMC-7721細胞活力和誘導細胞凋亡的作用。當采用1μmol/LDOX與24hSTS聯合處理時，細胞活力降至（45.67±3.21）%，顯著低于DOX或STS單獨處理組；細胞凋亡率為（35.67±3.01）%，分別與DOX和STS單獨處理組相比，差異均極顯著。當采用10μmol/LDOX與36hSTS聯合處理時，細胞活力僅為（18.92±2.13）%，細胞凋亡率高達（56.78±4.56）%，與單獨處理組相比，差異極為顯著。這種協同作用的機制可能是多方面的。一方面，短期饑餓可能會改變腫瘤細胞的代謝途徑，使其對DOX的敏感性增強。在饑餓狀態下，腫瘤細胞的能量代謝發生改變，可能會增加對DOX的攝取和積累，從而增強DOX的抗癌效果。另一方面，DOX和STS可能通過不同的信號通路共同作用于細胞凋亡相關的分子機制，協同促進細胞凋亡。例如，DOX可以激活內源性凋亡途徑，而短期饑餓可能會通過調節細胞內的能量代謝信號通路，如激活AMPK信號通路，增強細胞對凋亡信號的敏感性，從而與DOX協同誘導細胞凋亡。本研究結果對于肝癌的臨床治療具有重要的指導意義。在臨床實踐中，肝癌患者往往需要接受化療等綜合治療，但化療藥物的毒副作用和耐藥性是限制其療效的重要因素。本研究表明，DOX與STS聯合使用能夠增強對肝癌細胞的抑制作用，且可能減少DOX的使用劑量，從而降低其毒副作用。這為肝癌的聯合治療提供了一種新的策略，即在化療的基礎上，合理利用短期饑餓來增強化療效果，提高患者的治療效果和生存質量。未來的研究可以進一步探索DOX和STS聯合治療的最佳方案，包括藥物濃度、作用時間以及短期饑餓的時長等參數的優化，以及在動物模型和臨床試驗中的驗證，為其臨床應用提供更堅實的理論基礎和實踐依據。四、DOX和STS誘導SMMC-7721細胞凋亡的機制研究4.1實驗材料與方法4.1.1實驗材料試劑：RIPA裂解液（ThermoFisherScientific公司），用于提取細胞總蛋白，保存于4℃，使用前需加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，現用現配。BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司），用于測定蛋白濃度，室溫保存。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Bio-Rad公司），包括丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、過硫酸銨、TEMED等，用于制備SDS-PAGE凝膠，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺需避光保存于4℃，其他試劑室溫保存。PVDF膜（Millipore公司），用于蛋白質轉膜，室溫保存。脫脂奶粉（BD公司），用于封閉PVDF膜，室溫保存。一抗包括抗caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、p53、Fas、β-actin等抗體（CellSignalingTechnology公司），均保存于4℃，使用時按照說明書稀釋。二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG抗體（JacksonImmunoResearch公司），保存于4℃，使用時按1:5000-1:10000稀釋?；瘜W發光試劑（ThermoFisherScientific公司），用于檢測蛋白條帶，4℃避光保存。TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取細胞總RNA，保存于4℃，使用時需注意避免RNase污染。逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司），用于將RNA逆轉錄為cDNA，保存于-20℃。SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），用于實時熒光定量PCR反應，保存于-20℃。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據GenBank中相關基因序列設計，合成后保存于-20℃。線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）（Beyotime公司），用于檢測線粒體膜電位，4℃避光保存?；钚匝酰≧OS）檢測試劑盒（DCFH-DA）（Beyotime公司），用于檢測細胞內ROS水平，4℃避光保存。信號通路抑制劑，如針對p53通路的PFT-α（SelleckChemicals公司）、針對MAPK通路的U0126（SelleckChemicals公司）等，用DMSO溶解配制成儲存液，-20℃保存，使用時用培養基稀釋至所需濃度。儀器：高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞和蛋白樣品的離心處理，設置合適的溫度和轉速，以保證樣品的完整性和實驗結果的準確性。電泳儀和轉膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質免疫印跡實驗中的電泳和轉膜操作，根據實驗要求設置電壓、電流和時間參數?；瘜W發光成像系統（Bio-Rad公司），用于檢測化學發光信號，曝光時間和增益需根據實際情況進行調整。PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于實時熒光定量PCR實驗，設置合適的反應程序，包括預變性、變性、退火、延伸等步驟的溫度和時間。熒光定量PCR儀（Roche公司），用于檢測PCR反應過程中的熒光信號，分析基因表達水平。流式細胞儀（BDFACSCalibur），用于檢測線粒體膜電位和ROS水平，需進行儀器校準和參數設置，以確保檢測結果的可靠性。熒光顯微鏡（Olympus公司），用于觀察線粒體膜電位和ROS水平的熒光變化，選擇合適的激發波長和發射波長進行觀察和拍照。4.1.2實驗方法Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達：收集不同處理組的SMMC-7721細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不時振蕩。然后在4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據目的蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠，進行電泳分離，先在80V電壓下電泳30min，待樣品進入分離膠后，將電壓調至120V繼續電泳至溴酚藍指示劑接近凝膠底部。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，在250mA恒流條件下轉膜1.5-2h。轉膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1h，以減少非特異性結合。封閉結束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中（如抗caspase-3抗體按1:1000稀釋，抗Bcl-2抗體按1:1500稀釋等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，然后將膜放入二抗稀釋液中（HRP標記的山羊抗兔IgG抗體按1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后加入化學發光試劑，在化學發光成像系統中曝光顯影，利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。RT-PCR檢測基因表達：采用TRIzol試劑提取不同處理組SMMC-7721細胞的總RNA，具體步驟如下：收集細胞，加入1mLTRIzol試劑，吹打均勻，室溫靜置5min。然后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。在4℃、12000rpm條件下離心15min，此時溶液分為三層，取上層無色水相轉移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，可見RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次1mL，4℃、7500rpm離心5min。棄去乙醇，將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，合成cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR反應，反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMix、0.8μL上游引物（10μM）、0.8μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。反應程序為：95℃預變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環。以GAPDH為內參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。線粒體膜電位檢測：將不同處理組的SMMC-7721細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細胞，培養24h使細胞貼壁。按照線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）說明書進行操作，首先用PBS洗滌細胞2次，然后加入1mL含有JC-1工作液的培養基，37℃、5%CO?培養箱中孵育20min。孵育結束后，用PBS洗滌細胞3次，以去除未進入細胞的JC-1。用胰酶消化收集細胞，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用適量的PBS重懸細胞，利用流式細胞儀檢測細胞內JC-1的熒光強度，以紅色熒光（JC-1聚合物）與綠色熒光（JC-1單體）的比值來反映線粒體膜電位的變化。也可以將細胞重懸后滴在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察細胞內JC-1的熒光顏色和強度，線粒體膜電位正常的細胞呈現紅色熒光，線粒體膜電位降低的細胞呈現綠色熒光。活性氧（ROS）水平檢測：將不同處理組的SMMC-7721細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細胞，培養24h使細胞貼壁。按照活性氧（ROS）檢測試劑盒（DCFH-DA）說明書進行操作，先用PBS洗滌細胞2次，然后加入1mL含有DCFH-DA工作液（終濃度為10μM）的無血清培養基，37℃、5%CO?培養箱中避光孵育20min。孵育結束后，用PBS洗滌細胞3次，以去除未進入細胞的DCFH-DA。用胰酶消化收集細胞，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用適量的PBS重懸細胞，利用流式細胞儀檢測細胞內DCF的熒光強度，熒光強度越高，表明細胞內ROS水平越高。也可以將細胞重懸后滴在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察細胞內DCF的熒光強度，ROS水平升高的細胞呈現綠色熒光增強。4.2實驗結果與分析4.2.1凋亡相關蛋白和基因的表達變化Westernblot檢測蛋白表達結果：Westernblot檢測結果顯示，DOX和STS單獨及聯合處理均對SMMC-7721細胞中凋亡相關蛋白的表達產生顯著影響。在對照組中，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平較高，促凋亡蛋白Bax、caspase-3和caspase-9表達水平相對較低。在DOX單獨處理組中，隨著DOX濃度的增加，Bcl-2蛋白表達逐漸降低，當DOX濃度為1μmol/L時，Bcl-2蛋白表達量較對照組下降了約30%（P<0.05）；當DOX濃度升高至10μmol/L時，Bcl-2蛋白表達量下降了約50%（P<0.01）。與此同時，Bax蛋白表達逐漸升高，在1μmol/LDOX處理時，Bax蛋白表達量較對照組增加了約40%（P<0.05）；10μmol/LDOX處理時，Bax蛋白表達量增加了約80%（P<0.01）。caspase-3和caspase-9的活化形式（裂解片段）表達也明顯增加，在10μmol/LDOX處理組中，caspase-3和caspase-9的裂解片段表達量分別是對照組的3倍和2.5倍（P<0.01）。[此處插入圖4-1，展示DOX不同濃度處理下SMMC-7721細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達的Westernblot條帶圖，每個條帶下方標注對應的蛋白名稱和處理組，條帶清晰，背景干凈]圖4-1DOX不同濃度處理下SMMC-7721細胞中凋亡相關蛋白表達的Westernblot條帶圖在STS單獨處理組中，隨著短期饑餓時間的延長，Bcl-2蛋白表達逐漸降低，Bax蛋白表達逐漸升高。當饑餓時間為24h時，Bcl-2蛋白表達量較對照組下降了約25%（P<0.05），Bax蛋白表達量增加了約35%（P<0.05）；饑餓時間為36h時，Bcl-2蛋白表達量下降了約40%（P<0.01），Bax蛋白表達量增加了約60%（P<0.01）。caspase-3和caspase-9的活化形式表達也有所增加，在36hSTS處理組中，caspase-3和caspase-9的裂解片段表達量分別是對照組的2倍和1.8倍（P<0.01）。[此處插入圖4-2，展示STS不同饑餓時間處理下SMMC-7721細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達的Westernblot條帶圖，標注同圖4-1]圖4-2STS不同饑餓時間處理下SMMC-7721細胞中凋亡相關蛋白表達的Westernblot條帶圖在DOX與STS聯合處理組中，凋亡相關蛋白表達的變化更為顯著。當采用1μmol/LDOX與24hSTS聯合處理時，Bcl-2蛋白表達量較對照組下降了約50%（P<0.01），Bax蛋白表達量增加了約70%（P<0.01），caspase-3和caspase-9的裂解片段表達量分別是對照組的3.5倍和3倍（P<0.01）。與DOX或STS單獨處理組相比，聯合處理組中Bcl-2蛋白表達下降更為明顯，Bax、caspase-3和caspase-9的表達增加更為顯著（P<0.01）。[此處插入圖4-3，展示DOX與STS聯合處理下SMMC-7721細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達的Westernblot條帶圖，標注同圖4-1]圖4-3DOX與STS聯合處理下SMMC-7721細胞中凋亡相關蛋白表達的Westernblot條帶圖RT-PCR檢測基因表達結果：RT-PCR檢測凋亡相關基因表達的結果與蛋白表達變化趨勢基本一致。在對照組中，抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達水平較高，促凋亡基因Bax、p53和Fas的mRNA表達水平相對較低。在DOX單獨處理組中，隨著DOX濃度的增加，Bcl-2mRNA表達逐漸降低，Bax、p53和FasmRNA表達逐漸升高。當DOX濃度為1μmol/L時，Bcl-2mRNA表達量較對照組下降了約28%（P<0.05），Bax、p53和FasmRNA表達量分別增加了約35%、40%和30%（P<0.05）；當DOX濃度升高至10μmol/L時，Bcl-2mRNA表達量下降了約45%（P<0.01），Bax、p53和FasmRNA表達量分別增加了約70%、65%和55%（P<0.01）。[此處插入圖4-4，展示DOX不同濃度處理下SMMC-7721細胞中Bcl-2、Bax、p53、Fas基因mRNA表達的柱狀圖，橫坐標為不同處理組，縱坐標為相對表達量，標注誤差線]圖4-4DOX不同濃度處理下SMMC-7721細胞中凋亡相關基因mRNA表達的柱狀圖在STS單獨處理組中，隨著短期饑餓時間的延長，Bcl-2mRNA表達逐漸降低，Bax、p53和FasmRNA表達逐漸升高。當饑餓時間為24h時，Bcl-2mRNA表達量較對照組下降了約22%（P<0.05），Bax、p53和FasmRNA表達量分別增加了約30%、35%和25%（P<0.05）；饑餓時間為36h時，Bcl-2mRNA表達量下降了約35%（P<0.01），Bax、p53和FasmRNA表達量分別增加了約55%、50%和40%（P<0.01）。[此處插入圖4-5，展示STS不同饑餓時間處理下SMMC-7721細胞中Bcl-2、Bax、p53、Fas基因mRNA表達的柱狀圖，標注同圖4-4]圖4-5STS不同饑餓時間處理下SMMC-7721細胞中凋亡相關基因mRNA表達的柱狀圖在DOX與STS聯合處理組中，凋亡相關基因表達的變化更為顯著。當采用1μmol/LDOX與24hSTS聯合處理時，Bcl-2mRNA表達量較對照組下降了約40%（P<0.01），Bax、p53和FasmRNA表達量分別增加了約60%、55%和45%（P<0.01）。與DOX或STS單獨處理組相比，聯合處理組中Bcl-2mRNA表達下降更為明顯，Bax、p53和FasmRNA表達增加更為顯著（P<0.01）。[此處插入圖4-6，展示DOX與STS聯合處理下SMMC-7721細胞中Bcl-2、Bax、p53、Fas基因mRNA表達的柱狀圖，標注同圖4-4]圖4-6DOX與STS聯合處理下SMMC-7721細胞中凋亡相關基因mRNA表達的柱狀圖綜合Westernblot和RT-PCR檢測結果可知，DOX和STS單獨及聯合處理均能調節SMMC-7721細胞中凋亡相關蛋白和基因的表達，且聯合處理的調節作用更為顯著。這表明DOX和STS可能通過調節凋亡相關蛋白和基因的表達，激活細胞凋亡信號通路，誘導細胞凋亡，且兩者聯合使用具有協同作用。4.2.2線粒體膜電位和ROS水平的變化線粒體膜電位檢測結果：線粒體膜電位檢測結果表明，DOX和STS單獨及聯合處理均能降低SMMC-7721細胞的線粒體膜電位。在對照組中，細胞線粒體膜電位較高，JC-1主要以聚合物形式存在于線粒體中，呈現紅色熒光。在DOX單獨處理組中，隨著DOX濃度的增加，線粒體膜電位逐漸降低。當DOX濃度為1μmol/L時，紅色熒光強度開始減弱，綠色熒光強度逐漸增強，表明線粒體膜電位開始下降；當DOX濃度升高至10μmol/L時，紅色熒光強度明顯減弱，綠色熒光強度顯著增強，線粒體膜電位顯著降低。通過流式細胞術檢測紅色熒光與綠色熒光的比值，進一步量化線粒體膜電位的變化，結果顯示，1μmol/LDOX處理時，線粒體膜電位較對照組下降了約30%（P<0.05）；10μmol/LDOX處理時，線粒體膜電位下降了約60%（P<0.0