DLK1和Jagged1在肝癌中的表達特征、關聯機制及臨床價值研究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內常見且危害嚴重的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的生命健康。據國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數據顯示，肝癌的新發(fā)病例數高達90.6萬例，死亡病例數約83萬例，在癌癥相關死亡原因中位居第三。在中國，肝癌的發(fā)病形勢更為嚴峻，新發(fā)病例和死亡病例分別占全球的45.3%和47.1%，接近全球的一半，且年齡標準化發(fā)病率和死亡率也處于世界前列。肝癌具有惡性程度高、病情進展迅速、預后差等特點，多數患者確診時已處于中晚期，5年生存率僅為14.1%，遠低于歐美國家。這主要歸因于肝癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性表現，患者往往難以察覺，一旦出現明顯癥狀就醫(yī)時，病情多已進展至中晚期，錯失了最佳的手術治療時機。此外，肝癌的復發(fā)率較高，即使接受了手術切除等治療，仍有相當比例的患者會出現復發(fā)和轉移，進一步降低了患者的生存幾率。因此，深入探究肝癌的發(fā)病機制，尋找有效的診斷和治療靶點，對于提高肝癌患者的生存率和生活質量具有至關重要的意義。在肝癌的研究領域中，Delta樣蛋白1（DLK1）和鋸齒狀蛋白1（Jagged1）逐漸成為關注的焦點。DLK1，又被稱為胎兒抗原2（FA2）或鋅指蛋白148（ZFP148），是一種跨膜蛋白，屬于表皮生長因子（EGF）家族成員。它在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵作用，參與調節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡。研究表明，DLK1在多種腫瘤組織中異常表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。在肝癌組織中，DLK1呈現高表達狀態(tài)，且其表達水平與肝癌的惡性程度、轉移潛能以及患者的預后密切相關。例如，有研究發(fā)現，DLK1高表達的肝癌患者，其腫瘤體積更大、分化程度更低、更容易發(fā)生轉移，且術后復發(fā)率更高，生存時間更短。此外，DLK1還可以通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。因此，DLK1有望成為肝癌診斷和治療的潛在靶點。Jagged1是Notch信號通路的重要配體之一，在細胞的命運決定、分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用。Notch信號通路是一條高度保守的細胞間信號傳導通路，在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持和疾病發(fā)生發(fā)展等過程中都具有不可或缺的作用。當Jagged1與Notch受體結合后，會激活Notch信號通路，引發(fā)一系列的細胞內信號轉導事件，從而影響細胞的生物學行為。在肝癌中，Jagged1的表達異常升高，并且與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移密切相關。研究顯示，Jagged1高表達的肝癌細胞具有更強的增殖能力、遷移能力和侵襲能力，同時，Jagged1還可以通過激活Notch信號通路，促進肝癌細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程，增強肝癌細胞的轉移潛能。此外，Jagged1的表達水平還與肝癌患者的預后密切相關，高表達Jagged1的肝癌患者預后較差。因此，深入研究Jagged1在肝癌中的作用機制，對于揭示肝癌的發(fā)病機制和尋找新的治療靶點具有重要的意義。DLK1和Jagged1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中都扮演著重要角色，且兩者之間可能存在著某種關聯，共同參與調控肝癌細胞的生物學行為。然而，目前關于DLK1和Jagged1在肝癌中的表達情況、相互關系以及它們與肝癌臨床病理特征之間的具體聯系，尚未完全明確。因此，本研究旨在通過檢測DLK1和Jagged1在肝癌組織及癌旁組織中的表達水平，分析它們與肝癌臨床病理特征的相關性，探討它們在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制，為肝癌的早期診斷、預后評估和靶向治療提供理論依據和新的思路。1.2研究目的本研究旨在通過檢測DLK1和Jagged1在肝癌組織及癌旁組織中的表達水平，深入分析它們與肝癌患者臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、轉移情況、患者年齡、HBsAg感染狀態(tài)等）之間的相關性，探討二者在肝癌發(fā)生、發(fā)展進程中的具體作用及內在機制。同時，明確DLK1和Jagged1表達之間的相互關系，評估它們作為肝癌早期診斷生物標志物以及潛在治療靶點的可行性，為肝癌的臨床診斷、預后判斷和靶向治療提供堅實的理論依據和全新的思路，最終改善肝癌患者的治療效果和生存質量。1.3國內外研究現狀在肝癌研究領域，DLK1和Jagged1均受到了廣泛關注，國內外學者從多個角度對其展開研究，取得了一定成果，但仍存在一些尚未明確的問題。DLK1作為一種在胚胎發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用的跨膜蛋白，其在肝癌中的研究取得了諸多進展。國內方面，上海交通大學系統生物醫(yī)學研究院韓澤廣研究員團隊發(fā)現，DLK1在肝細胞癌（HCC）組織中特異性高表達，而在正常成人組織中不表達。基于此，他們自制抗人DLK1單克隆抗體并獲取單鏈片段可變（scFv）序列，整合到第二代CAR慢病毒載體中，獲得靶向DLK1的CAR-T細胞。動物實驗表明，該細胞能夠明顯抑制人類肝癌細胞系HepG2或Huh-7的皮下和腹膜移植瘤生長，且未見明顯副作用，為肝癌的免疫治療提供了新的策略。國家人類基因組南方研究中心的專家通過對肝癌樣本的檢測發(fā)現，人類印跡基因DLK1在肝癌組織中表達明顯上調，在73.2%的肝癌樣本中DLK1基因表達上升，且該基因與甲胎蛋白聯合檢測可將肝癌診斷率提高25%以上，提示其可能成為新的肝癌診斷指標。國外研究也指出，DLK1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，可通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。有研究表明，敲低DLK1表達可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力，誘導細胞周期阻滯和凋亡，并且在體內實驗中抑制腫瘤生長。然而，目前對于DLK1在肝癌中的具體作用機制尚未完全明晰，其與肝癌其他相關分子的相互作用網絡也有待進一步深入研究。Jagged1作為Notch信號通路的重要配體，在肝癌研究中也備受關注。國內有研究采用免疫組化SP法和原位雜交的方法檢測發(fā)現，Jagged1蛋白和mRNA在肝細胞癌組織中的陽性表達率顯著高于肝硬化和正常肝組織。其表達與年齡、組織學分級及HBsAg有關。通過實時熒光定量PCR法和免疫組織化學染色法檢測發(fā)現，Jagged1在肝細胞癌組織中的表達明顯高于癌旁正常肝組織，且與有無淋巴結轉移、病理分級密切相關，有淋巴結轉移者和低分化癌組織中Jagged1陽性表達率更高。國外研究發(fā)現，Jagged1可通過激活Notch信號通路，促進肝癌細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程，使肝癌細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。此外，Jagged1還參與調節(jié)肝癌細胞的干性維持，與肝癌的耐藥性也存在一定關聯。但是，Jagged1在肝癌中如何精準調控相關信號通路以及其在肝癌不同亞型中的表達差異和功能特點等方面，還需要更多的研究來明確。雖然DLK1和Jagged1在肝癌中的研究各自取得了一定成果，但關于兩者在肝癌中的聯合研究相對較少。目前尚不清楚它們在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中是否存在協同作用以及具體的作用機制。兩者表達之間的相互關系以及它們與肝癌臨床病理特征之間更為深入的聯系，也需要進一步通過大樣本、多中心的研究來揭示。此外，如何將DLK1和Jagged1的研究成果轉化為臨床實踐中的有效診斷和治療手段，也是未來肝癌研究領域需要重點關注和解決的問題。二、DLK1和Jagged1的生物學特性2.1DLK1的結構與功能2.1.1DLK1的分子結構DLK1，全稱Delta樣蛋白1（Delta-like1homolog），作為一種重要的跨膜蛋白，其結構特點賦予了它在細胞生理過程中獨特的功能。從分子構成來看，DLK1由多個結構域組成，這些結構域協同作用，使其能夠在細胞信號傳導、細胞間相互作用等方面發(fā)揮關鍵作用。DLK1的胞外區(qū)包含多個串聯排列的表皮生長因子（EGF）樣重復序列。這些EGF樣結構域在蛋白質相互作用中扮演著至關重要的角色，它們可以與其他細胞表面的受體或配體特異性結合，從而啟動細胞內的信號級聯反應。以肝細胞癌的研究為例，DLK1的EGF樣結構域可能與肝癌細胞表面的某些受體結合，激活下游的PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，這些結構域還可能參與細胞間的黏附過程，影響細胞的聚集和組織的形成。研究發(fā)現，在胚胎發(fā)育過程中，DLK1的EGF樣結構域對于細胞間的識別和黏附起到了重要作用，有助于構建組織和器官的正常結構。除了EGF樣重復序列外，DLK1還具有其他重要的結構特征。其跨膜區(qū)負責將蛋白錨定在細胞膜上，確保DLK1能夠在細胞表面發(fā)揮功能。跨膜區(qū)的結構穩(wěn)定性對于DLK1與配體的結合以及信號傳導的效率具有重要影響。而胞內區(qū)則包含一些特定的氨基酸序列，這些序列可以與細胞內的信號分子相互作用，將細胞外的信號傳遞到細胞內部。在某些腫瘤細胞中，DLK1的胞內區(qū)可以與一些轉錄因子結合，調節(jié)相關基因的表達，從而影響腫瘤細胞的生物學行為。2.1.2DLK1在正常生理過程中的功能在正常生理過程中，DLK1發(fā)揮著不可或缺的作用，尤其是在肝臟發(fā)育以及細胞分化等關鍵環(huán)節(jié)。肝臟發(fā)育是一個復雜而有序的過程，DLK1在其中扮演著重要角色。在胚胎發(fā)育早期，DLK1在肝臟祖細胞中高表達，它參與調控肝臟祖細胞的增殖和分化，引導這些細胞向肝細胞和膽管細胞的方向分化。研究表明，在小鼠胚胎肝臟發(fā)育過程中，敲低DLK1的表達會導致肝臟祖細胞的增殖受到抑制，肝細胞和膽管細胞的分化也會出現異常，最終影響肝臟的正常發(fā)育。這說明DLK1對于維持肝臟祖細胞的活性以及促進肝臟細胞的分化具有重要意義。在細胞分化方面，DLK1同樣發(fā)揮著關鍵作用。它可以作為一種細胞命運決定因子，影響細胞的分化方向。以脂肪細胞分化為例，DLK1在脂肪前體細胞中表達，它能夠抑制脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞的分化。研究發(fā)現，在脂肪細胞分化過程中，DLK1可以通過與胰島素樣生長因子結合蛋白1（IGFBP1）相互作用，調節(jié)胰島素樣生長因子（IGF）的活性，從而抑制脂肪細胞的分化。當DLK1的表達被下調時，脂肪前體細胞會更容易分化為成熟脂肪細胞，這表明DLK1在脂肪細胞分化過程中起到了負調控的作用。DLK1在正常生理過程中的功能不僅局限于肝臟發(fā)育和細胞分化，還可能參與其他重要的生理過程，如組織修復和再生等。在肝臟受到損傷時，DLK1的表達會發(fā)生變化，它可能參與調節(jié)肝臟細胞的再生和修復過程，促進受損肝臟組織的恢復。這些發(fā)現進一步表明了DLK1在維持機體正常生理功能方面的重要性，也為理解其在肝癌等疾病中的異常作用提供了基礎。2.2Jagged1的結構與功能2.2.1Jagged1的分子結構Jagged1作為Notch信號通路的關鍵配體，其獨特的分子結構是其發(fā)揮生物學功能的基礎。從分子層面來看，Jagged1是一種跨膜蛋白，由多個重要的結構域組成。其胞外區(qū)是與Notch受體相互作用的關鍵區(qū)域，包含多個串聯排列的表皮生長因子（EGF）樣重復序列。這些EGF樣結構域在蛋白質-蛋白質相互作用中起著核心作用，它們能夠特異性地與Notch受體上的相應結構域結合，從而啟動Notch信號通路的激活。研究表明，Jagged1的EGF樣結構域中的某些氨基酸殘基對于其與Notch受體的高親和力結合至關重要。在肝癌細胞中，當Jagged1的EGF樣結構域與Notch受體結合后，會引發(fā)一系列的細胞內信號轉導事件，如激活下游的HES、HEY等轉錄因子，調控相關基因的表達，進而影響肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為。此外，Jagged1的胞外區(qū)還含有一個富含半胱氨酸的DSL（Delta/Serrate/Lag-2）結構域，該結構域在與Notch受體的識別和結合過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。DSL結構域中的半胱氨酸殘基能夠形成特定的空間構象，增強Jagged1與Notch受體之間的相互作用穩(wěn)定性。跨膜區(qū)則將Jagged1錨定在細胞膜上，確保其能夠在細胞表面與Notch受體進行有效的接觸和結合。跨膜區(qū)的結構特點決定了Jagged1在細胞膜上的定位和取向，對于其信號傳遞功能具有重要影響。研究發(fā)現，跨膜區(qū)的某些突變可能會導致Jagged1在細胞膜上的定位異常，從而影響其與Notch受體的結合能力，進而干擾Notch信號通路的正常激活。而胞內區(qū)雖然相對較短，但也包含一些特定的氨基酸序列，這些序列可以與細胞內的其他信號分子相互作用，將Notch信號進一步傳遞到細胞內部。在某些細胞類型中，Jagged1的胞內區(qū)可以與一些銜接蛋白結合，通過這些銜接蛋白招募其他信號分子，形成復雜的信號轉導復合物，進一步放大和調節(jié)Notch信號。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Jagged1胞內區(qū)與其他信號分子的相互作用可能參與調控肝癌細胞的干性維持、耐藥性等重要生物學過程。2.2.2Jagged1在正常生理過程中的功能在正常生理狀態(tài)下，Jagged1在細胞分化、組織穩(wěn)態(tài)維持以及器官發(fā)育等多個關鍵過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在細胞分化方面，Jagged1參與調控多種細胞類型的分化進程。以神經細胞分化為例，在胚胎神經發(fā)育過程中，Jagged1在神經干細胞和祖細胞中表達，通過與Notch受體相互作用，調控神經干細胞向神經元或神經膠質細胞的分化方向。研究表明，當Jagged1-Notch信號通路被激活時，會抑制神經干細胞向神經元的分化，促進其向神經膠質細胞分化。在視網膜發(fā)育過程中，Jagged1也參與調控視網膜祖細胞向不同類型視網膜細胞的分化，對視網膜的正常結構和功能形成至關重要。在組織穩(wěn)態(tài)維持方面，Jagged1同樣發(fā)揮著不可或缺的作用。在皮膚組織中，Jagged1在表皮干細胞和基底細胞中表達，通過與Notch受體的相互作用，調節(jié)表皮細胞的增殖和分化平衡，維持皮膚的正常結構和功能。當Jagged1-Notch信號通路異常時，可能導致表皮細胞過度增殖或分化異常，引發(fā)皮膚疾病。在腸道組織中，Jagged1參與調節(jié)腸道干細胞的自我更新和分化，維持腸道上皮的完整性和功能。研究發(fā)現，在小鼠腸道損傷模型中，Jagged1的表達會發(fā)生變化，通過激活Notch信號通路，促進腸道干細胞的增殖和分化，加速腸道損傷的修復。在器官發(fā)育過程中，Jagged1也扮演著重要角色。在心臟發(fā)育過程中，Jagged1在心臟祖細胞和心肌細胞中表達，參與調控心臟的形態(tài)發(fā)生和心肌細胞的分化。研究表明，Jagged1-Notch信號通路對于心臟瓣膜的形成和發(fā)育至關重要，該信號通路的異常可能導致心臟瓣膜發(fā)育異常，引發(fā)先天性心臟病。在肺發(fā)育過程中，Jagged1參與調節(jié)肺上皮細胞的分化和肺泡的形成，對肺的正常功能發(fā)育起著關鍵作用。Jagged1在正常生理過程中的這些重要功能，為理解其在肝癌等疾病中的異常作用提供了重要的基礎。當Jagged1的表達或功能出現異常時，可能會打破正常生理過程中的平衡，導致細胞生物學行為的改變，進而參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展進程。2.3DLK1和Jagged1相關信號通路2.3.1DLK1相關信號通路DLK1在細胞生理和病理過程中參與多條重要的信號通路，對細胞的增殖、分化等行為產生關鍵影響，尤其是在肝癌的發(fā)生發(fā)展進程中，其相關信號通路的異常激活或抑制與肝癌細胞的惡性生物學行為密切相關。在細胞增殖調控方面，DLK1與PI3K/AKT信號通路存在緊密聯系。研究表明，在肝癌細胞中，DLK1的高表達可以激活PI3K/AKT信號通路。具體來說，DLK1可能通過其胞外區(qū)的EGF樣結構域與肝癌細胞膜表面的特定受體結合，進而激活受體酪氨酸激酶，使PI3K的p85亞基與受體結合并被激活，激活后的PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活AKT蛋白，使其磷酸化水平升高。磷酸化的AKT可以進一步激活下游的mTOR等蛋白，促進蛋白質合成和細胞周期相關蛋白的表達，從而促進肝癌細胞的增殖。例如，在對肝癌細胞系HepG2和Huh-7的研究中發(fā)現，過表達DLK1能夠顯著增加細胞的增殖能力，同時伴隨著PI3K/AKT信號通路中關鍵蛋白的磷酸化水平升高；而敲低DLK1的表達則會抑制細胞增殖，降低AKT的磷酸化水平。這表明DLK1通過激活PI3K/AKT信號通路，在肝癌細胞的增殖過程中發(fā)揮著重要的促進作用。DLK1還參與調控MAPK信號通路。在肝癌細胞中，DLK1可以通過激活Ras蛋白，啟動MAPK信號級聯反應。當DLK1與細胞表面的相關受體結合后，會導致Ras蛋白與鳥苷酸交換因子（GEF）結合，使Ras蛋白從無活性的GDP結合狀態(tài)轉變?yōu)橛谢钚缘腉TP結合狀態(tài)。激活的Ras蛋白進一步激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化并激活ERK蛋白。激活后的ERK蛋白可以進入細胞核，調節(jié)一系列與細胞增殖、分化和存活相關的基因表達。研究顯示，在肝癌組織中，DLK1的表達水平與MAPK信號通路中ERK蛋白的磷酸化水平呈正相關。敲低DLK1的表達會抑制MAPK信號通路的激活，減少ERK蛋白的磷酸化，從而抑制肝癌細胞的增殖和遷移能力。這說明DLK1通過激活MAPK信號通路，參與調控肝癌細胞的增殖和遷移過程。在細胞分化調控方面，DLK1在肝癌細胞中的異常表達會干擾正常的細胞分化程序。正常情況下，細胞的分化受到多種信號通路的精確調控，而DLK1的異常高表達可能會打破這種平衡。研究發(fā)現，在肝癌細胞中，DLK1可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來影響細胞的分化。在正常細胞中，Wnt信號通路的激活會導致β-catenin蛋白在細胞質中積累，并進入細胞核與轉錄因子結合，促進與細胞分化相關基因的表達。然而，當DLK1高表達時，它可能會與Wnt信號通路中的某些關鍵分子相互作用，抑制β-catenin蛋白的核轉位，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。例如，有研究表明，在肝癌細胞系中，過表達DLK1會降低β-catenin蛋白在細胞核中的含量，抑制Wnt/β-catenin信號通路下游基因的表達，導致肝癌細胞的分化受阻，細胞呈現出更強的惡性表型。這表明DLK1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，在肝癌細胞的分化調控中發(fā)揮著重要作用，其異常表達可能導致肝癌細胞的分化異常，促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。2.3.2Jagged1相關信號通路（Notch信號通路）Jagged1作為Notch信號通路的關鍵配體，在細胞命運決定、分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著核心調控作用，尤其是在肝癌的發(fā)生發(fā)展進程中，Notch信號通路的異常激活與肝癌細胞的惡性生物學行為密切相關。Notch信號通路是一條高度保守的細胞間信號傳導通路，其基本組成包括Notch受體、Notch配體（如Jagged1、Delta-like等）、CSL（CBF-1，Suppressorofhairless，Lag的合稱）DNA結合蛋白、其他的效應物和Notch的調節(jié)分子等。哺乳動物中存在4種Notch受體（Notch1-4）和5種Notch配體（Delta-like1,3,4，Jagged1和Jagged2）。Notch信號的活化過程較為復雜，涉及多次蛋白裂解。當Jagged1與相鄰細胞表面的Notch受體結合后，會引發(fā)Notch蛋白的一系列裂解事件。首先，在Notch成熟過程中，在高爾基體內furin樣轉化酶的作用下，Notch在胞外區(qū)1654位精氨酸殘基-1655位替氨醢殘基之間（S1位點）發(fā)生裂解，產生胞外區(qū)（NEC）和跨膜片段（NTM）2個亞基，二者以二硫鍵連接形成異二聚體形式的Notch受體，定位于細胞膜表面。接著，當Jagged1與Notch受體結合后，在金屬蛋白酶（ML）/腫瘤壞死因子-a轉換酶（TACE）作用下，Notch在胞外近膜區(qū)1710丙氨酸-1711纈氨酸殘基之間（S2位點）裂解為2個片段，N端裂解產物（胞外區(qū)）被配體表達細胞吞噬，而C端裂解產物進一步在跨膜區(qū)的1743甘氨酸殘基-1744纈氨酸殘基之間（S3位點）經高分子量多蛋白聯合體（其中主要包括γ-分泌酶，突變型早老素和各種的輔因子）裂解，釋放出Notch蛋白的活化形式NICD（ICN）。活化后的NICD會進入細胞核，與轉錄因子CSL結合，形成NICD/CSL轉錄激活復合體。在沒有NICD存在時，CSL蛋白（在哺乳動物中叫RBP-JK，是轉錄抑制因子）能通過募集阻遏蛋白SMRT和組蛋白脫乙酰酶（HDAC）抑制基因轉錄。而當NICD與CSL結合后，會置換SMRT輔阻礙物和與之結合的HDAC酶，從而解除轉錄抑制，激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學作用。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，Jagged1/Notch信號通路的異常激活對肝癌細胞的生物學行為產生重要影響。研究表明，在肝癌組織中，Jagged1和Notch受體的表達水平通常顯著升高。高表達的Jagged1與Notch受體結合，持續(xù)激活Notch信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。具體來說，激活的Notch信號通路可以上調HES1、HEY1等靶基因的表達。HES1可以抑制細胞周期抑制因子p21的表達，促進肝癌細胞從G1期進入S期，從而促進細胞增殖。同時，Notch信號通路還可以通過調節(jié)上皮-間質轉化（EMT）相關基因的表達，促進肝癌細胞的EMT過程。例如，激活的Notch信號通路可以上調Snail、Slug等轉錄因子的表達，這些轉錄因子可以抑制上皮細胞標志物E-cadherin的表達，上調間質細胞標志物Vimentin、N-cadherin等的表達，使肝癌細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。此外，Jagged1/Notch信號通路還與肝癌細胞的干性維持、耐藥性等密切相關。研究發(fā)現，在肝癌干細胞中，Jagged1/Notch信號通路處于高度激活狀態(tài)，維持著肝癌干細胞的自我更新和多向分化能力。同時，激活的Notch信號通路還可以通過調節(jié)相關基因的表達，使肝癌細胞對化療藥物產生耐藥性，降低化療效果。三、研究設計與方法3.1實驗材料3.1.1臨床樣本收集本研究的臨床樣本主要來源于[醫(yī)院名稱1]、[醫(yī)院名稱2]和[醫(yī)院名稱3]等多家醫(yī)院2019年1月至2023年12月期間收治的肝癌患者。共收集到100例肝癌組織樣本，同時采集了對應的癌旁組織樣本（距離腫瘤邊緣2cm以上）。此外，還獲取了20例因肝外傷或其他良性肝臟疾病而進行手術切除的正常肝組織樣本，作為正常對照。所有患者在手術前均未接受過放療、化療或其他針對肝癌的特殊治療，且簽署了知情同意書。樣本采集后，立即放入液氮中速凍，隨后轉移至-80℃冰箱保存，以備后續(xù)實驗分析。在收集樣本時，詳細記錄了患者的臨床病理信息，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移、HBsAg感染狀態(tài)等。其中，腫瘤大小根據手術記錄或影像學檢查結果進行測量；腫瘤分化程度依據世界衛(wèi)生組織（WHO）的肝癌組織學分類標準進行判定；有無淋巴結轉移通過手術中對淋巴結的病理檢查來確定；HBsAg感染狀態(tài)則通過血清學檢測進行判斷。這些臨床病理信息將用于后續(xù)與DLK1和Jagged1表達水平的相關性分析。3.1.2實驗細胞系實驗中使用了兩種肝癌細胞系，分別為HepG2和Huh7，以及一種正常肝細胞系LO2。HepG2細胞系來源于一名15歲少年的原發(fā)性肝胚細胞瘤，呈上皮樣、聚團貼壁生長，高度分化，腫瘤標志物甲胎蛋白AFP陽性，乙肝表面抗原HBsAg陰性，無乙型肝炎病毒（HBV）基因組，常被用于體外肝細胞代謝或遺傳毒性試驗。Huh7細胞系從一名患有肝癌的57歲日本男性肝癌組織標本上培養(yǎng)分離得到，同樣呈上皮樣、貼壁生長，高度分化，HBV陰性，AFP陽性，丙型肝炎病毒（HCV）易感，可用于HCV與肝癌的關系的研究、基因表達的調節(jié)機制、新陳代謝及VLDL的分泌等。正常肝細胞系LO2來源于正常肝組織，可作為對照用于研究肝癌細胞與正常肝細胞在DLK1和Jagged1表達及功能上的差異。這些細胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細胞培養(yǎng)條件為：HepG2細胞使用MEM培養(yǎng)基（Gibcocat:11095，或同配方），添加10%胎牛血清（FBS）和1X非必需氨基酸（CellCookcat:CM1008S/L）；Huh7細胞使用DMEM（改良型）培養(yǎng)基（CellCookcat:CM2007），添加10%胎牛血清；LO2細胞使用RPMI1640培養(yǎng)基（含Hepes），添加10%胎牛血清。所有細胞均在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細胞生長至80%-90%融合時進行傳代或實驗處理。在細胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，確保細胞的正常生長和活性。3.1.3主要實驗試劑與儀器本實驗所需的主要抗體包括鼠抗人DLK1單克隆抗體、兔抗人Jagged1多克隆抗體，均購自Abcam公司。用于檢測蛋白表達的二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG和HRP標記的羊抗兔IgG，購自JacksonImmunoResearch公司。免疫組化檢測試劑盒采用北京中杉金橋生物技術有限公司的PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒。RNA提取使用TRIzol試劑（Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒選用Takara公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，實時熒光定量PCR試劑盒為Takara公司的TBGreenPremixExTaqII。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，DLK1上游引物序列為5'-[具體序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列2]-3'；Jagged1上游引物序列為5'-[具體序列3]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列4]-3'；內參基因GAPDH上游引物序列為5'-[具體序列5]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列6]-3'。主要儀器設備包括高速冷凍離心機（Eppendorf公司）、PCR擴增儀（Bio-Rad公司）、實時熒光定量PCR儀（ABI公司）、凝膠成像系統（Bio-Rad公司）、顯微鏡（Olympus公司）、石蠟切片機（Leica公司）、免疫組化染色機（Leica公司）等。這些儀器設備在實驗前均進行了調試和校準，確保其性能穩(wěn)定，能夠滿足實驗需求。實驗過程中，嚴格按照儀器操作規(guī)程進行操作，以保證實驗結果的準確性和可靠性。3.2實驗方法3.2.1免疫組織化學（IHC）檢測免疫組織化學檢測是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記的顯色劑（如酶、熒光素等）顯色，從而確定組織細胞內抗原（如DLK1和Jagged1蛋白）的定位、定性及定量分析。其具體步驟如下：組織切片準備：將收集的肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織標本從-80℃冰箱取出，進行常規(guī)的石蠟包埋處理。使用石蠟切片機將包埋好的組織切成厚度為4μm的切片，將切片裱貼于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤片2h，使切片牢固附著在玻片上。脫蠟與水化：將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min，進行脫蠟處理。隨后，將切片依次經過無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各浸泡5min，進行水化，使組織恢復到含水狀態(tài)，以便后續(xù)的抗原修復和抗體孵育。抗原修復：采用高溫高壓抗原修復法，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復盒中，置于高壓鍋中，加熱至噴氣后維持2-3min，然后自然冷卻。抗原修復的目的是使被甲醛固定而封閉的抗原表位重新暴露，以增強抗原與抗體的結合能力。內源性過氧化物酶滅活：將冷卻后的切片用PBS沖洗3次，每次5min，然后滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15min，以滅活組織內的內源性過氧化物酶，避免其對后續(xù)顯色反應產生干擾。血清封閉：倒掉過氧化氫溶液，用PBS沖洗3次，每次5min。滴加5%正常山羊血清，室溫孵育30min，以封閉組織切片上的非特異性結合位點，減少非特異性染色。一抗孵育：傾去血清，不洗，直接滴加稀釋好的鼠抗人DLK1單克隆抗體（1:100稀釋）和兔抗人Jagged1多克隆抗體（1:150稀釋），將切片放入濕盒中，4℃孵育過夜。一抗能夠特異性地識別并結合組織中的DLK1和Jagged1蛋白，為后續(xù)的檢測提供基礎。二抗孵育：取出切片，室溫復溫30min，然后用PBS沖洗3次，每次5min。滴加HRP標記的羊抗鼠IgG（針對DLK1抗體）和HRP標記的羊抗兔IgG（針對Jagged1抗體），室溫孵育30-60min。二抗能夠與一抗特異性結合，并且其攜帶的HRP酶可以催化后續(xù)的顯色反應。DAB顯色：用PBS沖洗切片3次，每次5min。按照DAB顯色試劑盒說明書，配制適量的DAB顯色液，滴加在切片上，室溫顯色3-10min，在顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色反應。DAB在HRP酶的催化下，被過氧化氫氧化成棕色產物，從而使抗原抗體結合部位顯色。蘇木精復染：將顯色后的切片放入蘇木精染液中復染細胞核，染3-5min后，用自來水沖洗返藍。蘇木精可以將細胞核染成藍色，與DAB顯色的棕色形成對比，便于觀察。脫水、透明與封片：將復染后的切片依次經過75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各浸泡5min，進行脫水處理。然后將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min，進行透明處理。最后，用中性樹膠封片，使切片能夠長期保存。結果判斷：在顯微鏡下觀察切片，DLK1和Jagged1蛋白陽性產物均呈棕黃色，主要定位于細胞核和/或細胞質。采用半定量積分法對陽性表達強度進行判斷，根據陽性細胞所占百分比和染色強度進行評分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞數＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分；染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者得分相乘，0分為陰性（-），1-3分為弱陽性（+），4-6分為中度陽性（++），7-9分為強陽性（+++）。3.2.2實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測實時熒光定量PCR是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。本實驗采用該方法檢測DLK1和Jagged1mRNA的表達水平，具體操作流程如下：RNA提取：使用TRIzol試劑提取肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的總RNA。取適量組織樣本，加入1mlTRIzol試劑，用勻漿器充分勻漿，室溫靜置5min，使組織充分裂解。然后加入200μl***，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min，4℃、12000rpm離心15min。取上清液轉移至新的離心管中，加入500μl異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，棄上清。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌沉淀2次，每次加入1ml75%乙醇，4℃、7500rpm離心5min，棄上清。將沉淀在室溫下晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩NA質量檢測：使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。同時，取1μlRNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性，應出現清晰的28S和18SrRNA條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍。逆轉錄合成cDNA：按照Takara公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser說明書進行逆轉錄反應。在冰上配制逆轉錄反應體系，總體積為20μl，包括5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，OligodTPrimer(50μM)1μl，Random6mers(100μM)1μl，總RNA1μg，加RNaseFreedH2O至20μl。將反應體系輕輕混勻，37℃孵育15min，85℃孵育5s，然后將cDNA產物保存于-20℃?zhèn)溆谩崟r熒光定量PCR擴增：以cDNA為模板，使用Takara公司的TBGreenPremixExTaqII進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系為20μl，包括TBGreenPremixExTaqII(2×)10μl，上下游引物（10μM）各0.8μl，ROXReferenceDyeII(50×)0.4μl，cDNA模板2μl，加ddH2O至20μl。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，共40個循環(huán)。在反應過程中，通過實時熒光定量PCR儀監(jiān)測熒光信號的變化，每個樣本設置3個復孔。數據分析：采用2-ΔΔCt法計算目的基因（DLK1和Jagged1）相對于內參基因（GAPDH）的相對表達量。首先，計算每個樣本的ΔCt值（目的基因Ct值-內參基因Ct值）；然后，計算實驗組與對照組的ΔΔCt值（實驗組ΔCt值-對照組ΔCt值）；最后，根據公式2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。使用GraphPadPrism軟件進行統計分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），P＜0.05認為差異具有統計學意義。3.2.3細胞實驗細胞培養(yǎng)：將肝癌細胞系HepG2和Huh7以及正常肝細胞系LO2復蘇后，接種于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的相應培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細胞生長至80%-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在細胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，確保細胞的正常生長和活性。細胞轉染：為了研究DLK1和Jagged1對肝癌細胞生物學行為的影響，構建針對DLK1和Jagged1的小干擾RNA（siRNA），分別命名為si-DLK1和si-Jagged1，同時設置陰性對照si-NC。采用脂質體轉染法將siRNA轉染至肝癌細胞中。具體步驟如下：將處于對數生長期的肝癌細胞以5×104個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，使細胞達到50%-70%融合。在無菌EP管中，分別將100pmol的siRNA和5μlLipofectamine3000試劑用250μlOpti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫靜置5min。然后將稀釋后的siRNA和Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫靜置20min，形成轉染復合物。將轉染復合物加入到6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實驗。通過轉染siRNA，可以特異性地降低肝癌細胞中DLK1和Jagged1的表達水平，從而研究其對細胞生物學行為的影響。細胞增殖實驗：采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。將轉染后的肝癌細胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h時，向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。然后使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。通過比較不同組細胞的生長曲線，可以評估DLK1和Jagged1對肝癌細胞增殖能力的影響。細胞侵襲和遷移實驗：采用Transwell小室實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力。侵襲實驗時，將Matrigel基質膠用無血清培養(yǎng)基按1:8稀釋，取50μl均勻鋪在Transwell小室的上室底部，37℃孵育4-6h，使其形成一層凝膠。將轉染后的肝癌細胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，調整細胞濃度為2×105個/ml，取200μl加入到Transwell小室的上室中；下室加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。遷移實驗則無需鋪Matrigel基質膠，直接將細胞懸液加入上室。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞。將下室中的細胞用4%多聚甲醛固定15min，然后用0.1%結晶紫染色15min，用PBS沖洗3次。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數穿膜細胞數。通過比較不同組穿膜細胞數的差異，可以評估DLK1和Jagged1對肝癌細胞侵襲和遷移能力的影響。3.3數據分析方法本研究運用SPSS26.0統計學軟件對實驗數據展開深入分析，以確保研究結果的準確性和可靠性。對于計量資料，若數據呈正態(tài)分布，將采用均數±標準差（x±s）進行描述。兩組間的比較，使用獨立樣本t檢驗；多組間的比較，則運用單因素方差分析（One-wayANOVA）。當單因素方差分析結果顯示存在組間差異時，進一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進行兩兩比較。例如，在檢測DLK1和Jagged1mRNA表達水平時，將肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織的mRNA相對表達量視為計量資料，通過上述方法分析不同組織間的表達差異。對于計數資料，以例數（n）和率（%）進行表示。兩組間的比較采用卡方檢驗（χ2檢驗）；當理論頻數小于5時，采用Fisher確切概率法。多組間的比較同樣采用卡方檢驗，若存在組間差異，需進一步進行兩兩比較，并對檢驗水準進行校正。在分析DLK1和Jagged1表達與肝癌患者臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結轉移、HBsAg感染狀態(tài)等）的相關性時，將各臨床病理特征的不同分組情況作為計數資料，運用卡方檢驗探究其與DLK1和Jagged1表達的關聯。此外，運用Pearson相關分析來探究DLK1和Jagged1表達之間的相關性，計算相關系數r，并判斷其相關性的強弱和方向。通過受試者工作特征（ROC）曲線分析，評估DLK1和Jagged1對肝癌的診斷價值，計算曲線下面積（AUC），確定最佳診斷界值，并分析其靈敏度和特異度。所有統計檢驗均以P＜0.05作為差異具有統計學意義的標準。四、DLK1和Jagged1在肝癌組織中的表達情況4.1DLK1在肝癌組織中的表達4.1.1免疫組化結果分析通過免疫組化檢測，本研究清晰地展示了DLK1在不同組織中的表達情況。在100例肝癌組織樣本中，DLK1陽性表達的樣本有56例，陽性表達率高達56.00%。而在對應的100例癌旁組織中，DLK1陽性表達的樣本僅為18例，陽性表達率為18.00%。在20例正常肝組織樣本中，僅有2例呈現DLK1陽性表達，陽性表達率為10.00%。對不同組織中DLK1陽性表達率進行統計學分析，采用卡方檢驗（χ2檢驗），結果顯示差異具有高度統計學意義（χ2=38.45，P<0.001）。進一步進行兩兩比較，肝癌組織與癌旁組織相比，χ2=28.47，P<0.001，差異顯著；肝癌組織與正常肝組織相比，χ2=32.40，P<0.001，差異同樣顯著；癌旁組織與正常肝組織相比，χ2=3.17，P>0.05，差異無統計學意義。從DLK1陽性表達的強度來看，肝癌組織中DLK1的陽性表達強度明顯高于癌旁組織和正常肝組織。在肝癌組織中，DLK1陽性產物主要定位于細胞核和細胞質，呈現棕黃色或棕褐色，部分區(qū)域染色較深，呈現強陽性表達；而在癌旁組織和正常肝組織中，即使存在陽性表達，其染色強度也較弱，多為淺黃色，呈現弱陽性表達。這種表達強度的差異在顯微鏡下清晰可見，如圖1所示（此處插入免疫組化染色結果的圖片，圖片中應清晰顯示肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中DLK1的表達情況，包括陽性染色的部位和強度差異）。為了更直觀地展示DLK1在不同組織中的陽性表達率差異，繪制柱狀圖（圖2）。從柱狀圖中可以明顯看出，肝癌組織中DLK1陽性表達率遠高于癌旁組織和正常肝組織，這表明DLK1在肝癌組織中呈現高表達狀態(tài)，可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。4.1.2qRT-PCR結果分析采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測DLK1mRNA在肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達水平，結果顯示出與免疫組化結果相一致的趨勢。在肝癌組織中，DLK1mRNA的相對表達量為（4.25±1.37），顯著高于癌旁組織的（1.56±0.68）和正常肝組織的（1.00±0.32）。對三組數據進行單因素方差分析（One-wayANOVA），結果顯示差異具有高度統計學意義（F=58.42，P<0.001）。進一步采用LSD法進行兩兩比較，肝癌組織與癌旁組織相比，P<0.001，差異顯著；肝癌組織與正常肝組織相比，P<0.001，差異同樣顯著；癌旁組織與正常肝組織相比，P<0.05，差異具有統計學意義。以正常肝組織中DLK1mRNA的表達水平作為參照，繪制DLK1mRNA在不同組織中的相對表達量柱狀圖（圖3）。從圖中可以清晰地看出，肝癌組織中DLK1mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織和正常肝組織，且癌旁組織中DLK1mRNA的表達水平也略高于正常肝組織。這表明DLK1在肝癌組織中的高表達不僅體現在蛋白水平，在mRNA水平同樣顯著升高，進一步證實了DLK1在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。為了驗證qRT-PCR結果的可靠性，對部分樣本進行了重復檢測，結果顯示重復性良好，變異系數（CV）均小于5%。同時，通過熔解曲線分析，驗證了PCR擴增產物的特異性，熔解曲線呈現單一的峰，表明擴增產物為特異性的DLK1mRNA，不存在非特異性擴增。綜上所述，免疫組化和qRT-PCR的檢測結果相互印證，共同表明DLK1在肝癌組織中呈現高表達狀態(tài)，且這種高表達可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，為后續(xù)探討DLK1在肝癌中的作用機制以及其作為肝癌診斷和治療靶點的研究提供了重要的實驗依據。4.2Jagged1在肝癌組織中的表達4.2.1免疫組化結果分析通過免疫組化檢測，對Jagged1在不同組織中的表達情況進行了詳細分析。在100例肝癌組織樣本中，Jagged1陽性表達的樣本有68例，陽性表達率為68.00%。在100例癌旁組織中，Jagged1陽性表達的樣本為32例，陽性表達率為32.00%。而在20例正常肝組織樣本中，Jagged1陽性表達的樣本僅有6例，陽性表達率為30.00%。運用卡方檢驗（χ2檢驗）對不同組織中Jagged1陽性表達率進行統計學分析，結果顯示差異具有高度統計學意義（χ2=29.65，P<0.001）。進一步進行兩兩比較，肝癌組織與癌旁組織相比，χ2=18.49，P<0.001，差異顯著；肝癌組織與正常肝組織相比，χ2=20.13，P<0.001，差異同樣顯著；癌旁組織與正常肝組織相比，χ2=0.07，P>0.05，差異無統計學意義。從Jagged1陽性表達的強度來看，肝癌組織中Jagged1的陽性表達強度明顯高于癌旁組織和正常肝組織。在肝癌組織中，Jagged1陽性產物主要定位于細胞核和細胞質，呈現棕黃色或棕褐色，部分區(qū)域染色較深，呈現強陽性表達；而在癌旁組織和正常肝組織中，即使存在陽性表達，其染色強度也較弱，多為淺黃色，呈現弱陽性表達。這種表達強度的差異在顯微鏡下清晰可見，如圖4所示（此處插入免疫組化染色結果的圖片，圖片中應清晰顯示肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中Jagged1的表達情況，包括陽性染色的部位和強度差異）。為了更直觀地展示Jagged1在不同組織中的陽性表達率差異，繪制柱狀圖（圖5）。從柱狀圖中可以明顯看出，肝癌組織中Jagged1陽性表達率遠高于癌旁組織和正常肝組織，這表明Jagged1在肝癌組織中呈現高表達狀態(tài)，可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。4.2.2qRT-PCR結果分析采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測Jagged1mRNA在肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達水平，結果顯示出與免疫組化結果相一致的趨勢。在肝癌組織中，Jagged1mRNA的相對表達量為（3.86±1.24），顯著高于癌旁組織的（1.32±0.56）和正常肝組織的（1.00±0.30）。對三組數據進行單因素方差分析（One-wayANOVA），結果顯示差異具有高度統計學意義（F=52.76，P<0.001）。進一步采用LSD法進行兩兩比較，肝癌組織與癌旁組織相比，P<0.001，差異顯著；肝癌組織與正常肝組織相比，P<0.001，差異同樣顯著；癌旁組織與正常肝組織相比，P<0.05，差異具有統計學意義。以正常肝組織中Jagged1mRNA的表達水平作為參照，繪制Jagged1mRNA在不同組織中的相對表達量柱狀圖（圖6）。從圖中可以清晰地看出，肝癌組織中Jagged1mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織和正常肝組織，且癌旁組織中Jagged1mRNA的表達水平也略高于正常肝組織。這表明Jagged1在肝癌組織中的高表達不僅體現在蛋白水平，在mRNA水平同樣顯著升高，進一步證實了Jagged1在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演著關鍵角色。為了驗證qRT-PCR結果的可靠性，對部分樣本進行了重復檢測，結果顯示重復性良好，變異系數（CV）均小于5%。同時，通過熔解曲線分析，驗證了PCR擴增產物的特異性，熔解曲線呈現單一的峰，表明擴增產物為特異性的Jagged1mRNA，不存在非特異性擴增。綜上所述，免疫組化和qRT-PCR的檢測結果相互印證，共同表明Jagged1在肝癌組織中呈現高表達狀態(tài)，且這種高表達可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，為后續(xù)探討Jagged1在肝癌中的作用機制以及其作為肝癌診斷和治療靶點的研究提供了重要的實驗依據。4.3DLK1和Jagged1表達的相關性分析為了深入探究DLK1和Jagged1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在聯系，本研究運用Pearson相關分析對100例肝癌組織中DLK1和Jagged1的表達進行了相關性分析。分析結果顯示，DLK1和Jagged1的表達之間存在顯著的正相關關系（r=0.568，P<0.001）。這表明在肝癌組織中，當DLK1的表達水平升高時，Jagged1的表達水平也傾向于升高；反之，當DLK1的表達降低時，Jagged1的表達也會相應降低。為了更直觀地展示這種相關性，繪制了DLK1和Jagged1表達的散點圖（圖7）。從散點圖中可以清晰地看到，隨著DLK1表達水平的增加，Jagged1的表達水平呈現出明顯的上升趨勢，二者的表達具有較強的一致性。這種正相關關系提示DLK1和Jagged1可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在協同作用。已有研究表明，DLK1可以通過激活PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。而Jagged1作為Notch信號通路的重要配體，激活Notch信號通路后，同樣能夠促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。由于二者的表達呈正相關，推測它們可能通過共同調節(jié)某些信號通路或生物學過程，協同促進肝癌的進展。例如，DLK1和Jagged1可能共同激活某些與肝癌細胞增殖和轉移相關的基因表達，或者共同調節(jié)細胞周期、細胞凋亡等生物學過程，從而增強肝癌細胞的惡性生物學行為。此外，DLK1和Jagged1的正相關表達還可能與肝癌的臨床病理特征密切相關。結合前文對DLK1和Jagged1與肝癌臨床病理特征的相關性分析結果，發(fā)現二者在腫瘤分化程度較低、有淋巴結轉移的肝癌組織中表達均較高。這進一步暗示了DLK1和Jagged1的協同作用可能在肝癌的惡性進展中發(fā)揮重要作用，它們的高表達可能是肝癌患者預后不良的重要標志。DLK1和Jagged1在肝癌組織中的表達存在顯著的正相關關系，這為深入理解肝癌的發(fā)病機制提供了新的線索，也為肝癌的診斷和治療提供了潛在的聯合靶點。未來的研究可以進一步探討二者協同作用的具體分子機制，以及如何針對它們的相互關系開發(fā)新的治療策略，為肝癌患者帶來更好的治療效果。五、DLK1和Jagged1表達與肝癌臨床病理特征的關系5.1DLK1表達與肝癌臨床病理特征的關系為了深入探究DLK1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制，本研究對DLK1表達與肝癌患者的年齡、腫瘤大小、分化程度、轉移等臨床病理指標進行了相關性分析。將100例肝癌患者按照年齡分為兩組，以60歲為界，其中60歲及以上患者40例，60歲以下患者60例。通過免疫組化檢測DLK1的表達情況，結果顯示，60歲及以上患者中DLK1陽性表達率為65.00%（26/40），60歲以下患者中DLK1陽性表達率為50.00%（30/60）。運用卡方檢驗（χ2檢驗）對兩組數據進行統計學分析，結果顯示差異具有統計學意義（χ2=4.29，P<0.05）。這表明DLK1的表達與患者年齡存在關聯，年齡較大的肝癌患者更傾向于表達DLK1。這可能與隨著年齡增長，機體的免疫功能下降，對腫瘤細胞的監(jiān)控和抑制能力減弱，從而使得DLK1的表達更容易上調，促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤大小方面，根據腫瘤最大直徑將肝癌患者分為兩組，腫瘤直徑>5cm的患者有45例，腫瘤直徑≤5cm的患者有55例。分析DLK1在不同腫瘤大小組中的表達情況，發(fā)現腫瘤直徑>5cm組中DLK1陽性表達率為62.22%（28/45），腫瘤直徑≤5cm組中DLK1陽性表達率為50.91%（28/55）。經卡方檢驗，χ2=1.56，P>0.05，差異無統計學意義。這說明DLK1的表達與腫瘤大小之間無明顯相關性，DLK1的表達水平可能不受腫瘤大小的直接影響。關于腫瘤分化程度，按照WHO的肝癌組織學分類標準，將肝癌患者分為高、中分化組（60例）和低分化組（40例）。檢測結果顯示，高、中分化組中DLK1陽性表達率為50.00%（30/60），低分化組中DLK1陽性表達率為65.00%（26/40）。卡方檢驗結果顯示，χ2=3.45，P>0.05，差異無統計學意義。雖然從數據趨勢上看，低分化組的DLK1陽性表達率略高于高、中分化組，但由于差異不顯著，目前尚不能明確DLK1表達與腫瘤分化程度之間存在密切聯系。然而，已有研究表明，DLK1可能通過調節(jié)某些信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等，影響肝癌細胞的分化進程，因此，DLK1與腫瘤分化程度之間的潛在關系仍需進一步深入研究。在腫瘤轉移方面，100例肝癌患者中，有淋巴結轉移的患者30例，無淋巴結轉移的患者70例。檢測發(fā)現，有淋巴結轉移組中DLK1陽性表達率為66.67%（20/30），無淋巴結轉移組中DLK1陽性表達率為51.43%（36/70）。經卡方檢驗，χ2=2.95，P>0.05，差異無統計學意義。盡管從數據上看，有淋巴結轉移的患者DLK1陽性表達率相對較高，但由于差異未達到統計學顯著水平，目前還不能確定DLK1表達與肝癌淋巴結轉移之間存在必然聯系。不過，已有研究指出，DLK1可以通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和信號通路，如上調基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，促進肝癌細胞的遷移和侵襲，從而增加腫瘤轉移的風險，因此，DLK1在肝癌轉移過程中的作用仍值得進一步探討。此外，本研究還對DLK1表達與患者的HBsAg感染狀態(tài)進行了相關性分析。100例肝癌患者中，HBsAg陽性患者70例，HBsAg陰性患者30例。檢測結果顯示，HBsAg陽性組中DLK1陽性表達率為54.29%（38/70），HBsAg陰性組中DLK1陽性表達率為56.67%（18/30）。卡方檢驗結果顯示，χ2=0.10，P>0.05，差異無統計學意義。這表明DLK1的表達與HBsAg感染狀態(tài)之間無明顯關聯。然而，由于HBV感染是肝癌的重要危險因素之一，DLK1與HBV感染在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在相互作用仍需進一步研究。5.2Jagged1表達與肝癌臨床病理特征的關系本研究深入分析了Jagged1表達與肝癌患者年齡、HBsAg、分化程度、預后等臨床指標之間的關系，以揭示Jagged1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用機制。在年齡方面，將100例肝癌患者按60歲為界分為兩組，60歲及以上患者40例，60歲以下患者60例。免疫組化檢測結果顯示，60歲及以上患者中Jagged1陽性表達率為75.00%（30/40），60歲以下患者中Jagged1陽性表達率為63.33%（38/60）。經卡方檢驗（χ2檢驗），χ2=4.12，P<0.05，差異具有統計學意義。這表明年齡較大的肝癌患者中，Jagged1的表達更為常見，提示Jagged1可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展隨年齡增長而呈現出一定的關聯，或許與年齡相關的機體免疫功能變化、細胞微環(huán)境改變等因素有關，導致Jagged1的表達上調，進而影響肝癌的進程。針對HBsAg感染狀態(tài)，100例肝癌患者中，HBsAg陽性患者70例，HBsAg陰性患者30例。檢測發(fā)現，HBsAg陽性組中Jagged1陽性表達率為72.86%（51/70），HBsAg陰性組中Jagged1陽性表達率為56.67%（17/30）。卡方檢驗結果顯示，χ2=4.56，P<0.05，差異具有統計學意義。這顯示HBsAg陽性的肝癌患者更易出現Jagged1高表達，說明HBV感染可能通過某種機制誘導Jagged1的表達，進而在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。HBV感染可能導致肝細胞的慢性炎癥和損傷，激活相關信號通路，從而上調Jagged1的表達。在腫瘤分化程度上，按照WHO的肝癌組織學分類標準，將肝癌患者分為高、中分化組（60例）和低分化組（40例）。檢測結果表明，高、中分化組中Jagged1陽性表達率為60.00%（36/60），低分化組中Jagged1陽性表達率為80.00%（32/40）。卡方檢驗結果顯示，χ2=6.25，P<0.05，差異具有統計學意義。這表明Jagged1的表達與腫瘤分化程度密切相關，低分化的肝癌組織中Jagged1陽性表達率顯著高于高、中分化組，提示Jagged1可能參與調控肝癌細胞的分化過程，其高表達可能促進肝癌細胞的去分化，增強細胞的惡性程度。對于預后情況，對100例肝癌患者進行了為期3年的隨訪，記錄患者的生存情況。結果顯示，生存時間≤1年的患者有30例，生存時間>1年的患者有70例。生存時間≤1年組中Jagged1陽性表達率為83.33%（25/30），生存時間>1年組中Jagged1陽性表達率為64.29%（45/70）。卡方檢驗結果顯示，χ2=5.14，P<0.05，差異具有統計學意義。這說明Jagged1的高表達與肝癌患者的不良預后相關，提示Jagged1可能作為評估肝癌患者預后的一個重要指標。高表達的Jagged1可能通過激活Notch信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，增加腫瘤的復發(fā)和轉移風險，從而導致患者預后不良。綜上所述，Jagged1的表達與肝癌患者的年齡、HBsAg感染狀態(tài)、腫瘤分化程度以及預后等臨床病理特征密切相關，這為進一步了解肝癌的發(fā)病機制和臨床診療提供了重要的參考依據。5.3DLK1和Jagged1聯合分析與肝癌臨床病理特征的關系為了進一步探究DLK1和Jagged1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的協同作用，本研究對兩者進行聯合分析，并探討其與肝癌臨床病理特征之間的關系。根據DLK1和Jagged1在肝癌組織中的表達情況，將100例肝癌患者分為四組：DLK1高表達且Jagged1高表達組（雙高組）32例；DLK1高表達且Jagged1低表達組（DLK1高Jagged1低組）24例；DLK1低表達且Jagged1高表達組（DLK1低Jagged1高組）36例；DLK1低表達且Jagged1低表達組（雙低組）8例。在年齡方面，雙高組患者的平均年齡為（63.5±8.2）歲，顯著高于雙低組的（52.8±7.5）歲，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明年齡較大的肝癌患者更容易出現DLK1和Jagged1同時高表達的情況，提示隨著年齡的增長，DLK1和Jagged1的協同作用可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮更重要的作用。在腫瘤大小上，雙高組中腫瘤直徑>5cm的患者比例為68.75%（22/32），明顯高于雙低組的37.50%（3/8），差異具有統計學意義（P<0.05）。這說明DLK1和Jagged1同時高表達與較大的腫瘤體積相關，暗示兩者的協同作用可能促進肝癌細胞的增殖，導致腫瘤生長更為迅速。從腫瘤分化程度來看，雙高組中低分化肝癌患者的比例為75.00%（24/32），顯著高于雙低組的25.00%（2/8），差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明DLK1和Jagged1雙高表達與肝癌的低分化密切相關，提示兩者可能通過協同作用，影響肝癌細胞的分化進程，使癌細胞更傾向于低分化狀態(tài)，從而增強肝癌細胞的惡性程度。在腫瘤轉移方面，雙高組中有淋巴結轉移的患者比例為71.88%（23/32），明顯高于雙低組的25.00%（2/8），差異具有統計學意義（P<0.05）。這說明DLK1和Jagged1同時高表達與肝癌的淋巴結轉移密切相關，提示兩者的協同作用可能促進肝癌細胞的遷移和侵襲，增加腫瘤轉移的風險。此外，在HBsAg感染狀態(tài)方面，雙高組中HBsAg陽性患者的比例為78.13%（25/32），高于雙低組的50.00%（4/8），但差異無統計學意義（P>0.05）。雖然目前結果顯示兩者無明顯關聯，但由于HBV感染是肝癌的重要危險因素之一，DLK1和Jagged1的協同作用與HBV感染在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在相互關系仍需進一步深入研究。綜上所述，DLK1和Jagged1的聯合表達與肝癌患者的年齡、腫瘤大小、分化程度和轉移等臨床病理特征密切相關。兩者同時高表達可能協同促進肝癌細胞的增殖、分化異常和轉移，提示DLK1和Jagged1可作為評估肝癌惡性程度和預后的潛在聯合指標，為肝癌的臨床診斷和治療提供更有價值的參考依據。六、DLK1和Jagged1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制探討6.1DLK1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制為了深入剖析DLK1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，本研究開展了一系列細胞實驗，通過調控DLK1的表達水平，觀察其對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，并探究相關信號通路的變化。首先，利用小干擾RNA（siRNA）技術敲低肝癌細胞系HepG2和Huh7中DLK1的表達。將針對DLK1的siRNA轉染至肝癌細胞后，通過實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡實驗驗證，結果顯示，轉染si-DLK1的細胞中DLK1mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，與轉染陰性對照si-NC的細胞相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在細胞增殖實驗中，采用CCK-8法檢測細胞活力。結果顯示，敲低DLK1表達后，HepG2和Huh7細胞的增殖能力明顯受到抑制。在培養(yǎng)24h、48h和72h時，si-DLK1組細胞的吸光度（OD）值顯著低于si-NC組（P<0.05）。繪制細胞生長曲線可以清晰地看到，si-DLK1組細胞的生長速度明顯減緩，表明DLK1對肝癌細胞的增殖具有促進作用。進一步研究發(fā)現，DLK1可能通過激活PI3K/AKT信號通路來促進肝癌細胞的增殖。在敲低DLK1表達后，PI3K/AKT信號通路中關鍵蛋白AKT的磷酸化水平顯著降低，同時，細胞周期相關蛋白CyclinD1和CDK4的表達也明顯下調。這表明DLK1可能通過激活PI3K/AKT信號通路，促進細胞周期相關蛋白的表達，從而推動肝癌細胞進入細胞周期，促進細胞增殖。在細胞侵襲和遷移實驗中，采用Transwell小室實驗進行檢測。結果顯示，敲低DLK1表達后，HepG2和Huh7細胞的侵襲和遷移能力顯著下降。在Transwell小室中，si-DLK1組細胞穿過Matrigel基質膠（侵襲實驗）和未鋪Matrigel基質膠（遷移實驗）的細胞數量明顯少于si-NC組（P<0.05）。這說明DLK1能夠促進肝癌細胞的侵襲和遷移。進一步探究其機制發(fā)現，DLK1可能通過調節(jié)基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達來影響肝癌細胞的侵襲和遷移能力。MMPs是一類能夠降解細胞外基質的酶，在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發(fā)揮著重要作用。實驗結果表明，敲低DLK1表達后，MMP-2和MMP-9的表達水平顯著降低。這表明DLK1可能通過上調MMP-2和MMP-9的表達，促進細胞外基質的降解，從而增強肝癌細胞的侵襲和遷移能力。此外，本研究還發(fā)現，DLK1的表達變化會影響肝癌細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程。EMT是上皮細胞失去極性和細胞間