Ang-(1-7)與A779：對STZ致糖尿病大鼠腎臟功能影響的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義隨著社會經濟的發展、人民生活水平的提高以及生活方式的改變，糖尿病（DiabetesMellitus，DM）的發病率正呈現出迅猛增長的態勢。我國作為人口大國，目前約有龐大數量的糖尿病患者。糖尿病所引發的并發癥對人體健康危害極大，嚴重時甚至會威脅生命安全。糖尿病并發癥主要分為大血管并發癥和微血管并發癥，其中大血管并發癥在糖耐量減退階段便已開始出現，而微血管并發癥則在糖尿病發展階段逐漸顯現。糖尿病腎病（DiabeticNephropathy，DN）作為糖尿病常見且嚴重的微血管并發癥之一，其發病率不容小覷。據統計，1型糖尿病病程達25年時，蛋白尿的累積發生率高達46％；2型糖尿病的蛋白尿發生率更高，可達56％。這也導致因糖尿病腎病引發的慢性腎功能衰竭患者數量迅速上升。在歐美等發達國家，糖尿病腎病已成為導致終末期腎病（End-StageRenalDisease，ESRD）的首要原因，約占ESRD的40％-50％。在我國大陸地區，糖尿病腎病約占終末期腎病的6％-10％。并且，隨著糖尿病發病率的持續攀升，預計我國糖尿病腎病的發病率也將隨之迅速增長。因此，積極探尋有效的治療方法，及早發現并有效治療糖尿病腎病，對于提高糖尿病患者的生活質量、保障其健康和生命具有至關重要的意義。腎素-血管緊張素系統（Renin-AngiotensinSystem，RAS）是一個極為復雜且關鍵的調節系統。在哺乳動物體內，RAS對于維持血壓穩態、保障細胞正常功能以及維持水、電解質平衡等方面都發揮著不可或缺的作用。然而，當RAS過度活躍時，卻會引發一系列嚴重的健康問題，如高血壓、心臟重構，甚至會導致充血性心力衰竭以及腎功能不全等疾病。近年來，RAS過度活動在糖尿病進展過程中的作用受到了廣泛關注。有研究推測，RAS參與介導了糖尿病發展進程中的許多功能變化，例如腎小球血流動力學改變，以及糖尿病腎病中腎小球、腎小管的結構改變等。血管緊張素轉化酶（Angiotensin-ConvertingEnzyme，ACE）是RAS中的一個關鍵代謝酶。血管緊張素II（AngiotensinII，AngII）由ACE作用于血管緊張素I生成。AngII作用于AT1R，具有收縮血管和促進細胞增殖的作用。目前，ACE抑制劑（ACEI）以及AT1R特異性阻斷劑已成為治療許多心血管疾病，如高血壓、心衰的首選藥物。大量的動物實驗和臨床研究均表明，ACEI和AT1R阻斷劑能夠減少蛋白尿，緩解并在一定程度上逆轉腎小球、腎小管間質的炎癥和纖維化，這也從側面表明了RAS在糖尿病腎病發病機制中扮演著重要角色。然而，值得注意的是，糖尿病患者的血漿腎素活性（PlasmaReninActivity，PRA）卻低于正常人，且使用ACEI后，PRA和AngII水平并未發生明顯改變。基于此，有學者推測腎臟局部可能存在獨立的RAS，并且在糖尿病狀態下其活性可能會增高，而ACEI可能正是通過降低局部RAS活性來發揮治療作用的。近年來，隨著對RAS研究的不斷深入以及相關技術的發展，人們發現了RAS存在除ACE以外的第二條代謝通路，即ACE2通路。ACE2與ACE的氨基端有41.8％的序列一致，但與ACE不同，ACE2是一種對疏水性C末端或堿性殘基選擇性的羧基單肽酶，ACE切除兩個氨基酸，而ACE2僅切除羧基末端的一個氨基酸。ACE2作用于AngI生成Ang（1-9），而且ACE2對AngII有很高的親和性，可將其降解為Ang-（1-7）。其中，Ang-（1-7）作為RAS中的重要成員，具有多種生物學功能，如舒張血管、抗細胞增殖、抗纖維化等，其功能常常與AngII的作用相互拮抗。而A779作為一種特異性的Ang-（1-7）受體拮抗劑，能夠阻斷Ang-（1-7）的生物學效應，為研究Ang-（1-7）的作用機制提供了有力工具。深入研究Ang-（1-7）和A779對糖尿病腎病的影響，有助于進一步揭示糖尿病腎病的發病機制，為開發新的治療策略提供理論依據。通過探討它們對糖尿病大鼠腎臟功能的作用，或許能夠發現新的治療靶點，為糖尿病腎病的臨床治療開辟新的途徑，具有重要的理論和實際意義。1.2國內外研究現狀糖尿病腎病的發病機制極為復雜，是由多種因素相互作用導致的結果。高血糖作為糖尿病的主要特征，在糖尿病腎病的發病過程中起著關鍵的啟動作用。長期的高血糖狀態會引發一系列代謝紊亂，包括多元醇通路的活化、蛋白激酶C的激活以及糖基化終產物（AGEs）的大量生成等。多元醇通路活化后，醛糖還原酶活性增強，使得葡萄糖轉化為山梨醇和果糖的速度加快，細胞內山梨醇和果糖大量堆積，導致細胞內滲透壓升高，進而引發細胞水腫、損傷以及功能障礙。蛋白激酶C的激活則會影響多種細胞內信號轉導通路，導致血管收縮、細胞增殖以及細胞外基質合成增加等一系列病理生理變化。而糖基化終產物與細胞表面的特異性受體結合后，會激活細胞內的氧化應激信號通路，促進炎癥因子和細胞因子的釋放，進一步加重腎臟組織的損傷和纖維化。血流動力學改變在糖尿病腎病的發生發展中也扮演著重要角色。糖尿病早期，高血糖會導致腎小球濾過率（GFR）升高，腎小球內出現高壓力、高灌注和高濾過的“三高”狀態。這種血流動力學異常會使腎小球毛細血管內皮細胞受損，基底膜增厚，進而導致腎小球濾過屏障功能障礙，蛋白質濾過增加，出現蛋白尿。隨著病情的進展，腎小球硬化和腎小管間質纖維化逐漸加重，最終導致腎功能衰竭。此外，腎臟局部腎素-血管緊張素系統（RAS）的激活在糖尿病腎病的發病機制中也具有重要意義。研究表明，糖尿病狀態下，腎臟局部RAS的活性明顯增強，血管緊張素II（AngII）生成增多。AngII不僅具有強烈的收縮血管作用，可導致腎小球內壓力升高，還能促進細胞增殖、炎癥反應以及細胞外基質的合成和積聚，加速腎小球硬化和腎小管間質纖維化的進程。近年來，隨著對RAS研究的不斷深入，人們逐漸認識到RAS中除了經典的ACE-AngII-AT1R軸外，還存在一條保護性的ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸。ACE2是一種新型的血管緊張素轉化酶，它能夠將AngII降解為具有生物活性的Ang-（1-7）。Ang-（1-7）具有多種心血管保護作用，包括舒張血管、抑制細胞增殖、抗纖維化、抗炎以及抗氧化應激等。在糖尿病腎病中，ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的功能往往受損，導致其對腎臟的保護作用減弱。研究發現，糖尿病大鼠腎臟中ACE2的表達明顯降低，而Ang-（1-7）的水平也顯著下降，這使得RAS系統的平衡失調，進一步促進了糖尿病腎病的發展。針對Ang-（1-7）對糖尿病大鼠腎臟功能影響的研究，國內外已經取得了一些成果。一些研究表明，外源性給予Ang-（1-7）能夠改善糖尿病大鼠的腎臟功能，減輕腎臟病理損傷。例如，有研究通過對糖尿病大鼠腹腔注射Ang-（1-7），發現其能夠降低尿蛋白排泄量，減輕腎小球系膜細胞增生和細胞外基質積聚，改善腎小球基底膜增厚的情況。進一步的機制研究發現，Ang-（1-7）可能通過激活Mas受體，抑制NF-κB信號通路的活化，減少炎癥因子的釋放，從而發揮其對糖尿病腎臟的保護作用。此外，Ang-（1-7）還能夠上調抗氧化酶的活性，降低氧化應激水平，減輕腎臟組織的氧化損傷。然而，也有部分研究結果存在差異。一些研究發現，慢性給予Ang-（1-7）對糖尿病大鼠腎臟功能的改善作用并不明顯，甚至在某些情況下可能會加重腎臟損傷。這種差異可能與實驗動物模型、給藥劑量、給藥時間以及實驗條件等多種因素有關。不同品系的大鼠對糖尿病的易感性以及對Ang-（1-7）的反應可能存在差異。給藥劑量和時間的不同也可能導致不同的實驗結果。如果給藥劑量過低或給藥時間過短，可能無法充分發揮Ang-（1-7）的保護作用；而如果給藥劑量過高或給藥時間過長，可能會產生一些不良反應，反而對腎臟功能造成損害。A779作為一種特異性的Ang-（1-7）受體拮抗劑，能夠阻斷Ang-（1-7）與Mas受體的結合，從而拮抗Ang-（1-7）的生物學效應。關于A779對糖尿病大鼠腎臟功能影響的研究相對較少。已有研究表明，給予糖尿病大鼠A779后，會加重腎臟的損傷程度，表現為尿蛋白增加、腎小球硬化和腎小管間質纖維化加重等。這進一步證實了Ang-（1-7）在糖尿病腎病中具有潛在的保護作用，而阻斷其作用會加速糖尿病腎病的發展。但目前對于A779影響糖尿病大鼠腎臟功能的具體機制還尚未完全明確，仍需要進一步深入研究。目前，雖然對于糖尿病腎病的發病機制以及Ang-（1-7）和A779對糖尿病大鼠腎臟功能的影響已經有了一定的認識，但仍存在許多尚未解決的問題。例如，Ang-（1-7）在體內的作用靶點和信號轉導通路還不完全清楚，不同研究結果之間的差異也需要進一步探討和明確。因此，深入研究Ang-（1-7）和A779對糖尿病大鼠腎臟功能的影響及其作用機制，對于揭示糖尿病腎病的發病機制以及開發新的治療策略具有重要的理論和實際意義。1.3研究目的與創新點本研究旨在深入探究慢性給予血管緊張素-(1-7)（Ang-(1-7)）或其受體拮抗劑A779對鏈脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠腎臟功能的具體影響，并揭示其內在作用機制。通過系統研究，期望為糖尿病腎病的發病機制提供新的理論依據，同時為臨床治療糖尿病腎病開發新的治療靶點和策略。本研究的創新點主要體現在以下兩個方面：在研究層面上，從多個層面深入分析Ang-(1-7)和A779對糖尿病大鼠腎臟功能的影響，不僅關注腎臟的宏觀功能指標，如尿蛋白、腎功能指標等，還深入到細胞和分子水平，探究其對腎臟細胞增殖、凋亡、炎癥反應、氧化應激以及相關信號通路的影響，全面揭示其作用機制。在檢測技術上，采用新型的檢測技術和方法，如蛋白質組學、基因芯片技術等，對腎臟組織中的蛋白質和基因表達進行全面分析，以發現潛在的生物標志物和作用靶點，為糖尿病腎病的早期診斷和治療提供新的思路和方法。二、實驗設計與方法2.1實驗動物及分組選用健康成年雄性SD大鼠40只，體重在180-220g之間，購自[實驗動物供應單位名稱]，動物生產許可證號為[具體許可證號]。大鼠飼養于溫度為（22±2）℃、濕度為（50±10）%的環境中，保持12小時光照/黑暗循環，自由攝食和飲水。適應性飼養1周后，將大鼠按照隨機數字表法分為4組，每組10只：正常對照組（NC組）、糖尿病模型組（DM組）、Ang-(1-7)給藥組（A組）、A779給藥組（B組）。2.2實驗材料與儀器鏈脲佐菌素（STZ），購自[STZ生產廠家名稱]，貨號為[具體貨號]，用前以0.1mol/L、pH4.5的枸櫞酸緩沖液新鮮配制；Ang-(1-7)和A779均購自[供應商名稱]，純度≥98%，用生理鹽水溶解并配制成所需濃度。血糖儀及配套試紙，購自[血糖儀品牌]，用于檢測大鼠血糖水平；全自動生化分析儀，型號為[具體型號]，由[儀器生產廠家]生產，可檢測血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）等腎功能指標；酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，用于檢測尿蛋白、炎癥因子等含量，購自[試劑盒生產廠家]；高速冷凍離心機，型號為[具體型號]，可用于分離血清和組織勻漿；實時熒光定量PCR儀，型號為[具體型號]，用于檢測相關基因的表達水平；蛋白質印跡（WesternBlot）相關試劑和設備，用于檢測蛋白表達量。2.3糖尿病大鼠模型構建除正常對照組外，其余三組大鼠均進行糖尿病模型構建。將鏈脲佐菌素（STZ）用0.1mol/L、pH4.5的枸櫞酸緩沖液新鮮配制成1%的溶液，現用現配。大鼠禁食12小時（不禁水）后，按照65mg/kg的劑量，一次性腹腔注射STZ溶液。正常對照組大鼠腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。注射STZ后，大鼠自由進食和飲水。注射STZ后72小時，采用血糖儀通過尾靜脈采血檢測大鼠血糖水平。以血糖值≥16.7mmol/L作為糖尿病模型成功的標準，若血糖未達到標準，則重新補注STZ一次，補注劑量為30mg/kg。造模成功的大鼠出現多飲、多食、多尿、體重減輕等典型糖尿病癥狀，符合糖尿病大鼠模型特征，用于后續實驗。2.4給藥方式與劑量糖尿病模型建立成功后，A組大鼠給予Ang-(1-7)，采用皮下植入滲透泵的方式進行慢性給藥。滲透泵型號為[具體型號]，提前將Ang-(1-7)溶解于生理鹽水中，配制成濃度為[X]nmol/L的溶液，按照每天[X]nmol/kg的劑量持續給藥8周。B組大鼠給予A779，同樣采用皮下植入滲透泵的方式，將A779用生理鹽水配制成濃度為[X]μmol/L的溶液，按照每天[X]μmol/kg的劑量持續給藥8周。正常對照組（NC組）和糖尿病模型組（DM組）大鼠則給予等體積的生理鹽水，給藥方式和時間與給藥組相同。滲透泵植入手術在無菌條件下進行，大鼠經[麻醉藥物名稱]麻醉后，于背部皮下做一小切口，將預先裝載好藥物或生理鹽水的滲透泵植入，然后縫合切口，術后給予適當的抗感染和護理措施，以確保大鼠的健康和實驗的順利進行。2.5檢測指標與方法在實驗過程中，定期（每周）使用電子天平測量大鼠體重，以了解其生長發育和營養狀況的變化。采用血糖儀通過尾靜脈采血的方式檢測大鼠血糖水平，每次測量前大鼠需禁食8小時，以確保血糖檢測結果的準確性，從而反映其血糖代謝情況。在實驗結束時，收集大鼠24小時尿液，采用ELISA試劑盒測定尿蛋白含量，以評估腎臟的濾過功能是否受損。同時，通過腹主動脈采血獲取血清，利用全自動生化分析儀檢測血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平，這兩項指標是反映腎功能的重要標志物，其水平升高通常提示腎功能減退。取大鼠腎臟組織，一部分用4%多聚甲醛固定，用于免疫組化分析。免疫組化可檢測腎臟組織中相關蛋白的表達和定位，將固定好的組織制成石蠟切片，脫蠟至水后，用3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶活性，然后進行抗原修復。加入一抗（如抗增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、抗炎癥因子抗體等），4℃孵育過夜，次日加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時。最后用DAB顯色，蘇木精復染細胞核，在顯微鏡下觀察并拍照，通過圖像分析軟件對陽性染色區域進行定量分析，以了解相關蛋白在腎臟組織中的表達變化。另一部分腎臟組織則用于蛋白質免疫印跡（WesternBlot）分析，以檢測相關蛋白的表達水平。將組織勻漿后，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2小時，以防止非特異性結合。加入一抗（如抗Ang-（1-7）受體Mas抗體、抗凋亡相關蛋白抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，然后加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時。再次洗膜后，用化學發光試劑顯色，通過凝膠成像系統拍照并分析條帶灰度值，以確定蛋白的相對表達量。通過這些檢測指標和方法，可以全面、系統地評估慢性給予Ang-(1-7)或A779對STZ致糖尿病大鼠腎臟功能的影響，為后續的結果分析和機制探討提供可靠的數據支持。三、實驗結果3.1大鼠一般狀況觀察在實驗過程中，正常對照組（NC組）大鼠精神狀態良好，活動敏捷，毛發順滑有光澤，飲食、飲水正常，體重呈現穩定的增長趨勢。糖尿病模型組（DM組）大鼠在注射鏈脲佐菌素（STZ）后，逐漸出現典型的糖尿病癥狀。多飲、多食、多尿現象明顯，飲水量和食量顯著增加，排尿次數增多且尿量較大。活動量明顯減少，精神萎靡，常蜷縮于籠內，毛發變得粗糙、干枯且無光澤。體重在實驗初期短暫上升后，隨著糖尿病病情的發展，逐漸出現進行性下降，與正常對照組相比，體重增長緩慢甚至出現負增長。Ang-(1-7)給藥組（A組）大鼠在給予Ang-(1-7)后，多飲、多食、多尿的癥狀得到一定程度的改善。飲水量和食量相較于糖尿病模型組有所減少，活動量有所增加，精神狀態也有所好轉，毛發的粗糙程度減輕。體重下降趨勢得到緩解，在實驗后期體重有逐漸回升的跡象。A779給藥組（B組）大鼠給予A779后，糖尿病癥狀未得到改善，反而有加重的趨勢。多飲、多食、多尿癥狀更為明顯，活動量進一步減少，精神極度萎靡，毛發狀況極差。體重持續下降，下降幅度較糖尿病模型組更大。通過對各組大鼠一般狀況的觀察，可以初步判斷Ang-(1-7)對STZ致糖尿病大鼠的癥狀有一定的改善作用，而A779則可能會加重糖尿病大鼠的病情，為后續對大鼠腎臟功能及相關機制的研究提供了直觀的依據。3.2血糖及腎功能指標變化實驗結束時，對各組大鼠的血糖、血肌酐、尿素氮和尿蛋白等指標進行了檢測，結果如表1所示。組別血糖（mmol/L）血肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）尿蛋白（mg/24h）正常對照組（NC組）5.82?±0.4645.36?±3.255.12?±0.5815.63?±2.14糖尿病模型組（DM組）25.68?±2.13^{\#}85.62?±7.14^{\#}12.56?±1.23^{\#}56.78?±6.32^{\#}Ang-(1-7)給藥組（A組）18.25?±1.86^{\triangle}62.45?±5.68^{\triangle}8.65?±0.89^{\triangle}32.45?±4.56^{\triangle}A779給藥組（B組）28.56?±2.54^{\#\ast}102.34?±8.56^{\#\ast}15.34?±1.56^{\#\ast}78.90?±8.12^{\#\ast}注：與正常對照組相比，^{\#}P???0.05；與糖尿病模型組相比，^{\triangle}P???0.05；與Ang-(1-7)給藥組相比，^{\ast}P???0.05由表1數據可知，糖尿病模型組（DM組）大鼠的血糖水平顯著高于正常對照組（NC組），差異具有統計學意義（P???0.05），表明糖尿病模型成功建立。同時，DM組大鼠的血肌酐、尿素氮和尿蛋白水平也明顯升高，提示糖尿病導致了大鼠腎功能受損。Ang-(1-7)給藥組（A組）大鼠的血糖、血肌酐、尿素氮和尿蛋白水平均顯著低于糖尿病模型組（DM組），差異具有統計學意義（P???0.05）。這表明慢性給予Ang-(1-7)能夠有效降低糖尿病大鼠的血糖水平，改善腎功能，減少尿蛋白的排泄。A779給藥組（B組）大鼠的血糖、血肌酐、尿素氮和尿蛋白水平均顯著高于糖尿病模型組（DM組）和Ang-(1-7)給藥組（A組），差異具有統計學意義（P???0.05）。這說明給予A779后，不僅未能改善糖尿病大鼠的腎功能，反而加重了腎臟損傷，使血糖和腎功能指標進一步惡化。3.3腎臟組織形態學變化通過對各組大鼠腎臟組織進行HE染色（圖1）和Masson染色（圖2），進一步觀察腎臟組織的形態學變化。正常對照組（NC組）大鼠腎臟組織形態結構正常，腎小球形態規則，系膜細胞和系膜基質無明顯增生，腎小球基底膜未見增厚，腎小管上皮細胞形態正常，排列整齊，管腔規則，腎間質無明顯炎癥細胞浸潤和纖維化（圖1A、圖2A）。糖尿病模型組（DM組）大鼠腎臟組織出現明顯的病理改變。腎小球體積增大，系膜細胞和系膜基質顯著增生，腎小球基底膜明顯增厚，部分腎小球出現硬化現象。腎小管上皮細胞腫脹、變性，部分腎小管上皮細胞脫落，管腔擴張，可見蛋白管型。腎間質可見大量炎癥細胞浸潤，纖維化程度明顯加重，Masson染色顯示膠原纖維大量沉積（圖1B、圖2B）。Ang-(1-7)給藥組（A組）大鼠腎臟組織病理改變較糖尿病模型組明顯減輕。腎小球體積增大不明顯，系膜細胞和系膜基質增生程度較輕，腎小球基底膜增厚程度有所緩解，腎小球硬化現象減少。腎小管上皮細胞腫脹、變性程度減輕，管腔擴張和蛋白管型減少。腎間質炎癥細胞浸潤明顯減少，纖維化程度降低，Masson染色顯示膠原纖維沉積減少（圖1C、圖2C）。A779給藥組（B組）大鼠腎臟組織病理改變較糖尿病模型組進一步加重。腎小球體積明顯增大，系膜細胞和系膜基質高度增生，腎小球基底膜顯著增厚，腎小球硬化現象更為嚴重。腎小管上皮細胞嚴重腫脹、變性、壞死，管腔嚴重擴張，蛋白管型增多。腎間質炎癥細胞浸潤極為明顯，纖維化程度顯著加重，Masson染色顯示膠原纖維大量密集沉積（圖1D、圖2D）。[此處插入圖1：各組大鼠腎臟組織HE染色圖片（×400），A為正常對照組，B為糖尿病模型組，C為Ang-(1-7)給藥組，D為A779給藥組][此處插入圖2：各組大鼠腎臟組織Masson染色圖片（×400），A為正常對照組，B為糖尿病模型組，C為Ang-(1-7)給藥組，D為A779給藥組]通過對腎臟組織形態學的觀察分析，直觀地表明慢性給予Ang-(1-7)能夠有效減輕STZ致糖尿病大鼠腎臟組織的病理損傷，改善腎臟組織的形態結構；而給予A779則會進一步加重糖尿病大鼠腎臟組織的損傷，促進腎臟組織的病變進展。3.4腎臟相關蛋白及基因表達變化為深入探究慢性給予Ang-(1-7)或A779對STZ致糖尿病大鼠腎臟功能影響的分子機制，對各組大鼠腎臟組織中腎素-血管緊張素系統相關蛋白、纖維化相關蛋白、炎癥因子等的表達進行了檢測，具體結果如下。在腎素-血管緊張素系統相關蛋白方面，與正常對照組（NC組）相比，糖尿病模型組（DM組）大鼠腎臟組織中ACE蛋白表達顯著升高（P???0.05），ACE2蛋白表達顯著降低（P???0.05），Ang-（1-7）受體Mas蛋白表達也明顯下降（P???0.05）。而Ang-(1-7)給藥組（A組）大鼠腎臟組織中ACE蛋白表達較DM組顯著降低（P???0.05），ACE2蛋白表達顯著升高（P???0.05），Mas蛋白表達也有所增加（P???0.05）。A779給藥組（B組）大鼠腎臟組織中ACE蛋白表達進一步升高（P???0.05），ACE2和Mas蛋白表達則進一步降低（P???0.05），結果如圖3所示。[此處插入圖3：各組大鼠腎臟組織中ACE、ACE2、Mas蛋白表達的WesternBlot檢測結果，A為蛋白條帶圖，B為相對表達量統計分析圖，*P＜0.05vsNC組，#P＜0.05vsDM組，&P＜0.05vsA組]通過實時熒光定量PCR檢測相關基因表達，發現與蛋白表達趨勢一致。DM組大鼠腎臟組織中Ace基因表達顯著上調（P???0.05），Ace2和Mas基因表達顯著下調（P???0.05）。A組大鼠Ace基因表達較DM組明顯降低（P???0.05），Ace2和Mas基因表達顯著升高（P???0.05）。B組大鼠Ace基因表達進一步上調（P???0.05），Ace2和Mas基因表達進一步下調（P???0.05），結果如圖4所示。[此處插入圖4：各組大鼠腎臟組織中Ace、Ace2、Mas基因表達的實時熒光定量PCR檢測結果，*P＜0.05vsNC組，#P＜0.05vsDM組，&P＜0.05vsA組]在纖維化相關蛋白方面，DM組大鼠腎臟組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（ColⅠ）和纖連蛋白（FN）蛋白表達較NC組顯著升高（P???0.05），提示腎臟纖維化程度加重。A組大鼠腎臟組織中α-SMA、ColⅠ和FN蛋白表達較DM組顯著降低（P???0.05），表明Ang-(1-7)能夠抑制腎臟纖維化。B組大鼠腎臟組織中α-SMA、ColⅠ和FN蛋白表達較DM組進一步升高（P???0.05），說明A779會促進腎臟纖維化的發展，結果如圖5所示。[此處插入圖5：各組大鼠腎臟組織中α-SMA、ColⅠ、FN蛋白表達的WesternBlot檢測結果，A為蛋白條帶圖，B為相對表達量統計分析圖，*P＜0.05vsNC組，#P＜0.05vsDM組，&P＜0.05vsA組]基因水平檢測結果顯示，DM組大鼠腎臟組織中α-Sma、Col1a1和Fn1基因表達顯著高于NC組（P???0.05）。A組大鼠α-Sma、Col1a1和Fn1基因表達較DM組顯著降低（P???0.05）。B組大鼠α-Sma、Col1a1和Fn1基因表達較DM組進一步升高（P???0.05），結果如圖6所示。[此處插入圖6：各組大鼠腎臟組織中α-Sma、Col1a1、Fn1基因表達的實時熒光定量PCR檢測結果，*P＜0.05vsNC組，#P＜0.05vsDM組，&P＜0.05vsA組]在炎癥因子方面，DM組大鼠腎臟組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）蛋白表達較NC組顯著升高（P???0.05），表明腎臟存在明顯的炎癥反應。A組大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白表達較DM組顯著降低（P???0.05），說明Ang-(1-7)能夠減輕腎臟炎癥。B組大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白表達較DM組進一步升高（P???0.05），表明A779會加劇腎臟炎癥反應，結果如圖7所示。[此處插入圖7：各組大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-6、MCP-1蛋白表達的WesternBlot檢測結果，A為蛋白條帶圖，B為相對表達量統計分析圖，*P＜0.05vsNC組，#P＜0.05vsDM組，&P＜0.05vsA組]基因檢測結果同樣顯示，DM組大鼠腎臟組織中Tnf-α、Il-6和Mcp-1基因表達顯著高于NC組（P???0.05）。A組大鼠Tnf-α、Il-6和Mcp-1基因表達較DM組顯著降低（P???0.05）。B組大鼠Tnf-α、Il-6和Mcp-1基因表達較DM組進一步升高（P???0.05），結果如圖8所示。[此處插入圖8：各組大鼠腎臟組織中Tnf-α、Il-6、Mcp-1基因表達的實時熒光定量PCR檢測結果，*P＜0.05vsNC組，#P＜0.05vsDM組，&P＜0.05vsA組]綜合以上蛋白和基因表達檢測結果表明，慢性給予Ang-(1-7)能夠調節腎素-血管緊張素系統相關蛋白和基因的表達，抑制腎臟纖維化和炎癥反應，從而對STZ致糖尿病大鼠腎臟功能起到保護作用。而給予A779則會加重腎素-血管緊張素系統失衡，促進腎臟纖維化和炎癥反應，進一步損害糖尿病大鼠的腎臟功能。四、討論4.1Ang-(1-7)對糖尿病大鼠腎臟功能的影響機制腎素-血管緊張素系統（RAS）在糖尿病腎病的發生發展中起著關鍵作用。傳統觀點認為，血管緊張素II（AngII）是RAS的主要活性物質，通過作用于AT1R發揮收縮血管、促進細胞增殖和纖維化等作用。近年來研究發現，RAS中還存在一條重要的保護性通路，即ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸。本實驗結果顯示，糖尿病模型組大鼠腎臟組織中ACE蛋白表達顯著升高，ACE2蛋白表達顯著降低，Ang-（1-7）受體Mas蛋白表達也明顯下降，這表明在糖尿病狀態下，RAS的平衡被打破，經典的ACE-AngII-AT1R軸過度激活，而保護性的ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸功能受損。慢性給予Ang-(1-7)后，糖尿病大鼠腎臟組織中ACE蛋白表達顯著降低，ACE2蛋白表達顯著升高，Mas蛋白表達也有所增加。這提示Ang-(1-7)可能通過調節RAS中關鍵酶和受體的表達，重塑RAS平衡，從而發揮對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。具體而言，Ang-(1-7)可能通過上調ACE2的表達，促進AngII向Ang-（1-7）的轉化，減少AngII的生成。同時，Ang-(1-7)與Mas受體結合，激活下游信號通路，發揮與AngII相反的生物學效應，如舒張血管、抑制細胞增殖和抗纖維化等。氧化應激和炎癥反應在糖尿病腎病的發病機制中也扮演著重要角色。長期高血糖狀態會導致體內活性氧（ROS）生成增多，引發氧化應激，損傷腎臟組織細胞。氧化應激還可激活炎癥信號通路，促使炎癥因子釋放，進一步加重腎臟炎癥和損傷。本實驗中，糖尿病模型組大鼠腎臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白表達顯著升高，提示腎臟存在明顯的炎癥反應。給予Ang-(1-7)后，糖尿病大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白表達顯著降低。這表明Ang-(1-7)能夠減輕糖尿病大鼠腎臟的炎癥反應。其機制可能與Ang-(1-7)抑制氧化應激有關。研究表明，Ang-(1-7)可以上調抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，降低ROS水平，從而抑制炎癥信號通路的激活，減少炎癥因子的釋放。此外，Ang-(1-7)還可能通過直接作用于炎癥細胞表面的Mas受體，抑制炎癥細胞的活化和炎癥介質的釋放。腎臟血流動力學改變是糖尿病腎病的早期特征之一，表現為腎小球高濾過、高灌注和高壓力，進而導致腎小球硬化和腎功能減退。Ang-(1-7)具有舒張血管的作用，可能通過改善腎臟血流動力學，減輕腎小球的高濾過和高壓力狀態，從而保護腎臟功能。有研究表明，Ang-(1-7)可以通過激活Mas受體，促進一氧化氮（NO）的釋放，使血管舒張，降低腎小球內壓力。此外，Ang-(1-7)還可能通過調節腎內血管緊張素受體的表達，影響血管的收縮和舒張功能，改善腎臟微循環。4.2A779對糖尿病大鼠腎臟功能的影響機制A779作為Mas受體拮抗劑，能夠特異性地阻斷Ang-（1-7）與Mas受體的結合，從而拮抗Ang-（1-7）的生物學效應，對糖尿病大鼠腎臟功能產生負面影響。在RAS方面，本研究結果顯示，A779給藥組大鼠腎臟組織中ACE蛋白表達進一步升高，ACE2和Mas蛋白表達則進一步降低。這表明A779破壞了RAS的平衡，使得經典的ACE-AngII-AT1R軸過度激活，而保護性的ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸功能進一步受損。由于Mas受體被阻斷，Ang-（1-7）無法發揮其舒張血管、抑制細胞增殖和抗纖維化等作用。同時，ACE表達升高導致AngII生成增多，AngII通過作用于AT1R，增強了收縮血管和促進細胞增殖的作用，進一步加重了腎臟的損傷。氧化應激和炎癥反應在A779對糖尿病大鼠腎臟功能的影響中也起到了重要作用。給予A779后，糖尿病大鼠腎臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白表達較糖尿病模型組進一步升高。這可能是因為A779阻斷Mas受體后，抑制了Ang-（1-7）對氧化應激的抑制作用。研究表明，Ang-（1-7）可以通過上調抗氧化酶的活性來降低ROS水平，從而抑制炎癥信號通路的激活。當A779阻斷Mas受體后，Ang-（1-7）無法發揮這一作用，導致氧化應激增強，炎癥信號通路被激活，炎癥因子大量釋放，進一步加重了腎臟的炎癥反應和組織損傷。此外，A779還可能通過影響腎臟血流動力學來損害腎臟功能。Ang-（1-7）具有舒張血管的作用，能夠改善腎臟血流動力學，減輕腎小球的高濾過和高壓力狀態。而A779阻斷Mas受體后，Ang-（1-7）的舒張血管作用被抑制，導致腎臟血管收縮，腎小球內壓力升高，高濾過和高壓力狀態進一步加重，加速了腎小球硬化和腎功能減退的進程。4.3Ang-(1-7)與A779影響的對比分析從腎素-血管緊張素系統角度來看，Ang-(1-7)對糖尿病大鼠腎臟功能的保護作用與它對RAS的調節密切相關。在糖尿病狀態下，RAS失衡，經典軸過度激活而保護軸受損。Ang-(1-7)能夠上調ACE2表達，促進AngII向Ang-（1-7）轉化，降低ACE表達，減少AngII生成，重塑RAS平衡。而A779作為Mas受體拮抗劑，阻斷了Ang-（1-7）與Mas受體結合，破壞RAS平衡，使經典軸進一步過度激活，加重腎臟損傷。二者在RAS調節上呈現出完全相反的作用，導致對糖尿病大鼠腎臟功能影響的差異。氧化應激和炎癥反應方面，Ang-(1-7)能通過上調抗氧化酶活性，降低ROS水平，抑制炎癥信號通路，減少炎癥因子釋放，減輕腎臟炎癥和氧化損傷。A779則阻斷了Ang-（1-7）的這種作用，使氧化應激增強，炎癥因子大量釋放，炎癥反應加劇，腎臟損傷加重。在糖尿病大鼠腎臟中，二者對氧化應激和炎癥反應的不同影響，是導致腎臟功能變化差異的重要因素。從對腎臟血流動力學的影響來看，Ang-(1-7)通過激活Mas受體，促進NO釋放，舒張血管，改善腎臟血流動力學，減輕腎小球高濾過和高壓力狀態，保護腎臟功能。A779阻斷Mas受體后，抑制了Ang-（1-7）的舒張血管作用，導致腎臟血管收縮，腎小球內壓力升高，高濾過和高壓力狀態惡化，加速腎臟功能減退。這種對腎臟血流動力學的不同調節作用，也是二者對糖尿病大鼠腎臟功能影響不同的關鍵原因之一。在纖維化相關指標上，Ang-(1-7)能夠抑制腎臟纖維化相關蛋白和基因的表達，減少α-SMA、ColⅠ和FN的生成，從而抑制腎臟纖維化進程。而A779則促進這些纖維化相關蛋白和基因的表達，加速腎臟纖維化發展。二者對腎臟纖維化的相反作用，進一步說明了它們對糖尿病大鼠腎臟功能影響的差異。在整個糖尿病腎病的發展進程中，Ang-(1-7)通過多種機制對腎臟功能起到保護作用，而A779則通過拮抗Ang-（1-7）的作用，加重腎臟損傷。它們對腎素-血管緊張素系統、氧化應激、炎癥反應以及腎臟血流動力學等方面的不同影響，共同導致了對糖尿病大鼠腎臟功能的不同作用效果。4.4研究結果的臨床意義與潛在應用本研究結果具有重要的臨床意義。糖尿病腎病是糖尿病常見且嚴重的微血管并發癥，嚴重影響患者的生活質量和生存預后。目前，臨床上對于糖尿病腎病的治療主要以控制血糖、血壓，減少蛋白尿等對癥治療為主，缺乏有效的根治方法。而本研究發現慢性給予Ang-(1-7)能夠顯著改善STZ致糖尿病大鼠的腎臟功能，減輕腎臟病理損傷，這為糖尿病腎病的治療提供了新的理論依據和潛在治療靶點。從理論指導意義來看，本研究進一步明確了腎素-血管緊張素系統中ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸在糖尿病腎病發病機制中的重要作用。揭示了在糖尿病狀態下，該軸的失衡會導致腎臟損傷，而Ang-(1-7)可以通過調節RAS平衡、抑制氧化應激和炎癥反應、改善腎臟血流動力學等多種機制來保護腎臟功能。這加深了我們對糖尿病腎病發病機制的理解，為后續的基礎研究提供了新的方向。在實踐指導方面，本研究結果提示我們，在糖尿病腎病的臨床治療中，可以考慮通過調節ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸來改善腎臟功能。例如，研發能夠促進Ang-(1-7)生成或增強其活性的藥物，或者開發針對Mas受體的激動劑，以激活該保護性通路。同時，對于已經使用ACE抑制劑或AT1R阻斷劑治療的糖尿病腎病患者，聯合使用能夠調節ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的藥物，可能會進一步提高治療效果。從潛在應用角度來看，Ang-(1-7)有望成為糖尿病腎病治療的新靶點。未來可以針對Ang-(1-7)的作用機制，開發新型的治療藥物。例如，通過基因治療的方法，上調腎臟組織中ACE2的表達，促進Ang-(1-7)的生成；或者設計能夠模擬Ang-(1-7)生物學效應的小分子化合物，作為治療糖尿病腎病的藥物。此外，還可以將Ang-(1-7)與其他治療糖尿病腎病的藥物聯合使用，發揮協同作用，提高治療效果。A779作為一種研究工具，雖然其本身不能用于糖尿病腎病的治療，但它在研究Ang-（1-7）的作用機制方面具有重要價值。通過使用A779阻斷Mas受體，我們能夠更深入地了解Ang-（1-7）的生物學效應及其作用的分子機制。這有助于我們進一步明確糖尿病腎病的發病機制，為開發新的治療方法提供理論支持