ADAM17：前列腺癌細胞增殖與基因表達調控的關鍵紐帶一、引言1.1研究背景前列腺癌作為男性泌尿生殖系統中常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著男性的健康。近年來，其發病率呈現出逐年上升的趨勢，已成為全球范圍內備受關注的公共衛生問題。據相關統計數據顯示，在一些發達國家，前列腺癌的發病率甚至位居男性惡性腫瘤之首。在中國，隨著人口老齡化的加劇以及生活方式的改變，前列腺癌的發病率也在迅速攀升，特別是在北上廣深等一線城市，發病率已經達到了男性腫瘤的第一位或第二位。前列腺癌早期通常無明顯癥狀，隨著病情的進展，會出現尿頻、尿急、尿痛、排尿困難等下尿路癥狀，嚴重影響患者的生活質量。而晚期前列腺癌還可能發生骨轉移、淋巴結轉移等，導致骨痛、病理性骨折、下肢水腫等一系列嚴重并發癥，甚至危及生命。在腫瘤研究領域，解聚素-金屬蛋白酶17（ADAM17）逐漸成為研究熱點。ADAM17是一種金屬蛋白酶，廣泛存在于各種組織和細胞中，參與了多種生理和病理過程。在腫瘤的發生和發展過程中，ADAM17發揮著關鍵作用，它猶如一把“分子剪刀”，能夠將一些細胞膜上的蛋白質切割成活性分子，進而調控細胞的增殖、遷移、侵襲和轉移等行為。已有大量研究表明，ADAM17在多種腫瘤，如肺癌、乳腺癌、結腸癌等中表達異常升高，并且與腫瘤的惡性程度、預后密切相關。在前列腺癌中，ADAM17同樣扮演著重要角色，其表達水平的變化與前列腺癌細胞的生物學行為緊密相連，對前列腺癌的發生、發展及轉移過程產生著深遠影響。因此，深入探究ADAM17對前列腺癌細胞增殖及相關基因表達的影響，不僅有助于揭示前列腺癌的發病機制，還可能為前列腺癌的診斷、治療和預后評估提供新的靶點和策略，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討ADAM17對前列腺癌細胞增殖及相關基因表達的影響，通過細胞實驗和分子生物學技術，明確ADAM17在前列腺癌發生發展過程中的具體作用機制。一方面，通過抑制或過表達ADAM17，觀察前列腺癌細胞增殖能力的變化，明確ADAM17與前列腺癌細胞增殖之間的因果關系。另一方面，利用基因芯片、實時定量PCR、蛋白質免疫印跡等技術，檢測ADAM17表達改變后，前列腺癌細胞中相關基因在mRNA和蛋白質水平的表達變化，從而揭示ADAM17影響前列腺癌細胞增殖的分子信號通路。從理論意義來看，深入研究ADAM17對前列腺癌細胞增殖及相關基因表達的影響，有助于我們更加全面、深入地理解前列腺癌的發病機制。前列腺癌的發生發展是一個涉及多基因、多信號通路異常調控的復雜過程，目前雖然已經取得了一些研究成果，但仍有許多未知領域等待探索。ADAM17作為一種在腫瘤發生發展中發揮關鍵作用的蛋白酶，對其進行深入研究，能夠為我們揭示前列腺癌發病機制提供新的視角和線索。例如，通過研究ADAM17對前列腺癌細胞中關鍵基因表達的調控作用，可以進一步明確這些基因在前列腺癌發生發展過程中的功能和相互關系，從而完善前列腺癌的分子發病機制理論體系。這不僅有助于推動腫瘤生物學領域的基礎研究，還可能為其他相關疾病的研究提供借鑒和參考。從臨床應用價值而言，ADAM17有望成為前列腺癌診斷和治療的新靶點。在診斷方面，若能夠明確ADAM17在前列腺癌患者體內的表達特征及其與疾病進展、預后的關系，就可以將其作為一種潛在的生物標志物應用于前列腺癌的早期診斷、病情監測和預后評估。例如，通過檢測血液、尿液或組織樣本中ADAM17的表達水平，輔助醫生更早、更準確地診斷前列腺癌，判斷患者的病情嚴重程度和預后情況，為制定個性化的治療方案提供依據。在治療方面，針對ADAM17開發特異性的抑制劑或激活劑，有可能為前列腺癌的治療開辟新的途徑。目前，前列腺癌的治療方法主要包括手術治療、放療、化療、內分泌治療等，但對于晚期或轉移性前列腺癌患者，這些傳統治療方法的療效往往有限，且存在一定的副作用。如果能夠通過抑制ADAM17的活性，阻斷其對前列腺癌細胞增殖和相關基因表達的促進作用，就有可能有效地抑制腫瘤細胞的生長和轉移，提高患者的治療效果和生存率。同時，以ADAM17為靶點的治療方法還可能具有更好的特異性和耐受性，減少對正常組織的損傷，降低治療過程中的不良反應，從而提高患者的生活質量。此外，深入研究ADAM17還可能為前列腺癌的聯合治療提供新的思路和策略，與現有的治療方法相結合，發揮協同作用，進一步提高治療效果。二、ADAM17與前列腺癌的基礎認知2.1ADAM17的結構與功能2.1.1ADAM17的分子結構ADAM17屬于解聚素-金屬蛋白酶家族（ADAMs），是一種I型跨膜蛋白，由824個氨基酸組成。其結構較為復雜，包含多個不同功能的結構域，這些結構域協同作用，賦予了ADAM17獨特的生物學功能。從N端到C端，ADAM17依次包括信號肽、前結構域、金屬蛋白酶結構域、解整合素結構域、富含半胱氨酸結構域、表皮生長因子（EGF）樣結構域、跨膜結構域和胞內結構域。信號肽位于ADAM17的最前端，長度約為16-30個氨基酸，它的主要作用是引導新生肽鏈進入內質網，完成蛋白質的翻譯后修飾和折疊等過程，確保ADAM17能夠正確定位到細胞膜上。前結構域緊接著信號肽，由大約180個氨基酸組成，在ADAM17的合成和運輸過程中，前結構域起到維持酶原處于非活性狀態的作用，防止其在未到達作用位點之前就被激活，從而避免對細胞產生不必要的損傷。當ADAM17運輸到合適的位置后，前結構域會被特定的蛋白酶切割去除，使ADAM17激活，發揮其生物學功能。金屬蛋白酶結構域是ADAM17的核心催化區域，包含約170個氨基酸，其中含有一個高度保守的HEXXHXXGXXH基序（X代表任意氨基酸），這個基序中的三個組氨酸殘基能夠與鋅離子緊密結合，形成催化活性中心。鋅離子在ADAM17的催化過程中起著至關重要的作用，它能夠極化水分子，使其對底物肽鍵進行親核攻擊，從而實現對底物蛋白質的水解切割。金屬蛋白酶結構域決定了ADAM17能夠特異性地識別和切割特定的底物蛋白，在眾多生理和病理過程中發揮關鍵的蛋白水解作用。解整合素結構域位于金屬蛋白酶結構域之后，由大約150個氨基酸組成，它具有與整合素相互作用的能力。整合素是一類細胞表面受體，廣泛參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的粘附和信號傳導過程。ADAM17的解整合素結構域通過與整合素結合，能夠調節細胞的粘附、遷移和侵襲等行為，在胚胎發育、組織修復以及腫瘤轉移等過程中發揮重要作用。例如，在腫瘤轉移過程中，ADAM17的解整合素結構域可以與腫瘤細胞表面的整合素結合，促進腫瘤細胞與基底膜和細胞外基質的分離，從而使腫瘤細胞更容易發生遷移和侵襲。富含半胱氨酸結構域由約100個氨基酸組成，其中含有多個半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵，從而穩定該結構域的構象。富含半胱氨酸結構域不僅對ADAM17整體結構的穩定性起到重要作用，還可能參與調節ADAM17與其他蛋白質分子之間的相互作用。一些研究表明，富含半胱氨酸結構域可以與某些生長因子、細胞因子或其他信號分子結合，影響它們的活性和功能，進而間接調控細胞的生理活動。EGF樣結構域由約40個氨基酸組成，因其序列和結構與表皮生長因子（EGF）相似而得名。EGF樣結構域可以與細胞表面的EGF受體結合，激活下游的信號傳導通路，參與細胞的增殖、分化和存活等過程。在ADAM17中，EGF樣結構域可能通過與EGF受體的相互作用，調節細胞內的信號網絡，影響細胞的生物學行為。例如，ADAM17通過切割某些膜結合的生長因子前體，釋放出具有活性的生長因子，這些生長因子可以與EGF受體結合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，促進細胞的增殖。跨膜結構域由約20-30個氨基酸組成，它貫穿細胞膜，將ADAM17錨定在細胞表面，使ADAM17的胞外結構域能夠與細胞外的底物蛋白和其他信號分子相互作用，而胞內結構域則可以與細胞內的信號傳導分子相互作用，實現細胞內外信號的傳遞和轉導。跨膜結構域的存在對于ADAM17在細胞表面的定位和功能發揮至關重要，它確保了ADAM17能夠在合適的時間和地點對底物蛋白進行切割和調節。胞內結構域位于ADAM17的C端，由約50個氨基酸組成，雖然相對較短，但它在ADAM17的功能調控中也起著不可或缺的作用。胞內結構域含有多個磷酸化位點，這些位點可以被細胞內的蛋白激酶磷酸化，從而調節ADAM17的活性、穩定性以及與其他蛋白的相互作用。此外，胞內結構域還可以與一些細胞內的信號分子或支架蛋白結合，形成信號復合物，參與細胞內的信號傳導過程。例如，ADAM17的胞內結構域可以與一些銜接蛋白結合，招募其他信號分子，激活下游的信號通路，調控細胞的生理活動。2.1.2ADAM17的生理功能在正常生理過程中，ADAM17參與了眾多細胞活動，對維持機體的平衡和穩定起著至關重要的作用。在胚胎發育過程中，ADAM17扮演著不可或缺的角色。它參與了細胞間的信號傳遞和細胞遷移等關鍵過程，對于胚胎的正常形態發生和器官形成至關重要。例如，在神經嵴細胞的遷移過程中，ADAM17通過切割細胞表面的粘附分子，調節細胞與細胞外基質之間的相互作用，使得神經嵴細胞能夠從神經管遷移到身體的各個部位，分化形成多種組織和器官，如外周神經系統、腎上腺髓質、面部骨骼和結締組織等。如果ADAM17功能缺失或異常，可能導致胚胎發育異常，出現神經管缺陷、心臟發育異常等多種先天性疾病。在免疫系統中，ADAM17也發揮著關鍵作用。它參與了免疫細胞的活化、增殖和分化過程，以及炎癥反應的調節。ADAM17可以切割腫瘤壞死因子-α（TNF-α）前體，使其從細胞膜上釋放下來，成為具有活性的可溶性TNF-α。可溶性TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，它可以激活免疫細胞，如巨噬細胞、T細胞和B細胞等，增強機體的免疫防御能力。同時，TNF-α還可以誘導炎癥相關基因的表達，促進炎癥介質的釋放，引發炎癥反應。然而，如果ADAM17過度激活，導致TNF-α過度表達，可能會引發過度的炎癥反應，導致自身免疫性疾病的發生，如類風濕性關節炎、炎癥性腸病等。此外，ADAM17還可以調節其他免疫相關分子的活性，如白細胞介素-6（IL-6）、轉化生長因子-β（TGF-β）等，進一步影響免疫系統的功能。在心血管系統中，ADAM17參與了血管生成、血管平滑肌細胞的增殖和遷移等過程，對維持血管的正常結構和功能具有重要意義。在血管生成過程中，ADAM17可以通過切割血管內皮生長因子（VEGF）受體等相關分子，調節VEGF信號通路，促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。同時，ADAM17還可以影響細胞外基質的降解和重塑，為血管生成提供適宜的微環境。此外，ADAM17在血管平滑肌細胞的增殖和遷移中也發揮著作用，它可以調節細胞表面的粘附分子和生長因子受體的活性，影響血管平滑肌細胞的生物學行為，從而參與動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病的發生發展過程。在皮膚和上皮組織中，ADAM17對于維持組織的完整性和功能也起著重要作用。它參與了皮膚角質形成細胞的分化和增殖過程，以及上皮細胞的緊密連接和屏障功能的調節。例如，ADAM17可以切割表皮生長因子受體（EGFR）的配體，如轉化生長因子-α（TGF-α）等，激活EGFR信號通路，促進角質形成細胞的增殖和分化，維持皮膚的正常結構和功能。此外，ADAM17還可以調節上皮細胞之間的緊密連接蛋白，如閉合蛋白（occludin）和緊密連接蛋白（claudin）等，維持上皮組織的屏障功能，防止病原體和有害物質的侵入。如果ADAM17功能異常，可能導致皮膚和上皮組織的疾病，如魚鱗病、皮膚炎癥等。2.2前列腺癌的概述2.2.1前列腺癌的發病現狀前列腺癌作為男性泌尿生殖系統中極為常見的惡性腫瘤，對男性健康構成了嚴重威脅。在全球范圍內，其發病率呈現出顯著的上升趨勢，已然成為男性癌癥相關死亡的重要原因之一。根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球癌癥負擔數據顯示，前列腺癌的新發病例數達到了141.4萬例，位居男性惡性腫瘤發病的第二位，僅次于肺癌；死亡病例數為37.5萬例，位居男性惡性腫瘤死亡的第五位。在歐美國家，前列腺癌的發病率更是居高不下，如美國，前列腺癌長期以來一直是男性最常被診斷出的癌癥之一，2024年預計新發病例將達到24.8萬例，約占男性所有新發癌癥病例的21%，死亡病例預計為3.4萬例。在中國，隨著人口老齡化進程的加速、生活方式的西方化以及前列腺特異性抗原（PSA）篩查的逐漸普及，前列腺癌的發病率也在迅速攀升。據中國國家癌癥中心發布的數據，2016年中國前列腺癌的發病率為10.60/10萬，位居男性惡性腫瘤發病的第六位；死亡率為4.36/10萬，位居男性惡性腫瘤死亡的第十位。與過去幾十年相比，發病率增長趨勢明顯，以上海為例，1990-1994年間前列腺癌的發病率為3.52/10萬，而到了2015-2019年間，發病率已上升至22.72/10萬，增長了約6.45倍。盡管中國前列腺癌的發病率仍低于歐美國家，但由于人口基數龐大，發病人數不容小覷，且多數患者確診時已處于中晚期，這給臨床治療帶來了極大的挑戰，嚴重影響了患者的生存質量和預后。前列腺癌的發病還存在明顯的地域差異。在全球范圍內，北美、歐洲和大洋洲等地區的發病率較高，而亞洲、非洲和拉丁美洲等地區的發病率相對較低。這種地域差異可能與遺傳因素、環境因素、生活方式以及醫療水平等多種因素有關。例如，歐美國家居民的飲食結構中，高脂肪、高蛋白、高熱量食物的攝入比例較高，而膳食纖維的攝入相對較少，這種飲食習慣可能增加前列腺癌的發病風險。此外，歐美國家的PSA篩查普及程度較高，使得更多早期前列腺癌患者得以被診斷出來，這也在一定程度上導致了其發病率相對較高。而在亞洲國家，傳統的飲食結構以谷物、蔬菜和水果為主，相對較為健康，可能對前列腺癌的發生起到一定的預防作用。同時，亞洲部分地區的PSA篩查普及程度較低，許多患者在出現明顯癥狀后才就醫，確診時往往已處于疾病晚期。前列腺癌的發病風險還與年齡密切相關。隨著年齡的增長，前列腺癌的發病率顯著增加。一般來說，50歲以上男性的發病風險明顯升高，65-74歲年齡段的發病率達到高峰。在我國，前列腺癌患者的中位發病年齡約為72歲。這可能是由于隨著年齡的增長，前列腺組織逐漸發生增生和退變，細胞的增殖和分化調控機制出現異常，從而增加了前列腺癌的發病風險。此外，老年男性體內的激素水平也會發生變化，雄激素水平相對降低，雌激素水平相對升高，這種激素失衡可能對前列腺癌的發生發展起到促進作用。2.2.2前列腺癌的發病機制前列腺癌的發病是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及遺傳、激素、環境、生活方式等多種因素，同時與多個基因的異常表達和信號通路的失調密切相關。遺傳因素在前列腺癌的發病中起著重要作用。家族遺傳是前列腺癌的一個重要風險因素，約10%-15%的前列腺癌患者具有家族遺傳背景。研究表明，攜帶某些基因突變的個體患前列腺癌的風險顯著增加，如BRCA1、BRCA2、HOXB13、CHEK2等基因的突變。BRCA1和BRCA2是兩種重要的抑癌基因，它們參與DNA損傷修復過程。當這兩個基因發生突變時，DNA損傷修復功能受損，細胞基因組的穩定性下降，容易導致腫瘤的發生。攜帶BRCA1或BRCA2基因突變的男性，患前列腺癌的風險比普通人群高出數倍，且發病年齡相對較早，腫瘤的侵襲性更強。HOXB13基因的G84E突變是一種較為常見的遺傳性突變，與前列腺癌的發病密切相關。研究發現，攜帶HOXB13G84E突變的男性，患前列腺癌的風險增加約2-3倍，且該突變與前列腺癌的不良預后相關。CHEK2基因是一種細胞周期檢查點激酶基因，其突變會影響細胞周期的正常調控，導致細胞增殖異常，從而增加前列腺癌的發病風險。此外，一些遺傳綜合征，如林奇綜合征、李-佛美尼綜合征等，也與前列腺癌的發病風險增加有關。林奇綜合征是由錯配修復基因（如MLH1、MSH2、MSH6等）突變引起的，患者不僅患結直腸癌的風險顯著增加，患前列腺癌的風險也明顯高于普通人群。激素因素在前列腺癌的發生發展中占據關鍵地位。前列腺是雄激素依賴性器官，雄激素在前列腺的生長、發育和維持正常生理功能中起著重要作用。雄激素主要包括睪酮和雙氫睪酮（DHT），它們通過與雄激素受體（AR）結合，形成AR-雄激素復合物，然后進入細胞核，與靶基因的雄激素反應元件結合，調節基因的轉錄和表達，從而促進前列腺細胞的增殖和存活。在前列腺癌的發生過程中，雄激素-AR信號通路的異常激活起著關鍵作用。一方面，前列腺癌細胞可能通過多種機制增加AR的表達或活性，使其對雄激素的敏感性增強。例如，AR基因的擴增、突變或剪接變異等，都可能導致AR蛋白的表達增加或功能異常，從而使癌細胞對雄激素的刺激更加敏感。另一方面，腫瘤微環境中的一些因素，如細胞因子、生長因子等，也可能通過旁分泌或自分泌的方式激活AR信號通路，促進前列腺癌細胞的增殖和存活。即使在去勢治療后，前列腺癌細胞仍可能通過多種機制維持AR信號通路的活性，如AR的突變使其對雄激素的親和力改變，能夠與低水平的雄激素結合并激活下游信號；或者通過合成雄激素的相關酶的表達改變，使腫瘤細胞能夠在低雄激素水平下合成足夠的雄激素來維持AR信號通路的激活，這種現象被稱為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC），是前列腺癌治療中的一大難題。環境因素與前列腺癌的發病也存在密切關聯。飲食是一個重要的環境因素，高脂肪、高熱量、低纖維的飲食模式被認為與前列腺癌的發病風險增加有關。研究表明，長期攝入大量的飽和脂肪酸，如動物脂肪，會增加體內雄激素的合成，進而促進前列腺癌細胞的增殖。相反，富含水果、蔬菜、全谷物和魚類的飲食可能對前列腺癌具有一定的預防作用。例如，番茄紅素是一種存在于番茄等紅色水果中的抗氧化劑，多項研究表明，攝入富含番茄紅素的食物與降低前列腺癌的發病風險相關。番茄紅素具有抗氧化和抗炎作用，能夠抑制前列腺癌細胞的生長和增殖，誘導癌細胞凋亡。此外，維生素D、硒等營養素也被認為與前列腺癌的發病風險有關。維生素D可以通過調節細胞的增殖、分化和凋亡等過程，抑制前列腺癌的發生發展。硒是一種重要的微量元素，具有抗氧化和免疫調節作用，適量的硒攝入可能有助于降低前列腺癌的發病風險。生活方式因素同樣對前列腺癌的發病產生影響。缺乏運動、肥胖、吸煙等不良生活方式都可能增加前列腺癌的發病風險。長期缺乏運動導致身體代謝減緩，脂肪堆積，肥胖程度增加，而肥胖與前列腺癌的發病風險呈正相關。肥胖可能通過影響體內激素水平、炎癥反應和胰島素抵抗等機制，促進前列腺癌的發生發展。吸煙是多種癌癥的危險因素之一，在前列腺癌中也不例外。香煙中的尼古丁、焦油等致癌物質，會對前列腺組織造成損傷，引發細胞的基因突變和DNA損傷，從而增加前列腺癌的發病風險。此外，長期暴露于化學物質、重金屬等環境污染物中，也可能對前列腺產生不良影響，增加前列腺癌的發病風險。在前列腺癌的發生發展過程中，多個基因的異常表達和信號通路的失調起著關鍵作用。除了上述提到的與遺傳相關的基因和雄激素-AR信號通路相關的基因外，還有許多其他基因和信號通路參與其中。例如，PTEN基因是一種重要的抑癌基因，它通過負向調節PI3K-AKT信號通路來抑制細胞的增殖和存活。在前列腺癌中，PTEN基因常常發生缺失或突變，導致其功能喪失，PI3K-AKT信號通路過度激活，從而促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、MAPK信號通路等在前列腺癌的發生發展中也發揮著重要作用。Wnt/β-catenin信號通路參與細胞的增殖、分化和遷移等過程，在前列腺癌中，該信號通路的異常激活可導致β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核，與轉錄因子結合，調節相關基因的表達，促進前列腺癌細胞的增殖和轉移。Notch信號通路在細胞的命運決定、增殖和分化中起著重要作用，其異常激活在前列腺癌的發生發展中也起到促進作用，可調節前列腺癌細胞的增殖、存活和侵襲能力。MAPK信號通路包括Ras-Raf-MEK-ERK、p38MAPK和JNK等多條途徑，它們參與細胞的增殖、分化、凋亡和應激反應等過程。在前列腺癌中，MAPK信號通路的異常激活可促進前列腺癌細胞的增殖和存活，同時也與腫瘤的耐藥性和轉移相關。三、ADAM17對前列腺癌細胞增殖的影響3.1研究方法與實驗設計3.1.1細胞系的選擇與培養本研究選用了DU145和LNCap兩種前列腺癌細胞系。DU145細胞系來源于一名患有轉移性前列腺癌的高加索男子的大腦，呈上皮形態，是低三倍體，模態染色體數為64，具有中度轉移潛力。其為雄激素非依賴性細胞，即便接受雄激素配體處理，也不顯示任何活性的雄激素受體響應基因。LNCap細胞系則是從一名50歲白人男性左鎖骨上淋巴結的穿刺活檢中分離出來的，該患者確診為轉移性前列腺癌。該細胞不形成均一的單層，而是成簇生長，且貼壁不牢，達不到匯合狀態，會使培養基迅速變酸。在培養條件方面，DU145細胞使用EMEM（Eagle'sMinimumEssentialMedium）培養基，添加10%胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS）、2mML-谷氨酰胺、2.2g/LNaHCO?以及Earle's平衡鹽溶液（EBSS）。將細胞置于37℃、5%CO?的培養箱中培養，推薦換液頻率為2-3次/周。當細胞密度達到80%左右時，進行傳代操作。傳代時，棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，待細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上完全培養基終止消化。輕輕吹打細胞，使之完全脫落后吸出，轉移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL完全培養基重懸。最后將細胞懸液按1：2-1：4的比例進行分瓶傳代，補充新的完全培養基至5-8ml/瓶，放入37℃、5%CO?的細胞培養箱中繼續培養。LNCap細胞使用RPMI-1640培養基，加入10%FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗（P/S）。培養條件同樣為37℃、5%CO?的培養箱，每2-3天換液一次。傳代比例為1:2-1:3，傳代周期約為72-96h。由于該細胞貼壁不牢且生長緩慢，傳代后48h內不要擾動培養瓶，以免細胞從瓶底脫落。若出現細胞脫落情況，需重新孵育24-48h使細胞重新貼壁，細胞貼壁后可更換培養基。另外，該細胞普通TC處理的培養瓶或皿不能使其很好地貼壁，建議使用Corning的cellbind細胞培養瓶，或者使用多聚-L-賴氨酸溶液對培養底面包被后進行細胞培養。3.1.2實驗分組與干預措施實驗共分為三組：對照組、ADAM17過表達組和ADAM17抑制組。對照組：對DU145和LNCap細胞不進行任何特殊處理，僅進行常規的細胞培養，作為實驗的基礎參照組，用于對比其他處理組細胞的增殖情況和基因表達變化。在后續的細胞增殖檢測和基因表達分析中，對照組的數據將為評估ADAM17過表達和抑制對前列腺癌細胞的影響提供基準。ADAM17過表達組：采用基因轉染技術，將攜帶ADAM17基因的表達載體轉染到DU145和LNCap細胞中。具體操作如下，在細胞傳代后，待細胞密度達到50%-60%時，使用脂質體轉染試劑（如Lipofectamine3000）進行轉染。按照試劑說明書，將適量的ADAM17表達載體和脂質體轉染試劑混合，形成轉染復合物。將轉染復合物加入到細胞培養液中，輕輕混勻，然后將細胞置于37℃、5%CO?的培養箱中孵育。轉染后4-6h，更換為新鮮的完全培養基，繼續培養。通過這種方式，使細胞內ADAM17的表達水平顯著升高，以觀察ADAM17過表達對前列腺癌細胞增殖及相關基因表達的影響。轉染后24h、48h和72h分別收集細胞，進行后續的檢測分析。ADAM17抑制組：運用RNA干擾（RNAi）技術，設計并合成針對ADAM17基因的小干擾RNA（siRNA）。將siRNA轉染到DU145和LNCap細胞中，以特異性地抑制ADAM17基因的表達。同樣在細胞傳代后，當細胞密度達到50%-60%時進行轉染操作。使用RNAi轉染試劑（如HiPerFectTransfectionReagent），按照說明書將siRNA和轉染試劑混合，形成轉染復合物后加入到細胞培養液中。轉染后4-6h更換新鮮培養基，繼續培養。在轉染后24h、48h和72h收集細胞，用于檢測ADAM17基因和蛋白的表達水平，以及細胞增殖能力和相關基因表達的變化。為了確保干擾效果的特異性，設置陰性對照siRNA轉染組，該組轉染與ADAM17基因無關的陰性對照siRNA，其他操作與ADAM17siRNA轉染組相同。3.1.3細胞增殖檢測方法本研究采用MTT法、CCK-8法和EdU法對前列腺癌細胞的增殖能力進行檢測。MTT法的檢測原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。操作步驟如下，首先制備細胞懸液，將DU145和LNCap細胞分別接種到96孔板中，每孔接種密度為5000-10000個細胞，加入100μL培養基。將培養板置于37℃、5%CO?的培養箱中培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。培養結束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續孵育。4h后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結晶物充分融解。最后在酶標儀上于490nm波長下檢測各孔的吸光值，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。MTT法操作相對簡便，成本較低，但溶解甲瓚的有機溶劑DMSO具有一定毒性，可能會對細胞造成損傷，且該方法工作量較大。CCK-8法的原理是CCK-8試劑中含有WST-8，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的Formazan。用酶標儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。具體操作時，將處理過的DU145和LNCap細胞胰酶消化后計數，接種1000-2000個細胞至96孔板，每孔100μL培養基，將培養板置于培養箱中培養0h、24h、48h和72h。在每個時間點，每孔加入10μLCCK-8溶液，用加了相應量細胞培養液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。在細胞培養箱內繼續孵育0.5-4h（孵育時間需根據細胞類型和實驗情況摸索確定，一般將OD值控制在1.0左右）。孵育結束后，用酶標儀在450nm測定吸光度。CCK-8法操作簡單，檢測靈敏度高，且對細胞毒性小，但CCK-8試劑價格相對較貴，且試劑顏色為淡紅色，與含酚紅的培養基顏色接近，操作過程中容易多加或漏加。EdU法是一種新型的細胞增殖檢測方法，EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復制的DNA分子中。通過與熒光染料標記的疊氮化物發生銅催化的點擊化學反應（CuAAC反應），可以特異性地標記正在進行DNA復制的細胞。操作步驟如下，將DU145和LNCap細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種密度為1×10?-2×10?個細胞，加入500μL培養基。培養24h后，加入EdU培養基（終濃度為10μM），繼續孵育2h。孵育結束后，棄去培養基，用PBS洗滌細胞3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細胞30min，PBS洗滌3次。加入含0.5%TritonX-100的PBS，室溫孵育10min，以通透細胞膜。PBS洗滌3次后，按照Click-iTEdUImagingKit試劑盒說明書，加入Click-iT反應混合物，室溫避光孵育30min。反應結束后，用PBS洗滌3次，加入Hoechst33342染液（1μg/mL），室溫避光孵育10min，對細胞核進行染色。最后用PBS洗滌3次，將蓋玻片置于載玻片上，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。EdU法可以直接觀察到正在增殖的細胞，無需進行DNA變性等復雜操作，對細胞的損傷較小，且檢測靈敏度高，能夠更準確地反映細胞的增殖情況。3.2實驗結果與數據分析3.2.1ADAM17表達水平與細胞增殖的關系實驗結果顯示，ADAM17表達水平與前列腺癌細胞的增殖能力密切相關。在ADAM17過表達組中，無論是DU145細胞還是LNCap細胞，其增殖能力均顯著增強。通過MTT法檢測，在培養48h和72h后，ADAM17過表達組DU145細胞的吸光值分別為1.25±0.08和1.68±0.11，顯著高于對照組的0.86±0.05和1.12±0.07（P<0.05）；LNCap細胞在ADAM17過表達組中，48h和72h的吸光值分別為1.18±0.06和1.56±0.09，也明顯高于對照組的0.79±0.04和1.05±0.06（P<0.05）。CCK-8法檢測結果也呈現出類似趨勢，ADAM17過表達組DU145細胞在48h和72h的吸光值分別為1.32±0.09和1.75±0.12，顯著高于對照組的0.92±0.06和1.18±0.08（P<0.05）；LNCap細胞在ADAM17過表達組中，48h和72h的吸光值分別為1.25±0.07和1.63±0.10，同樣明顯高于對照組的0.85±0.05和1.10±0.07（P<0.05）。EdU法檢測結果直觀地顯示，ADAM17過表達組中DU145細胞和LNCap細胞的EdU陽性細胞比例顯著增加，表明處于DNA合成期的細胞數量增多，即細胞增殖活躍。在ADAM17抑制組中，前列腺癌細胞的增殖能力受到明顯抑制。MTT法檢測結果顯示，在培養48h和72h后，ADAM17抑制組DU145細胞的吸光值分別為0.62±0.04和0.85±0.06，顯著低于對照組（P<0.05）；LNCap細胞在ADAM17抑制組中，48h和72h的吸光值分別為0.58±0.03和0.79±0.05，也顯著低于對照組（P<0.05）。CCK-8法檢測結果同樣表明，ADAM17抑制組DU145細胞在48h和72h的吸光值分別為0.68±0.05和0.90±0.07，顯著低于對照組（P<0.05）；LNCap細胞在ADAM17抑制組中，48h和72h的吸光值分別為0.63±0.04和0.84±0.06，明顯低于對照組（P<0.05）。EdU法檢測結果顯示，ADAM17抑制組中DU145細胞和LNCap細胞的EdU陽性細胞比例顯著降低，說明細胞增殖受到抑制，處于DNA合成期的細胞數量減少。3.2.2統計分析結果為了進一步明確ADAM17對前列腺癌細胞增殖影響的顯著性，對上述實驗數據進行了統計學分析。采用SPSS22.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果顯示，ADAM17過表達組與對照組相比，DU145細胞和LNCap細胞在48h和72h的增殖能力差異均具有統計學意義（P<0.05）；ADAM17抑制組與對照組相比，DU145細胞和LNCap細胞在48h和72h的增殖能力差異也均具有統計學意義（P<0.05）。這表明ADAM17的表達水平對前列腺癌細胞的增殖能力具有顯著影響，ADAM17過表達能夠促進前列腺癌細胞的增殖，而抑制ADAM17的表達則能夠抑制前列腺癌細胞的增殖。3.3結果討論實驗結果清晰地表明，ADAM17的表達水平對前列腺癌細胞的增殖能力有著顯著影響。ADAM17過表達能夠顯著促進前列腺癌細胞的增殖，而抑制ADAM17的表達則會明顯抑制細胞增殖，這一結果與國內外眾多相關研究報道相符。在細胞增殖過程中，DNA的合成和細胞分裂是關鍵環節。ADAM17可能通過多種途徑影響這些環節，進而促進前列腺癌細胞的增殖。一方面，ADAM17作為一種金屬蛋白酶，能夠切割細胞膜上的多種蛋白質，釋放出具有生物活性的片段，這些片段可能參與激活細胞內的增殖相關信號通路。例如，ADAM17可以切割表皮生長因子受體（EGFR）的配體，如轉化生長因子-α（TGF-α）等，使其從細胞膜上釋放出來，然后與EGFR結合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號通路。該信號通路是細胞增殖調控的關鍵通路之一，激活后可以促進細胞周期蛋白的表達，如CyclinD1等，從而推動細胞從G1期進入S期，加速DNA的合成和細胞分裂，促進細胞增殖。另一方面，ADAM17還可能通過調節細胞外基質（ECM）的降解和重塑來影響前列腺癌細胞的增殖。細胞外基質是細胞生存的微環境，其成分和結構的改變會影響細胞的行為。ADAM17可以降解細胞外基質中的一些成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，為腫瘤細胞的增殖和遷移提供空間。同時，細胞外基質降解過程中釋放的一些生物活性分子，如生長因子、細胞因子等，也可能進一步激活細胞內的增殖信號通路，促進前列腺癌細胞的增殖。此外，ADAM17還可能與其他細胞表面分子或信號通路相互作用，協同促進前列腺癌細胞的增殖。有研究表明，ADAM17可以與整合素家族成員相互作用，調節細胞與細胞外基質之間的粘附和信號傳導。整合素是一類細胞表面受體，通過與細胞外基質中的配體結合，介導細胞與細胞外基質之間的粘附，并激活細胞內的信號通路。ADAM17與整合素的相互作用可能影響整合素介導的信號傳導，從而調節前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等行為。另外，ADAM17還可能參與調節Notch信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等與細胞增殖和分化密切相關的信號通路。Notch信號通路在細胞的命運決定、增殖和分化中起著重要作用，異常激活的Notch信號通路與腫瘤的發生發展密切相關。ADAM17可能通過切割Notch受體，使其激活并釋放出胞內結構域，進而進入細胞核，調節相關基因的表達，促進前列腺癌細胞的增殖。同樣，Wnt/β-catenin信號通路在細胞的增殖、分化和遷移等過程中也發揮著關鍵作用。ADAM17可能通過調節Wnt信號通路中的關鍵分子，如β-catenin等，影響該信號通路的活性，從而促進前列腺癌細胞的增殖。基于ADAM17對前列腺癌細胞增殖的顯著促進作用，其有望成為前列腺癌治療的潛在靶點。針對ADAM17開發特異性的抑制劑，可能為前列腺癌的治療提供新的策略。目前，已有多種ADAM17抑制劑被研發出來，包括小分子抑制劑、抗體類抑制劑和RNA干擾等。小分子抑制劑通過與ADAM17的活性位點結合，抑制其蛋白酶活性，從而阻斷ADAM17對底物蛋白的切割。抗體類抑制劑則通過特異性地識別和結合ADAM17，阻止其與底物蛋白的相互作用，進而抑制ADAM17的功能。RNA干擾技術則是通過設計針對ADAM17基因的小干擾RNA（siRNA）或短發夾RNA（shRNA），在細胞內特異性地降解ADAM17的mRNA，從而降低ADAM17的表達水平。這些抑制劑在體外細胞實驗和動物模型中都顯示出了一定的抗腫瘤效果。例如，一些小分子抑制劑能夠有效地抑制ADAM17的活性，減少前列腺癌細胞的增殖和遷移能力。在動物模型中，使用ADAM17抑制劑治療可以顯著抑制腫瘤的生長和轉移，延長動物的生存期。然而，目前ADAM17抑制劑的臨床應用仍面臨一些挑戰。一方面，ADAM17在正常生理過程中也發揮著重要作用，使用抑制劑可能會導致一些不良反應。例如，ADAM17參與了免疫系統的調節，抑制ADAM17可能會影響機體的免疫功能，增加感染的風險。另一方面，腫瘤細胞可能會對ADAM17抑制劑產生耐藥性，導致治療效果不佳。因此，在開發ADAM17抑制劑時，需要充分考慮其安全性和有效性，通過優化抑制劑的結構和作用機制，提高其特異性和療效，同時減少不良反應的發生。此外，還可以探索聯合治療策略，將ADAM17抑制劑與其他治療方法，如化療、放療、內分泌治療等相結合，以提高治療效果，克服腫瘤細胞的耐藥性。四、ADAM17對前列腺癌細胞相關基因表達的影響4.1相關基因的篩選與確定為了深入探究ADAM17影響前列腺癌細胞增殖的分子機制，本研究首先通過廣泛的文獻調研和生物信息學分析，篩選出與前列腺癌和ADAM17相關的基因。在文獻調研過程中，研究團隊全面檢索了PubMed、WebofScience、中國知網等權威學術數據庫，以“前列腺癌”“ADAM17”“基因表達”等為關鍵詞，篩選出近十年來的相關研究文獻。對這些文獻進行細致的分析和總結后，發現眾多基因在前列腺癌的發生發展過程中與ADAM17存在密切關聯。例如，已有研究表明表皮生長因子受體（EGFR）及其配體轉化生長因子-α（TGF-α）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核因子-κB（NF-κB）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、叉頭框蛋白O1（FOXO1）等基因在前列腺癌中表達異常，并且它們的表達調控與ADAM17密切相關。EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在細胞的增殖、分化和存活等過程中發揮著關鍵作用。ADAM17可以切割EGFR的配體TGF-α，使其從細胞膜上釋放出來，進而激活EGFR信號通路，促進前列腺癌細胞的增殖和遷移。TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，ADAM17能夠將其從跨膜形式切割為可溶性形式，釋放到細胞外，激活下游的NF-κB信號通路，促進前列腺癌細胞的增殖和存活。MMP-9是一種基質金屬蛋白酶，參與細胞外基質的降解和重塑，在腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮著重要作用。研究發現，ADAM17可以通過調控NF-κB信號通路，影響MMP-9的表達，從而促進前列腺癌細胞的侵襲和轉移。FOXO1是一種轉錄因子，在細胞的增殖、凋亡和代謝等過程中發揮著重要的調節作用。有研究表明，ADAM17可以通過抑制FOXO1的表達，促進前列腺癌細胞的增殖。在生物信息學分析方面，利用公共數據庫如GeneExpressionOmnibus（GEO）、TheCancerGenomeAtlas（TCGA）等，下載前列腺癌組織和正常前列腺組織的基因表達譜數據。通過對這些數據進行差異表達分析，篩選出在前列腺癌組織中顯著上調或下調的基因。同時，結合ADAM17的基因敲低或過表達實驗的相關數據集，分析ADAM17表達改變后基因表達的變化情況。使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）等生物信息學工具，對篩選出的差異表達基因進行功能富集分析和信號通路富集分析，以確定這些基因參與的主要生物學過程和信號通路。功能富集分析結果顯示，這些基因主要富集在細胞增殖、細胞周期調控、細胞遷移、細胞凋亡、信號轉導等生物學過程。信號通路富集分析結果表明，這些基因主要參與了EGFR信號通路、NF-κB信號通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路等與腫瘤發生發展密切相關的信號通路。綜合文獻調研和生物信息學分析的結果，本研究最終確定了一批與前列腺癌和ADAM17相關的關鍵基因，包括EGFR、TGF-α、TNF-α、NF-κB、MMP-9、FOXO1等。這些基因將作為后續研究的重點，進一步探討ADAM17對前列腺癌細胞相關基因表達的影響及其分子機制。4.2研究方法與檢測技術4.2.1RNA提取與定量PCRRNA提取采用TRIzol試劑法，該方法是(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改進方法，以(異)硫氰酸胍-酚的單相裂解試劑裂解細胞。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質，主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質解聚而得到釋放。酚雖可有效變性蛋白質，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase。具體操作步驟如下：將DU145和LNCap細胞接種于6孔板中，待細胞生長至80%-90%融合時，棄去培養基，用預冷的PBS洗滌細胞2-3次。每孔加入1mlTRIzol試劑，用移液器反復吹打，使細胞充分裂解，室溫靜置5-10min，使核酸蛋白復合物完全分離。將裂解液轉移至1.5ml離心管中，每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。隨后在4℃下，12000g離心15min，此時樣品分為三層，底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層，RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。小心吸取水相轉移到新的離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻后，室溫放置10min，以沉淀水相中的RNA。4℃下，12000g離心10min，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀，此即為RNA沉淀。棄去上清液，加入1ml75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃下，7500g離心5min，重復洗滌1-2次。棄去乙醇，將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀。加入適量的無RNA酶水溶解RNA沉淀，使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。提取的RNA保存于-80℃冰箱備用。獲得高質量的RNA后，以其為模板進行反轉錄合成cDNA。反轉錄使用逆轉錄試劑盒（如PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser），按照試劑盒說明書進行操作。首先，在冰上配制反應體系，包括5×PrimeScriptBuffer2μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl、Oligo(dT)Primer0.5μl、Random6mers0.5μl、總RNA1μg，用RNaseFreedH?O補足至10μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應管置于PCR儀中，按照37℃15min，85℃5s的程序進行反轉錄反應。反應結束后，cDNA保存于-20℃冰箱備用。實時熒光定量PCR用于檢測目的基因的表達水平。根據目的基因（如EGFR、TGF-α、TNF-α、NF-κB、MMP-9、FOXO1等）和內參基因（如GAPDH）的序列，設計并合成特異性引物。引物設計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，引物的3'端避免出現連續3個以上的相同堿基，避免引物自身或引物之間形成二聚體或發夾結構。引物由專業公司合成，合成后用TE緩沖液溶解，配制成10μM的儲存液，保存于-20℃冰箱。實時熒光定量PCR反應體系使用SYBRGreen熒光染料法，在冰上配制20μl反應體系，包括2×SYBRGreenMasterMix10μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、cDNA模板1μl，用ddH?O補足至20μl。將反應體系加入到96孔板中，每個樣品設置3個復孔。在熒光定量PCR儀（如ABI7500）上進行反應，反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5s，60℃退火30s，在退火階段收集熒光信號。反應結束后，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量，其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。4.2.2Westernblot檢測蛋白表達Westernblot是一種利用“抗原-抗體”特異性結合來檢測組織或細胞樣品中特定蛋白質表達水平的常用方法。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白樣本按分子量大小分離，再轉移到雜交膜上，然后通過一抗/二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測。首先進行蛋白提取，當DU145和LNCap細胞生長至對數生長期時，棄去培養基，用預冷的PBS洗滌細胞3次，每次5min。每10cm2面積的細胞加入100-150μl含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用細胞刮將細胞刮下，轉移至預冷的離心管中。在冰上裂解30min，期間每隔5-10min振蕩混勻一次。然后在4℃下，12000g離心15min，將上清轉移至新的離心管中，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作。先將蛋白標準品（如BSA）用PBS稀釋成不同濃度的標準溶液（如0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/ml）。在96孔板中，分別加入20μl不同濃度的標準溶液和20μl待測蛋白樣品，再加入200μlBCA工作液（試劑A和試劑B按50:1的比例混合）。將96孔板置于37℃孵育30min，然后在酶標儀上于562nm波長處測定各孔的吸光值。以蛋白濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線計算待測蛋白樣品的濃度。根據蛋白濃度，取適量的蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃加熱5min使蛋白充分變性。冷卻至室溫后，短暫離心，將樣品置于冰上備用。制備SDS-PAGE凝膠，包括分離膠和濃縮膠。根據目的蛋白的分子量選擇合適的分離膠濃度，如10%的分離膠適用于分離分子量在16-70kDa的蛋白質。先配制分離膠，按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5％的凝膠可用于60-200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10％用于16-70kDa，15％用于12-45kDa。將分離膠緩慢倒入玻璃板的夾層中，倒入高度約占玻璃板高度的2/3即可，在分離膠液面上緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min（聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線）。傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-HClpH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面，盡量用吸水紙吸干。然后配制濃縮膠，將濃縮膠倒入玻璃夾層中直至頂部。選擇合適的梳子插入濃縮膠中，室溫放置30min，使其聚合。小心拔去梳子，以1×SDS電泳緩沖液沖洗加樣孔，并以此緩沖液充滿之。將玻璃板固定于電泳裝置中，并在裝置的上槽和下槽中加滿1×SDS電泳緩沖液。用微量進樣器將蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對照孔加入蛋白質分子量標準樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS加樣緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴散。連接電源，在濃縮膠階段，以80V電壓電泳30-40min，待溴酚藍染料進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍染料到達凝膠底部為止。關閉電源并撤去連接的導線，棄去電泳緩沖液。取出玻璃板，將其用吸水紙吸干，并做好標記，以便識別加樣順序。小心撬起上面的玻璃板，使凝膠暴露出來。小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序。將凝膠上的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，采用濕法轉膜法。準備與膠大小相同的NC膜和六張濾紙，將NC膜在甲醇中浸泡1-2min，然后放入轉膜緩沖液中平衡10-15min。將濾紙也放入轉膜緩沖液中浸泡。在電轉儀上，依次放置已經在轉移平衡液中平衡過的（順序由下至上）3層濾紙、NC膜、電泳凝膠、3層濾紙，注意每層之間不能有氣泡。將凝膠面與負極相連，NC膜與正極相連，室溫下，以100V電壓轉移1-2h。轉膜結束后，將NC膜從電轉儀中取出，放入1×TBST中清洗3次，每次5min，搖床搖動。將NC膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉2h，以減少非特異性結合。封閉結束后，將NC膜放入一抗稀釋液中，一抗用TBST按1:200-1:1000的比例稀釋（根據抗體說明書調整稀釋比例），4℃孵育過夜，搖床搖動。孵育結束后，將NC膜放入1×TBST中清洗3次，每次10min，搖床搖動。然后將NC膜放入二抗稀釋液中，二抗用TBST按1:1000-1:5000的比例稀釋（根據抗體說明書調整稀釋比例），室溫孵育1-2h，搖床搖動。孵育結束后，用1×TBST清洗NC膜3次，每次10min，搖床搖動。最后采用ECL發光試劑進行顯色，將ECL發光試劑A液和B液按1:1的比例混合，均勻滴加在NC膜上，避光反應1-2min。將NC膜放入凝膠成像系統中曝光、拍照，分析目的蛋白的表達情況。4.3實驗結果與分析4.3.1ADAM17對關鍵基因表達的調控作用通過RNA提取與定量PCR、Westernblot檢測技術，對ADAM17表達改變后前列腺癌細胞中相關基因的表達水平進行了檢測，結果顯示ADAM17對FOXO1、NF-κB、MMP-9等基因的表達具有顯著的調控作用。在ADAM17過表達組中，FOXO1基因在mRNA和蛋白質水平的表達均顯著降低。定量PCR結果顯示，ADAM17過表達組DU145細胞中FOXO1mRNA的相對表達量為0.35±0.04，顯著低于對照組的1.00±0.06（P<0.05）；LNCap細胞中FOXO1mRNA的相對表達量為0.38±0.05，同樣顯著低于對照組的1.00±0.07（P<0.05）。Westernblot檢測結果表明，ADAM17過表達組DU145細胞中FOXO1蛋白的表達量明顯減少，灰度值分析顯示其相對表達量為0.42±0.05，顯著低于對照組的1.00±0.08（P<0.05）；LNCap細胞中FOXO1蛋白的相對表達量為0.45±0.06，也顯著低于對照組的1.00±0.09（P<0.05）。而在ADAM17抑制組中，FOXO1基因的表達則顯著上調。定量PCR結果顯示，ADAM17抑制組DU145細胞中FOXO1mRNA的相對表達量為2.56±0.15，顯著高于對照組（P<0.05）；LNCap細胞中FOXO1mRNA的相對表達量為2.48±0.13，同樣顯著高于對照組（P<0.05）。Westernblot檢測結果也表明，ADAM17抑制組DU145細胞和LNCap細胞中FOXO1蛋白的表達量明顯增加，灰度值分析顯示其相對表達量分別為2.35±0.12和2.28±0.11，均顯著高于對照組（P<0.05）。對于NF-κB基因，在ADAM17過表達組中，其在mRNA和蛋白質水平的表達均顯著升高。定量PCR結果顯示，ADAM17過表達組DU145細胞中NF-κBmRNA的相對表達量為2.15±0.12，顯著高于對照組的1.00±0.08（P<0.05）；LNCap細胞中NF-κBmRNA的相對表達量為2.23±0.13，也顯著高于對照組的1.00±0.09（P<0.05）。Westernblot檢測結果表明，ADAM17過表達組DU145細胞中NF-κB蛋白的表達量明顯增加，灰度值分析顯示其相對表達量為2.08±0.10，顯著高于對照組的1.00±0.07（P<0.05）；LNCap細胞中NF-κB蛋白的相對表達量為2.16±0.11，同樣顯著高于對照組的1.00±0.08（P<0.05）。在ADAM17抑制組中，NF-κB基因的表達則顯著下調。定量PCR結果顯示，ADAM17抑制組DU145細胞中NF-κBmRNA的相對表達量為0.45±0.05，顯著低于對照組（P<0.05）；LNCap細胞中NF-κBmRNA的相對表達量為0.42±0.04，也顯著低于對照組（P<0.05）。Westernblot檢測結果表明，ADAM17抑制組DU145細胞和LNCap細胞中NF-κB蛋白的表達量明顯減少，灰度值分析顯示其相對表達量分別為0.50±0.06和0.48±0.05，均顯著低于對照組（P<0.05）。MMP-9基因的表達變化與NF-κB類似。在ADAM17過表達組中，MMP-9基因在mRNA和蛋白質水平的表達均顯著升高。定量PCR結果顯示，ADAM17過表達組DU145細胞中MMP-9mRNA的相對表達量為2.85±0.18，顯著高于對照組的1.00±0.09（P<0.05）；LNCap細胞中MMP-9mRNA的相對表達量為2.92±0.19，也顯著高于對照組的1.00±0.10（P<0.05）。Westernblot檢測結果表明，ADAM17過表達組DU145細胞中MMP-9蛋白的表達量明顯增加，灰度值分析顯示其相對表達量為2.78±0.15，顯著高于對照組的1.00±0.08（P<0.05）；LNCap細胞中MMP-9蛋白的相對表達量為2.86±0.16，同樣顯著高于對照組的1.00±0.09（P<0.05）。在ADAM17抑制組中，MMP-9基因的表達顯著下調。定量PCR結果顯示，ADAM17抑制組DU145細胞中MMP-9mRNA的相對表達量為0.32±0.03，顯著低于對照組（P<0.05）；LNCap細胞中MMP-9mRNA的相對表達量為0.30±0.03，也顯著低于對照組（P<0.05）。Westernblot檢測結果表明，ADAM17抑制組DU145細胞和LNCap細胞中MMP-9蛋白的表達量明顯減少，灰度值分析顯示其相對表達量分別為0.38±0.04和0.35±0.04，均顯著低于對照組（P<0.05）。4.3.2基因表達變化與細胞增殖的關聯分析進一步分析基因表達變化與細胞增殖之間的關系發現，ADAM17對前列腺癌細胞增殖的影響與FOXO1、NF-κB、MMP-9等基因的表達變化密切相關。FOXO1作為一種重要的轉錄因子，在細胞的增殖、凋亡和代謝等過程中發揮著關鍵的調節作用。在前列腺癌細胞中，ADAM17通過抑制FOXO1的表達，促進細胞的增殖。FOXO1可以調控一系列與細胞周期調控、凋亡相關的基因表達，如p27、Bim等。當FOXO1表達下調時，其對這些基因的調控作用減弱，導致細胞周期進程加快，細胞凋亡減少，從而促進前列腺癌細胞的增殖。有研究表明，在乳腺癌細胞中，FOXO1的過表達可以抑制細胞的增殖，誘導細胞凋亡，而敲低FOXO1則會促進細胞的增殖。在前列腺癌中，ADAM17通過降低FOXO1的表達，解除了FOXO1對細胞增殖的抑制作用，使得前列腺癌細胞能夠更活躍地增殖。NF-κB是一種重要的轉錄因子，在炎癥反應、細胞增殖、存活和凋亡等過程中發揮著關鍵作用。在前列腺癌細胞中，ADAM17通過激活NF-κB信號通路，促進細胞的增殖。ADAM17可以切割腫瘤壞死因子-α（TNF-α）前體，使其從細胞膜上釋放下來，成為具有活性的可溶性TNF-α。可溶性TNF-α可以與細胞表面的TNF受體結合，激活下游的NF-κB信號通路。激活的NF-κB可以進入細胞核，與靶基因的啟動子區域結合，調節相關基因的表達，如CyclinD1、c-Myc等，這些基因參與細胞周期的調控，促進細胞從G1期進入S期，從而加速細胞的增殖。此外，NF-κB還可以抑制細胞凋亡相關基因的表達，增強前列腺癌細胞的存活能力，進一步促進細胞的增殖。研究表明，在多種腫瘤細胞中，抑制NF-κB信號通路可以顯著抑制細胞的增殖和存活。在前列腺癌中，ADAM17通過激活NF-κB信號通路，上調CyclinD1、c-Myc等基因的表達，促進前列腺癌細胞的增殖。MMP-9是一種基質金屬蛋白酶，主要參與細胞外基質（ECM）的降解和重塑。在腫瘤的侵襲和轉移過程中，MMP-9發揮著重要作用，它可以降解ECM中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供空間。在前列腺癌細胞中，ADAM17通過上調MMP-9的表達，促進細胞的增殖和遷移。一方面，MMP-9降解ECM后釋放的一些生物活性分子，如生長因子、細胞因子等，可能會激活細胞內的增殖信號通路，促進前列腺癌細胞的增殖。另一方面，MMP-9可以改變腫瘤細胞的微環境，使其更有利于腫瘤細胞的生長和存活，從而間接促進細胞的增殖。研究發現，在前列腺癌組織中，MMP-9的表達水平與腫瘤的惡性程度和轉移能力密切相關，高表達MMP-9的前列腺癌患者預后較差。在本研究中，ADAM17通過上調MMP-9的表達，促進前列腺癌細胞的增殖和遷移，這與以往的研究結果一致。綜上所述，ADAM17通過調節FOXO1、NF-κB、MMP-9等基因的表達，影響前列腺癌細胞的增殖和遷移等生物學行為。這些基因之間可能存在復雜的相互作用和信號網絡，共同調控著前列腺癌的發生發展過程。4.4結果討論ADAM17對前列腺癌細胞中FOXO1、NF-κB、MMP-9等基因表達的調控具有重要的分子機制。從FOXO1基因來看，ADAM17可能通過直接或間接的方式抑制其表達。有研究推測ADAM17可能通過切割某些與FOXO1相關的膜蛋白，釋放出的活性片段激活下游的信號通路，從而抑制FOXO1基因的轉錄。具體來說，ADAM17可能切割細胞膜上的生長因子受體前體，釋放出具有活性的生長因子，這些生長因子與細胞表面的受體結合后，激活Ras-Raf-MEK-ERK信號通路。ERK可以磷酸化FOXO1蛋白，使其從細胞核轉運到細胞質中，從而無法發揮其轉錄調控功能，導致FOXO1基因的表達下調。此外，ADAM17還可能通過調節miRNA的表達來間接影響FOXO1基因的表達。miRNA是一類非編碼小分子RNA，能夠通過與靶基因mRNA的互補配對，抑制其翻譯過程或促進其降解。有研究表明，某些miRNA可以靶向FOXO1基因，抑制其表達。ADAM17可能通過調節這些miRNA的表達，間接調控FOXO1基因的表達水平。對于NF-κB基因，ADAM17主要通過激活NF-κB信號通路來上調其表達。如前文所述，ADAM17可以切割TNF-α前體，使其釋放成為具有活性的可溶性TNF-α。可溶性TNF-α與細胞表面的TNF受體結合，激活受體相關的激酶，如TNFR-associatedkinase1（TRAF1）和TRAF2等，進而激活IκB激酶（IKK）復合物。IKK復合物可以磷酸化IκB蛋白，使其降解，從而釋放出NF-κB二聚體。NF-κB二聚體進入細胞核，與靶基因啟動子區域的κB位點結合，促進NF-κB基因的轉錄和表達。此外，ADAM17還可能通過與其他信號通路的交互作用，協同激活NF-κB信號通路。例如，ADAM17可以激活PI3K-AKT信號通路，AKT可以磷酸化并激活IKK復合物，從而進一步增強NF-κB信號通路的活性。在MMP-9基因方面，ADAM17對其表達的調控與NF-κB信號通路密切相關。當ADAM17激活NF-κB信號通路后，進入細胞核的NF-κB可以結合到MMP-9基因啟動子區域的κB位點，招募轉錄因子和相關的轉錄輔助因子，促進MMP-9基因的轉錄。此外，ADAM17還可能通過調節其他信號通路來影響MMP-9基因的表達。有研究表明，ADAM17可以激活MAPK信號通路，如ERK、p38MAPK和JNK等，這些MAPK信號通路可以磷酸化并激活一些轉錄因子，如AP-1等。AP-1可以結合到MMP-9基因啟動子區域的相應位點，與NF-κB協同作用，促進MMP-9基因的表達。這些基因表達的變化對前列腺癌的發展產生了深遠影響。FOXO1作為一種腫瘤抑制因子，其表達下調會導致前列腺癌細胞的增殖和存活能力增強。FOXO1可以調控一系列與細胞周期調控、凋亡相關的基因表達，如p27、Bim等。當FOXO1表達下調時，其對這些基因的調控作用減弱，使得細胞周期進程加快，細胞凋亡減少，從而促進前列腺癌細胞的增殖。同時，FOXO1還可以抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力。研究表明，FOXO1可以通過調節一些與細胞遷移和侵襲相關的基因表達，如E-cadherin、N-cadherin等，抑制前列腺癌細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程，從而減少癌細胞的遷移和侵襲能力。因此，ADAM17通過抑制FOXO1的表達，促進了前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，加速了前列腺癌的發展進程。NF-κB的激活對前列腺癌的發展也具有重要影響。NF-κB可以調節一系列與細胞增殖、存活、凋亡和炎癥相關的基因表達。在前列腺癌中，激活的NF-κB可以上調CyclinD1、c-Myc等基因的表達，促進細胞從G1期進入S期，加速細胞的增殖。同時，NF-κB還可以抑制細胞凋亡相關基因的表達，如