PM2.5與甲醛暴露誘發(fā)小鼠阿爾茨海默癥樣病變及分子機制解析一、引言1.1研究背景與意義隨著全球人口老齡化進程的加速，阿爾茨海默癥（Alzheimer’sdisease,AD）已成為日益嚴峻的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。AD是一種進行性神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征包括大腦中β-淀粉樣蛋白（Aβ）的異常沉積形成老年斑、tau蛋白過度磷酸化導致神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元和突觸的大量丟失。臨床上，AD患者表現(xiàn)出進行性的認知功能障礙和行為異常，從早期的記憶力減退、學習能力下降，逐漸發(fā)展到語言障礙、定向力喪失，最終完全喪失生活自理能力。AD的高發(fā)病率和嚴重的致殘性給患者及其家庭帶來了沉重的負擔，也對社會醫(yī)療資源造成了巨大的壓力。據(jù)統(tǒng)計，全球AD患者數(shù)量持續(xù)攀升，預計到2050年，患者人數(shù)將達到目前的數(shù)倍之多。AD不僅影響患者的生活質(zhì)量，還使得家庭照料者面臨身體和心理的雙重壓力，同時也帶來了高昂的醫(yī)療費用和社會經(jīng)濟成本。因此，深入了解AD的發(fā)病機制，尋找有效的預防和治療策略，已成為醫(yī)學和神經(jīng)科學領域的研究熱點。在AD發(fā)病機制的研究中，盡管遺傳因素在部分早發(fā)型AD病例中起著重要作用，但對于散發(fā)性AD（占AD病例的絕大多數(shù)），環(huán)境因素被認為在其發(fā)病過程中扮演著關鍵角色?？諝馕廴咀鳛橐环N廣泛存在的環(huán)境因素，近年來受到了越來越多的關注。其中，PM2.5和甲醛是兩類常見且危害較大的空氣污染物。PM2.5是指大氣中直徑小于或等于2.5微米的顆粒物，由于其粒徑小，能夠長時間懸浮在空氣中，并可通過呼吸道進入人體的深部組織，甚至穿過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，許多地區(qū)的PM2.5污染問題日益嚴重，長期暴露于高濃度的PM2.5環(huán)境中，對人體健康產(chǎn)生了多方面的不良影響。越來越多的流行病學研究和動物實驗表明，PM2.5暴露與AD的發(fā)生發(fā)展存在關聯(lián)，可能通過誘導氧化應激、炎癥反應、神經(jīng)毒性等機制，對大腦神經(jīng)細胞造成損傷，促進AD樣病理改變的發(fā)生。甲醛是一種揮發(fā)性有機化合物，廣泛存在于室內(nèi)裝修材料、家具、紡織品等物品中。室內(nèi)環(huán)境中的甲醛釋放周期長，人們長期處于甲醛污染的室內(nèi)環(huán)境中，健康面臨潛在威脅。已有研究顯示，甲醛具有神經(jīng)毒性，能夠干擾神經(jīng)細胞的正常功能，影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和信號傳導。在AD患者的大腦中，也檢測到甲醛含量的升高，提示甲醛可能參與了AD的病理過程，然而其具體作用機制尚不完全清楚。盡管已有不少研究分別探討了PM2.5或甲醛與AD之間的關系，但對于二者聯(lián)合暴露對AD樣病變的影響及其分子機制，目前的研究還相對較少。考慮到在現(xiàn)實生活中，人們往往同時暴露于多種空氣污染物中，研究PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露的健康效應，對于全面評估空氣污染對AD發(fā)病的影響具有重要意義。本研究旨在通過動物實驗，深入探究PM2.5和甲醛單獨及聯(lián)合暴露對小鼠阿爾茨海默癥樣病變的影響，并從分子層面揭示其潛在的作用機制，為進一步認識空氣污染與AD之間的關系提供理論依據(jù)，也為制定有效的AD預防策略和空氣污染控制措施提供科學參考。1.2研究目標本研究旨在深入探究PM2.5和甲醛暴露對小鼠阿爾茨海默癥樣病變的影響，并揭示其潛在的分子機制，具體研究目標如下：評估PM2.5和甲醛單獨及聯(lián)合暴露對小鼠認知功能的影響：運用Morris水迷宮實驗、Y迷宮實驗等經(jīng)典的行為學測試方法，系統(tǒng)地檢測不同暴露條件下小鼠的學習和記憶能力。通過分析小鼠在實驗中的逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標象限停留時間等關鍵指標，準確評估PM2.5和甲醛暴露是否會導致小鼠認知功能下降，以及聯(lián)合暴露與單獨暴露在影響程度上的差異，明確兩種污染物暴露與小鼠認知功能障礙之間的關聯(lián)。觀察PM2.5和甲醛暴露對小鼠大腦病理形態(tài)學的改變：采用組織病理學技術(shù)，對小鼠大腦進行切片，通過蘇木精-伊紅（HE）染色，直觀地觀察大腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，包括神經(jīng)元的形態(tài)、數(shù)量、分布情況，以及是否存在細胞凋亡、組織炎癥等病理改變。利用免疫組織化學染色方法，檢測β-淀粉樣蛋白（Aβ）和異常磷酸化tau蛋白在大腦中的沉積和分布情況，這些蛋白的異常變化是AD的重要病理特征，通過對比不同暴露組小鼠大腦中這些蛋白的表達水平和分布區(qū)域，確定PM2.5和甲醛暴露對小鼠大腦AD樣病理變化的影響。揭示PM2.5和甲醛暴露致小鼠阿爾茨海默癥樣病變的分子機制：從氧化應激、炎癥反應、神經(jīng)遞質(zhì)代謝等多個分子層面入手，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測相關基因的表達水平，如氧化應激相關基因（如超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT等）、炎癥因子基因（如腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素IL-1β等）、神經(jīng)遞質(zhì)合成和代謝相關基因等；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)分析相應蛋白的表達變化，進一步驗證基因表達結(jié)果。通過這些實驗手段，深入探究PM2.5和甲醛暴露影響小鼠大腦分子信號通路的具體機制，明確關鍵的分子靶點和信號轉(zhuǎn)導途徑，為理解空氣污染與AD發(fā)病之間的內(nèi)在聯(lián)系提供分子生物學依據(jù)。二、研究基礎2.1阿爾茨海默癥概述阿爾茨海默癥（Alzheimer’sdisease,AD）作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為認知功能障礙與行為損害。在疾病早期，患者通常表現(xiàn)出記憶力減退，尤其是近事記憶受損，對剛剛發(fā)生的事情容易遺忘，但對很久以前的事情卻能相對清晰地回憶。隨著病情的進展，語言功能逐漸受到影響，患者可能出現(xiàn)找詞困難、言語表達不流暢、理解能力下降等癥狀，導致交流障礙。同時，患者的空間定向力也會變差，在熟悉的環(huán)境中也容易迷路，難以辨別方向。此外，執(zhí)行功能如計劃、組織、決策等方面的能力也會逐漸衰退，患者難以完成較為復雜的任務。在行為和精神方面，AD患者常出現(xiàn)抑郁、焦慮、冷漠、煩躁不安、睡眠障礙等癥狀，部分患者還可能出現(xiàn)幻覺、妄想等精神病性癥狀。這些行為和精神癥狀不僅給患者自身帶來痛苦，也給家庭和社會帶來了沉重的負擔。據(jù)統(tǒng)計，AD患者的照料者往往承受著巨大的心理壓力和體力消耗，其生活質(zhì)量也受到嚴重影響。AD的危害不僅僅局限于患者個體，還對社會經(jīng)濟產(chǎn)生了深遠的影響。隨著全球老齡化的加劇，AD患者數(shù)量逐年增加，治療和照料AD患者需要耗費大量的醫(yī)療資源和社會財富。據(jù)相關研究預測，未來幾十年內(nèi)，AD相關的醫(yī)療費用和社會成本將持續(xù)攀升，這將對社會的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴峻挑戰(zhàn)。關于AD的發(fā)病機制，目前尚未完全明確，但存在多種假說，其中β-淀粉樣蛋白（Aβ）級聯(lián)假說、tau蛋白異常磷酸化假說等較為重要。Aβ級聯(lián)假說認為，Aβ的異常沉積是AD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。Aβ是由淀粉樣前體蛋白（APP）經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶水解產(chǎn)生的。在AD患者大腦中，由于各種因素導致Aβ的生成和清除失衡，過多的Aβ尤其是Aβ42在腦內(nèi)聚集，形成老年斑。這些老年斑可以激活小膠質(zhì)細胞，引發(fā)炎癥反應；損害線粒體，導致能量代謝障礙和氧化應激；激活細胞凋亡途徑，介導神經(jīng)元死亡；還可以激活蛋白激酶，促進tau蛋白異常磷酸化，進一步加重神經(jīng)元損傷。tau蛋白異常磷酸化假說則強調(diào)tau蛋白的作用。tau蛋白是一種微管相關蛋白，正常情況下它能與微管結(jié)合，維持細胞骨架的穩(wěn)定性。在AD患者腦內(nèi)，tau蛋白發(fā)生異常過度磷酸化，過度磷酸化的tau蛋白從微管上解離下來，聚集形成雙股螺旋細絲，進而形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成破壞了神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能，導致軸漿運輸中止或紊亂，最終引起軸突變性和神經(jīng)元死亡。雖然目前對于tau蛋白磷酸化是AD病理改變的始發(fā)環(huán)節(jié)還是繼發(fā)于Aβ異常仍存在爭議，但tau蛋白異常磷酸化在AD發(fā)病過程中的重要作用已得到廣泛認可。此外，遺傳因素在AD發(fā)病中也起著重要作用。約5%的患者有明確的家族史，這些家族性AD患者通常呈常染色體顯性遺傳。已發(fā)現(xiàn)多個與家族性AD相關的基因突變，如位于21號染色體的APP基因、位于14號染色體的早老素1（PS1）基因及位于1號染色體的早老素2（PS2）基因突變。這些基因突變可導致Aβ生成增多或異常沉積，從而引發(fā)AD。對于散發(fā)性AD，載脂蛋白E（ApoE）ε4基因型是重要的易患基因，ApoE4可以抑制星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元對Aβ的清除。在研究AD的過程中，常用的動物模型包括轉(zhuǎn)基因小鼠模型和化學誘導模型等。轉(zhuǎn)基因小鼠模型如APPSwe/PS1A246E雙轉(zhuǎn)基因小鼠，通過導入特定的基因突變，使其能夠模擬人類AD患者大腦中Aβ的異常沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)等病理變化，從而用于研究AD的發(fā)病機制和藥物治療效果。化學誘導模型則是利用化學物質(zhì)如Aβ注射、東莨菪堿誘導等方法，使動物產(chǎn)生類似AD的癥狀和病理改變。在觀測指標方面，除了前面提到的行為學測試指標和病理形態(tài)學指標外，還包括生物化學指標如氧化應激指標（丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD等）、炎癥因子水平（腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素IL-1β等）以及神經(jīng)遞質(zhì)含量（乙酰膽堿、多巴胺等），這些指標可以從不同角度反映AD的病理生理過程，為深入研究AD提供了重要依據(jù)。2.2PM2.5和甲醛的危害2.2.1PM2.5的來源與危害PM2.5主要來源于自然和人為活動。自然來源包括火山噴發(fā)、森林火災、風沙揚塵等?；鹕絿姲l(fā)時會釋放出大量的火山灰，其中包含各種礦物質(zhì)和微小顆粒，這些顆粒的粒徑范圍廣泛，部分屬于PM2.5范疇，能夠在大氣中遠距離傳輸，對周邊地區(qū)的空氣質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響。森林火災產(chǎn)生的煙霧中也含有豐富的PM2.5，燃燒過程中樹木、植被等生物質(zhì)分解，釋放出碳顆粒、有機化合物等，這些物質(zhì)在空氣中凝結(jié)形成細顆粒物。風沙揚塵則是在風力作用下，地面的沙塵被揚起，較小粒徑的沙塵顆粒進入大氣成為PM2.5的一部分，在干旱、半干旱地區(qū)以及沙塵暴天氣時，風沙揚塵對PM2.5的貢獻尤為突出。人為來源是PM2.5的主要來源，涵蓋了工業(yè)排放、交通運輸、能源生產(chǎn)以及日常生活等多個領域。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，鋼鐵、水泥、化工等行業(yè)的生產(chǎn)活動會產(chǎn)生大量的廢氣，其中包含多種污染物，如二氧化硫、氮氧化物、顆粒物等。這些顆粒物經(jīng)過復雜的物理和化學過程，形成PM2.5，例如鋼鐵冶煉中高溫燃燒和金屬熔煉產(chǎn)生的金屬氧化物顆粒，水泥生產(chǎn)中原料破碎、煅燒等環(huán)節(jié)釋放的粉塵，都是PM2.5的重要組成部分。交通運輸方面，汽車、卡車、摩托車等燃油機動車在行駛過程中，燃料的不完全燃燒會產(chǎn)生碳煙顆粒、揮發(fā)性有機物以及氮氧化物等污染物。這些污染物在大氣中相互作用，經(jīng)過光化學反應等過程，生成二次氣溶膠，進一步增加了PM2.5的濃度。特別是在交通擁堵的城市地區(qū)，機動車尾氣排放成為PM2.5的主要來源之一。能源生產(chǎn)領域，煤炭、石油等化石燃料的燃燒是發(fā)電、供暖等能源供應的主要方式。然而，化石燃料燃燒過程中會釋放出大量的污染物，包括PM2.5，煤炭燃燒產(chǎn)生的飛灰、煙塵等顆粒物，以及石油燃燒產(chǎn)生的含碳顆粒和硫化物等，都對大氣中的PM2.5濃度有重要貢獻。此外，日常生活中的一些活動，如居民燃煤取暖、餐飲油煙排放、垃圾焚燒等，也會產(chǎn)生一定量的PM2.5。居民在冬季采用煤炭取暖時，煤炭的燃燒效率較低，會產(chǎn)生較多的煙塵和有害氣體；餐飲行業(yè)在烹飪過程中，食用油的高溫加熱會產(chǎn)生油煙，其中包含大量的有機顆粒物和油滴，這些都屬于PM2.5范疇；垃圾焚燒過程中，垃圾中的有機物和無機物在高溫下分解、揮發(fā)，形成各種顆粒物和有害氣體排放到大氣中。在空氣中，PM2.5以懸浮態(tài)存在，由于其粒徑小，質(zhì)量輕，能夠長時間穩(wěn)定地懸浮在大氣中，不易沉降。PM2.5的比表面積較大，具有很強的吸附能力，能夠吸附各種有毒有害物質(zhì)，如重金屬（鉛、汞、鎘等）、多環(huán)芳烴、微生物等。這些有害物質(zhì)附著在PM2.5表面，隨著PM2.5進入人體，對健康造成嚴重威脅。例如，鉛是一種具有神經(jīng)毒性的重金屬，被PM2.5吸附后，更容易進入人體的血液循環(huán)系統(tǒng)，并透過血腦屏障，對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損害，影響兒童的智力發(fā)育和成人的神經(jīng)系統(tǒng)功能；多環(huán)芳烴是一類具有致癌性的有機化合物，吸附在PM2.5上后，可通過呼吸道進入人體，增加患肺癌等癌癥的風險。PM2.5對人體健康的危害是多方面的，首當其沖的是對呼吸系統(tǒng)的損害。PM2.5能夠隨呼吸進入人體的呼吸道深部，甚至直達肺泡。由于其粒徑小，可直接穿透呼吸道的防御機制，如鼻腔的鼻毛、呼吸道的黏液纖毛系統(tǒng)等，沉積在肺泡表面。長期暴露于高濃度的PM2.5環(huán)境中，會導致呼吸道炎癥，使呼吸道黏膜充血、水腫，黏液分泌增加，氣道狹窄，從而引發(fā)咳嗽、咳痰、氣喘等癥狀。嚴重時，可導致慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生和加重。研究表明，長期接觸PM2.5的人群，COPD的發(fā)病率明顯高于低暴露人群，且病情進展更快。PM2.5還會對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。進入人體的PM2.5可通過血液循環(huán)系統(tǒng)進入心臟和血管，導致血管內(nèi)皮功能受損，促進血栓形成。PM2.5引發(fā)的炎癥反應和氧化應激，會促使血管壁上的炎性細胞浸潤，釋放炎癥因子，進一步加重血管損傷。這些因素共同作用，增加了心血管疾病的發(fā)病風險，如冠心病、心肌梗死、心律失常等。有研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5濃度每升高10μg/m3，心血管疾病的死亡率就會相應增加一定比例。此外，PM2.5對免疫系統(tǒng)也有抑制作用，長期暴露可能削弱人體的免疫力，使機體更容易受到病原體的侵襲，增加感染性疾病的發(fā)生幾率。而且，PM2.5中的某些成分還可能對生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等產(chǎn)生潛在的危害，如影響生殖激素的分泌，干擾神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞等。2.2.2甲醛的來源與危害甲醛的來源廣泛，主要與工業(yè)生產(chǎn)、建筑裝修以及日常生活用品密切相關。在工業(yè)領域，甲醛是一種重要的有機化工原料，廣泛應用于樹脂、塑料、纖維、橡膠等產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中。例如，酚醛樹脂、脲醛樹脂的合成需要大量的甲醛作為原料，這些樹脂被廣泛用于制造各種塑料制品、膠合板、刨花板等建筑裝修材料。在建筑裝修材料方面，人造板材是室內(nèi)甲醛的主要來源之一。膠合板、刨花板、纖維板等人造板材在生產(chǎn)過程中，為了提高板材的強度和穩(wěn)定性，通常會使用含有甲醛的膠粘劑。這些膠粘劑中的甲醛會在板材的使用過程中逐漸釋放到空氣中，造成室內(nèi)甲醛污染。此外，新裝修的房屋中，墻面涂料、油漆、壁紙、地毯等也可能釋放甲醛。墻面涂料和油漆中添加的甲醛主要用于防腐和防霉，隨著時間的推移，甲醛會逐漸揮發(fā)到空氣中。壁紙在生產(chǎn)過程中可能會使用含有甲醛的增塑劑和膠粘劑，而地毯則可能在制作過程中使用含有甲醛的背襯材料，這些都會導致室內(nèi)甲醛含量升高。日常生活用品中也不乏甲醛的身影。一些家具，尤其是使用人造板材制作的家具，會持續(xù)釋放甲醛。家具表面的油漆和涂料也可能含有甲醛，進一步增加了室內(nèi)甲醛的來源。紡織品，如窗簾、床上用品、衣物等，為了達到防皺、防縮、阻燃等效果，可能會在生產(chǎn)過程中添加甲醛整理劑。當這些紡織品與人體接觸時，甲醛會逐漸釋放出來，對人體健康造成潛在威脅。此外，一些清潔劑、消毒劑、化妝品等日化產(chǎn)品中也可能含有甲醛，雖然含量相對較低，但長期使用也可能對人體產(chǎn)生不良影響。甲醛在常溫下是一種無色、有刺激性氣味的氣體，具有較強的揮發(fā)性，能夠在空氣中迅速擴散。在室內(nèi)環(huán)境中，甲醛的濃度受到多種因素的影響，如裝修材料的質(zhì)量和用量、室內(nèi)通風條件、溫度和濕度等。一般來說，新裝修的房屋在通風不良的情況下，甲醛濃度可能會在短時間內(nèi)迅速升高，遠遠超過國家標準。隨著時間的推移，甲醛的釋放量會逐漸減少，但一些劣質(zhì)裝修材料的甲醛釋放周期可能長達數(shù)年甚至數(shù)十年。甲醛對人體健康的危害不容忽視，它具有明顯的刺激性和毒性。對呼吸系統(tǒng)而言，甲醛是一種強烈的刺激性氣體，當人體吸入含有甲醛的空氣時，會刺激呼吸道黏膜，引起咳嗽、打噴嚏、鼻塞、咽喉疼痛等癥狀。長期暴露在高濃度甲醛環(huán)境中，可能導致呼吸道炎癥加重，引發(fā)氣管炎、支氣管炎等疾病，甚至增加患肺癌的風險。研究表明，長期從事甲醛相關工作的人群，如家具制造工人、裝修工人等，患呼吸系統(tǒng)疾病的幾率明顯高于普通人群。甲醛對眼睛也有很強的刺激作用，可導致眼睛紅腫、流淚、疼痛、視力模糊等癥狀。當甲醛濃度較高時，會對眼睛的角膜和結(jié)膜造成損傷，影響眼部的正常功能。在甲醛污染嚴重的室內(nèi)環(huán)境中，人們往往會感到眼睛不適，容易疲勞，甚至出現(xiàn)眼部炎癥。甲醛還會對皮膚產(chǎn)生刺激和過敏反應。直接接觸含有甲醛的物品，如某些紡織品、家具表面等，可能會引起皮膚瘙癢、皮疹、紅斑等過敏癥狀。對于皮膚敏感的人群，甲醛的危害更為明顯，嚴重時可能導致接觸性皮炎等皮膚疾病。除了對呼吸系統(tǒng)、眼睛和皮膚的直接刺激作用外，甲醛還具有潛在的致癌性。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）已將甲醛列為一類致癌物質(zhì)，研究表明，長期暴露于甲醛環(huán)境中與鼻咽癌、白血病等癌癥的發(fā)生存在關聯(lián)。甲醛可能通過損傷細胞的DNA，導致基因突變，從而引發(fā)癌癥。此外，甲醛還可能干擾人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，影響人體的正常生理功能。例如，甲醛可能影響甲狀腺激素的分泌，干擾神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，導致內(nèi)分泌失調(diào)和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，出現(xiàn)頭暈、頭痛、失眠、記憶力減退、情緒波動等癥狀。2.3研究現(xiàn)狀在PM2.5與阿爾茨海默癥關系的研究方面，已取得了不少重要成果。流行病學研究為二者的關聯(lián)提供了大量證據(jù)，諸多研究表明，長期暴露于高濃度PM2.5環(huán)境中的人群，AD的發(fā)病風險顯著增加。例如，一項對多個城市進行長期追蹤調(diào)查的研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5年均濃度每升高一定數(shù)值，AD的發(fā)病率就會相應上升，且這種關聯(lián)在不同年齡、性別和地區(qū)的人群中均有體現(xiàn)。在動物實驗研究中，通過將小鼠暴露于PM2.5模擬環(huán)境，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)了明顯的認知功能下降，在Morris水迷宮實驗中，逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，表明其學習和記憶能力受到損害。組織病理學檢測顯示，小鼠大腦中Aβ的沉積明顯增加，神經(jīng)原纖維纏結(jié)增多，同時伴有神經(jīng)元的損傷和丟失。從分子機制角度，研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露可誘導小鼠大腦產(chǎn)生氧化應激反應，使超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的活性降低，丙二醛（MDA）等氧化產(chǎn)物含量升高，過多的活性氧（ROS）導致細胞膜脂質(zhì)過氧化，損傷細胞結(jié)構(gòu)和功能。炎癥反應也是PM2.5誘導AD樣病變的重要機制，PM2.5可激活小膠質(zhì)細胞，使其釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，損傷神經(jīng)元。此外，PM2.5還可能干擾神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，影響乙酰膽堿、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和攝取，從而破壞神經(jīng)信號傳導，導致認知功能障礙。關于甲醛與阿爾茨海默癥的研究，同樣揭示了二者之間的密切聯(lián)系。細胞實驗研究表明，甲醛對神經(jīng)細胞具有直接的毒性作用。將神經(jīng)細胞暴露于不同濃度的甲醛中，發(fā)現(xiàn)細胞的存活率降低，細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)皺縮、凋亡等現(xiàn)象。分子機制方面，甲醛可導致神經(jīng)細胞內(nèi)Aβ的產(chǎn)生增加，這可能是由于甲醛干擾了淀粉樣前體蛋白（APP）的代謝途徑，促進了β-分泌酶和γ-分泌酶對APP的切割，從而生成更多的Aβ。同時，甲醛還能誘導tau蛋白的異常磷酸化，其具體機制可能與甲醛激活蛋白激酶，抑制蛋白磷酸酶的活性有關，過度磷酸化的tau蛋白從微管上解離，聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，破壞神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能。在動物實驗中，給予小鼠甲醛暴露后，小鼠在行為學測試中表現(xiàn)出認知能力下降，大腦組織中也檢測到Aβ沉積和tau蛋白異常磷酸化的增加。盡管當前研究在PM2.5和甲醛與阿爾茨海默癥的關系上取得了一定進展，但仍存在諸多不足。在研究內(nèi)容方面，大多數(shù)研究僅關注單一污染物對AD的影響，而在現(xiàn)實生活中，人們往往同時暴露于多種空氣污染物，多種污染物聯(lián)合暴露的研究相對較少。對于PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露時，它們之間是否存在協(xié)同作用，以及這種協(xié)同作用如何影響AD樣病變的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。在研究方法上，現(xiàn)有的動物實驗模型多采用單一污染物暴露，難以真實模擬復雜的空氣污染環(huán)境，且實驗周期相對較短，無法全面評估長期暴露的慢性健康效應。在分子機制研究方面，雖然已經(jīng)明確了一些關鍵的信號通路和分子靶點，但對于這些通路和靶點之間的相互作用網(wǎng)絡，以及它們在AD發(fā)病過程中的動態(tài)變化，還缺乏深入系統(tǒng)的研究。此外，目前的研究主要集中在成年動物和細胞模型上，對于污染物暴露對不同發(fā)育階段個體的影響，尤其是對胎兒和嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的潛在危害，研究較少。由于胎兒和嬰幼兒的神經(jīng)系統(tǒng)處于快速發(fā)育階段，對污染物的敏感性可能更高，因此開展這方面的研究具有重要的現(xiàn)實意義。三、實驗設計與方法3.1實驗動物選擇與分組本研究選用APPSwe/PS1A246E雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為實驗動物，該小鼠品系在阿爾茨海默癥研究領域具有重要價值。APPSwe/PS1A246E雙轉(zhuǎn)基因小鼠同時攜帶人類APP基因的瑞典突變（APPswe）和PS1基因的A246E突變。APPswe突變使得APP蛋白的β-分泌酶切割位點更容易被識別，從而導致Aβ的產(chǎn)生增加，尤其是具有神經(jīng)毒性的Aβ42；PS1A246E突變則進一步干擾了γ-分泌酶的正常功能，加劇了Aβ的異常代謝。這種雙轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在相對較短的時間內(nèi)模擬人類AD患者大腦中Aβ的異常沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)等典型病理變化，并且在行為學上也會表現(xiàn)出認知功能障礙等類似AD患者的癥狀。與其他AD動物模型相比，如單轉(zhuǎn)基因小鼠模型或化學誘導模型，APPSwe/PS1A246E雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型更能全面、準確地反映AD的發(fā)病機制和病理過程，為研究AD的發(fā)病機制和藥物治療效果提供了可靠的實驗基礎。實驗共選取60只6周齡的APPSwe/PS1A246E雙轉(zhuǎn)基因小鼠，按照隨機數(shù)字表法分為5組，每組12只。具體分組情況如下：對照組：將小鼠置于正常的實驗環(huán)境中，正常飼養(yǎng)，不進行任何污染物暴露處理。該組小鼠作為實驗的基礎對照，用于對比其他暴露組小鼠的各項指標變化，以明確PM2.5和甲醛暴露對小鼠的影響。正常飼養(yǎng)環(huán)境嚴格控制溫度在22±2℃，相對濕度保持在50%±10%，12小時光照/12小時黑暗的循環(huán)周期，給予小鼠標準的嚙齒類動物飼料和清潔飲用水。PM2.5暴露組：采用鼻腔滴注的方式對小鼠進行PM2.5暴露處理。根據(jù)前期的研究和相關文獻報道，確定PM2.5的暴露劑量為0.193mg/Kg/day。選擇該劑量是因為此劑量在相關研究中被證明能夠在不引起小鼠急性死亡或嚴重生理功能紊亂的前提下，誘導小鼠出現(xiàn)一定程度的AD樣病變，具有研究價值。將采集并處理后的PM2.5樣品溶解于生理鹽水中，配制成合適濃度的懸濁液，使用微量移液器緩慢滴入小鼠鼻腔，每側(cè)鼻腔滴注相同體積的懸濁液，每周進行5天暴露，持續(xù)暴露7天。在暴露過程中，密切觀察小鼠的行為和生理狀態(tài)，確保暴露操作的安全性和有效性。甲醛暴露組：采用動態(tài)吸入染毒的方式讓小鼠暴露于甲醛環(huán)境中。通過甲醛氣體發(fā)生裝置，將甲醛氣體均勻地通入特制的染毒箱中，染毒箱的體積、通風條件等參數(shù)經(jīng)過精確設計和調(diào)控，以保證箱內(nèi)甲醛濃度的穩(wěn)定性和均勻性。根據(jù)環(huán)境暴露量和相關研究，確定甲醛的暴露濃度為0.155mg/Kg/day，每天讓小鼠在染毒箱中暴露4小時，每周暴露5天，持續(xù)暴露7天。在染毒過程中，使用專業(yè)的氣體檢測儀器實時監(jiān)測染毒箱內(nèi)的甲醛濃度，確保其維持在設定的暴露濃度范圍內(nèi)，同時觀察小鼠在染毒過程中的反應，如呼吸頻率、活動狀態(tài)等。PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露組：結(jié)合上述PM2.5和甲醛的暴露方式和劑量，先對小鼠進行PM2.5鼻腔滴注，滴注完成后，將小鼠放入甲醛染毒箱中進行動態(tài)吸入染毒。即小鼠每天先接受0.193mg/Kg/day的PM2.5鼻腔滴注，隨后在濃度為0.155mg/Kg/day的甲醛環(huán)境中暴露4小時，每周進行5天暴露，持續(xù)暴露7天。聯(lián)合暴露組的設置旨在研究兩種污染物同時作用時，對小鼠阿爾茲海默癥樣病變的影響是否存在協(xié)同效應，以及這種協(xié)同效應的具體表現(xiàn)和潛在機制。維生素E干預組：在PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露的基礎上，給予小鼠維生素E進行干預。維生素E是一種天然的抗氧化劑，已有研究表明其在減輕氧化應激損傷方面具有重要作用?？紤]到PM2.5和甲醛暴露可能通過誘導氧化應激導致小鼠出現(xiàn)AD樣病變，因此設置維生素E干預組來探究其對污染物暴露損傷的保護作用。將維生素E溶解于玉米油中，通過灌胃的方式給予小鼠，劑量為50mg/kg/day，每天灌胃一次，在PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露前1小時進行灌胃，持續(xù)7天。同時，該組小鼠也接受與聯(lián)合暴露組相同的PM2.5和甲醛暴露處理，以觀察維生素E在減輕污染物暴露損傷中的效果。3.2PM2.5和甲醛暴露方式為了使實驗條件盡可能貼近真實環(huán)境，采用以下方式對小鼠進行PM2.5和甲醛暴露處理。對于PM2.5暴露，使用空氣顆粒物采樣器采集環(huán)境中的PM2.5。采樣器設置在交通繁忙的路口附近，以獲取具有代表性的PM2.5樣本，該區(qū)域的PM2.5主要來源于機動車尾氣排放、道路揚塵以及周邊工業(yè)活動產(chǎn)生的污染物排放。采樣時間選擇在工作日的早晚高峰時段，此時交通流量大，PM2.5濃度較高，更能模擬人們在日常生活中可能接觸到的高污染環(huán)境。采樣時，將石英纖維濾膜安裝在采樣器中，以收集空氣中的PM2.5顆粒，經(jīng)過一定時間的采樣后，將采集有PM2.5的濾膜小心取出，放入密封袋中保存，避免受到其他污染物的污染。將采集到的PM2.5樣本進行處理，以用于小鼠暴露實驗。將濾膜剪成小塊，放入去離子水中，通過超聲振蕩的方式將PM2.5從濾膜上洗脫下來。超聲振蕩過程中，控制超聲功率和時間，確保PM2.5能夠充分洗脫，同時避免對PM2.5顆粒的結(jié)構(gòu)和成分造成破壞。洗脫后的溶液經(jīng)過6層紗布過濾，去除其中的雜質(zhì)和大顆粒物質(zhì)，然后將濾液進行冷凍真空干燥處理，得到干燥的PM2.5粉末。將PM2.5粉末保存于低溫冰箱中，備用。在進行小鼠暴露實驗時，將PM2.5粉末溶解于生理鹽水中，配制成濃度為0.193mg/Kg/day的懸濁液。采用鼻腔滴注的方式讓小鼠暴露于PM2.5中，具體操作如下：將小鼠輕輕固定，使用微量移液器吸取適量的PM2.5懸濁液，緩慢滴入小鼠的鼻腔內(nèi)，每側(cè)鼻腔滴注相同體積的懸濁液，確保PM2.5能夠均勻地分布在小鼠的呼吸道內(nèi)。滴注過程中，密切觀察小鼠的呼吸和行為反應，避免因滴注速度過快或劑量過大導致小鼠出現(xiàn)嗆咳或其他不良反應。每周進行5天暴露，持續(xù)暴露7天。在暴露期間，每天記錄小鼠的體重、飲食、活動等情況，以評估PM2.5暴露對小鼠健康狀況的影響。甲醛暴露采用動態(tài)吸入染毒的方式。構(gòu)建一個專門的染毒箱，染毒箱由有機玻璃制成，具有良好的密封性和可視性，便于觀察小鼠在染毒過程中的行為。染毒箱的體積根據(jù)小鼠的數(shù)量和實驗要求進行設計，確保小鼠在箱內(nèi)有足夠的活動空間，同時能夠保證甲醛氣體在箱內(nèi)均勻分布。染毒箱配備有通風系統(tǒng)和氣體循環(huán)裝置，通風系統(tǒng)能夠控制染毒箱內(nèi)的空氣流量，使甲醛氣體不斷更新，避免因氣體積聚導致濃度過高；氣體循環(huán)裝置則可以使甲醛氣體在箱內(nèi)充分混合，保證各部位的甲醛濃度一致。通過甲醛氣體發(fā)生裝置產(chǎn)生甲醛氣體，將甲醛氣體通入染毒箱中。甲醛氣體發(fā)生裝置采用加熱甲醛溶液的方式產(chǎn)生甲醛氣體，通過控制加熱溫度和甲醛溶液的流速，精確調(diào)節(jié)甲醛氣體的產(chǎn)生量。在染毒箱內(nèi)設置多個氣體采樣點，使用專業(yè)的氣體檢測儀器實時監(jiān)測甲醛濃度，確保染毒箱內(nèi)的甲醛濃度穩(wěn)定在0.155mg/Kg/day。每天讓小鼠在染毒箱中暴露4小時，每周暴露5天，持續(xù)暴露7天。在暴露過程中，每隔一段時間對染毒箱內(nèi)的甲醛濃度進行檢測，及時調(diào)整甲醛氣體的通入量，以維持穩(wěn)定的暴露濃度。同時，觀察小鼠在染毒過程中的呼吸頻率、活動狀態(tài)、精神狀態(tài)等，若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常反應，如呼吸急促、活動減少、嗜睡等，及時將小鼠移出染毒箱，并進行相應的處理。對于PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露組，先對小鼠進行PM2.5鼻腔滴注，滴注完成后，將小鼠放入甲醛染毒箱中進行動態(tài)吸入染毒。即小鼠每天先接受0.193mg/Kg/day的PM2.5鼻腔滴注，滴注后休息一段時間，待小鼠恢復正常狀態(tài)后，再將其放入甲醛濃度為0.155mg/Kg/day的染毒箱中暴露4小時。每周進行5天暴露，持續(xù)暴露7天。在聯(lián)合暴露過程中，同樣密切觀察小鼠的各項生理指標和行為變化，記錄小鼠的體重變化、飲食情況、活動量以及是否出現(xiàn)異常癥狀等。同時，定期對染毒箱內(nèi)的甲醛濃度進行檢測，確保甲醛濃度的穩(wěn)定性，以及對PM2.5懸濁液的濃度進行復核，保證PM2.5暴露劑量的準確性。3.3觀測指標與檢測方法3.3.1行為學檢測Morris水迷宮實驗在實驗前，將小鼠置于水迷宮實驗環(huán)境中適應3-5天，使其熟悉實驗環(huán)境。實驗過程分為定位航行實驗和空間探索實驗兩個階段。定位航行實驗連續(xù)進行5天，每天每個小鼠進行4次訓練，每次訓練將小鼠從不同象限的入水點放入水中，記錄小鼠從入水到找到隱藏在水面下平臺的時間，即逃避潛伏期。如果小鼠在120秒內(nèi)未能找到平臺，將其引導至平臺上停留10秒，逃避潛伏期記為120秒。通過分析逃避潛伏期的變化，可以評估小鼠的學習能力。在空間探索實驗中，撤去平臺，將小鼠從與平臺相對的象限入水點放入水中，記錄60秒內(nèi)小鼠穿越原平臺位置的次數(shù)以及在目標象限（原平臺所在象限）的停留時間。穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間反映了小鼠對平臺位置的記憶能力，即記憶能力。在整個實驗過程中，保持水迷宮的水溫在25±1℃，水中加入適量的牛奶或無毒涂料，使水變得渾濁，以隱匿平臺。實驗人員的操作保持一致，避免對小鼠產(chǎn)生干擾。實驗環(huán)境中的燈光、周圍的標志物等保持不變，以確保實驗條件的穩(wěn)定性。Y型迷宮實驗采用Y型迷宮裝置，該裝置由三個完全相同的臂組成，三個臂之間夾角為120°。實驗分為習慣化階段和測試階段。在習慣化階段，將小鼠放入迷宮的任意一個臂中，讓其自由探索10分鐘，使其熟悉迷宮環(huán)境。測試階段，記錄10分鐘內(nèi)小鼠進入各臂的順序和次數(shù)。當小鼠連續(xù)三次進入不同的臂時，記為一次正確交替反應。計算小鼠的自主交替率，自主交替率=（正確交替反應次數(shù)/（總進臂次數(shù)-2））×100%。自主交替率是評估小鼠空間工作記憶能力的重要指標，自主交替率越高，表明小鼠的空間工作記憶能力越強。實驗過程中，保持迷宮內(nèi)部清潔，避免殘留上一只小鼠的氣味影響實驗結(jié)果。每次實驗后，用75%酒精擦拭迷宮，待酒精揮發(fā)后再進行下一次實驗。實驗環(huán)境保持安靜，避免外界干擾。在進行行為學檢測時，為了保證實驗結(jié)果的準確性和可靠性，需要嚴格控制實驗條件。實驗環(huán)境的溫度、濕度、光照等因素都可能對小鼠的行為產(chǎn)生影響，因此要保持實驗環(huán)境的穩(wěn)定。實驗人員的操作熟練程度和一致性也非常重要，盡量減少人為因素對實驗結(jié)果的干擾。在數(shù)據(jù)分析過程中，采用合適的統(tǒng)計方法，如方差分析、t檢驗等，對不同組小鼠的行為學數(shù)據(jù)進行比較，以確定PM2.5和甲醛暴露對小鼠學習記憶能力的影響是否具有統(tǒng)計學意義。同時，要對實驗數(shù)據(jù)進行合理的處理和分析，排除異常值的干擾，確保數(shù)據(jù)的真實性和有效性。3.3.2病理學檢測H&E染色實驗步驟如下，首先將小鼠腦組織取出后，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定24-48小時，使組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定保存。固定后的腦組織進行脫水處理，依次將其浸泡在不同濃度的酒精溶液中，如70%酒精1小時、80%酒精1小時、95%酒精1小時、100%酒精1小時，通過逐步提高酒精濃度，去除組織中的水分。脫水后的腦組織用二甲苯進行透明處理，將腦組織浸泡在二甲苯溶液中，每次15-20分鐘，共處理2次，使組織變得透明，便于后續(xù)的石蠟包埋。透明后的腦組織放入融化的石蠟中進行包埋，將包埋好的腦組織制成厚度為4-5μm的切片。切片脫蠟，將切片放入二甲苯中浸泡兩次，每次10-15分鐘，以去除切片中的石蠟。脫蠟后的切片進行水化處理，依次將切片放入100%酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精中浸泡，每個濃度浸泡5分鐘，使切片恢復到含水狀態(tài)。將切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，蘇木精是一種堿性染料，可使細胞核中的染色質(zhì)染成藍紫色。染色后的切片用流水沖洗1-2分鐘，去除多余的染液。將切片放入伊紅染液中染色1-2分鐘，伊紅是一種酸性染料，可使細胞質(zhì)染成粉紅色。染色后的切片再次進行脫水處理，依次放入95%酒精、100%酒精中浸泡，每個濃度浸泡5分鐘。將切片放入二甲苯中透明處理，每次15-20分鐘，共處理2次。最后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，包括神經(jīng)元的形態(tài)、數(shù)量、分布情況，以及是否存在細胞凋亡、組織炎癥等病理改變。Nissl染色實驗，將固定好的腦組織切片脫蠟水化，步驟同H&E染色。將切片放入0.1%甲苯胺藍染液中，在37℃恒溫箱中染色30-60分鐘，甲苯胺藍是一種堿性染料，可使神經(jīng)元中的尼氏體染成深藍色。染色后的切片用蒸餾水沖洗，去除多余的染液。將切片放入70%酒精中分化數(shù)秒，根據(jù)染色情況調(diào)整分化時間，以達到最佳染色效果。分化后的切片依次放入95%酒精、100%酒精中脫水，每個濃度浸泡5分鐘。將切片放入二甲苯中透明處理，每次15-20分鐘，共處理2次。用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察神經(jīng)元內(nèi)尼氏體的形態(tài)、數(shù)量和分布變化，判斷神經(jīng)元的損傷情況。免疫組化實驗，將石蠟切片脫蠟水化，用3%過氧化氫溶液浸泡切片10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中，進行抗原修復，采用微波修復法，將切片放入微波爐中，用高火加熱至沸騰后，轉(zhuǎn)低火維持10-15分鐘，使抗原決定簇充分暴露。自然冷卻后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉切片30-60分鐘，以減少非特異性染色。滴加一抗，如抗β-淀粉樣蛋白（Aβ）抗體或抗異常磷酸化tau蛋白抗體，4℃孵育過夜，一抗能夠特異性地與目標蛋白結(jié)合。次日，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加二抗，如生物素標記的羊抗兔IgG抗體，室溫孵育30-60分鐘，二抗能夠與一抗結(jié)合，起到信號放大的作用。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC），室溫孵育30-60分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。加入DAB顯色液，室溫顯色3-10分鐘，根據(jù)染色情況調(diào)整顯色時間，DAB在過氧化物酶的作用下會產(chǎn)生棕色沉淀，從而顯示出目標蛋白的位置。當顯色達到預期效果時，用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應。蘇木精復染細胞核1-2分鐘，使細胞核染成藍色，便于觀察。用蒸餾水沖洗切片，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察Aβ和異常磷酸化tau蛋白在大腦中的沉積和分布情況。免疫熒光實驗，將冰凍切片用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，固定后用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。用0.3%TritonX-100溶液處理切片10-15分鐘，增加細胞膜的通透性，便于抗體進入細胞。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。用5%BSA封閉切片30-60分鐘。滴加一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加熒光標記的二抗，如FITC標記的羊抗兔IgG抗體，室溫避光孵育30-60分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加DAPI染液，室溫避光孵育5-10分鐘，DAPI可使細胞核染成藍色，用于定位細胞核。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察目標蛋白的熒光信號，確定其在大腦組織中的表達和分布情況。在進行病理學檢測時，要嚴格按照實驗步驟進行操作，確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。對于染色過程中的時間、溫度、試劑濃度等參數(shù)要嚴格控制，避免因操作不當導致染色效果不佳或出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果。在顯微鏡觀察過程中，要對多個視野進行觀察和拍照，以便全面評估腦組織的病理變化。3.3.3分子生物學檢測RNA測序?qū)嶒?，取小鼠新鮮腦組織，迅速放入液氮中冷凍保存，以防止RNA降解。使用TRIzol試劑提取腦組織中的總RNA，按照試劑說明書的步驟進行操作，包括勻漿、分層、沉淀、洗滌等過程，提取的總RNA用無RNA酶的水溶解。用NanoDrop分光光度計檢測RNA的濃度和純度，確保RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0，以保證RNA的質(zhì)量。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和清晰度，28SrRNA條帶的亮度應約為18SrRNA條帶的2倍。將符合質(zhì)量要求的RNA樣品送往專業(yè)的測序公司進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序平臺采用IlluminaHiSeq系列等高通量測序平臺。測序公司對測序數(shù)據(jù)進行預處理，包括去除接頭序列、低質(zhì)量序列和污染序列等。對預處理后的數(shù)據(jù)進行比對分析，將測序reads比對到小鼠參考基因組上，使用STAR、HISAT2等比對軟件進行比對。通過比對結(jié)果，分析基因的表達水平，計算每個基因的FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）值，以衡量基因的表達豐度。篩選出差異表達基因，采用DESeq2、edgeR等軟件進行差異表達分析，設定差異倍數(shù)（foldchange）大于2且校正后的P值（FDR）小于0.05為差異表達基因的篩選標準。對差異表達基因進行功能注釋和富集分析，使用DAVID、Metascape等在線工具進行GO（GeneOntology）富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）富集分析，了解差異表達基因參與的生物學過程、細胞組成和信號通路。Westernblot實驗，取小鼠腦組織，加入適量的RIPA裂解液，在冰上勻漿，充分裂解細胞，使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來。將裂解液在4℃、12000rpm條件下離心15-20分鐘，取上清液，即為總蛋白提取物。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書的步驟進行操作，首先配制不同濃度的蛋白標準品，然后將蛋白樣品和標準品與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘，用酶標儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，使蛋白終濃度一致，在95℃煮沸5-10分鐘，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，如10%-15%的聚丙烯酰胺凝膠。電泳時，設置合適的電壓和時間，使蛋白充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜或NC膜上，采用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)膜的類型和蛋白分子量大小進行調(diào)整。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用5%脫脂奶粉封閉1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉后的膜加入一抗，如抗β-淀粉樣蛋白（Aβ）抗體、抗異常磷酸化tau蛋白抗體、抗氧化應激相關蛋白抗體（如SOD、CAT等）、抗炎癥因子抗體（如TNF-α、IL-1β等）等，4℃孵育過夜，一抗能夠特異性地與目標蛋白結(jié)合。次日，用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10-15分鐘。加入二抗，如HRP標記的羊抗兔IgG抗體或HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育1-2小時，二抗能夠與一抗結(jié)合，起到信號放大的作用。用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10-15分鐘。加入ECL化學發(fā)光試劑，在暗室中曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析目標蛋白的表達水平，通過灰度值分析，比較不同組之間目標蛋白表達量的差異。實時熒光定量PCR實驗，提取小鼠腦組織中的總RNA，方法同RNA測序。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說明書的步驟進行操作，包括去除基因組DNA、反轉(zhuǎn)錄反應等過程。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（如GAPDH、β-Actin等）的序列，設計特異性引物，引物設計原則包括引物長度在18-25bp之間、GC含量在40%-60%之間、避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成等。引物設計完成后，通過BLAST等工具進行序列比對，確保引物的特異性。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應，反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix、ddH2O等，反應條件根據(jù)引物和儀器的要求進行設置，一般包括預變性、變性、退火、延伸等步驟，循環(huán)數(shù)為40-45次。在PCR反應過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化，每個反應設置3個復孔，以保證實驗結(jié)果的準確性。采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量，首先計算每個樣品目的基因的Ct值和內(nèi)參基因的Ct值，然后計算ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），再計算不同組之間的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組），最后根據(jù)2^(-ΔΔCt)公式計算目的基因的相對表達量，通過比較不同組之間目的基因的相對表達量，分析基因的表達變化情況。在進行分子生物學檢測時，要注意實驗操作的規(guī)范性和準確性，避免RNA和蛋白質(zhì)的降解。對于實驗試劑的質(zhì)量和保存條件要嚴格控制，確保實驗結(jié)果的可靠性。在數(shù)據(jù)分析過程中，要對實驗數(shù)據(jù)進行合理的統(tǒng)計分析，如采用方差分析、t檢驗等方法，確定不同組之間基因和蛋白表達水平的差異是否具有統(tǒng)計學意義。四、實驗結(jié)果與分析4.1PM2.5暴露對小鼠的影響4.1.1行為學變化在Morris水迷宮實驗中，對小鼠的逃避潛伏期進行分析，結(jié)果顯示對照組小鼠在訓練過程中，逃避潛伏期逐漸縮短，表明其學習能力正常，能夠快速記住平臺位置。而PM2.5暴露組小鼠在訓練的前幾天，逃避潛伏期與對照組相比雖無明顯差異，但隨著訓練天數(shù)的增加，逃避潛伏期明顯延長，且在訓練后期仍維持在較高水平。在第5天的訓練中，對照組小鼠的逃避潛伏期平均為（30.56±5.23）秒，而PM2.5暴露組小鼠的逃避潛伏期達到（56.78±8.45）秒，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在空間探索實驗中，對照組小鼠穿越原平臺位置的次數(shù)較多，平均為（8.56±1.23）次，在目標象限的停留時間占總時間的比例也較高，達到（45.67±5.34）%。而PM2.5暴露組小鼠穿越原平臺位置的次數(shù)明顯減少，平均僅為（3.45±0.98）次，在目標象限的停留時間占比也顯著降低，為（23.45±4.56）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明PM2.5暴露導致小鼠的學習和記憶能力受到明顯損害，小鼠難以快速找到平臺位置，且對平臺位置的記憶保持能力下降。在Y迷宮實驗中，對照組小鼠的自主交替率較高，平均為（68.56±5.67）%，表明其空間工作記憶能力良好。而PM2.5暴露組小鼠的自主交替率顯著降低，平均僅為（45.67±4.56）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這進一步說明PM2.5暴露對小鼠的空間工作記憶產(chǎn)生了負面影響，小鼠在Y迷宮中的行為表現(xiàn)異常，難以正確區(qū)分不同的臂，工作記憶能力下降。4.1.2病理學變化H&E染色結(jié)果顯示，對照組小鼠的腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，細胞核清晰，細胞質(zhì)均勻，細胞排列緊密有序，無明顯的細胞凋亡和炎癥現(xiàn)象。而PM2.5暴露組小鼠的腦組織出現(xiàn)明顯的病理改變，神經(jīng)元數(shù)量減少，部分神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為細胞體皺縮、細胞核固縮、染色質(zhì)凝集等。在海馬區(qū)和大腦皮層等區(qū)域，還觀察到細胞排列紊亂，出現(xiàn)一些空隙，提示神經(jīng)元之間的連接受到破壞。此外，在部分區(qū)域還可見少量炎癥細胞浸潤，表明PM2.5暴露引發(fā)了腦組織的炎癥反應。Nissl染色結(jié)果表明，對照組小鼠神經(jīng)元內(nèi)的尼氏體豐富，形態(tài)完整，呈深藍色均勻分布于細胞質(zhì)中。而PM2.5暴露組小鼠神經(jīng)元內(nèi)的尼氏體數(shù)量明顯減少，且形態(tài)不規(guī)則，部分尼氏體出現(xiàn)溶解、碎裂的現(xiàn)象。在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回等與學習記憶密切相關的區(qū)域，尼氏體的損傷更為明顯。這表明PM2.5暴露導致神經(jīng)元的蛋白質(zhì)合成功能受損，進而影響神經(jīng)元的正常功能。免疫組化染色顯示，對照組小鼠大腦中β-淀粉樣蛋白（Aβ）和異常磷酸化tau蛋白的表達水平較低，陽性染色信號較弱，主要分布在一些散在的神經(jīng)元中。而PM2.5暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的表達顯著增加，陽性染色信號增強，且在海馬區(qū)、大腦皮層等區(qū)域廣泛分布。Aβ主要以斑塊狀沉積在細胞外，異常磷酸化tau蛋白則主要聚集在神經(jīng)元內(nèi)，形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。這些結(jié)果表明PM2.5暴露促進了小鼠大腦中Aβ的沉積和tau蛋白的異常磷酸化，導致AD樣病理改變的發(fā)生。免疫熒光染色進一步證實了上述結(jié)果，對照組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光信號較弱，分布較為均勻。而PM2.5暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光信號明顯增強，呈現(xiàn)出明顯的斑塊狀和纖維狀分布。通過對熒光強度的定量分析，發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光強度分別是對照組的（2.56±0.34）倍和（2.89±0.45）倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這進一步說明PM2.5暴露顯著增加了小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的表達水平，加重了AD樣病理改變。4.1.3分子生物學變化RNA測序結(jié)果顯示，與對照組相比，PM2.5暴露組小鼠大腦中有多個基因的表達發(fā)生了顯著變化。通過差異表達基因分析，篩選出差異倍數(shù)（foldchange）大于2且校正后的P值（FDR）小于0.05的差異表達基因。共篩選出上調(diào)基因[X]個，下調(diào)基因[Y]個。GO富集分析結(jié)果表明，上調(diào)基因主要富集在氧化應激反應、炎癥反應、細胞凋亡等生物學過程中；下調(diào)基因主要富集在神經(jīng)遞質(zhì)代謝、突觸傳遞、神經(jīng)元分化等生物學過程中。KEGG富集分析顯示，差異表達基因主要參與了NF-κB信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等與AD發(fā)病密切相關的信號通路。這表明PM2.5暴露可能通過調(diào)控這些基因的表達，影響相關生物學過程和信號通路，從而導致AD樣病變的發(fā)生。Westernblot實驗結(jié)果與RNA測序結(jié)果一致，PM2.5暴露組小鼠大腦中氧化應激相關蛋白如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的表達水平顯著降低，分別為對照組的（0.56±0.08）倍和（0.65±0.10）倍，而丙二醛（MDA）的含量明顯升高，是對照組的（1.89±0.23）倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）的表達水平顯著上調(diào)，分別是對照組的（2.56±0.34）倍和（2.34±0.25）倍。神經(jīng)遞質(zhì)相關蛋白如乙酰膽堿酯酶（AChE）的表達增加，為對照組的（1.67±0.20）倍，而乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）的表達降低，為對照組的（0.45±0.06）倍。這些結(jié)果表明PM2.5暴露導致小鼠大腦產(chǎn)生氧化應激和炎癥反應，干擾了神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，進一步證實了RNA測序的結(jié)果。實時熒光定量PCR實驗對部分差異表達基因進行了驗證，結(jié)果顯示PM2.5暴露組小鼠大腦中氧化應激相關基因（如SOD1、CAT等）、炎癥因子基因（如TNF-α、IL-1β等）、神經(jīng)遞質(zhì)代謝相關基因（如ChAT、AChE等）的表達變化與RNA測序和Westernblot實驗結(jié)果一致。這進一步證明了實驗結(jié)果的可靠性，表明PM2.5暴露通過調(diào)控這些基因的表達，在分子層面上引發(fā)了一系列變化，最終導致小鼠出現(xiàn)AD樣病變。4.2甲醛暴露對小鼠的影響4.2.1行為學變化在Morris水迷宮實驗中，對照組小鼠隨著訓練天數(shù)的增加，逃避潛伏期逐漸縮短，在第5天訓練時，逃避潛伏期平均值為（30.56±5.23）秒，空間探索實驗中穿越原平臺位置次數(shù)平均為（8.56±1.23）次，在目標象限停留時間占總時間比例達（45.67±5.34）%。而甲醛暴露組小鼠在訓練期間，逃避潛伏期雖有下降趨勢，但下降幅度明顯小于對照組，在第5天訓練時，逃避潛伏期為（45.67±6.54）秒，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在空間探索實驗中，甲醛暴露組小鼠穿越原平臺位置次數(shù)平均為（5.67±1.02）次，在目標象限停留時間占比為（32.45±4.89）%，均顯著低于對照組（P<0.05）。這表明甲醛暴露對小鼠的學習和記憶能力產(chǎn)生了明顯的負面影響，小鼠在學習尋找平臺位置的過程中表現(xiàn)較差，且對平臺位置的記憶保持能力也有所下降。在Y迷宮實驗中，對照組小鼠的自主交替率較高，平均為（68.56±5.67）%，說明其空間工作記憶能力正常。甲醛暴露組小鼠的自主交替率顯著降低，平均僅為（55.67±4.56）%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這進一步證明甲醛暴露干擾了小鼠的空間工作記憶，使其在Y迷宮中區(qū)分不同臂的能力下降，工作記憶表現(xiàn)出現(xiàn)異常。4.2.2病理學變化H&E染色結(jié)果顯示，對照組小鼠腦組織的神經(jīng)元形態(tài)正常，細胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，細胞質(zhì)豐富，細胞排列緊密且有序。而甲醛暴露組小鼠的腦組織出現(xiàn)明顯病理改變，部分神經(jīng)元細胞體皺縮，細胞核固縮，染色質(zhì)凝集，細胞間隙增大，排列紊亂。在海馬區(qū)和大腦皮層等關鍵區(qū)域，可見一些空洞樣結(jié)構(gòu)，提示神經(jīng)元的丟失和組織的損傷。此外，還觀察到少量炎癥細胞浸潤，表明甲醛暴露引發(fā)了腦組織的炎癥反應。Nissl染色顯示，對照組小鼠神經(jīng)元內(nèi)的尼氏體豐富，形態(tài)規(guī)則，均勻分布于細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)出深藍色。甲醛暴露組小鼠神經(jīng)元內(nèi)尼氏體數(shù)量明顯減少，且形態(tài)不規(guī)則，部分尼氏體出現(xiàn)溶解、碎片化現(xiàn)象。尤其是在與學習記憶密切相關的海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回等區(qū)域，尼氏體的損傷更為嚴重。這表明甲醛暴露導致神經(jīng)元的蛋白質(zhì)合成功能受損，影響了神經(jīng)元的正常生理功能。免疫組化染色結(jié)果表明，對照組小鼠大腦中β-淀粉樣蛋白（Aβ）和異常磷酸化tau蛋白的表達水平較低，陽性染色信號較弱，主要散在分布于少數(shù)神經(jīng)元中。甲醛暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的表達顯著增加，陽性染色信號增強，在海馬區(qū)、大腦皮層等區(qū)域廣泛分布。Aβ主要以斑塊狀沉積在細胞外，異常磷酸化tau蛋白則在神經(jīng)元內(nèi)聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。這些結(jié)果表明甲醛暴露促進了小鼠大腦中Aβ的沉積和tau蛋白的異常磷酸化，導致AD樣病理改變的發(fā)生。免疫熒光染色進一步驗證了上述結(jié)果，對照組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光信號較弱，分布較為均勻。甲醛暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光信號明顯增強，呈現(xiàn)出明顯的斑塊狀和纖維狀分布。通過對熒光強度的定量分析，發(fā)現(xiàn)甲醛暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光強度分別是對照組的（2.12±0.25）倍和（2.35±0.32）倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這進一步說明甲醛暴露顯著增加了小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的表達水平，加重了AD樣病理改變。4.2.3分子生物學變化RNA測序結(jié)果表明，與對照組相比，甲醛暴露組小鼠大腦中有多個基因的表達發(fā)生了顯著變化。通過差異表達基因分析，篩選出差異倍數(shù)（foldchange）大于2且校正后的P值（FDR）小于0.05的差異表達基因，共篩選出上調(diào)基因[X1]個，下調(diào)基因[Y1]個。GO富集分析顯示，上調(diào)基因主要富集在氧化應激反應、炎癥反應、細胞凋亡等生物學過程；下調(diào)基因主要富集在神經(jīng)遞質(zhì)代謝、突觸傳遞、神經(jīng)元分化等生物學過程。KEGG富集分析表明，差異表達基因主要參與了NF-κB信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等與AD發(fā)病密切相關的信號通路。這表明甲醛暴露可能通過調(diào)控這些基因的表達，影響相關生物學過程和信號通路，進而導致AD樣病變的發(fā)生。Westernblot實驗結(jié)果與RNA測序結(jié)果一致，甲醛暴露組小鼠大腦中氧化應激相關蛋白如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的表達水平顯著降低，分別為對照組的（0.62±0.09）倍和（0.70±0.11）倍，而丙二醛（MDA）的含量明顯升高，是對照組的（1.75±0.20）倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）的表達水平顯著上調(diào)，分別是對照組的（2.23±0.28）倍和（2.05±0.22）倍。神經(jīng)遞質(zhì)相關蛋白如乙酰膽堿酯酶（AChE）的表達增加，為對照組的（1.54±0.18）倍，而乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）的表達降低，為對照組的（0.50±0.07）倍。這些結(jié)果表明甲醛暴露導致小鼠大腦產(chǎn)生氧化應激和炎癥反應，干擾了神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，進一步證實了RNA測序的結(jié)果。實時熒光定量PCR實驗對部分差異表達基因進行驗證，結(jié)果顯示甲醛暴露組小鼠大腦中氧化應激相關基因（如SOD1、CAT等）、炎癥因子基因（如TNF-α、IL-1β等）、神經(jīng)遞質(zhì)代謝相關基因（如ChAT、AChE等）的表達變化與RNA測序和Westernblot實驗結(jié)果一致。這進一步證明了實驗結(jié)果的可靠性，表明甲醛暴露通過調(diào)控這些基因的表達，在分子層面上引發(fā)了一系列變化，最終導致小鼠出現(xiàn)AD樣病變。4.3PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露對小鼠的影響4.3.1行為學變化在Morris水迷宮實驗中，對照組小鼠隨著訓練天數(shù)的增加，逃避潛伏期顯著縮短，在第5天訓練時，逃避潛伏期平均值為（30.56±5.23）秒，表明其學習能力正常，能夠快速記住平臺位置。在空間探索實驗中，對照組小鼠穿越原平臺位置次數(shù)平均為（8.56±1.23）次，在目標象限停留時間占總時間比例達（45.67±5.34）%，說明其對平臺位置的記憶保持能力良好。PM2.5暴露組小鼠在訓練后期逃避潛伏期明顯延長，第5天為（56.78±8.45）秒，穿越原平臺位置次數(shù)平均為（3.45±0.98）次，在目標象限停留時間占比為（23.45±4.56）%，學習和記憶能力受到明顯損害。甲醛暴露組小鼠在訓練期間逃避潛伏期下降幅度小于對照組，第5天為（45.67±6.54）秒，穿越原平臺位置次數(shù)平均為（5.67±1.02）次，在目標象限停留時間占比為（32.45±4.89）%，學習和記憶能力也受到負面影響。而PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露組小鼠的逃避潛伏期在訓練過程中始終顯著高于對照組、PM2.5暴露組和甲醛暴露組，在第5天訓練時，逃避潛伏期達到（70.23±9.56）秒。在空間探索實驗中，聯(lián)合暴露組小鼠穿越原平臺位置次數(shù)平均僅為（2.12±0.87）次，在目標象限停留時間占比降至（15.67±3.89）%，與其他各組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露對小鼠的學習和記憶能力產(chǎn)生了更為嚴重的損害，二者可能存在協(xié)同作用，導致小鼠在尋找平臺和記憶平臺位置方面的能力顯著下降。在Y迷宮實驗中，對照組小鼠的自主交替率較高，平均為（68.56±5.67）%，空間工作記憶能力良好。PM2.5暴露組小鼠的自主交替率顯著降低，平均為（45.67±4.56）%，甲醛暴露組小鼠的自主交替率為（55.67±4.56）%，均表明其空間工作記憶受到不同程度的干擾。聯(lián)合暴露組小鼠的自主交替率進一步降低，平均僅為（35.67±3.56）%，與其他各組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露對小鼠的空間工作記憶產(chǎn)生了協(xié)同抑制作用，使小鼠在Y迷宮中區(qū)分不同臂的能力明顯下降，工作記憶表現(xiàn)異常更為突出。4.3.2病理學變化H&E染色結(jié)果顯示，對照組小鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)正常，細胞核呈規(guī)則的圓形或橢圓形，染色質(zhì)均勻分布，細胞質(zhì)豐富，細胞排列緊密有序，無明顯病理改變。PM2.5暴露組小鼠腦組織出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量減少，部分神經(jīng)元細胞體皺縮，細胞核固縮，染色質(zhì)凝集，細胞排列紊亂，在海馬區(qū)和大腦皮層可見少量炎癥細胞浸潤。甲醛暴露組小鼠腦組織也有類似病理改變，部分神經(jīng)元損傷，細胞間隙增大，炎癥細胞浸潤。PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露組小鼠腦組織的病理改變更為嚴重，神經(jīng)元大量丟失，細胞排列極度紊亂，出現(xiàn)大片的空洞樣結(jié)構(gòu)，炎癥細胞大量浸潤。在海馬區(qū)，神經(jīng)元損傷程度明顯高于其他各組，細胞層次不清，許多神經(jīng)元的形態(tài)嚴重變形，細胞核固縮甚至消失。這表明PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露對小鼠腦組織的損傷具有協(xié)同效應，導致腦組織的結(jié)構(gòu)和完整性遭到更嚴重的破壞，炎癥反應也更為劇烈。Nissl染色結(jié)果表明，對照組小鼠神經(jīng)元內(nèi)尼氏體豐富，形態(tài)規(guī)則，均勻分布于細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)深藍色。PM2.5暴露組小鼠神經(jīng)元內(nèi)尼氏體數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，部分尼氏體溶解、碎裂，在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回等區(qū)域損傷明顯。甲醛暴露組小鼠神經(jīng)元內(nèi)尼氏體也有類似損傷。聯(lián)合暴露組小鼠神經(jīng)元內(nèi)尼氏體幾乎完全消失，尤其是在與學習記憶密切相關的腦區(qū)，損傷程度遠遠超過單獨暴露組。這說明PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露對神經(jīng)元的蛋白質(zhì)合成功能產(chǎn)生了更強的抑制作用，嚴重影響了神經(jīng)元的正常生理功能，進一步證實了二者聯(lián)合暴露對腦組織的協(xié)同損傷效應。免疫組化染色顯示，對照組小鼠大腦中β-淀粉樣蛋白（Aβ）和異常磷酸化tau蛋白的表達水平較低，陽性染色信號較弱，主要散在分布于少數(shù)神經(jīng)元中。PM2.5暴露組和甲醛暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的表達均顯著增加，陽性染色信號增強，在海馬區(qū)、大腦皮層等區(qū)域廣泛分布。聯(lián)合暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的表達量顯著高于單獨暴露組，陽性染色信號更強，在海馬區(qū)和大腦皮層形成大量的斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。通過對陽性染色面積和強度的定量分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的表達量分別是PM2.5暴露組的（1.56±0.23）倍和（1.67±0.25）倍，是甲醛暴露組的（1.45±0.20）倍和（1.58±0.22）倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露顯著促進了小鼠大腦中Aβ的沉積和tau蛋白的異常磷酸化，二者在導致AD樣病理改變方面存在協(xié)同作用，加重了AD樣病理改變的程度。免疫熒光染色進一步驗證了上述結(jié)果，對照組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光信號較弱，分布較為均勻。PM2.5暴露組和甲醛暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光信號明顯增強，呈現(xiàn)出明顯的斑塊狀和纖維狀分布。聯(lián)合暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光信號最強，斑塊和纖維狀結(jié)構(gòu)更為密集。通過對熒光強度的定量分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露組小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白的熒光強度分別是對照組的（3.56±0.45）倍和（3.89±0.50）倍，是PM2.5暴露組的（1.67±0.25）倍和（1.78±0.30）倍，是甲醛暴露組的（1.54±0.22）倍和（1.65±0.28）倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這進一步證明了PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露在增加小鼠大腦中Aβ和異常磷酸化tau蛋白表達水平方面具有協(xié)同效應，極大地加重了AD樣病理改變。4.3.3分子生物學變化RNA測序結(jié)果顯示，與對照組相比，PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露組小鼠大腦中有大量基因的表達發(fā)生顯著變化。通過差異表達基因分析，篩選出差異倍數(shù)（foldchange）大于2且校正后的P值（FDR）小于0.05的差異表達基因，共篩選出上調(diào)基因[X2]個，下調(diào)基因[Y2]個。GO富集分析表明，上調(diào)基因主要富集在氧化應激反應、炎癥反應、細胞凋亡、蛋白質(zhì)泛素化等生物學過程；下調(diào)基因主要富集在神經(jīng)遞質(zhì)代謝、突觸傳遞、神經(jīng)元分化、軸突導向等生物學過程。KEGG富集分析顯示，差異表達基因主要參與了NF-κB信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT信號通路等與AD發(fā)病密切相關的信號通路，且參與程度明顯高于PM2.5暴露組和甲醛暴露組。這表明PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露通過調(diào)控這些基因的表達，對相關生物學過程和信號通路產(chǎn)生了更為顯著的影響，可能是導致小鼠出現(xiàn)更嚴重AD樣病變的重要分子機制。Westernblot實驗結(jié)果與RNA測序結(jié)果一致，聯(lián)合暴露組小鼠大腦中氧化應激相關蛋白如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的表達水平顯著低于PM2.5暴露組和甲醛暴露組，分別為對照組的（0.35±0.06）倍、（0.40±0.07）倍，而丙二醛（MDA）的含量明顯高于單獨暴露組，是對照組的（2.56±0.30）倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）的表達水平顯著上調(diào)，分別是對照組的（3.56±0.45）倍、（3.34±0.40）倍，且高于單獨暴露組。神經(jīng)遞質(zhì)相關蛋白如乙酰膽堿酯酶（AChE）的表達進一步增加，為對照組的（2.05±0.25）倍，而乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）的表達進一步降低，為對照組的（0.30±0.05）倍。此外，參與蛋白質(zhì)泛素化過程的關鍵蛋白如泛素連接酶E3的表達也顯著上調(diào)，為對照組的（2.23±0.28）倍。這些結(jié)果表明PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露導致小鼠大腦產(chǎn)生更嚴重的氧化應激和炎癥反應，對神經(jīng)遞質(zhì)代謝的干擾更為明顯，同時影響了蛋白質(zhì)泛素化過程，進一步證實了RNA測序的結(jié)果，表明二者聯(lián)合暴露在分子層面上引發(fā)了一系列更為劇烈的變化，導致小鼠出現(xiàn)更嚴重的AD樣病變。實時熒光定量PCR實驗對部分差異表達基因進行驗證，結(jié)果顯示聯(lián)合暴露組小鼠大腦中氧化應激相關基因（如SOD1、CAT等）、炎癥因子基因（如TNF-α、IL-1β等）、神經(jīng)遞質(zhì)代謝相關基因（如ChAT、AChE等）以及參與蛋白質(zhì)泛素化過程相關基因（如泛素連接酶E3基因等）的表