pH調控小鼠肝炎病毒S蛋白構象變化的分子機制探秘一、引言1.1研究背景與意義冠狀病毒作為一類有包膜的正義單鏈RNA病毒，在病毒學研究領域備受關注。這類病毒基因組龐大，在自然界中廣泛傳播，可感染包括人類、多種哺乳動物以及鳥類等眾多宿主。在過去的二十年間，冠狀病毒引發了一系列嚴重的公共衛生事件，給全球健康和經濟發展帶來了沉重打擊。2002-2003年，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）爆發，迅速在全球范圍內傳播，造成了8000多人感染，近800人死亡，其高致病性和快速傳播性引發了全球恐慌，對國際旅游業、商業活動等造成了巨大沖擊。2012年，中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）出現，雖然傳播范圍相對局限，但病死率高達35%左右，同樣對地區公共衛生安全構成了嚴重威脅。而2019年末開始爆發并持續至今的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情，更是給全球帶來了全方位、深層次的影響。此次疫情導致數億人感染，數百萬人失去生命，在全球范圍內引發了醫療資源緊張、經濟衰退、社會秩序紊亂等一系列問題。冠狀病毒的感染過程是一個復雜而精細的分子機制，其中刺突蛋白（SpikeProtein，S蛋白）起著關鍵作用。S蛋白是冠狀病毒表面的一種跨膜糖蛋白，以三聚體形式存在，猶如病毒的“鑰匙”，負責識別和結合宿主細胞表面的特異性受體，進而介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合，使病毒得以進入宿主細胞內，啟動感染過程。S蛋白由S1和S2兩個亞基組成，S1亞基包含受體結合結構域（RBD），負責與宿主細胞受體相互作用，其氨基酸序列和空間結構的特異性決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性；S2亞基則主要負責膜融合過程，在S1與受體結合引發的一系列構象變化后，S2亞基上的膜融合肽暴露并插入宿主細胞膜，隨后S2亞基的兩個七肽重復序列（HR1和HR2）相互作用形成六螺旋束（6-HB）結構，拉近病毒包膜與宿主細胞膜的距離，最終實現膜融合。S蛋白不僅是病毒感染的關鍵因子，也是宿主免疫系統識別的主要抗原，其結構和功能的改變直接影響病毒的感染性、傳播能力以及致病性。在冠狀病毒感染機制的研究中，S蛋白的構象變化一直是研究的重點和熱點。S蛋白在介導病毒感染過程中會經歷一系列復雜而有序的構象變化，這些變化受到多種因素的調控，其中環境pH值是一個重要的影響因素。pH值的改變可以觸發S蛋白從初始的亞穩態向一系列中間態和最終的融合后態轉變。研究表明，在一些冠狀病毒中，如流感病毒，低pH環境可誘導其表面糖蛋白發生構象變化，從而啟動膜融合過程。對于冠狀病毒而言，不同的感染部位和細胞內環境可能存在pH值的差異，這種差異如何影響S蛋白的構象變化，進而影響病毒的感染效率和感染途徑，目前仍不完全清楚。小鼠肝炎病毒（MurineHepatitisVirus，MHV）作為冠狀病毒科的模式病毒，具有與其他冠狀病毒相似的結構和感染機制，同時因其易于在實驗室條件下進行培養和操作，成為研究冠狀病毒感染機制的重要模型。前期研究發現，MHV的S蛋白在pH8.0且無受體誘導的條件下，能夠發生構象變化并高效介導非受體依賴的細胞膜融合，這一現象為研究pH對冠狀病毒S蛋白構象變化的影響提供了獨特的模型和研究基礎。深入探究pH對MHVS蛋白構象變化的機制，不僅有助于揭示冠狀病毒感染的分子機制，還能為開發新型抗病毒藥物和疫苗提供理論依據。通過明確pH調控S蛋白構象變化的關鍵位點和分子通路，有望針對這些靶點設計特異性的抑制劑，阻斷病毒的感染過程；同時，對S蛋白構象變化機制的深入理解，也有助于優化疫苗設計，提高疫苗的免疫原性和保護效果。1.2國內外研究現狀在冠狀病毒研究領域，S蛋白的結構與功能一直是重點關注對象，尤其是pH對S蛋白構象變化的影響機制。國內外眾多學者針對不同冠狀病毒，包括SARS-CoV、MERS-CoV以及新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）等，開展了廣泛而深入的研究。國外方面，[國外研究團隊1]利用冷凍電鏡技術，解析了SARS-CoVS蛋白在不同pH條件下的高分辨率結構。研究發現，當pH值降低時，S蛋白的RBD結構域會發生顯著的構象變化，這種變化增強了RBD與宿主細胞受體血管緊張素轉化酶2（ACE2）的親和力，從而促進病毒與宿主細胞的結合。[國外研究團隊2]對MERS-CoV的研究表明，低pH環境可誘導S蛋白從預融合狀態向融合后狀態轉變，在這一過程中，S2亞基的結構重排是實現膜融合的關鍵步驟，且該過程涉及多個保守氨基酸殘基的質子化和去質子化反應。在針對SARS-CoV-2的研究中，[國外研究團隊3]通過單分子熒光共振能量轉移（smFRET）技術，實時監測了S蛋白在不同pH值下的構象動態變化。結果顯示，pH值的微小改變就能引發S蛋白三聚體內部的結構重排，進而影響其與受體的結合能力以及膜融合活性。國內的研究團隊也在該領域取得了豐碩成果。[國內研究團隊1]通過生物化學和細胞生物學實驗，揭示了SARS-CoV-2S蛋白在pH介導的構象變化過程中，S1亞基與S2亞基之間的相互作用模式發生改變。當pH值下降時，S1亞基的部分結構域會發生解離，暴露出S2亞基上的關鍵膜融合位點，從而啟動膜融合過程。[國內研究團隊2]利用定點突變技術，對SARS-CoV-2S蛋白中的關鍵氨基酸殘基進行突變，研究其在不同pH條件下的功能變化。發現某些位于S2亞基HR1區域的氨基酸突變，會顯著影響pH誘導的膜融合效率，表明這些氨基酸在pH介導的構象變化和膜融合過程中發揮著重要作用。然而，目前針對pH對小鼠肝炎病毒（MHV）S蛋白構象變化機制的研究相對較少。僅有少數研究關注到MHV在特定pH條件下的感染特性和S蛋白的功能變化。前期研究雖已發現MHV的S蛋白在pH8.0且無受體誘導的條件下能發生構象變化并介導非受體依賴的細胞膜融合，但對于這一過程中具體的分子機制，包括哪些氨基酸殘基參與pH感知、pH變化如何引發S蛋白的逐級構象變化以及這些構象變化如何精確調控膜融合過程等關鍵問題，仍缺乏深入且系統的研究。現有研究在技術手段上，主要集中于傳統的細胞融合實驗和簡單的蛋白表達分析，缺乏如冷凍電鏡、單分子熒光成像等先進技術在MHVS蛋白構象變化研究中的應用，這限制了對其分子機制的深入解析。在研究內容方面，對于MHVS蛋白在不同pH環境下與宿主細胞相互作用的動態過程，以及病毒感染過程中pH微環境的時空變化對S蛋白功能的影響等方面，尚未開展全面且深入的探究。1.3研究目標與內容本研究旨在深入探究pH對小鼠肝炎病毒（MHV）S蛋白構象變化的機制，通過多維度、系統性的研究方法，揭示這一復雜過程中的關鍵分子事件和調控通路，為冠狀病毒感染機制的研究提供新的理論依據和研究思路，具體研究目標如下：明確pH影響MHVS蛋白構象變化的關鍵位點：通過生物信息學分析，預測MHVS蛋白中可能對pH敏感的氨基酸殘基，尤其是組氨酸殘基，因其pKa值接近中性，在pH變化時易發生質子化和去質子化反應，可能在pH介導的構象變化中起關鍵作用。利用定點突變技術，對這些預測的關鍵位點進行突變，構建一系列S蛋白突變體。通過比較野生型和突變體S蛋白在不同pH條件下的構象變化情況，確定對pH敏感的關鍵氨基酸位點，明確其在pH感知和構象變化啟動中的作用。解析pH引發MHVS蛋白逐級構象變化的過程：運用先進的結構生物學技術，如冷凍電鏡（Cryo-EM）和X射線晶體學，結合單分子熒光共振能量轉移（smFRET）技術，對野生型和關鍵位點突變體的S蛋白在不同pH條件下的結構進行高分辨率解析和實時動態監測。詳細描繪S蛋白從初始狀態到中間態，最終到融合后態的構象變化軌跡，闡明pH變化如何誘導S蛋白各結構域之間的相互作用發生改變，以及這些變化如何引發S蛋白的逐級構象重排，明確各中間態的結構特征和轉變過程中的關鍵結構變化。闡明pH介導的MHVS蛋白構象變化調控膜融合的分子機制：構建基于細胞的膜融合模型，利用熒光標記和共聚焦顯微鏡技術，觀察野生型和突變體S蛋白在不同pH條件下介導的細胞膜融合過程。結合生化分析方法，檢測膜融合過程中關鍵分子事件的發生，如膜融合肽的暴露、七肽重復序列（HR1和HR2）的相互作用以及六螺旋束（6-HB）結構的形成。通過這些研究，深入理解pH介導的S蛋白構象變化如何精確調控膜融合的啟動、進展和完成，揭示膜融合過程中的關鍵分子調控機制。為實現上述研究目標，本研究將開展以下具體研究內容：生物信息學分析與突變體構建：收集和分析已有的MHVS蛋白序列數據，運用生物信息學工具，如氨基酸序列比對、結構預測軟件等，識別可能與pH感知相關的保守氨基酸殘基，特別是組氨酸殘基，并對其在S蛋白三維結構中的位置和周圍微環境進行分析。根據分析結果，設計針對這些關鍵氨基酸殘基的定點突變方案，利用PCR-based定點突變技術，構建一系列S蛋白突變體質粒。通過測序驗證突變體的準確性，并將突變體質粒轉化至合適的表達系統中，如大腸桿菌或真核細胞表達系統，用于后續實驗。S蛋白的表達、純化與鑒定：在優化的表達條件下，誘導野生型和突變體S蛋白在相應表達系統中的表達。利用親和層析、離子交換層析等蛋白質純化技術，對表達的S蛋白進行純化，獲得高純度的蛋白質樣品。通過SDS-PAGE、Westernblot等方法對純化后的S蛋白進行鑒定，確定其純度、分子量和表達量。同時，采用圓二色譜（CD）、熒光光譜等技術對S蛋白的二級和三級結構進行初步表征，為后續構象變化研究提供基礎。pH對S蛋白構象變化的影響研究：運用多種生物物理技術，如動態光散射（DLS）、小角X射線散射（SAXS）、核磁共振（NMR）等，結合熒光標記和熒光光譜技術，研究不同pH條件下野生型和突變體S蛋白的構象變化。通過監測S蛋白的粒徑分布、溶液中的構象形態、化學位移變化以及熒光信號變化等參數，獲取S蛋白在不同pH條件下的構象信息，繪制構象變化曲線，確定pH誘導構象變化的閾值和關鍵pH區間。利用冷凍電鏡技術，解析不同pH條件下S蛋白的高分辨率三維結構，直觀展示構象變化的細節，結合結構分析軟件，深入分析構象變化過程中各結構域之間的相互作用變化和關鍵氨基酸殘基的動態變化。S蛋白介導的膜融合機制研究：構建基于細胞的膜融合實驗體系，如表達MHVS蛋白的細胞與表達受體的靶細胞共培養體系，利用熒光染料標記細胞膜，通過共聚焦顯微鏡觀察不同pH條件下細胞融合的動態過程，統計融合效率，分析pH對膜融合的影響。運用生化分析方法，如蛋白質免疫印跡（Westernblot）、免疫共沉淀（Co-IP）等技術，檢測膜融合過程中S蛋白的裂解、膜融合肽的暴露以及HR1和HR2相互作用形成6-HB結構的情況，確定這些關鍵分子事件與pH變化和S蛋白構象變化之間的關系。通過構建缺失關鍵結構域或氨基酸殘基的突變體，進一步驗證這些結構和殘基在pH介導的膜融合過程中的作用，闡明pH調控膜融合的分子機制。1.4研究方法與技術路線突變質粒構建：運用PCR-based定點突變技術對MHVS蛋白基因進行改造。根據生物信息學預測結果，針對可能對pH敏感的氨基酸殘基（尤其是組氨酸殘基）設計引物，通過PCR擴增引入突變位點。將擴增后的片段與相應的質粒載體連接，轉化至大腸桿菌感受態細胞中，如DH5α菌株。利用氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，提取質粒進行測序驗證，確保突變位點準確無誤。受體蛋白的真核表達：將編碼MHVS蛋白受體的基因克隆至真核表達載體，如pcDNA3.1。通過脂質體轉染法將重組表達載體導入真核細胞，如HEK293T細胞。轉染后48-72小時，收集細胞，利用Westernblot檢測受體蛋白在細胞內的表達情況，以β-actin作為內參，確保表達的準確性和穩定性。同時，采用流式細胞儀檢測受體蛋白在細胞表面的表達，通過特異性抗體標記，分析表達受體蛋白的細胞比例和表達強度。細胞轉染：采用脂質體轉染試劑，如Lipofectamine3000，將野生型和突變體S蛋白表達質粒以及受體蛋白表達質粒轉染至細胞中。按照試劑說明書，將質粒與脂質體在無血清培養基中混合，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質體-質粒復合物。然后將復合物加入到培養的細胞中，置于37℃、5%CO?培養箱中培養，使質粒進入細胞并表達相應蛋白。western-blot檢測冠狀病毒S蛋白在細胞內的表達：轉染后的細胞用RIPA裂解液裂解，提取總蛋白。通過BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進行SDS-PAGE電泳分離。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1-2小時，以阻斷非特異性結合。隨后，加入抗S蛋白的特異性一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1-2小時。再次洗滌后，利用化學發光試劑進行顯色，在凝膠成像系統下觀察并拍照記錄S蛋白的表達條帶。流式細胞儀檢測冠狀病毒S蛋白在細胞表面的表達：轉染后的細胞用胰酶消化，收集細胞并重懸于PBS中。加入抗S蛋白的熒光標記抗體，4℃避光孵育30-60分鐘。用PBS洗滌細胞3次，去除未結合的抗體。將細胞重懸于適量PBS中，利用流式細胞儀檢測細胞表面熒光強度，分析表達S蛋白的細胞比例和熒光強度分布，從而確定S蛋白在細胞表面的表達情況。MHV假病毒的包裝及假病毒顆粒中S蛋白的檢測：將MHVS蛋白表達質粒、包裝質粒（如psPAX2和pMD2.G）共轉染至293T細胞中，利用細胞內的包裝機制產生假病毒顆粒。轉染48-72小時后，收集細胞培養上清，通過超速離心濃縮假病毒顆粒。采用Westernblot方法檢測假病毒顆粒中S蛋白的表達，以確定假病毒包裝的有效性和S蛋白的完整性。受體結合實驗：將表達S蛋白的細胞與表達受體蛋白的細胞共培養，或使用純化的S蛋白與受體蛋白進行體外結合實驗。通過免疫共沉淀（Co-IP）技術，驗證S蛋白與受體蛋白之間的相互作用。將細胞裂解液與抗S蛋白抗體孵育，加入ProteinA/G磁珠，沉淀與S蛋白結合的受體蛋白。通過Westernblot檢測沉淀中的受體蛋白，分析S蛋白與受體的結合情況。同時，利用表面等離子共振（SPR）技術，精確測定S蛋白與受體之間的結合親和力和動力學參數，進一步量化兩者的相互作用。細胞融合的熒光定量分析：利用熒光染料標記表達S蛋白的細胞和表達受體蛋白的細胞，如用CFSE標記一種細胞，用DiI標記另一種細胞。將兩種細胞共培養于不同pH條件下，通過共聚焦顯微鏡觀察細胞融合過程，以融合細胞中同時出現兩種熒光信號為判斷標準。每隔一定時間采集圖像，統計融合細胞的數量，計算融合效率，繪制細胞融合效率隨時間和pH變化的曲線，分析pH對細胞融合的影響。MHV重組病毒的拯救：構建包含MHV全基因組的感染性克隆質粒，通過定點突變技術引入S蛋白突變位點。將重組質粒轉染至敏感細胞，如小鼠肝癌細胞系Hepa1-6，利用細胞內的轉錄和翻譯機制，拯救出具有感染性的重組病毒。通過空斑實驗測定重組病毒的滴度，驗證重組病毒的感染性和穩定性。利用重組病毒感染細胞，研究pH對病毒感染過程中S蛋白構象變化和膜融合的影響，以及病毒在不同pH條件下的復制能力和致病性。本研究的技術路線如圖1-1所示：首先通過生物信息學分析預測MHVS蛋白中對pH敏感的氨基酸殘基，基于此設計定點突變方案，構建S蛋白突變體質粒。將野生型和突變體S蛋白表達質粒以及受體蛋白表達質粒分別轉染至合適細胞，利用western-blot和流式細胞儀檢測蛋白表達情況。包裝MHV假病毒并檢測假病毒顆粒中S蛋白，進行受體結合實驗和細胞融合的熒光定量分析。拯救MHV重組病毒，研究pH對病毒感染相關過程的影響，最終深入探究pH對MHVS蛋白構象變化的機制。[此處插入技術路線圖1-1，圖中清晰展示從生物信息學分析到最終機制探究的各步驟及相互關系]二、相關理論基礎2.1冠狀病毒概述2.1.1冠狀病毒的分類與結構冠狀病毒在病毒學分類體系中屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）。根據國際病毒分類委員會（ICTV）的分類標準，冠狀病毒可進一步分為α、β、γ和δ四個屬。α屬和β屬冠狀病毒主要感染哺乳動物，包括人類、蝙蝠、小鼠等；γ屬冠狀病毒主要感染鳥類，如雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）是家禽養殖業中重要的病原體；δ屬冠狀病毒的宿主范圍相對較窄，可感染鳥類和豬等動物。冠狀病毒粒子呈球形或橢圓形，具有多形性，直徑通常在80-120納米之間。病毒粒子的最外層是一層包膜，包膜主要由脂質雙分子層構成，來源于宿主細胞的細胞膜。包膜上鑲嵌著三種主要的結構蛋白：刺突蛋白（SpikeProtein，S蛋白）、膜蛋白（MembraneProtein，M蛋白）和小膜蛋白（EnvelopeProtein，E蛋白）。S蛋白以三聚體的形式突出于病毒包膜表面，形成獨特的“冠狀”結構，這也是冠狀病毒名稱的由來。S蛋白是病毒感染宿主細胞的關鍵蛋白，其結構復雜，由S1和S2兩個亞基組成。S1亞基位于三聚體的頂部，包含受體結合結構域（RBD），負責識別并結合宿主細胞表面的特異性受體，不同冠狀病毒的S1亞基氨基酸序列差異較大，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性；S2亞基則貫穿包膜，主要負責病毒包膜與宿主細胞膜的融合過程，其結構相對保守，包含多個功能區域，如融合肽（FP）、七肽重復序列1（HR1）、七肽重復序列2（HR2）等，這些區域在膜融合過程中發揮著關鍵作用。M蛋白是病毒包膜中含量最豐富的蛋白，它具有三個跨膜結構域，大部分位于包膜內部，僅一小部分暴露在包膜表面。M蛋白在維持病毒粒子的形態和穩定性方面發揮著重要作用，同時也參與病毒的組裝和出芽過程。E蛋白是一種小的跨膜蛋白，在病毒粒子中的含量相對較少。E蛋白參與病毒的組裝、釋放以及病毒感染過程中的膜融合調節等多個環節，雖然其具體功能尚未完全明確，但研究表明它對于病毒的感染性和致病性具有重要影響。除了上述三種主要結構蛋白外，冠狀病毒粒子內部還包含核衣殼蛋白（NucleocapsidProtein，N蛋白）和病毒基因組RNA。N蛋白與病毒基因組RNA緊密結合，形成核衣殼結構，保護病毒RNA免受核酸酶的降解，同時在病毒的轉錄和復制過程中也發揮著重要作用。2.1.2冠狀病毒的生命周期冠狀病毒的生命周期是一個復雜而有序的過程，涉及病毒與宿主細胞的一系列相互作用，從病毒入侵宿主細胞開始，到子代病毒的釋放，可分為以下幾個主要階段：吸附與入侵：冠狀病毒通過其表面的S蛋白與宿主細胞表面的特異性受體結合，啟動感染過程。不同的冠狀病毒識別不同的宿主細胞受體，例如，SARS-CoV和SARS-CoV-2主要利用血管緊張素轉化酶2（ACE2）作為受體，MERS-CoV則以二肽基肽酶4（DPP4）為受體。S蛋白的RBD與受體結合后，引發S蛋白的構象變化，暴露出S2亞基上的融合肽。融合肽插入宿主細胞膜，隨后S2亞基發生一系列構象重排，形成六螺旋束結構，拉近病毒包膜與宿主細胞膜的距離，最終實現膜融合，病毒基因組RNA進入宿主細胞內。脫殼與基因組復制：病毒基因組RNA進入宿主細胞后，首先進行脫殼，釋放出裸露的RNA。冠狀病毒的基因組為正義單鏈RNA（+ssRNA），可以直接作為信使RNA（mRNA），在宿主細胞的核糖體上翻譯出病毒的非結構蛋白（nsps）。這些非結構蛋白組裝形成復制轉錄復合體（RTC），以病毒基因組RNA為模板，進行負鏈RNA（-ssRNA）的合成。然后，以負鏈RNA為模板，大量合成子代病毒的基因組RNA和亞基因組RNA（sgRNA）。亞基因組RNA主要用于翻譯病毒的結構蛋白和其他輔助蛋白。病毒蛋白合成與組裝：在病毒基因組復制的同時，病毒的結構蛋白和輔助蛋白也在宿主細胞的內質網（ER）中合成。S蛋白、M蛋白和E蛋白在合成后，通過內質網-高爾基體途徑進行加工和運輸，最終到達內質網-高爾基體中間室（ERGIC）。N蛋白與新合成的病毒基因組RNA在宿主細胞的細胞質中結合，形成核衣殼結構。核衣殼結構轉移到ERGIC，與在那里聚集的S蛋白、M蛋白和E蛋白相互作用，進行病毒粒子的組裝。病毒釋放：組裝完成的病毒粒子通過高爾基體分泌途徑，以出芽的方式從宿主細胞中釋放出來。釋放出的子代病毒可以繼續感染周圍的細胞，從而擴大病毒的感染范圍。在整個生命周期中，冠狀病毒與宿主細胞之間存在著復雜的相互作用，宿主細胞的各種生理過程和信號通路也會對病毒的感染和復制產生影響。例如，宿主細胞的免疫應答機制會試圖識別和清除病毒，而病毒則會進化出一系列策略來逃避宿主的免疫防御，這種病毒與宿主之間的動態博弈關系是冠狀病毒感染機制研究的重要內容。2.1.3冠狀病毒的流行病學特征及危害冠狀病毒具有廣泛的宿主范圍和傳播途徑，其流行病學特征復雜多樣，對人類和動物健康構成了嚴重威脅。在傳播途徑方面，冠狀病毒主要通過呼吸道飛沫傳播和密切接觸傳播。當感染病毒的個體咳嗽、打噴嚏或說話時，會產生含有病毒的飛沫，這些飛沫可以被周圍的易感個體吸入，從而導致感染。密切接觸傳播則包括直接接觸感染者的呼吸道分泌物、體液或間接接觸被病毒污染的物體表面后再接觸口鼻等黏膜部位。此外，一些冠狀病毒還可以通過氣溶膠傳播，尤其是在相對封閉、通風不良的環境中，含有病毒的氣溶膠可以在空氣中長時間懸浮，增加了感染的風險。不同冠狀病毒的易感人群存在一定差異。對于人類冠狀病毒感染，老年人、兒童以及患有基礎疾病（如心血管疾病、糖尿病、慢性呼吸系統疾病等）的人群往往更容易感染，且感染后病情可能更為嚴重。例如，在COVID-19疫情中，老年人和患有多種基礎疾病的患者的重癥率和死亡率明顯高于其他人群。對于動物冠狀病毒，不同種類的動物對特定冠狀病毒的易感性不同。例如，豬對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）易感，雞對雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）易感，這些病毒感染會給養殖業帶來巨大的經濟損失。冠狀病毒感染對人類和動物健康的危害是多方面的。在人類方面，冠狀病毒感染可導致從普通感冒到嚴重急性呼吸綜合征等多種疾病。如2002-2003年的SARS疫情，SARS-CoV感染導致患者出現發熱、咳嗽、呼吸困難等嚴重癥狀，病死率較高。2012年爆發的MERS疫情，MERS-CoV感染主要引起中東地區患者的嚴重呼吸道疾病，病死率高達35%左右。而COVID-19疫情的影響更為廣泛和深遠，不僅導致大量患者出現輕重不一的癥狀，包括發熱、干咳、乏力、嗅覺味覺減退或喪失、鼻塞、流涕、咽痛、結膜炎、肌痛和腹瀉等，還引發了全球范圍內的醫療資源緊張、經濟衰退、社會秩序紊亂等一系列問題。在動物方面，冠狀病毒感染可導致動物的生長發育受阻、繁殖性能下降、免疫力降低，甚至死亡。例如，PEDV感染可導致仔豬出現嚴重的腹瀉、嘔吐和脫水癥狀，病死率較高，給養豬業造成了巨大的經濟損失；IBV感染會影響雞的呼吸道和生殖系統，導致雞的產蛋量下降、生長緩慢，降低養殖效益。此外，動物冠狀病毒的感染還可能存在跨物種傳播的風險，一旦發生跨物種傳播，可能引發新的公共衛生事件。2.2小鼠肝炎病毒S蛋白2.2.1S蛋白的結構特征及功能小鼠肝炎病毒（MHV）的S蛋白作為病毒表面的關鍵蛋白，在病毒感染宿主細胞的過程中發揮著不可或缺的作用。其結構復雜且精細，由S1和S2兩個亞基組成，二者協同作用，共同完成病毒感染的起始階段。S1亞基位于S蛋白三聚體的頂部，相對分子質量較大，約為100-110kDa。S1亞基包含多個結構域，其中受體結合結構域（RBD）是其核心功能區域。RBD負責識別并特異性結合宿主細胞表面的受體，這種識別和結合具有高度的特異性和親和力，是病毒感染宿主細胞的第一步。研究表明，MHV的S1亞基通過RBD與宿主細胞表面的糖蛋白CEACAM1a緊密結合。CEACAM1a屬于癌胚抗原相關細胞黏附分子家族，其在小鼠的肝臟、肺臟、小腸等多種組織細胞表面廣泛表達。S1亞基的RBD與CEACAM1a的結合，決定了MHV的組織嗜性和感染范圍。除RBD外，S1亞基還包含N端結構域（NTD）等其他結構域。NTD在病毒感染過程中的具體功能尚未完全明確，但有研究推測其可能參與病毒與宿主細胞的初始識別或在S蛋白的構象調節中發揮一定作用。S2亞基則貫穿病毒包膜，相對分子質量約為60-70kDa。S2亞基主要負責介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合過程，這是病毒進入宿主細胞的關鍵步驟。S2亞基包含多個重要的功能區域，從N端到C端依次為融合肽（FP）、七肽重復序列1（HR1）、七肽重復序列2（HR2）、跨膜結構域（TM）和胞內結構域（ICD）。融合肽位于S2亞基的N端，是一段富含疏水氨基酸的短肽。在S蛋白介導膜融合的過程中，當S1亞基與宿主細胞受體結合后，會引發S蛋白的構象變化，使融合肽暴露并插入宿主細胞膜，為后續的膜融合過程奠定基礎。HR1和HR2是S2亞基中高度保守的區域，它們在膜融合過程中發揮著核心作用。在融合過程中，HR1和HR2會相互作用，形成六螺旋束（6-HB）結構。具體來說，三個HR1區域首先相互纏繞形成三股螺旋結構，隨后三個HR2區域反向纏繞在HR1螺旋的外側，形成穩定的6-HB結構。這種結構的形成能夠拉近病毒包膜與宿主細胞膜的距離，促使兩者發生融合。跨膜結構域位于S2亞基的中部，由一段疏水氨基酸組成，它將S蛋白錨定在病毒包膜上，確保S蛋白在病毒感染過程中的穩定性和正確定位。胞內結構域則位于S2亞基的C端，雖然其長度較短，但可能參與病毒感染過程中的信號傳導以及與病毒其他蛋白或宿主細胞內蛋白的相互作用。綜上所述，MHV的S蛋白通過S1亞基的受體結合功能和S2亞基的膜融合功能，協同完成病毒對宿主細胞的感染過程。S1亞基的RBD與宿主細胞受體的特異性結合，啟動了病毒感染的級聯反應，而S2亞基各功能區域的有序作用，確保了病毒包膜與宿主細胞膜的有效融合，使病毒基因組能夠順利進入宿主細胞，為后續的病毒復制和傳播創造條件。2.2.2S蛋白與受體相互作用關系小鼠肝炎病毒（MHV）的S蛋白與宿主細胞受體的相互作用是病毒感染過程中的關鍵起始步驟，這種相互作用高度特異且精確，涉及多個分子層面的識別與結合過程。MHV主要利用S蛋白的S1亞基中的受體結合結構域（RBD）來識別并結合宿主細胞表面的特異性受體，即癌胚抗原相關細胞黏附分子1a（CEACAM1a）。CEACAM1a屬于免疫球蛋白超家族成員，是一種廣泛表達于小鼠多種組織細胞表面的跨膜糖蛋白。其胞外區域包含多個免疫球蛋白樣結構域，其中N-端的IgV樣結構域是與MHVS蛋白RBD相互作用的關鍵區域。研究表明，MHVS蛋白RBD與CEACAM1a的結合具有高親和力，通過X射線晶體學和冷凍電鏡技術解析的二者復合物結構顯示，RBD與CEACAM1a的IgV樣結構域之間存在多個關鍵氨基酸殘基的相互作用。在RBD中，一些保守的氨基酸殘基，如酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）等，通過氫鍵、靜電相互作用以及疏水相互作用等方式，與CEACAM1aIgV樣結構域中的對應氨基酸殘基緊密結合。這些相互作用不僅決定了二者結合的特異性，還對結合的穩定性和親和力產生重要影響。例如，RBD中的某個關鍵酪氨酸殘基與CEACAM1aIgV樣結構域中的一個保守天冬氨酸殘基形成的氫鍵，在維持復合物結構穩定方面發揮著關鍵作用。當對這個酪氨酸殘基進行突變時，會顯著降低S蛋白與CEACAM1a的結合親和力，進而影響病毒的感染效率。此外，S蛋白與CEACAM1a的結合還受到多種因素的影響。從空間構象角度來看，S蛋白三聚體的整體構象以及RBD在三聚體中的位置和取向，都會影響其與CEACAM1a的結合。在天然狀態下，S蛋白三聚體處于一種動態平衡的構象狀態，只有當RBD處于合適的構象和取向時，才能有效地與CEACAM1a結合。一些研究利用單分子熒光共振能量轉移（smFRET）技術，實時監測了S蛋白三聚體在溶液中的構象動態變化以及與CEACAM1a結合過程中的構象變化。結果發現，在與CEACAM1a結合之前，S蛋白三聚體的RBD存在多種構象狀態，而只有部分構象狀態下的RBD能夠與CEACAM1a有效結合。當RBD與CEACAM1a結合后，會引發S蛋白三聚體的構象重排，進一步增強二者的結合穩定性。從環境因素角度分析，溶液中的離子強度、pH值等也會對S蛋白與CEACAM1a的結合產生影響。適當的離子強度能夠屏蔽S蛋白和CEACAM1a表面的電荷，減少靜電排斥作用，有利于二者的結合。而pH值的變化則可能影響S蛋白和CEACAM1a表面氨基酸殘基的質子化狀態，從而改變它們之間的靜電相互作用和氫鍵形成，進而影響結合親和力。研究表明，在生理pH值附近，S蛋白與CEACAM1a的結合親和力較高，當pH值偏離生理范圍時，結合親和力會逐漸下降。綜上所述，MHVS蛋白與宿主細胞受體CEACAM1a的相互作用是一個復雜而精細的過程，涉及多個氨基酸殘基的特異性相互作用、蛋白構象的動態變化以及環境因素的影響。深入理解這種相互作用關系，對于揭示MHV的感染機制以及開發針對MHV感染的防治策略具有重要意義。2.2.3S蛋白誘導膜融合機制小鼠肝炎病毒（MHV）的S蛋白在介導病毒包膜與宿主細胞膜融合的過程中，經歷了一系列復雜而有序的構象變化，這些變化精確調控著膜融合的各個階段，確保病毒能夠順利進入宿主細胞。在病毒感染的起始階段，S蛋白以三聚體的形式存在于病毒包膜表面，處于一種亞穩定的預融合狀態。此時，S1亞基位于三聚體的頂部，其受體結合結構域（RBD）隱藏在三聚體內部，處于一種“封閉”構象，以避免與宿主細胞發生非特異性結合。S2亞基則貫穿病毒包膜，其融合肽（FP）被S1亞基覆蓋，處于未暴露狀態。當S1亞基的RBD與宿主細胞表面的受體癌胚抗原相關細胞黏附分子1a（CEACAM1a）特異性結合后，會引發S蛋白的構象變化。這種結合誘導S1亞基發生構象重排，RBD從“封閉”構象轉變為“開放”構象，進一步加強與CEACAM1a的結合。同時，S1亞基的構象變化會傳遞到S2亞基，導致S2亞基的N端區域發生位移，使原本被S1亞基覆蓋的融合肽暴露出來。融合肽暴露后，憑借其富含疏水氨基酸的特性，迅速插入宿主細胞膜，這是膜融合過程的關鍵起始步驟。插入宿主細胞膜的融合肽，就像一個“錨”，將病毒包膜與宿主細胞膜拉近。隨后，S2亞基發生進一步的構象變化，其七肽重復序列1（HR1）和七肽重復序列2（HR2）開始發揮核心作用。在這一過程中，三個HR1區域首先相互纏繞，形成一個三股螺旋的中間結構。接著，三個HR2區域從相反的方向纏繞在HR1螺旋的外側，最終形成一個穩定的六螺旋束（6-HB）結構。6-HB結構的形成，能夠極大地拉近病毒包膜與宿主細胞膜之間的距離，使兩者之間的脂質雙分子層發生緊密接觸。在6-HB結構的作用下，病毒包膜與宿主細胞膜之間的脂質雙分子層發生融合，形成一個融合孔。融合孔最初較小，但會隨著膜融合過程的進行逐漸擴大。病毒基因組RNA通過這個擴大的融合孔進入宿主細胞的細胞質中，完成病毒的入侵過程。在S蛋白誘導膜融合的整個過程中，還存在一些輔助因素和調節機制。例如，S蛋白的糖基化修飾對膜融合過程具有重要影響。S蛋白上的糖基化位點分布廣泛，這些糖基化修飾不僅可以保護S蛋白免受宿主免疫系統的識別和攻擊，還可能參與調節S蛋白的構象變化和膜融合活性。研究發現，某些糖基化位點的缺失或修飾異常，會導致S蛋白構象變化受阻，膜融合效率降低。此外，宿主細胞內的一些分子伴侶和輔助蛋白也可能參與S蛋白介導的膜融合過程。它們可能通過與S蛋白相互作用，協助S蛋白完成正確的構象變化，或者調節膜融合過程中的一些關鍵分子事件。例如，宿主細胞內的某些熱休克蛋白（HSPs）被發現能夠與MHVS蛋白相互作用，在S蛋白的折疊、組裝以及膜融合過程中發揮輔助作用。2.3pH對生物大分子構象的影響機制pH值作為一個重要的環境因素，對蛋白質、核酸等生物大分子的構象有著顯著的影響，其作用機制涉及多個層面的分子相互作用。對于蛋白質而言，pH值的改變主要通過影響氨基酸殘基的電荷狀態來調控蛋白質的構象。蛋白質由眾多氨基酸通過肽鍵連接而成，每個氨基酸都包含一個氨基（-NH?）和一個羧基（-COOH），在不同的pH環境下，這些基團會發生質子化或去質子化反應。當pH值低于氨基酸的等電點（pI）時，氨基會結合質子（H?）而帶正電荷，羧基則保持質子化狀態；當pH值高于等電點時，羧基會失去質子而帶負電荷，氨基則保持去質子化狀態。這種電荷狀態的改變會導致蛋白質分子內和分子間靜電相互作用的變化。例如，在酸性條件下，蛋白質分子中帶正電荷的氨基酸殘基增多，分子內可能會因靜電排斥作用增強而使蛋白質的構象變得相對松散；在堿性條件下，帶負電荷的氨基酸殘基增多，同樣可能改變蛋白質的靜電相互作用網絡，影響其構象。特別地，組氨酸殘基在pH對蛋白質構象影響中具有獨特作用。組氨酸的側鏈含有一個咪唑基，其pKa值接近中性（約為6.0）。這使得在生理pH值附近，組氨酸殘基容易受到pH值微小變化的影響而發生質子化和去質子化反應。當組氨酸殘基質子化時，咪唑基帶上正電荷，會與周圍帶負電荷的氨基酸殘基產生靜電相互作用，或者破壞原有的氫鍵網絡；當組氨酸殘基去質子化時，其電荷狀態和空間結構的改變也會對蛋白質的局部和整體構象產生影響。在許多蛋白質中，組氨酸殘基位于關鍵的結構域或功能區域，其質子化狀態的改變可以作為pH變化的“傳感器”，引發蛋白質構象的級聯變化。例如，在一些酶蛋白中，組氨酸殘基參與構成活性中心，pH值的改變通過影響組氨酸的質子化狀態，進而影響酶與底物的結合能力和催化活性。除了靜電相互作用，pH值還會影響蛋白質分子內的氫鍵、疏水相互作用等非共價相互作用。氫鍵是維持蛋白質二級和三級結構的重要作用力之一，pH值的變化可能會改變氨基酸殘基的質子化狀態，從而影響氫鍵的形成和斷裂。例如，某些氨基酸殘基在特定pH值下才能形成穩定的氫鍵，當pH值改變時，這些氫鍵可能被破壞，導致蛋白質的二級結構（如α-螺旋、β-折疊等）發生改變，進而影響三級結構。疏水相互作用也是維持蛋白質結構穩定的重要因素，在水溶液中，蛋白質的疏水氨基酸殘基傾向于聚集在分子內部，形成疏水核心，以減少與水分子的接觸。pH值的變化可能會影響蛋白質分子的電荷分布和水化層結構，進而影響疏水相互作用的強度。在極端pH條件下，蛋白質分子的電荷分布發生顯著改變，可能會破壞疏水核心的穩定性，導致蛋白質的構象發生劇烈變化，甚至發生變性。對于核酸等生物大分子，pH值同樣會產生重要影響。以DNA為例，DNA分子由磷酸基團、脫氧核糖和堿基組成。磷酸基團在生理pH值下帶負電荷，使得DNA分子整體呈酸性。當pH值降低時，溶液中的質子濃度增加，可能會與DNA分子上的磷酸基團結合，中和其負電荷，削弱DNA雙鏈之間的靜電斥力，使雙鏈結構變得相對不穩定。同時，pH值的改變還可能影響堿基之間的氫鍵相互作用。DNA雙鏈中，A與T之間通過兩個氫鍵配對，G與C之間通過三個氫鍵配對，pH值的變化可能會影響這些氫鍵的穩定性，進而影響DNA的雙鏈結構和高級結構。在堿性條件下，DNA分子可能會發生去質子化反應，導致堿基的化學性質發生改變，同樣可能影響DNA的結構和功能。此外，RNA分子由于含有核糖，其羥基在堿性條件下更容易發生水解反應，導致RNA分子的降解，從而影響其結構和功能。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1主要試劑及培養基本實驗選用的主要試劑包括：限制性內切酶，如EcoRI、BamHI等，購自NEB公司，其純度高，酶切活性穩定，用于DNA片段的切割，在構建突變體質粒時可精準切割目的基因和載體；T4DNA連接酶，同樣來自NEB公司，能高效催化DNA片段的連接反應，實現目的基因與載體的連接，確保突變體質粒構建的準確性；高保真DNA聚合酶，如Q5High-FidelityDNAPolymerase，購自NEB公司，其保真度高，可有效減少PCR擴增過程中的堿基錯配，保證擴增的S蛋白基因序列的準確性；dNTPMix，由四種脫氧核糖核苷酸組成，購自ThermoFisherScientific公司，用于DNA合成，在PCR擴增和質粒構建過程中為DNA合成提供原料；DNAMarker，購自TaKaRa公司，包含不同大小的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳中用于判斷DNA片段的大小，方便對實驗結果進行分析；蛋白質Marker，購自ThermoFisherScientific公司，含有多種已知分子量的蛋白質，在SDS-PAGE電泳中用于確定蛋白質的分子量，便于檢測S蛋白的表達情況。此外，還有用于細胞培養的胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS），購自Gibco公司，富含多種細胞生長必需的營養成分和生長因子，能為細胞提供良好的生長環境，促進細胞的增殖和存活；DMEM培養基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium），購自Gibco公司，是一種常用的細胞培養基，含有豐富的氨基酸、維生素、糖類等營養物質，適用于多種細胞的培養，本實驗中用于培養表達S蛋白和受體蛋白的細胞；Opti-MEM減血清培養基，購自Gibco公司，在細胞轉染實驗中使用，可減少血清對轉染效率的影響，提高轉染效果；Lipofectamine3000轉染試劑，購自Invitrogen公司，是一種高效的脂質體轉染試劑，能夠將質粒等核酸分子高效導入細胞內，實現基因的表達。用于蛋白質檢測的試劑有：兔抗小鼠肝炎病毒S蛋白多克隆抗體，購自Abcam公司，具有高特異性和親和力，能特異性識別MHVS蛋白，用于Westernblot和免疫熒光等實驗中檢測S蛋白的表達和定位；羊抗兔IgG-HRP（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G）二抗，購自JacksonImmunoResearch公司，與一抗結合后，通過HRP催化底物顯色，用于Westernblot檢測中放大信號，增強檢測的靈敏度；ECL化學發光底物，購自ThermoFisherScientific公司，在Westernblot檢測中，與HRP反應產生化學發光信號，使蛋白質條帶在凝膠成像系統下清晰可見。用于細胞融合實驗的熒光染料，如CFSE（羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯）和DiI（1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate），購自ThermoFisherScientific公司，CFSE可標記細胞的細胞質，DiI可標記細胞膜，在細胞融合實驗中，通過共聚焦顯微鏡觀察兩種熒光信號的融合情況，定量分析細胞融合效率。3.1.2主要儀器設備本實驗用到的主要儀器設備有：高速冷凍離心機，型號為ThermoScientificSorvallST8，購自賽默飛世爾科技公司，最大轉速可達15,000rpm，具備冷凍功能，可在低溫下進行離心操作，用于細胞破碎后的蛋白質和核酸分離、病毒顆粒的濃縮等，能有效保持生物樣品的活性和穩定性；PCR儀，型號為Bio-RadT100，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，可精確控制PCR反應的溫度和時間，實現DNA的擴增，用于S蛋白基因的擴增以及定點突變引物的擴增；恒溫培養箱，型號為ThermoScientificHeracellVIOS160i，購自賽默飛世爾科技公司，能夠提供穩定的溫度、濕度和CO?濃度環境，用于細胞的培養，維持細胞的正常生長和代謝；二氧化碳培養箱，型號為ESCOOptiCellCO?Incubator，購自藝思高生物科技（蘇州）有限公司，同樣可精確控制CO?濃度和溫度，為細胞培養提供適宜條件，確保細胞在培養過程中保持良好的生長狀態；酶標儀，型號為Bio-TekSynergyH1，購自伯騰儀器有限公司，可用于檢測酶聯免疫吸附實驗（ELISA）中的吸光度值，在本實驗中可用于定量分析蛋白質的表達水平、受體結合實驗中的信號檢測等；流式細胞儀，型號為BDFACSCantoII，購自美國BD公司，能夠對細胞進行快速、準確的分析和分選，在本實驗中用于檢測細胞表面S蛋白和受體蛋白的表達情況，通過熒光標記抗體與細胞表面蛋白結合，利用流式細胞儀檢測熒光強度，分析表達蛋白的細胞比例和熒光強度分布；共聚焦顯微鏡，型號為LeicaTCSSP8，購自徠卡顯微系統（上海）有限公司，具有高分辨率和高靈敏度，能夠對細胞進行三維成像，在細胞融合實驗中用于觀察細胞融合的動態過程，通過熒光標記的細胞，清晰地觀察融合細胞中熒光信號的變化，統計融合細胞的數量，計算融合效率；冷凍離心機，型號為Sigma3-18K，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，可在低溫下進行高速離心，用于蛋白質純化過程中的樣品處理，避免蛋白質在高溫下變性，保證蛋白質的活性和結構完整性；電泳儀，型號為Bio-RadPowerPacBasic，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，用于核酸和蛋白質的電泳分離，通過電場作用使DNA和蛋白質在凝膠中遷移，根據分子量大小分離不同的片段，便于后續的檢測和分析；凝膠成像系統，型號為Bio-RadChemiDocMP，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，可對電泳后的凝膠進行成像和分析，通過檢測熒光或化學發光信號，拍攝凝膠圖像，對蛋白質和核酸條帶進行定量分析，確定目的條帶的含量和純度。3.1.3主要耗材實驗過程中使用的主要耗材包括：細胞培養皿，規格有6孔板、12孔板、24孔板等，購自Corning公司，采用優質聚苯乙烯材料制成，表面經過特殊處理，有利于細胞的貼壁生長，用于細胞的培養和傳代；移液器吸頭，包括10μL、200μL、1000μL等不同規格，購自Axygen公司，采用高品質塑料制成，具有良好的密封性和準確性，用于準確移取各種試劑和樣品；離心管，規格有1.5mL、2mL、5mL、15mL、50mL等，購自Eppendorf公司，由高強度塑料制成，可耐受高速離心，用于樣品的離心和儲存；PCR管，規格為0.2mL和0.5mL，購自Axygen公司，專為PCR反應設計，能夠耐受PCR反應的高溫條件，保證反應的順利進行；96孔酶標板，購自Corning公司，用于酶標儀檢測實驗，其材質和表面處理適合蛋白質和細胞的吸附，便于進行ELISA等實驗；PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜），購自Millipore公司，具有良好的蛋白質吸附性能和化學穩定性，在Westernblot實驗中用于蛋白質的轉印，將凝膠中的蛋白質轉移到膜上，便于后續的檢測；瓊脂糖，購自Sigma公司，用于制備瓊脂糖凝膠，在核酸電泳中根據DNA片段的大小進行分離；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，購自Bio-Rad公司，包含制備SDS-PAGE凝膠所需的各種試劑和材料，可方便快捷地制備不同濃度的凝膠，用于蛋白質的分離和檢測；透析袋，購自Spectrum公司，用于蛋白質的透析，去除蛋白質樣品中的雜質和鹽分，提高蛋白質的純度；超濾管，規格有3K、10K、30K等截留分子量，購自Millipore公司，利用超濾原理對蛋白質溶液進行濃縮和脫鹽處理，可有效提高蛋白質的濃度，同時去除小分子雜質。3.1.4菌株、質粒和細胞實驗選用的菌株為大腸桿菌DH5α，購自天根生化科技（北京）有限公司，該菌株具有易于轉化、生長迅速等特點，常用于質粒的擴增和保存。實驗中使用的質粒包括：表達小鼠肝炎病毒S蛋白的質粒pCMV-MHV-S，由本實驗室前期構建保存，該質粒以pCMV為載體，包含MHVS蛋白的完整編碼基因，可在真核細胞中高效表達S蛋白；表達MHVS蛋白受體CEACAM1a的質粒pEGFP-CEACAM1a，同樣由本實驗室構建保存，以pEGFP為載體，將CEACAM1a基因與綠色熒光蛋白（GFP）基因融合表達，便于通過熒光觀察受體蛋白的表達和定位；用于包裝MHV假病毒的輔助質粒psPAX2和pMD2.G，購自Addgene公司，在假病毒包裝過程中，與pCMV-MHV-S質粒共轉染至細胞中，提供病毒包裝所需的各種蛋白，協助產生具有感染性的假病毒顆粒。實驗選用的細胞系為HEK293T細胞，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，該細胞系來源于人胚腎細胞，具有生長快、易于轉染等優點，常用于基因表達和病毒包裝等實驗；小鼠肝癌細胞系Hepa1-6，購自ATCC（AmericanTypeCultureCollection），對MHV具有較高的敏感性，可用于病毒感染實驗、重組病毒的拯救以及研究病毒感染過程中S蛋白的功能和構象變化。在實驗前，所有細胞均在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃、5%CO?的恒溫培養箱中培養，定期傳代，確保細胞處于良好的生長狀態。3.2實驗方法3.2.1常用溶液的配方及配制PBS緩沖液（磷酸鹽緩沖液，PhosphateBufferedSaline）：稱取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa?HPO?和0.24gKH?PO?，將這些試劑加入到800mL去離子水中，充分攪拌溶解，用HCl或NaOH調節pH值至7.4，然后加去離子水定容至1000mL。將配制好的PBS緩沖液分裝到合適的容器中，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻后4℃保存備用。PBS緩沖液常用于細胞培養過程中的細胞洗滌、蛋白樣品的稀釋和保存等，其pH值接近生理pH，能夠維持細胞和蛋白質的正常生理狀態。RIPA裂解液（RadioImmunoprecipitationAssayLysisBuffer）：在90mL去離子水中依次加入5mL1MTris-HCl（pH7.4）、10mL5MNaCl、1mL10%NP-40、0.5mL10%脫氧膽酸鈉和0.1mL100mMPMSF（苯甲基磺酰氟，使用前加入）。充分混勻后，用HCl或NaOH調節pH值至7.4，最后加去離子水定容至100mL。RIPA裂解液用于細胞總蛋白的提取，其含有多種去污劑，能夠有效裂解細胞，釋放細胞內的蛋白質，同時PMSF可以抑制蛋白酶的活性，防止蛋白降解。SDS-PAGE凝膠電泳相關溶液：30%丙烯酰胺溶液：稱取29.0g丙烯酰胺和1.0gN,N'-亞甲雙丙烯酰胺，加入去離子水溶解并定容至100mL，過濾后4℃避光保存。丙烯酰胺和N,N'-亞甲雙丙烯酰胺是SDS-PAGE凝膠的主要成分，在催化劑和引發劑的作用下聚合形成凝膠，用于蛋白質的分離。1.5MTris-HCl（pH8.8）：稱取18.17gTris（三羥甲基氨基甲烷），加入80mL去離子水溶解，用HCl調節pH值至8.8，然后加去離子水定容至100mL。該溶液用于制備分離膠，為凝膠提供合適的緩沖環境。1.0MTris-HCl（pH6.8）：稱取12.11gTris，加入80mL去離子水溶解，用HCl調節pH值至6.8，加去離子水定容至100mL。主要用于制備濃縮膠，與分離膠形成不同的pH環境，使蛋白質在電泳過程中能夠更好地聚焦和分離。10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：稱取10gSDS，加入去離子水加熱攪拌溶解，定容至100mL。SDS是一種陰離子去污劑，能夠使蛋白質變性并帶上負電荷，消除蛋白質分子間的電荷差異和結構差異，使蛋白質在電場中的遷移率僅與分子量有關。10%過硫酸銨（APS）：稱取1g過硫酸銨，加入去離子水溶解并定容至10mL，現用現配。APS作為引發劑，在TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）的催化下，引發丙烯酰胺和N,N'-亞甲雙丙烯酰胺的聚合反應。TEMED：無需配制，直接使用。TEMED作為加速劑，加速APS引發的聚合反應，使凝膠快速凝固。5×上樣緩沖液：在3mL去離子水中加入1.25mL1.0MTris-HCl（pH6.8）、2.0gSDS、0.5mL0.5MEDTA（乙二胺四乙酸，pH8.0）、5.0mL甘油、0.5mL1%溴酚藍和2.5mL2-巰基乙醇（使用前加入）。充分混勻后，分裝保存于-20℃。上樣緩沖液用于將蛋白質樣品進行處理，使其能夠在SDS-PAGE凝膠中有效分離，其中的溴酚藍作為指示劑，指示電泳的進程；2-巰基乙醇用于還原蛋白質中的二硫鍵，使蛋白質充分變性。轉膜緩沖液：稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris、0.37gSDS，加入去離子水溶解，再加入200mL甲醇，最后加去離子水定容至1000mL。轉膜緩沖液用于將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質轉移到PVDF膜上，甲醇的作用是使蛋白質與凝膠結合更緊密，同時增加膜的疏水性，有利于蛋白質的轉移。封閉液：用PBS緩沖液配制5%脫脂牛奶溶液，即稱取5g脫脂奶粉，加入100mLPBS緩沖液，充分攪拌溶解。封閉液用于在Westernblot實驗中封閉PVDF膜上的非特異性結合位點，減少背景干擾。TBST緩沖液（Tris-BufferedSalineTween-20）：在900mL去離子水中加入100mL10×TBS（Tris-緩沖鹽水）緩沖液和1mLTween-20，充分混勻。10×TBS緩沖液的配制方法為：稱取80gNaCl、24.2gTris，加入800mL去離子水溶解，用HCl調節pH值至7.6，然后加去離子水定容至1000mL。TBST緩沖液常用于Westernblot實驗中的膜洗滌步驟，Tween-20作為表面活性劑，能夠降低液體的表面張力，增強洗滌效果，去除未結合的抗體和雜質。3.2.2突變質粒的構建引物設計：根據生物信息學分析預測的小鼠肝炎病毒（MHV）S蛋白中可能對pH敏感的氨基酸殘基，尤其是組氨酸殘基，使用PrimerPremier5.0軟件設計定點突變引物。引物設計原則如下：突變位點位于引物的中間位置，兩側分別保證有15-20個堿基與模板互補配對，以確保引物與模板的特異性結合；引物長度一般在30-40bp之間，GC含量在40%-60%之間，以保證引物的穩定性和擴增效率；上下游引物的Tm值（解鏈溫度）盡量相近，差值控制在5℃以內，以保證PCR擴增的特異性和一致性。例如，針對S蛋白中某個組氨酸殘基（如H209）的突變，設計上游引物5'-CTGCCCATCGACCCCGCTGACCCC-3'（下劃線部分為突變位點，將組氨酸對應的密碼子替換為目標氨基酸的密碼子），下游引物5'-GGGTCAGCGGGGTCGATGGGGCAG-3'。設計好的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增：以表達MHVS蛋白的質粒pCMV-MHV-S為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為50μL，包括5μL10×Q5High-FidelityDNAPolymerase緩沖液、1μLdNTPMix（10mMeach）、上下游引物各1μL（10μM）、1μL模板質粒（約50ng）、0.5μLQ5High-FidelityDNAPolymerase（2U/μL）和39.5μL去離子水。PCR反應程序如下：98℃預變性30秒；98℃變性10秒，60℃退火30秒（根據引物Tm值適當調整退火溫度），72℃延伸1分鐘（根據擴增片段長度調整延伸時間，一般每1kb延伸1分鐘），共進行30個循環；最后72℃延伸5分鐘。使用PCR儀（Bio-RadT100）進行擴增。擴增結束后，取5μLPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察擴增條帶的大小和特異性。若擴增條帶大小與預期相符且無雜帶，則表明擴增成功。酶切連接：將PCR擴增產物和表達載體pCMV-MHV-S分別用相應的限制性內切酶進行雙酶切。根據引物設計時引入的酶切位點，選擇合適的限制性內切酶，如EcoRI和BamHI。酶切反應體系為20μL，包括2μL10×限制性內切酶緩沖液、1μL限制性內切酶（10U/μL）、10μLPCR產物或質粒DNA和7μL去離子水。37℃孵育2-3小時。酶切結束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒（Qiagen）回收酶切后的目的片段和載體片段。將回收的目的片段和載體片段按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進行連接反應。連接反應體系為10μL，包括1μL10×T4DNA連接酶緩沖液、1μLT4DNA連接酶（3U/μL）、3μL回收的目的片段、3μL回收的載體片段和2μL去離子水。16℃孵育過夜。轉化與篩選：將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。取50μLDH5α感受態細胞，加入5μL連接產物，輕輕混勻，冰浴30分鐘；然后42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘；加入500μL無抗生素的LB培養基，37℃振蕩培養1小時，使細菌復蘇。將復蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養過夜。次日，挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養12-16小時。質粒提取與鑒定：使用質粒小提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取培養菌液中的質粒。按照試劑盒說明書進行操作，最后將提取的質粒溶解在適量的去離子水中。采用雙酶切鑒定和測序鑒定兩種方法對提取的質粒進行鑒定。雙酶切鑒定方法與上述酶切連接中的酶切反應相同，將提取的質粒進行雙酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切條帶的大小和數量，判斷是否為正確的重組質粒。測序鑒定則將提取的質粒送至上文提到的生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結果與預期的突變序列進行比對，確保突變位點準確無誤，且無其他堿基突變。3.2.3受體蛋白的真核表達載體構建：以表達MHVS蛋白受體CEACAM1a的質粒pEGFP-CEACAM1a為基礎，使用限制性內切酶EcoRI和BamHI對其進行雙酶切，回收含有CEACAM1a基因的片段。同時，對真核表達載體pcDNA3.1進行同樣的雙酶切處理，回收線性化的載體片段。將回收的CEACAM1a基因片段與線性化的pcDNA3.1載體片段按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進行連接反應，連接體系和條件同突變質粒構建中的酶切連接步驟。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆。提取陽性克隆中的質粒，進行雙酶切鑒定和測序鑒定，確保CEACAM1a基因正確插入到pcDNA3.1載體中，且序列無誤。轉染細胞：將處于對數生長期的HEK293T細胞以1×10?個/孔的密度接種到6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養基。將細胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱中培養24小時，待細胞融合度達到70%-80%時進行轉染。轉染前，將Opti-MEM減血清培養基和Lipofectamine3000轉染試劑按照試劑說明書進行稀釋。具體操作如下：在一個無菌EP管中加入100μLOpti-MEM培養基，再加入2μLLipofectamine3000轉染試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；在另一個無菌EP管中加入100μLOpti-MEM培養基，加入1μg構建好的表達CEACAM1a的重組質粒，輕輕混勻。然后將含有Lipofectamine3000轉染試劑的溶液逐滴加入到含有重組質粒的溶液中，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成脂質體-質粒復合物。將6孔板中的培養基吸出，用PBS緩沖液洗滌細胞1-2次，然后每孔加入800μLOpti-MEM培養基。將孵育好的脂質體-質粒復合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，將6孔板放回恒溫培養箱中繼續培養。表達檢測：轉染后48-72小時，進行受體蛋白CEACAM1a的表達檢測。對于細胞內表達檢測，棄去6孔板中的培養基，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，然后每孔加入150μLRIPA裂解液，冰上裂解30分鐘。將裂解后的細胞懸液轉移至1.5mL離心管中，4℃、12,000rpm離心15分鐘，取上清液作為細胞總蛋白樣品。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，然后通過Westernblot檢測CEACAM1a的表達情況。以β-actin作為內參，使用兔抗小鼠CEACAM1a多克隆抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP二抗進行檢測，通過ECL化學發光底物顯色，在凝膠成像系統下觀察并拍照記錄條帶。對于細胞表面表達檢測，將轉染后的細胞用胰酶消化，收集細胞并重懸于PBS中，調整細胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液，加入1μLFITC標記的鼠抗人CEACAM1a單克隆抗體，4℃避光孵育30分鐘。用PBS洗滌細胞3次，去除未結合的抗體。將細胞重懸于500μLPBS中，利用流式細胞儀檢測細胞表面熒光強度，分析表達CEACAM1a的細胞比例和熒光強度分布，從而確定受體蛋白在細胞表面的表達情況。3.2.4細胞轉染轉染前準備：將HEK293T細胞或Hepa1-6細胞接種到相應的細胞培養皿中，如6孔板、12孔板或24孔板，接種密度根據實驗需求和細胞生長特性進行調整。一般情況下，將處于對數生長期的細胞以適當密度接種，使細胞在轉染時達到合適的融合度。例如，在6孔板中，將HEK293T細胞以1×10?個/孔的密度接種，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱中培養。在轉染前24小時，更換一次培養基，以保證細胞處于良好的生長狀態。同時，準備好轉染所需的試劑和耗材，包括待轉染的質粒DNA、Lipofectamine3000轉染試劑、Opti-MEM減血清培養基、無菌EP管、移液器吸頭等。轉染試劑與質粒混合：根據轉染細胞的數量和培養皿的規格，按照Lipofectamine3000轉染試劑的說明書確定質粒DNA和轉染試劑的用量。一般來說，在6孔板中進行轉染時，每孔使用1-2μg質粒DNA和2-4μLLipofectamine3000轉染試劑。在無菌EP管中，先加入適量的Opti-MEM減血清培養基，如100μL，然后加入所需量的Lipofectamine3000轉染試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。在另一個無菌EP管中，加入相同體積的Opti-MEM培養基，再加入相應量的質粒DNA，輕輕混勻。將孵育后的含有Lipofectamine3000轉染試劑的溶液逐滴加入到含有質粒DNA的溶液中，邊加邊輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使脂質體與質粒DNA充分結合，形成脂質體-質粒復合物。轉染細胞：將培養皿中的培養基吸出，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞1-2次，去除殘留的血清和雜質。每孔加入適量的Opti-MEM培養基，如6孔板中每孔加入800μL。將孵育好的脂質體-質粒復合物逐滴加入到培養皿中，輕輕搖勻，使復合物均勻分布在細胞表面。將培養皿放回37℃、5%CO?的恒溫培養箱中繼續培養。轉染后4-6小時四、實驗結果與分析4.1MHVA59野生型S蛋白構象變化情況本實驗通過多種技術手段，對MHVA59野生型S蛋白在不同條件下的構象變化進行了深入研究。利用表面等離子共振（SPR）技術和生物膜層干涉技術（BLI），監測S蛋白與受體的結合動力學，同時運用熒光標記和熒光光譜技術，追蹤S蛋白在不同pH值下的構象變化。在有受體存在的條件下，將表達MHVA59野生型S蛋白的細胞與表達受體CEACAM1a的細胞共培養。通過免疫共沉淀（Co-IP）實驗，成功驗證了S蛋白與CEACAM1a之間的特異性相互作用。結果顯示，在生理pH值（pH7.4）條件下，S蛋白能夠迅速與CEACAM1a結合，形成穩定的復合物。進一步利用SPR技術測定兩者的結合親和力，得到其平衡解離常數（KD）值為[X]nM，表明S蛋白與CEACAM1a具有較高的親和力。在結合過程中，通過熒光共振能量轉移（FRET）實驗，監測到S蛋白的構象發生了明顯變化。隨著S蛋白與CEACAM1a的結合，FRET效率逐漸增加，從初始的[初始FRET效率值1]上升到結合后的[結合后FRET效率值1]，這表明S蛋白的構象逐漸從初始的預融合狀態向有利于膜融合的狀態轉變，S1亞基與S2亞基之間的相對位置發生改變，S1亞基的構象重排使得S2亞基上的部分結構域暴露，為后續的膜融合過程做好準備。在pH8.0且無受體存在的條件下，對