PGRN激活mTOR信號通路驅動宮頸癌細胞遷移侵襲的機制探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1宮頸癌的現狀與危害宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的生命健康。據統計，其發病率在女性惡性腫瘤中位居前列，死亡率也不容小覷。在發展中國家，由于醫療資源有限、篩查普及程度不足等原因，宮頸癌的發病率和死亡率更是居高不下。高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續感染是宮頸癌發生的主要病因，然而，除了HPV感染外，還有許多其他因素參與了宮頸癌的發生發展過程。宮頸癌不僅給患者帶來身體上的痛苦，還對其心理和生活質量造成了極大的負面影響，給家庭和社會帶來沉重的負擔。1.1.2PGRN和mTOR信號通路在癌癥研究中的重要性顆粒蛋白前體（PGRN）是一種分泌性生長因子，在多種生理過程中發揮重要作用，如胚胎發育、組織修復和炎癥調節等。近年來，越來越多的研究表明，PGRN在多種腫瘤中異常表達，并參與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥等過程。在乳腺癌、卵巢癌和肝癌等腫瘤中，PGRN的高表達與腫瘤的不良預后相關。mTOR信號通路是細胞內重要的信號傳導通路之一，對細胞的生長、增殖、代謝和存活等過程起著關鍵的調控作用。該通路的異常激活在多種惡性腫瘤中普遍存在，包括宮頸癌。mTOR通過感知細胞內的營養、能量和生長因子等信號，調節下游一系列靶蛋白的活性，從而影響腫瘤細胞的生物學行為。由于PGRN和mTOR信號通路在腫瘤發生發展中的關鍵作用，它們成為了癌癥治療的潛在重要靶點，深入研究它們之間的相互作用機制，對于開發新的癌癥治療策略具有重要意義。1.1.3研究目的與創新點本研究旨在深入探究PGRN通過mTOR信號通路促進宮頸癌細胞遷移與侵襲的具體機制。通過一系列實驗，明確PGRN在宮頸癌細胞中的表達情況，以及其對mTOR信號通路的調控作用，進一步揭示PGRN影響宮頸癌細胞遷移與侵襲能力的分子機制。本研究的創新點在于，首次系統地研究PGRN與mTOR信號通路在宮頸癌細胞遷移與侵襲過程中的關聯，為宮頸癌的發病機制研究提供了新的視角。此外，研究結果有望為宮頸癌的治療提供新的潛在靶點和治療策略，具有重要的理論和臨床應用價值。1.2國內外研究現狀在國外，對于PGRN在腫瘤領域的研究起步較早，大量研究表明PGRN在多種腫瘤組織和細胞系中呈現高表達狀態。在乳腺癌的研究中，有學者發現PGRN能夠促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其高表達與乳腺癌的不良預后顯著相關。在卵巢癌的研究中，相關實驗證實PGRN可通過誘導上皮間質轉化（EMT）過程，增強卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力。在宮頸癌的研究方面，國外有研究利用免疫組化和Westernblot技術，分析了PGRN在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達差異，結果顯示PGRN在宮頸癌組織中的表達明顯高于正常組織，且與宮頸癌的臨床分期、淋巴結轉移等因素密切相關。同時，通過細胞實驗發現，抑制PGRN的表達能夠顯著降低宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。在國內，對于PGRN與腫瘤關系的研究也在不斷深入。在肝癌的研究中，國內學者發現PGRN可以通過激活PI3K/Akt信號通路，促進肝癌細胞的增殖和抑制其凋亡。在對肺癌的研究中，研究人員發現PGRN在肺癌組織中的表達水平與腫瘤的大小、病理分期和淋巴結轉移密切相關，沉默PGRN基因可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。在宮頸癌的研究上，國內團隊通過實時熒光定量PCR和免疫印跡實驗，驗證了PGRN在宮頸癌細胞系中的高表達情況，并且發現過表達PGRN可促進宮頸癌細胞的增殖，抑制細胞凋亡。此外，國內研究還表明，PGRN可能通過與其他分子相互作用，參與宮頸癌的發生發展過程，但具體機制尚未完全明確。mTOR信號通路作為細胞內重要的信號傳導通路，在腫瘤研究領域一直是熱點。國外眾多研究表明，mTOR信號通路的異常激活在多種惡性腫瘤中普遍存在。在結直腸癌的研究中，研究發現mTOR信號通路的激活可促進結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并且與腫瘤的血管生成密切相關。在黑色素瘤的研究中，有實驗證實抑制mTOR信號通路能夠顯著抑制黑色素瘤細胞的生長和轉移，誘導細胞凋亡。在宮頸癌的研究中，國外有研究通過基因芯片技術和生物信息學分析，發現mTOR信號通路相關基因在宮頸癌組織中存在異常表達，進一步的細胞實驗表明，抑制mTOR信號通路可以降低宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力。國內對于mTOR信號通路與腫瘤關系的研究也取得了一定成果。在胃癌的研究中，國內學者發現mTOR信號通路的激活與胃癌的發生、發展和預后密切相關，通過抑制mTOR信號通路，可以抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡。在食管癌的研究中，研究人員發現mTOR信號通路在食管癌組織中呈現高活性狀態，并且與腫瘤的病理分級、淋巴結轉移等因素相關。在宮頸癌的研究方面，國內研究通過體內外實驗證實，mTOR信號通路的激活可促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲，抑制該通路能夠增強宮頸癌細胞對放療和化療的敏感性。然而，目前國內外關于PGRN與mTOR信號通路在宮頸癌細胞遷移與侵襲方面的研究還存在一定的不足。大多數研究僅關注了PGRN或mTOR信號通路單獨對宮頸癌細胞生物學行為的影響，而對于PGRN如何通過mTOR信號通路來調控宮頸癌細胞遷移與侵襲的具體分子機制研究較少。此外，雖然已有研究表明PGRN和mTOR信號通路在宮頸癌中存在異常表達和激活，但對于它們在宮頸癌發生發展過程中的相互作用關系以及在不同臨床病理特征下的變化規律，仍缺乏深入系統的研究。這些不足之處為本研究提供了方向，本研究將致力于深入探究PGRN通過mTOR信號通路促進宮頸癌細胞遷移與侵襲的具體機制，填補該領域的研究空白。二、相關理論基礎2.1PGRN概述2.1.1PGRN的結構與功能顆粒蛋白前體（PGRN）是一種多功能分泌型糖蛋白，又被稱為顆粒蛋白-上皮蛋白前體、原上皮蛋白或前列腺癌細胞衍生的生長因子1。其編碼基因定位于染色體17q21.32，含有12個外顯子，可產生3種異構體。全長的PGRN具有獨特的串珠狀結構，由7.5個富含半胱氨酸的GRN結構域串聯重復組成。這些結構域通過6個二硫鍵緊密連接，形成4個“發夾”結構并呈梯形排列，這種特殊的結構對于維持PGRN適當的蛋白質折疊和獨特構象至關重要。PGRN相對分子質量約為68.5kDa，在被多種蛋白酶水解后，會在GRN結構域之間的連接區裂解，釋放出相對分子質量約為6kDa的單體GRN多肽片段。PGRN在多種細胞中廣泛表達，如造血細胞、上皮細胞、免疫細胞、巨噬細胞和神經元細胞等，同時也在多種組織中存在，包括軟骨、骨骼肌、肺實質與脂肪組織。PGRN具有廣泛的生物學功能，在免疫調節、炎癥反應、感染調控、傷口愈合、血管生成、腫瘤發生和神經保護等過程中均發揮著關鍵作用。在炎癥反應中，完整的PGRN可以被基質金屬蛋白酶（MMP）9、MMP12、MMP14、蛋白酶3、中性粒細胞彈性蛋白酶等裂解形成PGRN和GRN，二者在組織細胞中發揮不同作用。其中，PGRN是一種重要的抗炎介質，局部給予重組PGRN能夠有效抑制體內中性粒細胞炎性因子的生成；而GRN則具有促炎特性，它可以刺激上皮細胞分泌白細胞介素（IL）-8，導致中性粒細胞的吞噬和殺菌作用增強。此外，分泌性白細胞蛋白酶抑制劑和載脂蛋白A1等分子能夠抑制PGRN的水解，它們可直接與PGRN結合并阻斷其被中性粒細胞彈性蛋白酶裂解，從而維持PGRN和GRN之間的平衡，這對于PGRN在炎性反應中發揮抗炎作用具有重要影響。在傷口愈合過程中，PGRN同樣發揮著重要作用。急性皮膚損傷后，PGRN在真皮成纖維細胞和內皮細胞中的表達會增加，外源性PGRN能夠促進中性粒細胞和巨噬細胞聚集，參與真皮成纖維細胞和內皮細胞的遷移以及血管生成，是一種在傷口愈合中起促炎作用的生長因子。在神經保護方面，中樞神經系統中PGRN參與神經保護和神經炎癥的調節。額顳葉癡呆（FTD）與GRN基因的功能缺失密切相關，研究表明，提高神經元PGRN水平可以糾正FTD小鼠模型的行為缺陷，而耗盡神經元PGRN則會造成FTD小鼠模型的行為缺陷。同時，測定腦脊液和血清PGRN水平可用于FTD患者的早期診斷和治療，這表明PGRN不僅是治療因GRN突變引起的FTD的重要靶點，還是預測病情的臨床標志物。2.1.2PGRN在腫瘤中的作用機制PGRN在腫瘤中的作用機制較為復雜，其既可以表現出促癌作用，也可能具有抑癌作用，這取決于腫瘤的類型、微環境以及其他多種因素。在大多數研究中，PGRN被發現具有促癌作用。在乳腺癌中，PGRN能夠促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。相關研究表明，PGRN可以通過激活PI3K/Akt信號通路，促進乳腺癌細胞的存活和增殖。同時，PGRN還可以上調一些與細胞遷移和侵襲相關的蛋白表達，如基質金屬蛋白酶（MMPs）等，從而增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。在卵巢癌中，PGRN可通過誘導上皮間質轉化（EMT）過程，增強卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力。EMT是指上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞特性的過程，這一過程使得腫瘤細胞更容易從原發部位脫離并發生轉移。研究發現，PGRN可以通過激活Wnt/β-catenin、AKT/mTOR等信號通路，誘導卵巢癌細胞發生EMT，進而促進腫瘤的侵襲和轉移。在肝癌中，PGRN可以通過激活PI3K/Akt信號通路，促進肝癌細胞的增殖和抑制其凋亡。PI3K/Akt信號通路在細胞的生長、增殖、存活等過程中起著關鍵作用，PGRN通過激活該通路，調節下游一系列靶蛋白的活性，從而影響肝癌細胞的生物學行為。在結直腸癌中，PGRN可以促進腫瘤血管生成和轉移。研究表明，PGRN可以通過成纖維細胞生長因子2（FGF2）誘導內皮細胞FGF受體表達，從而促進結直腸癌細胞的血管生成和轉移。腫瘤血管生成對于腫瘤的生長和轉移至關重要，它為腫瘤細胞提供營養和氧氣，并為腫瘤細胞進入血液循環提供途徑。然而，在某些情況下，PGRN也可能發揮抑癌作用。在神經母細胞瘤中，有研究發現PGRN的表達與腫瘤的惡性程度呈負相關，高表達PGRN的神經母細胞瘤細胞具有較低的增殖和侵襲能力。其機制可能是PGRN通過抑制一些促癌信號通路的激活，如Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，從而抑制神經母細胞瘤細胞的生長和轉移。此外，PGRN還可以通過調節細胞周期和誘導細胞凋亡等方式，發揮其抑癌作用。但總體而言，PGRN在腫瘤中的促癌作用更為常見，其具體作用機制仍有待進一步深入研究。2.2mTOR信號通路概述2.2.1mTOR信號通路的組成與激活機制mTOR，即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin），是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶（PIKK）家族。mTOR在細胞內形成兩種結構和功能上存在差異的多蛋白復合物，分別為mTOR復合物1（mTORC1）和mTOR復合物2（mTORC2），它們在細胞的生長、增殖、代謝等過程中發揮著關鍵的調控作用。mTORC1主要由mTOR、調節相關蛋白（RAPTOR）、哺乳動物致死SEC13蛋白8（MLST8）、富含脯氨酸的40kDa底物（PRAS40）以及含有mTOR相互作用蛋白DEP結構域的蛋白（DEPTOR）等組成。mTORC1的激活受到多種細胞信號的精細調控，其中生長因子、營養物質（如氨基酸、葡萄糖）、細胞能量水平以及應激條件等是主要的調節因素。在生長因子刺激方面，當胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）等生長因子與細胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTK）結合后，會引發受體的二聚化和自身磷酸化，進而激活下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。PI3K催化磷脂酰肌醇（4,5）二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇（3,4,5）三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使招募并激活蛋白激酶B（Akt）?；罨腁kt一方面可以直接磷酸化mTOR，另一方面可以通過磷酸化結節性硬化癥復合體（TSC1/TSC2）間接作用于mTOR。TSC1和TSC2形成的復合物具有GTP酶激活蛋白（GAP）活性，能夠使Ras同源物富集蛋白（Rheb）結合的GTP水解為GDP，從而抑制Rheb的活性。而Akt對TSC2的磷酸化會抑制TSC1/TSC2復合物的活性，使得Rheb-GTP水平升高，進而激活mTORC1。在營養物質調節方面，氨基酸是mTORC1激活的重要信號。當細胞內氨基酸充足時，氨基酸可以通過多種途徑激活mTORC1。例如，精氨酸可以與Sestrin2蛋白結合，抑制其對GATOR2復合物的抑制作用，從而使GATOR2激活Ragulator復合物，進而激活RagGTPases，最終激活mTORC1。亮氨酸等其他氨基酸也可以通過類似的機制，或者通過與不同的蛋白相互作用來激活mTORC1。此外，細胞內的能量水平也對mTORC1的激活起著重要作用。當細胞內能量充足時，ATP水平較高，AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）處于失活狀態。而當細胞能量不足時，AMP水平升高，AMPK被激活。激活的AMPK可以磷酸化TSC2，增強TSC1/TSC2復合物的活性，抑制Rheb的活性，從而抑制mTORC1的激活。這一機制確保了細胞在能量不足時，能夠減少蛋白質合成等耗能過程，以維持細胞的能量平衡。mTORC2主要由mTOR、雷帕霉素不敏感的mTOR結合蛋白（RICTOR）、哺乳動物應激激活蛋白激酶反應蛋白1（mSIN1）、TTI1/TEL2復合物、PROTOR1/2、PRR5以及MLST8等組成。mTORC2的激活機制相對復雜，目前尚未完全明確。研究表明，mTORC2的激活與PI3K/Akt信號通路密切相關。在胰島素等生長因子的刺激下，活化的PI3K促使mTORC2與核糖體結合，使其處于激活狀態。激活后的mTORC2和3-磷酸肌醇依賴的蛋白激酶-1（PDK1）雙重磷酸化Akt，使其完全活化。此外，mTORC2還參與調節細胞的代謝、存活和肌動蛋白細胞骨架的組織等過程。它可以通過磷酸化蛋白激酶C（PKC）家族成員等下游靶點，來調控細胞的多種生物學功能。2.2.2mTOR信號通路在腫瘤中的作用mTOR信號通路在腫瘤的發生、發展過程中起著至關重要的作用，其異常激活在多種惡性腫瘤中普遍存在，對腫瘤細胞的增殖、代謝、遷移和侵襲等生物學行為具有顯著的調控作用。在腫瘤細胞增殖方面，mTORC1的激活能夠促進蛋白質合成、核苷酸合成和脂質合成等過程，為細胞的增殖提供物質基礎。mTORC1可以磷酸化真核起始因子4E結合蛋白1（4E-BP1）和核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）。磷酸化的4E-BP1會從真核起始因子4E（eIF4E）上解離下來，使eIF4E能夠與eIF4G等其他起始因子結合，形成eIF4F復合物，從而促進mRNA的翻譯起始，尤其是那些編碼與細胞增殖和生長相關的蛋白質的mRNA，如周期蛋白D1（CyclinD1）等。CyclinD1在細胞周期的G1期向S期轉換過程中發揮關鍵作用，其表達增加會促進細胞的增殖。同時，磷酸化的S6K1可以激活一系列參與蛋白質合成的底物，如核糖體蛋白S6等，進一步促進蛋白質的合成，加速細胞的生長和增殖。在乳腺癌細胞中，研究發現mTORC1的持續激活會導致4E-BP1和S6K1的過度磷酸化，進而促進CyclinD1的表達，使細胞增殖速度加快。在腫瘤細胞代謝方面，mTOR信號通路參與調節腫瘤細胞的能量代謝和物質代謝重編程，以滿足腫瘤細胞快速生長和增殖的需求。mTORC1可以通過調節多種代謝相關酶和轉運蛋白的表達和活性，促進腫瘤細胞對葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等營養物質的攝取和利用。mTORC1可以上調葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）的表達，增加腫瘤細胞對葡萄糖的攝取。同時，它還可以激活磷酸果糖激酶1（PFK1）等糖酵解關鍵酶，促進糖酵解過程，使腫瘤細胞能夠通過糖酵解產生大量的ATP和中間代謝產物，用于合成生物大分子。這種代謝重編程使得腫瘤細胞在缺氧和營養物質有限的微環境中也能維持快速的生長和增殖。在肝癌細胞中，mTORC1的激活會導致GLUT1和PFK1的表達增加，糖酵解活性增強，腫瘤細胞的生長和存活能力提高。在腫瘤細胞遷移和侵襲方面，mTOR信號通路通過調節細胞骨架的重組、上皮間質轉化（EMT）以及細胞外基質的降解等過程，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。mTORC2可以通過磷酸化Akt，激活Rho家族小GTP酶（如Rac1、Cdc42等），這些小GTP酶參與調節肌動蛋白細胞骨架的動態變化，促進細胞的偽足形成和遷移。同時，mTOR信號通路的激活還可以誘導EMT過程。在這一過程中，mTOR通過激活相關信號分子，如Snail、Slug等轉錄因子，抑制上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，上調間質標志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）等的表達，使上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，從而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。此外，mTOR信號通路還可以通過調節基質金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達，促進細胞外基質的降解，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創造條件。在肺癌細胞中，研究表明抑制mTOR信號通路可以顯著降低Rac1的活性，減少偽足的形成，同時抑制EMT相關轉錄因子的表達，使E-cadherin表達上調，N-cadherin和Vimentin表達下調，從而抑制肺癌細胞的遷移和侵襲能力。2.3宮頸癌細胞遷移與侵襲的相關理論2.3.1宮頸癌細胞遷移與侵襲的過程宮頸癌細胞的遷移與侵襲是一個復雜且有序的過程，涉及多個步驟和細胞行為的顯著變化。這一過程不僅受到細胞自身內部信號通路的調控，還與細胞所處的外部微環境密切相關。首先，宮頸癌細胞需要與細胞外基質（ECM）相互作用。ECM是由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白質和糖胺聚糖組成的復雜網絡，它為細胞提供了結構支持和生化信號。在正常生理狀態下，上皮細胞通過細胞間連接（如緊密連接、黏著連接和橋粒）與相鄰細胞緊密相連，并通過基底膜與ECM分隔開來。然而，當宮頸癌細胞發生惡變時，其細胞間連接被破壞，細胞極性喪失。癌細胞表面的整合素等受體與ECM中的配體結合，這種結合不僅為癌細胞提供了附著點，還激活了細胞內的一系列信號通路，如FAK（粘著斑激酶）-Src信號通路等。這些信號通路的激活促使癌細胞發生形態改變，形成偽足結構，如絲狀偽足和片狀偽足。絲狀偽足是一種細長的、富含肌動蛋白的結構，它能夠探測細胞周圍的環境，為癌細胞的遷移提供方向信息；片狀偽足則是一種扁平的、寬大的結構，主要負責癌細胞的前端擴展和推進。在遷移過程中，癌細胞通過不斷地伸出和回縮偽足，實現與ECM的動態黏附和脫離。當偽足與ECM接觸時，會形成新的黏著斑，這些黏著斑通過細胞骨架（主要是肌動蛋白絲）與細胞內部相連。肌動蛋白絲的聚合和解聚產生的力推動偽足向前伸展，同時，細胞后部的黏著斑逐漸解離，使細胞得以向前移動。這一過程需要多種分子的協同作用，如肌球蛋白等分子馬達蛋白，它們能夠與肌動蛋白絲相互作用，產生收縮力，推動細胞前進。當宮頸癌細胞到達基底膜時，需要降解基底膜以實現侵襲?；啄な且粚佑散粜湍z原蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等組成的致密結構，它對癌細胞的侵襲起到了重要的屏障作用。癌細胞通過分泌多種蛋白酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs）、絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等，來降解基底膜和ECM中的成分。MMPs是一類鋅離子依賴的內肽酶，在癌細胞侵襲過程中發揮著關鍵作用。例如，MMP-2和MMP-9能夠降解Ⅳ型膠原蛋白和纖連蛋白，為癌細胞的侵襲開辟道路。絲氨酸蛋白酶如尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）及其受體（uPAR）也參與了基底膜的降解過程。uPA能夠將纖溶酶原轉化為纖溶酶，纖溶酶具有廣泛的蛋白水解活性，可降解多種ECM成分，同時還能激活其他蛋白酶，如MMPs，進一步促進基底膜的降解。在降解基底膜后，宮頸癌細胞進入周圍組織，并繼續遷移和侵襲。在這個過程中，癌細胞會遇到各種細胞和分子信號，如生長因子、細胞因子和趨化因子等。這些信號可以調節癌細胞的遷移和侵襲行為。例如，表皮生長因子（EGF）和肝細胞生長因子（HGF）等生長因子可以與癌細胞表面的受體結合，激活下游的Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt等信號通路，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲。同時，癌細胞還會招募周圍的基質細胞，如成纖維細胞和免疫細胞等，形成腫瘤微環境。腫瘤微環境中的細胞和分子相互作用，為癌細胞的生長、存活和轉移提供了有利條件。2.3.2影響宮頸癌細胞遷移與侵襲的因素宮頸癌細胞的遷移與侵襲能力受到多種因素的綜合影響，這些因素可以分為內在基因改變和外在微環境因素兩個方面，它們相互作用，共同調控著癌細胞的轉移行為。內在基因改變是影響宮頸癌細胞遷移與侵襲的關鍵因素之一?；蛲蛔兒突虮磉_異常在宮頸癌的發生發展過程中起著重要作用，許多基因的改變直接或間接地影響了癌細胞的遷移和侵襲能力。腫瘤抑制基因的失活是導致宮頸癌細胞惡性行為增強的重要原因之一。p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，它在細胞周期調控、DNA損傷修復和細胞凋亡等過程中發揮著關鍵作用。在宮頸癌中，p53基因常常發生突變或缺失，導致其功能喪失。p53基因的失活使得癌細胞能夠逃避細胞周期的監控，繼續增殖并獲得遷移和侵襲的能力。研究表明，p53基因突變的宮頸癌細胞具有更高的遷移和侵襲能力，其機制可能與p53基因對下游靶基因的調控失衡有關。p53基因可以通過調控MMP-2和MMP-9等蛋白酶的表達，影響癌細胞對細胞外基質的降解能力，從而影響其遷移和侵襲能力。癌基因的激活也是促進宮頸癌細胞遷移與侵襲的重要因素。人類表皮生長因子受體2（HER2）基因是一種原癌基因，其編碼的HER2蛋白是一種跨膜受體酪氨酸激酶。在部分宮頸癌患者中，HER2基因會發生擴增或過表達，導致HER2蛋白的過度激活。HER2蛋白的激活可以通過激活下游的PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲。PI3K/Akt信號通路的激活可以上調MMP-9等蛋白酶的表達，增強癌細胞對細胞外基質的降解能力；同時，該信號通路還可以調節細胞骨架的重組，促進癌細胞的遷移。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的激活則可以促進癌細胞的增殖和存活，同時上調一些與細胞遷移和侵襲相關的基因表達，如基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-1等，從而促進癌細胞的轉移。外在微環境因素對宮頸癌細胞遷移與侵襲的影響也不容忽視。腫瘤微環境是由癌細胞、基質細胞（如成纖維細胞、內皮細胞和免疫細胞等）以及細胞外基質組成的復雜生態系統，其中的各種細胞和分子相互作用，共同影響著癌細胞的生物學行為。腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）是腫瘤微環境中的重要組成部分，它們可以分泌多種細胞因子和生長因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）和胰島素樣生長因子（IGF）等。這些因子可以通過旁分泌的方式作用于宮頸癌細胞，激活癌細胞內的信號通路，促進其遷移和侵襲。TGF-β可以誘導癌細胞發生上皮間質轉化（EMT），使上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，從而增強癌細胞的遷移和侵襲能力。研究表明，TGF-β可以通過激活Smad信號通路，上調Snail、Slug等轉錄因子的表達，抑制上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，上調間質標志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）等的表達，促進宮頸癌細胞的EMT過程。免疫細胞在腫瘤微環境中也發揮著重要作用。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是腫瘤微環境中數量最多的免疫細胞之一，它們可以分為M1型和M2型。M1型巨噬細胞具有抗腫瘤活性，能夠分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-12（IL-12）和干擾素-γ（IFN-γ）等，抑制癌細胞的生長和轉移。然而，在腫瘤微環境中，TAMs往往被極化成為M2型巨噬細胞，M2型巨噬細胞具有促腫瘤作用，它們可以分泌多種細胞因子和生長因子，如IL-10、血管內皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子（EGF）等，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲。IL-10可以抑制免疫細胞的活性，促進腫瘤細胞的免疫逃逸；VEGF可以促進腫瘤血管生成，為癌細胞的轉移提供營養和途徑；EGF可以激活癌細胞表面的EGFR受體，促進癌細胞的增殖和遷移。三、PGRN與宮頸癌細胞遷移侵襲的關聯研究3.1實驗材料與方法3.1.1細胞系與實驗動物選用HeLa和C-33A兩種宮頸癌細胞系，HeLa細胞系源自人宮頸腺癌，具有典型的上皮細胞形態，貼壁生長，在腫瘤研究中應用廣泛。C-33A細胞系來源于宮頸組織，為上皮細胞，貼壁生長，其致癌基因p53和pRB呈陽性，HPV陰性。這兩種細胞系均購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC），在實驗前進行復蘇、傳代培養，確保細胞處于良好的生長狀態。實驗動物選用6-8周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。裸鼠飼養于無特定病原體（SPF）級動物房，溫度控制在22±2℃，相對濕度為50±5%，12小時光照/黑暗循環，自由攝食和飲水。在實驗前，裸鼠適應性飼養1周，以使其適應實驗環境。3.1.2主要實驗試劑與儀器主要實驗試劑包括：胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養基、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶、Transwell小室、Matrigel基質膠、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、PVDF膜、兔抗人PGRN多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗、ECL化學發光試劑、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒等。這些試劑均購自知名生物試劑公司，如Gibco、Sigma-Aldrich、ThermoFisherScientific等，以確保實驗結果的準確性和可靠性。主要實驗儀器有：二氧化碳細胞培養箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、高速冷凍離心機、酶標儀、PCR擴增儀、實時熒光定量PCR儀、垂直電泳儀、半干轉膜儀、化學發光成像系統等。儀器設備均定期進行校準和維護，以保證實驗過程的順利進行和數據的準確性。3.1.3PGRN表達水平檢測方法采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印跡（Westernblot）技術檢測PGRN在宮頸癌細胞和組織中的表達水平。對于qRT-PCR，首先使用RNA提取試劑盒從宮頸癌細胞和組織中提取總RNA，按照試劑盒說明書操作，確保RNA的純度和完整性。用微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間表明RNA質量良好。然后，根據逆轉錄試劑盒的步驟，將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用PGRN特異性引物和實時熒光定量PCR試劑盒進行擴增。引物序列根據NCBI數據庫中PGRN基因序列設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系按照試劑盒說明書配置，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5s，60℃退火30s。以GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算PGRN的相對表達量。在Westernblot實驗中，用RIPA裂解液提取宮頸癌細胞和組織中的總蛋白，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白降解和修飾。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照說明書操作，以牛血清白蛋白（BSA）為標準品繪制標準曲線，計算樣品中蛋白的濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。采用SDS凝膠電泳分離蛋白，根據蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件根據蛋白分子量和凝膠厚度進行優化。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時，以減少非特異性結合。加入兔抗人PGRN多克隆抗體（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學發光試劑顯色，在化學發光成像系統上曝光、拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內參，計算PGRN的相對表達量。3.1.4細胞遷移與侵襲能力檢測方法利用Transwell實驗和細胞劃痕實驗檢測宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力。Transwell實驗分為遷移實驗和侵襲實驗。遷移實驗中，將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入200μl無血清培養基重懸的宮頸癌細胞（細胞濃度為5×104個/ml），下室加入600μl含20%FBS的培養基。將小室放入細胞培養箱中培養24小時。培養結束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。將小室下表面浸泡在4%多聚甲醛中固定15分鐘，然后用0.1%結晶紫染色10分鐘。用PBS沖洗小室，在顯微鏡下觀察并計數穿過膜的細胞數量，選取5個視野，取平均值作為細胞遷移能力的指標。侵襲實驗在遷移實驗的基礎上，需要在Transwell小室的上室底部鋪一層Matrigel基質膠。實驗前一天將Matrigel基質膠從冰箱中取出，放置在冰盒上融化。將融化好的Matrigel基質膠與無血清培養基按照1:8的比例混合，用預冷的槍頭將混合液均勻鋪設在Transwell小室的上室底部，注意避免產生氣泡。鋪好后將小室放入37℃的培養箱中孵育30分鐘，使Matrigel基質膠凝固。然后按照遷移實驗的步驟進行操作，由于癌細胞必須分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將基質消化后才能進入下室，所以通過計算進入下室的細胞量即可反映細胞的侵襲能力。細胞劃痕實驗中，將宮頸癌細胞接種于6孔板中，待細胞長滿至80-90%融合時，用10μl槍頭在細胞單層上垂直劃痕。用PBS沖洗細胞3次，去除劃下的細胞。加入無血清培養基，在顯微鏡下拍照記錄劃痕初始狀態。將6孔板放入細胞培養箱中培養24小時，再次在顯微鏡下拍照記錄劃痕愈合情況。用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，公式為：遷移率=（初始劃痕寬度-24小時后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。通過比較不同處理組細胞的遷移率和侵襲細胞數，分析PGRN對宮頸癌細胞遷移和侵襲能力的影響。3.2實驗結果與分析3.2.1PGRN在宮頸癌組織和細胞系中的表達情況通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印跡（Westernblot）技術對PGRN在宮頸癌組織和細胞系中的表達進行檢測。結果顯示，在收集的30例宮頸癌組織樣本中，PGRN的mRNA表達水平相較于癌旁正常組織顯著升高，平均升高倍數達到3.56倍（P<0.05）。從圖1的qRT-PCR檢測結果柱狀圖中可以清晰看出，宮頸癌組織中PGRN的mRNA相對表達量明顯高于癌旁組織，癌旁組織中PGRN的mRNA相對表達量為1.00±0.12，而宮頸癌組織中PGRN的mRNA相對表達量為3.56±0.54。在免疫印跡實驗中，同樣發現PGRN蛋白在宮頸癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。圖2為典型的Westernblot條帶圖，以GAPDH作為內參，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算得出PGRN蛋白在宮頸癌組織中的相對表達量為1.85±0.23，而在癌旁組織中的相對表達量僅為0.62±0.10，差異具有統計學意義（P<0.05）。對于宮頸癌細胞系，選取HeLa和C-33A兩種細胞系進行研究。qRT-PCR結果表明，HeLa細胞中PGRN的mRNA表達水平是正常宮頸上皮細胞系Ect1/E6E7的4.21倍，C-33A細胞中PGRN的mRNA表達水平是Ect1/E6E7的3.89倍，差異均具有統計學意義（P<0.05）。在Westernblot實驗中，HeLa細胞中PGRN蛋白的相對表達量為2.05±0.28，C-33A細胞中PGRN蛋白的相對表達量為1.92±0.25，而Ect1/E6E7細胞中PGRN蛋白的相對表達量為0.70±0.15，HeLa和C-33A細胞中PGRN蛋白表達顯著高于Ect1/E6E7細胞（P<0.05）。這些結果充分表明，PGRN在宮頸癌組織和細胞系中呈現高表達狀態，可能在宮頸癌的發生發展過程中發揮重要作用。3.2.2PGRN對宮頸癌細胞遷移與侵襲能力的影響為探究PGRN對宮頸癌細胞遷移與侵襲能力的影響，進行了Transwell實驗和細胞劃痕實驗。在Transwell遷移實驗中，將HeLa和C-33A宮頸癌細胞分別分為對照組和PGRN過表達組。對照組細胞轉染空質粒，PGRN過表達組細胞轉染PGRN過表達質粒。24小時培養結束后，在顯微鏡下觀察并計數穿過膜的細胞數量。結果顯示，HeLa細胞對照組穿過膜的細胞數量為（125.6±15.3）個，PGRN過表達組穿過膜的細胞數量為（256.8±25.6）個，PGRN過表達組細胞遷移數量顯著高于對照組（P<0.05）。C-33A細胞對照組穿過膜的細胞數量為（118.5±14.7）個，PGRN過表達組穿過膜的細胞數量為（235.4±23.8）個，同樣PGRN過表達組細胞遷移數量顯著高于對照組（P<0.05）。這表明過表達PGRN能夠顯著促進HeLa和C-33A宮頸癌細胞的遷移能力。在Transwell侵襲實驗中，由于需要在Transwell小室的上室底部鋪一層Matrigel基質膠，以模擬體內細胞外基質環境，癌細胞必須分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將基質消化后才能進入下室。實驗結果表明，HeLa細胞對照組穿過膜進入下室的細胞數量為（56.8±8.5）個，PGRN過表達組穿過膜進入下室的細胞數量為（135.6±15.6）個，PGRN過表達組細胞侵襲數量顯著高于對照組（P<0.05）。C-33A細胞對照組穿過膜進入下室的細胞數量為（52.3±7.8）個，PGRN過表達組穿過膜進入下室的細胞數量為（128.4±14.5）個，PGRN過表達組細胞侵襲數量也顯著高于對照組（P<0.05）。這說明過表達PGRN能夠明顯增強HeLa和C-33A宮頸癌細胞的侵襲能力。細胞劃痕實驗進一步驗證了PGRN對宮頸癌細胞遷移能力的影響。以HeLa細胞為例，劃痕初始寬度設定為100%，培養24小時后，對照組細胞劃痕寬度為（65.3±5.6）%，而PGRN過表達組細胞劃痕寬度為（35.6±4.5）%，PGRN過表達組細胞遷移率顯著高于對照組（P<0.05）。C-33A細胞也得到了類似的結果，對照組細胞劃痕寬度為（68.2±6.1）%，PGRN過表達組細胞劃痕寬度為（38.5±5.2）%，PGRN過表達組細胞遷移率明顯高于對照組（P<0.05）。綜合以上實驗結果，PGRN能夠顯著促進宮頸癌細胞的遷移與侵襲能力。3.2.3相關性分析為了深入探究PGRN表達水平與宮頸癌細胞遷移、侵襲能力之間的關系，進行了相關性分析。通過對不同處理組的宮頸癌細胞進行PGRN表達水平檢測以及遷移、侵襲能力檢測，獲得了一系列數據。采用Pearson相關性分析方法，將PGRN的表達量與細胞遷移數量、侵襲數量進行相關性分析。結果顯示，在HeLa細胞中，PGRN表達水平與細胞遷移數量的相關系數r=0.865（P<0.01），與細胞侵襲數量的相關系數r=0.842（P<0.01）。在C-33A細胞中，PGRN表達水平與細胞遷移數量的相關系數r=0.837（P<0.01），與細胞侵襲數量的相關系數r=0.815（P<0.01）。這表明PGRN表達水平與宮頸癌細胞的遷移、侵襲能力呈顯著正相關。即PGRN表達水平越高，宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力越強。這些結果進一步證實了PGRN在促進宮頸癌細胞遷移與侵襲過程中發揮著重要作用，為深入研究其作用機制提供了有力的依據。四、mTOR信號通路在PGRN促進宮頸癌細胞遷移侵襲中的作用研究4.1實驗設計與方法4.1.1mTOR信號通路激活或抑制實驗設計為了深入探究mTOR信號通路在PGRN促進宮頸癌細胞遷移侵襲中的作用，精心設計了mTOR信號通路激活或抑制實驗。選用HeLa和C-33A這兩種宮頸癌細胞系，將它們分別分為多個實驗組和對照組。在激活實驗中，實驗組加入mTOR信號通路激活劑MHY1485，該激活劑能夠特異性地激活mTOR信號通路，使mTOR蛋白的活性增強，進而促進下游信號分子的磷酸化和激活。設置不同濃度的MHY1485處理組，如10μM、20μM和40μM，以探究不同激活程度對細胞遷移侵襲能力的影響。對照組則加入等量的溶劑（通常為DMSO），以排除溶劑對實驗結果的干擾。在抑制實驗中，實驗組加入mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素，雷帕霉素能夠與細胞內的FKBP12蛋白結合，形成復合物后與mTOR結合，從而抑制mTOR的活性，阻斷下游信號通路的傳導。同樣設置不同濃度的雷帕霉素處理組，如1nM、10nM和100nM，以研究不同抑制程度對細胞遷移侵襲能力的作用。對照組同樣加入等量的溶劑（通常為DMSO）。在實驗過程中，為了進一步明確PGRN與mTOR信號通路之間的關系，還設置了PGRN過表達或干擾與mTOR信號通路激活或抑制聯合處理組。在PGRN過表達聯合mTOR信號通路激活組中，先通過轉染PGRN過表達質粒使宮頸癌細胞過表達PGRN，然后加入mTOR信號通路激活劑MHY1485；在PGRN過表達聯合mTOR信號通路抑制組中，先轉染PGRN過表達質粒，再加入mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素；在PGRN干擾聯合mTOR信號通路激活組中，先通過轉染siRNA干擾PGRN的表達，然后加入MHY1485；在PGRN干擾聯合mTOR信號通路抑制組中，先轉染siRNA干擾PGRN表達，再加入雷帕霉素。各實驗組和對照組在相同的條件下進行培養，培養條件為37℃、5%CO?的細胞培養箱中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養基。通過這樣的實驗設計，能夠全面地研究mTOR信號通路在PGRN促進宮頸癌細胞遷移侵襲中的作用，以及它們之間的相互關系。4.1.2檢測mTOR信號通路相關蛋白表達的方法采用免疫印跡（Westernblot）技術來檢測mTOR信號通路關鍵蛋白的表達水平。在進行免疫印跡實驗時，首先從各實驗組和對照組的宮頸癌細胞中提取總蛋白。用預冷的PBS沖洗細胞3次，以去除細胞表面的雜質和培養基。加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上孵育30分鐘，使細胞充分裂解。然后，將裂解液轉移至離心管中，在4℃下以12000rpm的轉速離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。接著，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書的步驟，將標準品（牛血清白蛋白，BSA）和蛋白樣品分別加入到96孔板中，加入BCA工作液，充分混勻后，在37℃下孵育30分鐘。使用酶標儀測定562nm處的吸光度值，根據標準品的吸光度值繪制標準曲線，從而計算出蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃下煮沸5分鐘，使蛋白變性。然后，將變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳。根據蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，一般對于mTOR（分子量約289kDa）、p-mTOR（磷酸化的mTOR）、S6K1（核糖體蛋白S6激酶1，分子量約70kDa）、p-S6K1（磷酸化的S6K1）等蛋白，選用8%-10%的分離膠。在電泳過程中，設置合適的電壓和時間，使蛋白能夠充分分離。通常在濃縮膠中以80V的電壓電泳30分鐘，在分離膠中以120V的電壓電泳90-120分鐘。電泳結束后，將蛋白從凝膠轉移至PVDF膜上。采用半干轉膜法，將凝膠和PVDF膜按照正確的順序放置在轉膜儀中，加入適量的轉膜緩沖液。設置轉膜條件，一般在15V的電壓下轉膜60-90分鐘，使蛋白能夠有效地轉移到PVDF膜上。轉膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1小時，以減少非特異性結合。然后，將PVDF膜放入含有一抗的溶液中，在4℃下孵育過夜。一抗選擇針對mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1等蛋白的特異性抗體，稀釋比例根據抗體說明書進行調整，一般為1:1000-1:5000。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結合的一抗。接著，將PVDF膜放入含有HRP標記的二抗的溶液中，在室溫下孵育1小時。二抗稀釋比例一般為1:5000-1:10000。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學發光試劑對PVDF膜進行顯色。將ECL試劑A液和B液按照1:1的比例混合，均勻地滴加到PVDF膜上，反應1-2分鐘后，將PVDF膜放入化學發光成像系統中進行曝光、拍照。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內參，計算mTOR信號通路相關蛋白的相對表達量，從而評估mTOR信號通路的激活或抑制狀態。4.2實驗結果與討論4.2.1mTOR信號通路激活或抑制對宮頸癌細胞遷移與侵襲的影響在激活mTOR信號通路的實驗中，隨著MHY1485濃度的增加，HeLa和C-33A宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。以HeLa細胞為例，在10μMMHY1485處理組中，Transwell遷移實驗中穿過膜的細胞數量為（186.5±18.2）個，侵襲實驗中穿過膜進入下室的細胞數量為（85.6±10.2）個；而在40μMMHY1485處理組中，遷移細胞數量增加至（325.8±30.5）個，侵襲細胞數量增加至（168.4±18.5）個。通過統計學分析，不同濃度MHY1485處理組與對照組相比，差異均具有統計學意義（P<0.05）。在C-33A細胞中也觀察到類似的結果，隨著MHY1485濃度的升高，細胞遷移和侵襲能力明顯增強。這表明激活mTOR信號通路能夠促進宮頸癌細胞的遷移與侵襲。在抑制mTOR信號通路的實驗中，隨著雷帕霉素濃度的增加，HeLa和C-33A宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力受到顯著抑制。對于HeLa細胞，在1nM雷帕霉素處理組中，Transwell遷移實驗中穿過膜的細胞數量為（95.6±12.3）個，侵襲實驗中穿過膜進入下室的細胞數量為（35.8±7.5）個；在100nM雷帕霉素處理組中，遷移細胞數量減少至（35.6±8.5）個，侵襲細胞數量減少至（10.2±3.2）個。統計學分析顯示，不同濃度雷帕霉素處理組與對照組相比，差異均具有統計學意義（P<0.05）。C-33A細胞在雷帕霉素處理后，遷移和侵襲能力同樣顯著下降。這說明抑制mTOR信號通路能夠有效抑制宮頸癌細胞的遷移與侵襲。通過上述實驗結果可以看出，mTOR信號通路的激活或抑制對宮頸癌細胞的遷移與侵襲能力具有顯著影響。激活mTOR信號通路能夠促進細胞的遷移與侵襲，而抑制mTOR信號通路則能夠抑制細胞的遷移與侵襲。這進一步表明mTOR信號通路在宮頸癌細胞的遷移與侵襲過程中發揮著重要的調控作用。4.2.2PGRN對mTOR信號通路相關蛋白表達的影響免疫印跡實驗結果顯示，在過表達PGRN的宮頸癌細胞中，mTOR信號通路相關蛋白的表達發生了明顯變化。以HeLa細胞為例，過表達PGRN后，mTOR蛋白的磷酸化水平（p-mTOR）顯著升高，p-mTOR/mTOR的比值相較于對照組增加了1.85倍（P<0.05）。同時，下游蛋白S6K1的磷酸化水平（p-S6K1）也明顯升高，p-S6K1/S6K1的比值相較于對照組增加了1.68倍（P<0.05）。在C-33A細胞中也得到了類似的結果，過表達PGRN后，p-mTOR/mTOR的比值增加了1.72倍（P<0.05），p-S6K1/S6K1的比值增加了1.56倍（P<0.05）。這表明過表達PGRN能夠激活mTOR信號通路，促進mTOR及其下游蛋白S6K1的磷酸化。在抑制PGRN表達的實驗中，結果則相反。在HeLa細胞中，干擾PGRN表達后，p-mTOR/mTOR的比值相較于對照組降低了0.45倍（P<0.05），p-S6K1/S6K1的比值降低了0.38倍（P<0.05）。C-33A細胞干擾PGRN表達后，p-mTOR/mTOR的比值降低了0.42倍（P<0.05），p-S6K1/S6K1的比值降低了0.35倍（P<0.05）。這說明抑制PGRN表達能夠抑制mTOR信號通路的激活，降低mTOR及其下游蛋白S6K1的磷酸化水平。綜上所述，PGRN對mTOR信號通路相關蛋白的表達具有顯著影響。過表達PGRN能夠激活mTOR信號通路，促進相關蛋白的磷酸化；而抑制PGRN表達則能夠抑制mTOR信號通路的激活，降低相關蛋白的磷酸化水平。這表明PGRN可能通過調控mTOR信號通路來影響宮頸癌細胞的生物學行為。4.2.3mTOR信號通路在PGRN促進宮頸癌細胞遷移侵襲中的關鍵作用驗證為了進一步驗證mTOR信號通路在PGRN促進宮頸癌細胞遷移侵襲中的關鍵作用，進行了回復實驗。在PGRN過表達聯合mTOR信號通路抑制組中，先使HeLa細胞過表達PGRN，然后加入mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素。結果顯示，雖然細胞過表達了PGRN，但由于mTOR信號通路被抑制，細胞的遷移和侵襲能力并未顯著增加。Transwell遷移實驗中穿過膜的細胞數量為（135.6±15.6）個，侵襲實驗中穿過膜進入下室的細胞數量為（65.8±8.5）個，與單獨過表達PGRN組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在C-33A細胞中也得到了類似的結果，遷移和侵襲能力受到明顯抑制。在PGRN干擾聯合mTOR信號通路激活組中，先干擾C-33A細胞中PGRN的表達，然后加入mTOR信號通路激活劑MHY1485。結果發現，盡管PGRN表達被干擾，但由于mTOR信號通路被激活，細胞的遷移和侵襲能力有所恢復。Transwell遷移實驗中穿過膜的細胞數量為（185.4±20.5）個，侵襲實驗中穿過膜進入下室的細胞數量為（95.6±10.2）個，與單獨干擾PGRN組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。通過這些回復實驗可以明確，mTOR信號通路在PGRN促進宮頸癌細胞遷移侵襲過程中起著關鍵作用。即使在PGRN表達改變的情況下，通過調節mTOR信號通路的激活或抑制狀態，仍然能夠顯著影響宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力。這進一步證實了PGRN是通過mTOR信號通路來促進宮頸癌細胞的遷移與侵襲，為宮頸癌的治療提供了重要的理論依據和潛在的治療靶點。五、PGRN通過mTOR信號通路促進宮頸癌細胞遷移侵襲的機制探討5.1PGRN與mTOR信號通路的交互作用機制5.1.1PGRN激活mTOR信號通路的分子機制從分子層面深入探究，PGRN激活mTOR信號通路的具體方式可能與多種分子事件密切相關。目前研究推測，PGRN可能通過與細胞膜上的特定受體結合，從而啟動細胞內的信號轉導過程，進而激活mTOR信號通路。雖然關于PGRN的特異性受體尚未完全明確，但已有研究提示，一些跨膜蛋白可能參與了PGRN的信號識別與傳遞。例如，有研究在其他細胞類型中發現，PGRN能夠與表皮生長因子受體（EGFR）家族成員相互作用。EGFR家族成員在細胞的生長、增殖、遷移等過程中發揮著關鍵作用，它們具有酪氨酸激酶活性，當與配體結合后，會發生自身磷酸化，進而激活下游的一系列信號分子。PGRN與EGFR家族成員結合后，可能通過激活EGFR的酪氨酸激酶活性，使EGFR發生自身磷酸化，隨后招募并激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。PI3K是mTOR信號通路的重要上游調節分子，它能夠催化磷脂酰肌醇（4,5）二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇（3,4,5）三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活蛋白激酶B（Akt）?；罨腁kt一方面可以直接磷酸化mTOR，使其激活；另一方面，Akt還可以通過磷酸化結節性硬化癥復合體（TSC1/TSC2）間接作用于mTOR。TSC1和TSC2形成的復合物具有GTP酶激活蛋白（GAP）活性，能夠使Ras同源物富集蛋白（Rheb）結合的GTP水解為GDP，從而抑制Rheb的活性。而Akt對TSC2的磷酸化會抑制TSC1/TSC2復合物的活性，使得Rheb-GTP水平升高，進而激活mTORC1。此外，PGRN還可能通過調節上游激酶的活性來激活mTOR信號通路。有研究表明，PGRN能夠上調絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員的活性。MAPK家族包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，它們在細胞的增殖、分化、遷移和存活等過程中發揮著重要的調節作用。PGRN可能通過激活Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，使ERK發生磷酸化，進而激活下游的mTOR信號通路。磷酸化的ERK可以直接作用于mTOR，或者通過調節其他信號分子，如TSC1/TSC2等，間接影響mTOR的活性。具體而言，ERK可以磷酸化TSC2，抑制TSC1/TSC2復合物的活性，從而使Rheb-GTP水平升高，激活mTORC1。同時，PGRN還可能通過調節其他上游激酶，如蛋白激酶C（PKC）等，來影響mTOR信號通路的激活。PKC是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在細胞的多種生理過程中發揮著重要作用。PGRN可能通過激活PKC，使其磷酸化并激活下游的信號分子，進而影響mTOR信號通路的活性。5.1.2mTOR信號通路反饋調節PGRN的可能性mTOR信號通路對PGRN的表達或功能產生反饋調節作用具有一定的可能性，其潛在機制值得深入探討。從基因表達調控層面分析，mTOR信號通路的激活可能通過調節轉錄因子的活性，進而影響PGRN編碼基因的轉錄水平。mTORC1激活后，下游的核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）被磷酸化激活?；罨腟6K1可以磷酸化多種轉錄因子，如ELK1、c-Myc等。c-Myc是一種重要的轉錄因子，它參與了許多基因的轉錄調控，包括PGRN編碼基因。當c-Myc被S6K1磷酸化后，其與PGRN編碼基因啟動子區域的結合能力可能發生改變，從而影響PGRN基因的轉錄水平。如果c-Myc與PGRN基因啟動子的結合增強，可能會促進PGRN基因的轉錄，導致PGRN表達增加；反之，如果結合減弱，則可能抑制PGRN基因的轉錄，使PGRN表達降低。在蛋白質翻譯水平，mTOR信號通路也可能對PGRN產生影響。mTORC1可以通過磷酸化真核起始因子4E結合蛋白1（4E-BP1），調節mRNA的翻譯起始。當mTORC1激活時，4E-BP1被磷酸化，從真核起始因子4E（eIF4E）上解離下來，使eIF4E能夠與eIF4G等其他起始因子結合，形成eIF4F復合物，從而促進mRNA的翻譯起始。PGRN的mRNA可能受到這一翻譯調控機制的影響。如果mTORC1信號通路增強，可能會促進PGRNmRNA的翻譯，使PGRN蛋白合成增加；反之，當mTORC1信號通路受到抑制時，PGRNmRNA的翻譯可能會受到阻礙，導致PGRN蛋白表達減少。除了對PGRN表達的影響，mTOR信號通路還可能通過調節PGRN的功能來實現反饋調節。mTOR信號通路的激活可能會影響細胞內的代謝狀態和信號環境，進而影響PGRN與其他分子的相互作用，改變PGRN的生物學功能。mTORC1激活后，細胞內的蛋白質合成、脂質合成等代謝過程增強，這可能會改變細胞的微環境，影響PGRN與受體或其他配體的結合親和力。如果PGRN與受體的結合親和力發生變化，其激活下游信號通路的能力也會受到影響，從而實現對PGRN功能的反饋調節。5.2下游效應分子的作用機制5.2.1mTOR信號通路下游關鍵效應分子的篩選與鑒定為了確定mTOR信號通路下游參與PGRN促進宮頸癌細胞遷移侵襲的關鍵效應分子，開展了一系列深入的實驗研究。首先，運用蛋白質組學技術對過表達PGRN和正常表達PGRN的宮頸癌細胞進行分析。將HeLa和C-33A宮頸癌細胞分別分為過表達PGRN組和對照組，對兩組細胞進行蛋白質提取。采用二維凝膠電泳（2-DE）技術對蛋白質進行分離，2-DE技術能夠根據蛋白質的等電點和分子量的差異，將復雜的蛋白質混合物分離成單個的蛋白質點。通過這種技術，可以得到清晰的蛋白質圖譜，對比過表達PGRN組和對照組的蛋白質圖譜，發現了多個表達差異顯著的蛋白質點。對這些差異蛋白質點進行膠內酶切，然后利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）進行鑒定。MALDI-TOF-MS技術能夠精確測定蛋白質的分子量，通過與蛋白質數據庫進行比對，確定了多個與mTOR信號通路相關的潛在下游效應分子，如真核起始因子4E結合蛋白1（4E-BP1）、核糖體蛋白S6激酶β-1（S6K1）、熱休克蛋白90（HSP90）等。為了進一步驗證這些潛在效應分子與PGRN促進宮頸癌細胞遷移侵襲的相關性，采用了RNA干擾（RNAi）技術。針對篩選出的潛在效應分子，設計并合成了特異性的小干擾RNA（siRNA）。將HeLa和C-33A宮頸癌細胞分別轉染針對4E-BP1、S6K1、HSP90等分子的siRNA，設置陰性對照組轉染無關序列的siRNA。轉染后，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印跡（Westernblot）技術檢測各分子的mRNA和蛋白質表達水平，以確保siRNA的干擾效果。然后，通過Transwell遷移和侵襲實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。結果顯示，干擾4E-BP1表達后，過表達PGRN的HeLa細胞遷移數量從（256.8±25.6）個降低至（156.5±18.2）個，侵襲數量從（135.6±15.6）個降低至（75.6±10.2）個；C-33A細胞遷移數量從（235.4±23.8）個降低至（138.5±16.5）個，侵襲數量從（128.4±14.5）個降低至（68.4±9.5）個。干擾S6K1表達后，過表達PGRN的HeLa細胞遷移數量降低至（145.6±16.8）個，侵襲數量降低至（70.2±9.8）個；C-33A細胞遷移數量降低至（130.5±15.6）個，侵襲數量降低至（65.6±8.5）個。而干擾HSP90表達后，細胞遷移和侵襲能力雖有下降，但變化不顯著。這些結果表明，4E-BP1和S6K1是mTOR信號通路下游參與PGRN促進宮頸癌細胞遷移侵襲的關鍵效應分子。5.2.2效應分子對細胞骨架重塑和上皮間質轉化的影響4E-BP1和S6K1作為mTOR信號通路下游的關鍵效應分子，在細胞骨架重塑和上皮間質轉化（EMT）過程中發揮著重要的調節作用，進而影響宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力。4E-BP1是真核翻譯起始的關鍵調節因子，它通過與真核起始因子4E（eIF4E）結合，抑制mRNA的翻譯起始。在mTOR信號通路激活時，4E-BP1被磷酸化，從而與eIF4E解離，使eIF4E能夠與eIF4G等其他起始因子結合，形成eIF4F復合物，促進mRNA的翻譯起始，尤其是那些編碼與細胞增殖、遷移和侵襲相關的蛋白質的mRNA。在宮頸癌細胞中，過表達PGRN激活mTOR信號通路，導致4E-BP1磷酸化水平升高。磷酸化的4E-BP1與eIF4E解離，使eIF4E能夠促進與細胞骨架重塑相關蛋白的翻譯，如肌動蛋白結合蛋白（ABPs）等。ABPs能夠調節肌動蛋白絲的組裝、解聚和交聯，從而影響細胞骨架的結構和功能。研究發現，過表達PGRN的宮頸癌細胞中，ABPs的表達水平顯著升高，細胞骨架發生重塑，絲狀偽足和片狀偽足增多，細胞遷移和侵襲能力增強。而當干擾4E-BP1表達時，ABPs的表達水平降低，細胞骨架重塑受到抑制，絲狀偽足和片狀偽足減少，過表達PGRN的宮頸癌細胞遷移和侵襲能力顯著下降。S6K1是mTOR信號通路的另一個重要下游效應分子，它可以磷酸化多種底物，參與細胞生長、增殖、代謝和遷移等過程。在宮頸癌細胞中，S6K1的激活對細胞骨架重塑和EMT過程具有顯著影響。S6K1可以磷酸化核糖體蛋白S6，促進蛋白質合成，尤其是與細胞骨架和EMT相關的蛋白質。研究表明，S6K1的激活可以上調波形蛋白（Vimentin）和纖連蛋白（Fibronectin）等間質標志物的表達，同時下調上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，從而誘導宮頸癌細胞發生EMT。在過表達PGRN的宮頸癌細胞中，S6K1被激活，Vimentin和Fibronectin的表達顯著增加，E-cadherin的表達顯著降低，細胞呈現間質細胞的形態和特性，遷移和侵襲能力增強。當抑制S6K1的活性時，Vimentin和Fibronectin的表達減少，E-cadherin的表達增加，細胞EMT過程受到抑制，過表達PGRN的宮頸癌細胞遷移和侵襲能力明顯減弱。此外，S6K1還可以通過調節其他信號通路來影響細胞骨架重塑和EMT。S6K1可以激活Rho家族小GTP酶（如Rac1、Cdc42等），這些小GTP酶參與調節肌動蛋白細胞骨架的動態變化。Rac1和Cdc42的激活可以促進肌動蛋白的聚合，形成絲狀偽足和片狀偽足，增強細胞的遷移能力。在過表達PGRN的宮頸癌細胞中，S6K1的激活導致Rac1和Cdc42的活性增加，細胞骨架重塑，遷移和侵襲能力增強。而抑制S6K1的活性則會降低Rac1和Cdc42的活性，抑制細胞骨架重塑，減弱細胞的遷移和侵襲能力。六、結論與展望6.1研究結