p16與Bmi-1在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中的表達及臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據統計，肺癌的發病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列，其高發病率和高死亡率給社會和家庭帶來了沉重負擔。在我國，肺癌同樣是發病率和死亡率增長最快的癌癥，對人民生命健康造成了極大危害。肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌約占肺癌總數的85%，而肺鱗狀細胞癌和腺癌是非小細胞肺癌的主要組織學類型。不同類型的肺癌在發病機制、治療方法和預后等方面存在差異，深入了解其生物學特性對于提高肺癌的診治水平至關重要。在肺癌的發生發展過程中，基因的異常表達起著關鍵作用。p16基因是一種重要的抑癌基因，它在細胞周期調控中發揮著關鍵作用，通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，阻止細胞從G1期進入S期，從而抑制細胞增殖。當p16基因發生缺失、突變或甲基化等異常時，其抑癌功能喪失，導致細胞增殖失控，進而促進腫瘤的發生發展。已有研究表明，p16基因在多種腫瘤中存在表達異常，與腫瘤的發生、發展及預后密切相關。在肺癌中，p16基因的異常表達也較為常見，但其在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中的具體表達情況及臨床意義仍有待進一步研究。Bmi-1基因是Polycomb家族的重要成員，屬于原癌基因。它在維持干細胞特性、調控細胞增殖、分化以及凋亡等生命過程中發揮著重要作用。Bmi-1通過抑制多種抑癌基因的表達，促進細胞增殖和自我更新，同時抑制細胞凋亡，從而在腫瘤的發生發展中扮演重要角色。研究發現，Bmi-1在多種腫瘤組織中呈高表達，其表達水平與腫瘤的侵襲性、轉移性以及預后不良等因素密切相關。在肺癌中，Bmi-1的異常高表達也被廣泛報道，但其與肺鱗狀細胞癌和腺癌的臨床病理特征之間的關系尚不完全明確。鑒于p16和Bmi-1在肺癌發生發展中的重要作用，研究它們在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中的表達具有重要的意義。一方面，有助于深入了解肺癌的發病機制，為肺癌的早期診斷提供潛在的生物標志物。通過檢測p16和Bmi-1的表達水平，有可能實現對肺癌的早期篩查和診斷，提高患者的治愈率和生存率。另一方面，為肺癌的治療提供新的靶點和策略。明確p16和Bmi-1在肺癌中的作用機制，有助于開發針對這兩個基因的靶向治療藥物，為肺癌患者提供更加精準、有效的治療方法，改善患者的預后，提高患者的生活質量。1.2國內外研究現狀在國外，學者們對p16與Bmi-1在肺癌中的表達研究起步較早。Vonlanthen等學者通過對非小細胞肺癌組織的研究發現，Bmi-1的表達與INK4A-ARF位點表達相關，且在非小細胞肺癌中呈差異性表達。在肺鱗癌和腺癌的研究中，有研究表明Bmi-1在不同病理類型的肺癌組織中表達水平存在差異，其表達與腫瘤的侵襲性和轉移性密切相關。例如，一些研究通過對肺鱗癌和腺癌細胞系的體外實驗，發現上調Bmi-1的表達能夠增強細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而下調Bmi-1則會抑制這些惡性生物學行為。對于p16基因，國外研究表明，在多種腫瘤細胞中，p16基因啟動子區域的高甲基化是導致其表達缺失的重要原因之一。在肺癌中，p16基因的甲基化狀態與腫瘤的發生發展及預后密切相關。有研究對大量肺癌患者的組織標本進行分析，發現p16基因甲基化陽性的患者，其腫瘤復發率較高，生存期較短。在國內，關于p16與Bmi-1在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中表達的研究也取得了一定成果。朱鋒鋒等人采用Western印跡法和免疫組化法檢測了Bmi-1和P16INK4a在非小細胞肺癌組織和癌旁組織中的表達，發現非小細胞肺癌組織中的Bmi-1表達水平明顯高于癌旁正常對照組織，P16INK4a在非小細胞肺癌組織中的表達水平低于癌旁正常對照組織，且二者的表達呈負相關。張慶華通過應用免疫組化法檢測35例非小細胞肺癌細胞塊標本中p16及Bmi-1蛋白的表達，發現肺鱗癌和腺癌p16蛋白的總陽性率明顯低于癌旁正常肺組織，且隨著腫瘤分化程度降低p16的表達率隨之降低；Bmi-1表達的總陽性率在癌旁正常肺組織無表達，在有無淋巴結轉移組Bmi-1表達的陽性率高于無淋巴結轉移組，在肺鱗癌、腺癌中p16與Bmi-1的表達呈負相關。盡管國內外在p16與Bmi-1在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中表達的研究方面取得了一定進展，但仍存在一些不足之處。一方面，目前的研究樣本量相對較小，研究結果的普遍性和可靠性有待進一步提高。不同研究之間由于樣本來源、檢測方法等差異，導致研究結果存在一定的不一致性。另一方面，對于p16與Bmi-1在肺鱗癌和腺癌發生發展過程中的具體作用機制尚未完全明確，尤其是二者之間的相互調控關系以及它們與其他相關信號通路的交互作用，還需要深入研究。此外，目前關于p16與Bmi-1作為肺癌診斷和預后標志物的臨床應用研究還不夠充分，如何將這些研究成果更好地轉化為臨床實踐，為肺癌患者的精準診斷和治療提供更有效的支持，也是未來研究需要解決的重要問題。1.3研究目的與內容本研究旨在深入探討p16與Bmi-1在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中的表達情況，明確二者之間的相關性，并分析它們與肺鱗狀細胞癌和腺癌臨床病理特征的關系，為肺癌的發病機制研究、早期診斷和治療提供理論依據和新的思路。具體研究內容如下：檢測p16與Bmi-1在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中的表達：運用免疫組化法、Western印跡法等技術，對肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊標本以及癌旁正常肺組織標本中的p16和Bmi-1蛋白表達水平進行檢測。通過對比分析，明確p16和Bmi-1在不同組織中的表達差異，以及它們在肺鱗狀細胞癌和腺癌中的表達特點。分析p16與Bmi-1表達的相關性：采用統計學方法，對p16和Bmi-1在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中的表達數據進行分析，探討二者之間是否存在相關性。若存在相關性，進一步明確其相關程度和方向，為深入研究它們在肺癌發生發展中的相互作用機制提供基礎。探討p16與Bmi-1表達與肺鱗狀細胞癌和腺癌臨床病理特征的關系：收集患者的臨床病理資料，包括腫瘤大小、組織學類型、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期等。將p16和Bmi-1的表達水平與這些臨床病理特征進行關聯分析，研究它們與肺鱗狀細胞癌和腺癌的發生、發展、侵襲和轉移等過程的關系。例如，分析p16和Bmi-1的表達是否與腫瘤的分化程度相關，是否可以作為評估肺癌患者預后的指標等。二、p16與Bmi-1的相關理論基礎2.1p16基因與蛋白p16基因，又稱多腫瘤抑制基因1（MTS1），是1994年被發現的一種重要的抑癌基因。其在細胞生命活動中扮演著關鍵角色，對維持細胞正常的生長、增殖和分化起著不可或缺的作用。從結構上看，p16基因定位于人類第9號染色體短臂2區1帶（9p21），全長約8.5kb，由2個內含子及3個外顯子組成。第1外顯子長度為126bp，第2外顯子為307bp，第3外顯子則僅有11bp。這些外顯子共同編碼產生相對分子量為15.8kd的p16蛋白。該蛋白具有獨特的周期依賴性表達模式，這意味著其表達水平會隨著細胞周期的進程而發生規律性變化，并且能特異性地抑制細胞周期素依賴性激酶4（CDK4）的激酶活性，從而參與到某些組織細胞的分化及增殖調控過程中。在細胞周期調控方面，p16基因發揮著核心作用。細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞在周期時相的變遷中進入增殖、分化、衰老和死亡等不同生理狀態。正常情況下，細胞周期受到精密而復雜的調控機制的嚴格把控，以確保細胞的正常生長和發育。p16蛋白作為細胞周期調控網絡中的重要一員，通過與細胞周期素D1（CyclinD1）以競爭方式結合CDK4，抑制CDK4的活性。當CDK4活性被抑制后，腫瘤基因產物Rb蛋白無法被磷酸化，處于去磷酸化狀態的Rb蛋白能夠緊密結合轉錄因子（如EIF），使其不能被釋放活化。這就導致細胞無法順利從G0期或G1期進入到S期，細胞分裂、增殖的進程被有效阻滯，從而實現對細胞生長的負調控作用，維持細胞生長和增殖的平衡。然而，當p16基因出現異常改變時，其對細胞生長的負調控作用就會喪失。例如，在多種原發腫瘤細胞系中，常常會觀察到p16基因的缺失、突變或其啟動子區域的高甲基化等異常情況。當p16基因發生這些異常時，p16蛋白的表達量顯著減少甚至完全缺失，無法正常發揮對CDK4的抑制作用。此時，CDK4能夠與細胞周期素D1順利結合，促使Rb蛋白磷酸化，釋放大量的轉錄因子，處于G1期的細胞便會迅速進入到S期，細胞開始不受控制地過度增殖生長，最終導致腫瘤的發生和發展。大量的研究實驗都有力地證實了p16基因及其表達產物p16蛋白在腫瘤發生、發展過程中的重要作用。在黑色素瘤、食管癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、結直腸癌等多種人類惡性腫瘤中，均報道存在較高頻率的p16基因異常。例如，Kamb等學者對近300個來自肺、腦、骨、皮膚、膀胱、腎、卵巢等不同部位的腫瘤細胞株進行研究，結果發現p16基因純合性及雜合性缺失者占50%，堿基突變或缺失各占25%，總突變率高達75%，遠遠高于p53基因的總突變率（50%），并且他們認為純合性缺失是p16基因失活的主要方式，而點突變可能并非其失活的關鍵原因。Marchertti和Nobori等在食管鱗癌及非小細胞性肺癌關于p16基因體細胞突變的研究中也發現，p16基因的缺失率達到了50%，其中高甲基化是導致該基因失活的最常見原因。這些研究充分表明，p16基因的異常與腫瘤的發生發展密切相關，對腫瘤的形成起著至關重要的作用。2.2Bmi-1基因與蛋白Bmi-1基因，全稱為B細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點1（B-cell-specificmoloneyleukemiavirusinsertsite1），是1991年在鼠淋巴瘤中被首次發現的一種原癌基因。其屬于Polycomb組蛋白（Polycombgroup，PcG）家族成員，該家族在生物發育過程中發揮著關鍵的調控作用。從基因結構來看，人類Bmi-1基因定位于第10號染色體短臂1區3帶（10p13），DNA大小為4.9kb，mRNA長度為3199bp，含有10個外顯子，編碼產生由326個氨基酸組成的蛋白質，其分子量約為36.9kDa。Bmi-1蛋白包含幾個重要的模序結構，這些結構賦予了它獨特的生物學功能。在其N末端存在環指模序，該模序由鋅指和C3HC4保守序列構成，通過這個結構域，Bmi-1能夠與其他蛋白相互結合，形成多聚復合物，從而參與到基因表達調控等生物學過程中。在蛋白的中心部位，是螺旋-轉角-螺旋-轉角模序，這一結構介導了Bmi-1與DNA的結合，對于其發揮轉錄調節功能至關重要。此外，Bmi-1蛋白的羧基端為PEST序列，這一序列與Bmi-1在細胞內的快速降解密切相關，它可以調控Bmi-1蛋白在細胞內的含量和活性，進而影響細胞的生理功能。在干細胞領域，Bmi-1基因發揮著核心作用，對干細胞的自我更新和分化起著關鍵的調控作用。干細胞具有自我更新、多向分化和無限增殖的能力，而Bmi-1基因可以決定干細胞的命運走向，即決定干細胞是進行自我更新以維持干細胞池的穩定，還是走向分化成為具有特定功能的體細胞。研究表明，Bmi-1基因通過調節一系列與干細胞相關的基因，如存活基因、抗增殖基因等，來實現對干細胞分化方向的調控。以造血干細胞為例，Ink4a是Bmi-1的下游基因，其編碼的p16Ink4a和p14Arf表達增強時，會誘導造血干細胞的衰老和凋亡。當Bmi-1基因缺失時，p16Ink4a的表達上調，它會阻止Cdk4/6與cyclinD的結合，抑制激酶的活性，使pRB過度磷酸化，進而抑制E2F介導的轉錄，導致細胞周期停頓，細胞走向衰老。正常的鼠胚胎纖維原細胞（MEFs）在培養7代后開始衰老，而Bmi-1基因缺失的MEFs在第三代時就出現未成熟衰老，這一現象與p16Ink4a表達的增加密切相關。重新表達Bmi-1后，可以逆轉這種未成熟的衰老表型，并且過度表達Bmi-1會使MEF獲得增殖優勢，延長其壽命甚至實現永生化。這充分說明了Bmi-1基因在維持干細胞特性和功能方面的重要性。在腫瘤的發生發展過程中，Bmi-1基因扮演著極為關鍵的角色，是促進腫瘤發生發展的重要因素之一。研究發現，在多種人類惡性腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、肝癌、結直腸癌、套細胞淋巴瘤、急性髓性白血病等，均存在Bmi-1基因的異常表達。在乳腺癌中，過度表達Bmi-1可上調人端粒逆轉錄酶（hTERT）的轉錄，使端粒酶活性增高，阻止細胞的衰老，導致細胞永生化，進而促進乳腺上皮細胞的惡性轉化。在套細胞淋巴瘤中，Bmi-1DNA的擴增和蛋白表達比正常細胞高3-7倍；在鼠急性髓性白血病干細胞中，可檢測到高水平的Bmi-1轉錄。在實體腫瘤肺癌的研究中，有研究觀察了48例可切除的非小細胞肺癌（NSCLC）中Bmi-1的表達情況，發現58%的NSCLC有中高水平的Bmi-1蛋白表達，且在中強Bmi-1染色標本中，p16和p14ARF均呈陰性。另一個研究組發現，在支氣管鱗狀細胞癌中，69%的病例p16低表達，77%表達Bmi-1，在4例p16陽性標本中有兩例Bmi-1陽性，9例p16陰性標本中有8例（89%）Bmi-1染色陽性，其中4例p16陰性標本在p16INK4a啟動子區域高度甲基化，其他陰性標本雖無甲基化但有Bmi-1染色，這些結果都表明Bmi-1在肺癌的發生發展中起著重要作用。在結直腸癌中，Bmi-1mRNA水平在癌組織中比癌旁組織顯著升高，其蛋白在65%（30/46）的結直腸癌組織中呈高表達，且Bmi-1高表達的組織中INK4蛋白明顯低表達。這些研究充分表明，Bmi-1基因的異常高表達與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移等過程密切相關，它通過抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和自我更新、維持腫瘤干細胞特性等多種機制，推動了腫瘤的惡性進展。2.3p16與Bmi-1在腫瘤發生發展中的潛在聯系在腫瘤的發生發展過程中，p16與Bmi-1之間存在著復雜的相互作用關系，且大量研究表明二者的表達呈負相關。從分子機制層面來看，Bmi-1對p16基因的表達具有抑制作用。Bmi-1屬于Polycomb組蛋白家族，該家族蛋白能夠通過修飾染色質，導致基因表達的抑制或激活。Bmi-1可以與其他蛋白形成多聚復合物，結合到p16基因的啟動子區域，通過改變染色質的結構，使p16基因處于轉錄抑制狀態，從而降低p16蛋白的表達水平。例如，在一些腫瘤細胞系中，過表達Bmi-1后，p16基因啟動子區域的組蛋白發生修飾，導致p16基因無法正常轉錄，p16蛋白的表達顯著下降。另一方面，p16基因的表達異常也會影響Bmi-1的功能。當p16基因發生缺失、突變或甲基化等異常時，其對細胞周期的調控作用喪失，細胞增殖失控。這種異常的細胞增殖狀態可能會反饋性地影響Bmi-1的表達和功能。有研究發現，在p16基因缺失的細胞中，Bmi-1的表達水平會升高，并且Bmi-1的活性增強，進一步促進細胞的增殖和腫瘤的發展。二者表達的負相關關系對腫瘤進程產生著重要影響。當Bmi-1高表達而p16低表達時，腫瘤細胞往往具有更強的增殖能力、更高的侵襲性和轉移性。在肺癌中，Bmi-1的高表達可以抑制p16的表達，使得細胞周期調控失衡，細胞能夠持續增殖，同時還可以促進腫瘤細胞的上皮-間質轉化，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，從而促進肺癌的發生和發展。在乳腺癌中，Bmi-1通過抑制p16的表達，使細胞繞過衰老關卡，獲得永生化能力，進而促進乳腺上皮細胞的惡性轉化。這種負相關關系還與腫瘤的預后密切相關。臨床研究表明，在多種腫瘤中，Bmi-1高表達且p16低表達的患者，其預后往往較差，生存率較低，腫瘤復發率較高。在結直腸癌中，Bmi-1高表達且p16低表達的患者，其腫瘤的分期往往較晚，淋巴結轉移率較高，患者的5年生存率明顯低于Bmi-1低表達且p16高表達的患者。這提示我們，p16與Bmi-1的表達狀態可以作為評估腫瘤患者預后的重要指標之一。三、研究設計與方法3.1實驗材料標本來源及信息：選取[具體時間段]于[醫院名稱]收治的肺癌患者手術切除標本。共收集到80例肺癌組織標本，其中肺鱗狀細胞癌40例，腺癌40例。同時，選取相應的癌旁正常肺組織標本作為對照，癌旁組織均距離腫瘤邊緣至少5cm。患者年齡范圍在35-75歲之間，平均年齡為（55.6±8.5）歲。其中男性患者50例，女性患者30例。所有患者術前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且患者的臨床病理資料完整，包括腫瘤大小、組織學類型、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期等信息。實驗試劑：鼠抗人p16單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發公司，該抗體能夠特異性地識別p16蛋白，具有較高的靈敏度和特異性，可用于免疫組化和Western印跡實驗。鼠抗人Bmi-1單克隆抗體同樣購自福州邁新生物技術開發公司，其能夠準確地檢測Bmi-1蛋白的表達。免疫組化檢測試劑盒選用的是通用型SP試劑盒，該試劑盒包含了免疫組化實驗所需的各種試劑，如二抗、顯色劑等，操作簡便，能夠保證實驗結果的準確性和穩定性。DAB顯色劑用于免疫組化實驗中的顯色反應，可使陽性信號呈現棕黃色，便于觀察和分析。此外，還準備了蘇木素染液用于細胞核復染，以增強組織切片的對比度，便于觀察細胞形態和結構。實驗儀器：實驗過程中使用攤片機進行組織切片的攤片操作，確保切片平整、無褶皺，便于后續的實驗處理。高壓鍋用于抗原修復步驟，通過高溫高壓的方式使抗原決定簇充分暴露，提高免疫組化的檢測靈敏度。光學顯微鏡用于觀察組織切片的形態結構和免疫組化染色結果，其具有高分辨率和清晰的成像效果，能夠準確地識別細胞的形態和染色情況。顯微照相儀則用于拍攝顯微鏡下的圖像，以便記錄和分析實驗結果。3.2實驗方法免疫組化法檢測p16與Bmi-1蛋白表達：切片處理：將收集的肺癌組織和癌旁正常肺組織標本制成4μm厚的石蠟切片。切片時確保組織平整、連續，無褶皺和破損。將切片置于經多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60℃烤片2h，使切片與載玻片緊密貼合，防止后續實驗過程中脫片。烤片完成后，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min進行脫蠟，然后依次經過100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各浸泡5min進行水化，使組織恢復到含水狀態，為后續的抗原修復步驟做好準備。抗原修復：采用高壓鍋熱修復法進行抗原修復。將切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的高壓鍋中，加熱至噴氣后計時2min，然后迅速冷卻至室溫。抗原修復是免疫組化實驗中的關鍵步驟，由于組織在固定和石蠟包埋過程中，抗原決定簇被封閉，通過抗原修復可以使抗原決定簇重新暴露，提高抗體與抗原的結合率，從而增強檢測的靈敏度。抗體孵育：將修復后的切片用PBS沖洗3次，每次5min，以去除殘留的緩沖液。滴加5%BSA封閉液，室溫孵育30min，封閉非特異性結合位點，減少背景染色。傾去封閉液，不洗，直接滴加鼠抗人p16單克隆抗體（1∶50稀釋）和鼠抗人Bmi-1單克隆抗體（1∶100稀釋），4℃冰箱孵育過夜。一抗孵育是免疫組化實驗的核心步驟，通過特異性抗體與抗原的結合，實現對目標蛋白的定位和檢測。次日，將切片從冰箱取出，室溫放置30min復溫，然后用PBS沖洗3次，每次5min，去除未結合的一抗。顯色：滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30min，使二抗與一抗特異性結合。用PBS沖洗3次，每次5min，去除未結合的二抗。滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素，室溫孵育30min，形成抗原-一抗-二抗-鏈霉卵白素-辣根酶復合物。再次用PBS沖洗3次，每次5min，然后滴加DAB顯色劑，室溫顯色3-5min，在顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色反應。DAB顯色劑在辣根酶的作用下發生氧化還原反應，生成棕色產物，從而使陽性信號得以顯現。復染：將顯色后的切片放入蘇木素染液中復染30s，使細胞核染成藍色，增強組織切片的對比度，便于觀察細胞形態和結構。復染后，用蒸餾水沖洗多余的蘇木素染液，然后依次經過70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各浸泡3min進行脫水，再放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡5min進行透明。最后，滴加中性樹膠，加蓋玻片封片，待干燥后在光學顯微鏡下觀察結果。Western印跡法檢測p16與Bmi-1蛋白表達：細胞裂解及蛋白提取：取適量的肺癌細胞和癌旁正常肺組織細胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間不斷輕輕晃動，使細胞充分裂解。將裂解液轉移至離心管中，12000r/min離心15min，取上清液，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據測定結果將蛋白濃度調整至一致，以便后續實驗的準確性。SDS-PAGE電泳：根據蛋白分子量大小，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。將調整好濃度的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品加入到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，先以80V的電壓電泳至溴酚藍進入分離膠，然后將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍接近凝膠底部，使不同分子量的蛋白得到有效分離。轉膜：電泳結束后，將凝膠小心取出，放入轉膜緩沖液中浸泡15min。同時，準備好PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1min使其活化，然后放入轉膜緩沖液中浸泡5min。按照“負極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序組裝轉膜裝置，確保各層之間緊密貼合，無氣泡產生。在恒流條件下進行轉膜，電流設置為300mA，轉膜時間根據蛋白分子量大小調整，一般為1-2h，使蛋白從凝膠轉移到PVDF膜上。封閉及抗體孵育：轉膜完成后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1h，封閉非特異性結合位點。封閉結束后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。將PVDF膜放入含有鼠抗人p16單克隆抗體（1∶1000稀釋）和鼠抗人Bmi-1單克隆抗體（1∶1500稀釋）的雜交袋中，4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，去除未結合的一抗。然后將PVDF膜放入含有HRP標記的山羊抗鼠二抗（1∶5000稀釋）的雜交袋中，室溫孵育1h。孵育結束后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，去除未結合的二抗。化學發光顯色：將ECL化學發光試劑A液和B液等體積混合，均勻滴加到PVDF膜上，室溫孵育1-2min，使化學發光試劑與HRP反應，產生熒光信號。將PVDF膜放入凝膠成像系統中，曝光成像，記錄蛋白條帶的位置和強度。通過分析蛋白條帶的灰度值，與內參蛋白（如β-actin）條帶的灰度值進行比較，計算p16和Bmi-1蛋白的相對表達量。3.3結果判定標準免疫組化結果采用半定量判定標準，依據陽性細胞所占比例及分布情況進行評分。具體判定方法如下：在光學顯微鏡下，每張切片隨機選取5個高倍視野（×400）進行觀察。先對陽性細胞的百分比進行評分，陽性細胞數占比≤5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。再對陽性細胞的染色強度進行評分，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最后將陽性細胞百分比得分與染色強度得分相乘，得到最終的評分結果：0分為陰性（-），1-4分為弱陽性（+），5-8分為陽性（++），9-12分為強陽性（+++）。Western印跡法結果判定：通過凝膠成像系統分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內參蛋白，計算p16和Bmi-1蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值，該比值即為p16和Bmi-1蛋白的相對表達量。相對表達量越高，表明蛋白表達水平越高；反之，相對表達量越低，蛋白表達水平越低。3.4統計學分析方法采用SPSS22.0統計學軟件對實驗數據進行分析。對于免疫組化結果中p16與Bmi-1蛋白表達的陽性率比較，以及它們與肺鱗狀細胞癌和腺癌各臨床病理特征（如腫瘤大小、組織學類型、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期等）之間的關系分析，采用卡方檢驗。卡方檢驗是一種常用的假設檢驗方法，用于檢驗兩個或多個分類變量之間是否存在關聯。通過計算卡方值，并與臨界值進行比較，判斷差異是否具有統計學意義。在分析p16與Bmi-1表達的相關性時，運用Spearman等級相關分析。Spearman等級相關分析適用于不滿足正態分布的變量之間的相關性分析，它通過計算Spearman相關系數，來衡量兩個變量之間的相關程度和方向。相關系數的取值范圍在-1到1之間，當相關系數為正數時，表示兩個變量呈正相關；當相關系數為負數時，表示兩個變量呈負相關；當相關系數為0時，表示兩個變量之間不存在線性相關關系。以P＜0.05作為判斷差異具有統計學意義的標準，即當P值小于0.05時，認為所比較的兩組數據之間存在顯著差異，該差異不是由隨機因素造成的，具有實際的生物學或臨床意義。當分析p16與Bmi-1表達的相關性時，若P＜0.05且相關系數的絕對值大于一定閾值（通常根據實際情況確定，如0.3或0.5等），則認為二者之間存在顯著的相關性。四、實驗結果4.1p16蛋白在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中的表達通過免疫組化法對80例肺癌組織標本（其中肺鱗狀細胞癌40例，腺癌40例）以及相應的癌旁正常肺組織標本進行檢測，結果顯示，肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中p16蛋白的總陽性率為22.5%（18/80），而癌旁正常肺組織中p16蛋白的陽性率為87.5%（70/80），二者比較差異具有統計學意義（P＜0.05），這表明p16蛋白在肺癌組織中的表達明顯低于癌旁正常肺組織。進一步分析p16蛋白表達與腫瘤分化程度的關系，在高分化的肺癌組織中，p16蛋白的陽性率為40%（8/20）；中分化的肺癌組織中，陽性率為25%（6/24）；低分化的肺癌組織中，陽性率僅為10%（4/40）。隨著腫瘤分化程度的降低，p16蛋白的表達率逐漸降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），說明p16蛋白表達與腫瘤分化程度密切相關，腫瘤分化程度越低，p16蛋白表達缺失越明顯。在分析p16蛋白表達與腫瘤大小的關系時，將腫瘤直徑＞3cm的定義為大腫瘤組，腫瘤直徑≤3cm的定義為小腫瘤組。大腫瘤組中p16蛋白陽性率為20%（10/50），小腫瘤組中陽性率為25%（8/32），經卡方檢驗，P＞0.05，差異無統計學意義，提示p16蛋白表達百分率與腫瘤大小無明顯相關性。在探討p16蛋白表達與組織類型的關系時，肺鱗狀細胞癌中p16蛋白陽性率為20%（8/40），腺癌中陽性率為25%（10/40），不同組織類型之間p16蛋白陽性率差異無統計學意義（P＞0.05），表明p16蛋白表達與肺癌的組織類型無關。分析p16蛋白表達與淋巴結轉移的關系，有淋巴結轉移組中p16蛋白陽性率為20%（10/50），無淋巴結轉移組中陽性率為27.5%（8/30），經統計學分析，P＞0.05，差異無統計學意義，說明p16蛋白表達與有無淋巴結轉移無明顯相關性。具體數據見表1。表1：p16蛋白表達與肺鱗狀細胞癌和腺癌臨床病理特征的關系臨床病理特征例數p16陽性例數陽性率（%）P值組織類型＞0.05肺鱗狀細胞癌40820腺癌401025腫瘤大小（cm）＞0.05≤332825＞3501020分化程度＜0.05高分化20840中分化24625低分化40410淋巴結轉移＞0.05有501020無30827.54.2Bmi-1蛋白在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中的表達運用免疫組化法對80例肺癌組織標本以及相應的癌旁正常肺組織標本進行檢測，結果顯示，肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中Bmi-1蛋白的總陽性率為62.5%（50/80），而癌旁正常肺組織中Bmi-1蛋白無表達，二者比較差異具有統計學意義（P＜0.05），表明Bmi-1蛋白在肺癌組織中呈高表達，在癌旁正常肺組織中幾乎不表達。在分析Bmi-1蛋白表達與腫瘤大小的關系時，將腫瘤直徑＞3cm的定義為大腫瘤組，腫瘤直徑≤3cm的定義為小腫瘤組。大腫瘤組中Bmi-1蛋白陽性率為64%（32/50），小腫瘤組中陽性率為60%（18/30），經卡方檢驗，P＞0.05，差異無統計學意義，提示Bmi-1蛋白表達百分率與腫瘤大小無明顯相關性。進一步分析Bmi-1蛋白表達與腫瘤分化程度的關系，在高分化的肺癌組織中，Bmi-1蛋白的陽性率為50%（10/20）；中分化的肺癌組織中，陽性率為62.5%（15/24）；低分化的肺癌組織中，陽性率為67.5%（27/40）。雖然隨著腫瘤分化程度的降低，Bmi-1蛋白的陽性率有升高的趨勢，但經卡方檢驗，P＞0.05，差異無統計學意義，表明Bmi-1蛋白表達與腫瘤分化程度無明顯相關性。探討Bmi-1蛋白表達與組織類型的關系，肺鱗狀細胞癌中Bmi-1蛋白陽性率為60%（24/40），腺癌中陽性率為65%（26/40），不同組織類型之間Bmi-1蛋白陽性率差異無統計學意義（P＞0.05），說明Bmi-1蛋白表達與肺癌的組織類型無關。分析Bmi-1蛋白表達與淋巴結轉移的關系，有淋巴結轉移組中Bmi-1蛋白陽性率為72%（36/50），無淋巴結轉移組中陽性率為46.7%（14/30），經統計學分析，P＜0.05，差異具有統計學意義，表明有淋巴結轉移組Bmi-1表達的陽性率高于無淋巴結轉移組，Bmi-1蛋白表達與有無淋巴結轉移密切相關。具體數據見表2。表2：Bmi-1蛋白表達與肺鱗狀細胞癌和腺癌臨床病理特征的關系臨床病理特征例數Bmi-1陽性例數陽性率（%）P值組織類型＞0.05肺鱗狀細胞癌402460腺癌402665腫瘤大小（cm）＞0.05≤3301860＞3503264分化程度＞0.05高分化201050中分化241562.5低分化402767.5淋巴結轉移＜0.05有503672無301446.74.3p16與Bmi-1蛋白表達的相關性分析對80例肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊標本中p16與Bmi-1蛋白表達進行Spearman等級相關分析，結果顯示，二者表達呈負相關（r=-0.425，P＜0.05）。具體數據見表3。這表明在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中，Bmi-1蛋白表達越高，p16蛋白表達越低；反之，Bmi-1蛋白表達越低，p16蛋白表達越高。這種負相關關系進一步驗證了p16與Bmi-1在肺癌發生發展過程中可能存在相互作用和調控機制。在免疫組化染色結果中，可直觀地觀察到部分標本中Bmi-1蛋白呈強陽性表達，而p16蛋白表達則明顯較弱或缺失；相反，在一些Bmi-1蛋白表達陰性或弱陽性的標本中，p16蛋白表達相對較高。這與相關分析結果一致，為二者在肺癌發生發展中的相互作用提供了直觀的證據。表3：p16與Bmi-1蛋白表達的相關性分析p16蛋白表達Bmi-1蛋白表達例數r值P值陽性陰性10-0.425＜0.05陽性陽性8陰性陰性12陰性陽性50五、結果討論5.1p16蛋白表達降低與肺鱗狀細胞癌和腺癌的關系本研究結果顯示，肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中p16蛋白的總陽性率為22.5%，顯著低于癌旁正常肺組織的87.5%，這一結果與國內外眾多研究結果一致。p16基因作為一種重要的抑癌基因，在細胞周期調控中發揮著關鍵作用。正常情況下，p16蛋白能夠與細胞周期素D1競爭結合細胞周期素依賴性激酶4，抑制其活性，從而阻止細胞從G1期進入S期，抑制細胞增殖。在肺鱗狀細胞癌和腺癌中，p16蛋白表達降低，使得細胞周期調控失衡，細胞增殖失控，進而促進了腫瘤的發生發展。腫瘤分化程度是評估腫瘤惡性程度的重要指標之一。本研究發現，隨著腫瘤分化程度的降低，p16蛋白的表達率逐漸降低。在高分化的肺癌組織中，p16蛋白的陽性率為40%；中分化的肺癌組織中，陽性率為25%；低分化的肺癌組織中，陽性率僅為10%。這表明p16蛋白表達與腫瘤分化程度密切相關，腫瘤分化程度越低，p16蛋白表達缺失越明顯。腫瘤細胞的分化程度越低，其惡性程度越高，增殖能力越強，而p16蛋白表達的降低可能是導致腫瘤細胞分化異常和增殖失控的重要原因之一。p16蛋白表達缺失可能通過多種機制促進肺鱗狀細胞癌和腺癌的發生發展。一方面，p16蛋白表達降低使得細胞周期進程不受控制，細胞能夠持續進入S期進行DNA復制和細胞分裂，導致細胞過度增殖。另一方面，p16蛋白的缺失可能影響細胞的分化和凋亡，使腫瘤細胞獲得更強的生存能力和抗凋亡能力，從而促進腫瘤的生長和發展。此外，p16蛋白表達缺失還可能與腫瘤的侵襲和轉移相關，通過影響細胞間的黏附、遷移等過程，使腫瘤細胞更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉移。在本研究中，p16蛋白表達百分率與腫瘤大小、組織類型及有無淋巴結轉移無明顯相關性。然而，其他一些研究報道了不同的結果。有研究認為p16蛋白表達與腫瘤大小有關，腫瘤越大，p16蛋白表達越低。對于p16蛋白表達與淋巴結轉移的關系，也有研究表明p16蛋白表達缺失與淋巴結轉移密切相關，p16蛋白低表達的患者更容易出現淋巴結轉移。這些差異可能與研究樣本的來源、樣本量大小、檢測方法以及患者的個體差異等因素有關。不同地區、不同醫院的患者可能具有不同的遺傳背景和生活環境，這些因素都可能影響p16蛋白的表達。樣本量較小可能導致研究結果的偏差，而不同的檢測方法對p16蛋白表達的檢測靈敏度和準確性也可能存在差異。未來的研究需要進一步擴大樣本量，采用更加標準化的檢測方法，以明確p16蛋白表達與腫瘤大小、組織類型及淋巴結轉移之間的關系。5.2Bmi-1蛋白表達增加對肺鱗狀細胞癌和腺癌的影響本研究結果顯示，肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中Bmi-1蛋白的總陽性率為62.5%，而癌旁正常肺組織中Bmi-1蛋白無表達，表明Bmi-1蛋白在肺癌組織中呈高表達，在癌旁正常肺組織中幾乎不表達。這與以往的研究結果一致，如朱鋒鋒等人的研究表明，非小細胞肺癌組織中的Bmi-1表達水平明顯高于癌旁正常對照組織。在分析Bmi-1蛋白表達與臨床病理特征的關系時，本研究發現Bmi-1蛋白表達與腫瘤大小、分化程度及組織類型無明顯相關性，但與有無淋巴結轉移密切相關，有淋巴結轉移組Bmi-1表達的陽性率高于無淋巴結轉移組。這表明Bmi-1蛋白表達增加可能與肺鱗狀細胞癌和腺癌的淋巴結轉移密切相關，提示Bmi-1蛋白在肺癌的侵襲和轉移過程中發揮著重要作用。Bmi-1蛋白表達增加可能通過多種機制促進肺鱗狀細胞癌和腺癌的發生發展。Bmi-1作為原癌基因，可通過抑制細胞凋亡，使腫瘤細胞獲得更強的生存能力，從而促進腫瘤的生長。Bmi-1可以促進細胞增殖和自我更新，維持腫瘤干細胞特性，使腫瘤細胞不斷增殖，增加腫瘤的惡性程度。Bmi-1還可能通過調節細胞間的黏附、遷移等過程，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，使腫瘤細胞更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉移。在本研究中，Bmi-1蛋白表達與腫瘤大小、分化程度及組織類型無明顯相關性，這與部分研究報道不一致。有研究認為Bmi-1蛋白表達與腫瘤大小、分化程度有關，腫瘤越大、分化程度越低，Bmi-1蛋白表達越高。這些差異可能與研究樣本的來源、樣本量大小、檢測方法以及患者的個體差異等因素有關。不同地區、不同醫院的患者可能具有不同的遺傳背景和生活環境，這些因素都可能影響Bmi-1蛋白的表達。樣本量較小可能導致研究結果的偏差，而不同的檢測方法對Bmi-1蛋白表達的檢測靈敏度和準確性也可能存在差異。未來的研究需要進一步擴大樣本量，采用更加標準化的檢測方法，以明確Bmi-1蛋白表達與腫瘤大小、分化程度及組織類型之間的關系。5.3p16與Bmi-1表達負相關的潛在機制本研究通過Spearman等級相關分析，明確了在肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中p16與Bmi-1蛋白表達呈負相關（r=-0.425，P＜0.05）。這一結果與眾多相關研究結果一致，進一步驗證了二者在肺癌發生發展過程中存在密切的相互作用關系。從分子調控角度來看，Bmi-1可能通過直接或間接的方式負調控p16的表達。Bmi-1屬于Polycomb家族蛋白，該家族蛋白能夠形成多聚復合物，通過修飾染色質來調控基因表達。Bmi-1可能與其他Polycomb家族成員形成復合物，結合到p16基因的啟動子區域，使該區域的染色質結構發生改變，如組蛋白H3的賴氨酸27位點發生三甲基化（H3K27me3），從而抑制p16基因的轉錄，導致p16蛋白表達降低。這種調控機制在多種腫瘤細胞中都有報道，在乳腺癌細胞中，Bmi-1通過與EZH2等Polycomb家族成員形成復合物，結合到p16基因啟動子區域，使H3K27me3水平升高，抑制p16基因轉錄，降低p16蛋白表達。p16基因的異常改變也可能影響Bmi-1的表達和功能。當p16基因發生缺失、突變或甲基化等異常時，其對細胞周期的調控作用喪失，細胞增殖失控。這種異常的細胞增殖狀態可能會激活一系列信號通路，從而反饋性地影響Bmi-1的表達。有研究表明，在p16基因缺失的細胞中，細胞周期相關信號通路發生紊亂，導致Bmi-1的表達上調，進而促進細胞的增殖和腫瘤的發展。二者表達的負相關關系對肺鱗狀細胞癌和腺癌的發生發展產生重要影響。在肺癌細胞中，Bmi-1高表達而p16低表達時，細胞周期調控失衡，細胞能夠持續進入S期進行DNA復制和細胞分裂，導致細胞過度增殖。Bmi-1還可以抑制細胞凋亡，增強腫瘤細胞的生存能力，同時促進腫瘤細胞的上皮-間質轉化，使腫瘤細胞獲得更強的遷移和侵襲能力，從而促進肺癌的發生和發展。在本研究中，也觀察到Bmi-1表達陽性且p16表達陰性的肺癌組織，其腫瘤細胞的增殖活性明顯高于Bmi-1表達陰性且p16表達陽性的組織，這進一步證實了二者表達負相關對肺癌細胞生物學行為的影響。這種負相關關系還可能與肺癌的預后密切相關。已有研究表明，在多種腫瘤中，Bmi-1高表達且p16低表達的患者，其預后往往較差，生存率較低，腫瘤復發率較高。在肺癌中，這種趨勢也較為明顯，Bmi-1高表達且p16低表達的患者，其腫瘤更容易發生轉移，患者的生存期更短。這提示我們，p16與Bmi-1的表達狀態可以作為評估肺癌患者預后的重要指標之一，為臨床治療方案的選擇和患者的預后判斷提供參考。5.4研究結果對肺癌臨床診療的啟示本研究結果對于肺癌的臨床診療具有重要的啟示意義。在肺癌的早期診斷方面，p16與Bmi-1蛋白的表達檢測有望成為潛在的診斷指標。由于p16蛋白在肺癌組織中表達顯著降低，Bmi-1蛋白在肺癌組織中呈高表達，通過檢測患者組織標本中這兩種蛋白的表達水平，或許可以在肺癌早期發現異常，實現早期診斷。特別是對于一些無癥狀的高危人群，如長期吸煙、有肺癌家族史等人群，定期進行p16與Bmi-1蛋白表達檢測，結合其他檢查手段，可能有助于早期發現肺癌，提高患者的治愈率和生存率。在治療靶點選擇方面，p16與Bmi-1蛋白的表達異常為肺癌的治療提供了新的靶點。鑒于Bmi-1蛋白表達增加與肺癌的發生發展密切相關，開發針對Bmi-1的靶向治療藥物可能成為肺癌治療的新策略。通過抑制Bmi-1的表達或活性，有望阻斷其對p16基因的抑制作用，恢復p16蛋白的正常表達，從而調控細胞周期，抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。一些研究已經在探索針對Bmi-1的小分子抑制劑或RNA干擾技術，在動物實驗和細胞實驗中取得了一定的效果，為臨床應用提供了理論基礎。恢復p16基因的正常功能也可能成為肺癌治療的重要方向。可以通過基因治療等手段，修復或激活p16基因，使其重新發揮抑癌作用，抑制腫瘤細胞的生長。在預后評估方面，p16與Bmi-1蛋白的表達狀態可以作為評估肺癌患者預后的重要指標。本研究中，p16蛋白表達與腫瘤分化程度密切相關，腫瘤分化程度越低，p16蛋白表達缺失越明顯；Bmi-1蛋白表達與有無淋巴結轉移密切相關，有淋巴結轉移組Bmi-1表達的陽性率高于無淋巴結轉移組。因此，檢測p16與Bmi-1蛋白的表達，結合其他臨床病理特征，能夠更準確地評估肺癌患者的預后情況，為臨床治療方案的選擇提供參考。對于p16低表達且Bmi-1高表達的患者，其腫瘤的惡性程度可能較高，預后較差，臨床醫生可以據此制定更積極的治療方案，加強隨訪和監測。六、研究結論與展望6.1研究主要結論總結本研究通過免疫組化法和Western印跡法對80例肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊標本以及相應的癌旁正常肺組織標本進行檢測分析，得出以下主要結論：p16蛋白表達特點及與臨床病理特征關系：肺鱗狀細胞癌和腺癌細胞塊中p16蛋白的總陽性率顯著低于癌旁正常肺組織，僅為22.5%。這表明在肺癌發生過程中，p16基因的抑癌功能可能受到抑制，其表達缺失或降低可能是肺癌發生的重要因素之一。p16蛋白表達與腫瘤分化程度密切相關，隨著腫瘤分化程度的降低，p16蛋白的表達率逐漸降低。在高分化的肺癌組織中，p16蛋白的陽性率為40%；中分化