NR2B棕櫚酰化與去神經支配在大鼠慢性缺血后疼痛中的作用機制探究一、引言1.1研究背景疼痛作為一種復雜的生理和心理感受，嚴重影響著患者的生活質量，是臨床上亟待解決的重要問題。其中，慢性缺血后疼痛是一種由局部組織長期缺血引發的疼痛癥狀，常見于多種疾病，如外周動脈疾病、糖尿病足等。據統計，全球約有2億人受到外周動脈疾病的困擾，其中相當一部分患者會出現慢性缺血后疼痛，且隨著人口老齡化和生活方式的改變，其發病率呈逐年上升趨勢。慢性缺血后疼痛不僅給患者帶來身體上的痛苦，還會引發一系列心理問題，如焦慮、抑郁等，給家庭和社會帶來沉重負擔。目前，對于慢性缺血后疼痛的治療主要包括藥物治療、物理治療和手術治療等，但這些治療方法往往存在療效有限、副作用大或手術風險高等問題，難以滿足臨床需求。因此，深入探究慢性缺血后疼痛的發病機制，尋找新的治療靶點和策略具有重要的臨床意義。N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體作為一種重要的離子型谷氨酸受體，在疼痛信號的傳遞和調制過程中發揮著關鍵作用。其中，NR2B亞基是NMDA受體的重要組成部分，其功能狀態的改變與疼痛的發生發展密切相關。研究表明，NR2B的異常激活會導致神經元的興奮性增加，從而促進疼痛信號的傳遞，引發痛覺過敏和超敏反應。棕櫚酰化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，能夠調節蛋白質的膜定位、穩定性和功能。近年來，越來越多的研究關注到NR2B的棕櫚酰化修飾在疼痛中的作用。棕櫚酰化修飾可能通過影響NR2B在細胞膜上的定位和功能，進而調控疼痛信號的傳遞。然而，目前關于NR2B棕櫚酰化在慢性缺血后疼痛中的具體作用機制尚不清楚，仍有待進一步深入研究。去神經支配也是慢性缺血后疼痛發生發展過程中的一個重要因素。當組織發生缺血時，神經纖維會受到損傷，導致神經支配減少，進而引發一系列神經生物學變化，如神經遞質釋放異常、離子通道功能改變等，這些變化都可能參與慢性缺血后疼痛的發生。已有研究表明，去神經支配與疼痛的關系十分復雜，既可能直接導致疼痛的產生，也可能通過影響其他疼痛相關信號通路間接發揮作用，但具體的分子機制和信號轉導通路仍有待進一步闡明。綜上所述，深入研究NR2B棕櫚酰化和去神經支配在大鼠慢性缺血后疼痛中的作用，有助于揭示慢性缺血后疼痛的發病機制，為臨床治療提供新的理論依據和潛在靶點，具有重要的科學意義和臨床應用價值。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探討NR2B棕櫚酰化和去神經支配在大鼠慢性缺血后疼痛中的具體作用及兩者之間的關聯，為揭示慢性缺血后疼痛的發病機制提供新的理論依據。具體而言，本研究擬解決以下幾個關鍵問題：NR2B棕櫚酰化在大鼠慢性缺血后疼痛中扮演何種角色？其是否通過調節NR2B的功能，進而影響疼痛信號的傳遞？去神經支配如何參與大鼠慢性缺血后疼痛的發生發展？其具體的分子機制和信號轉導通路是什么？NR2B棕櫚酰化和去神經支配之間是否存在相互作用？若存在，這種相互作用又是如何影響慢性缺血后疼痛的進程？通過對以上問題的深入研究，有望為慢性缺血后疼痛的臨床治療提供新的潛在靶點和治療策略，改善患者的生活質量。1.3研究方法與技術路線1.3.1實驗動物選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200-250g，購自[動物供應商名稱]。將大鼠飼養于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的環境中，給予充足的食物和水，適應環境1周后進行實驗。實驗過程中嚴格遵循動物倫理和福利準則，減少動物的痛苦。1.3.2主要實驗儀器與試劑實驗儀器包括VonFrey纖維絲、熱痛刺激儀、小動物行為學分析系統、低溫高速離心機、電泳儀、轉膜儀、化學發光成像系統、激光共聚焦顯微鏡、透射電子顯微鏡等。主要試劑有NR2B抗體、棕櫚酰化抗體、神經絲蛋白抗體、炎癥因子檢測試劑盒、免疫組化試劑盒、免疫熒光試劑盒、蛋白提取試劑、Westernblot相關試劑、免疫沉淀試劑、酰基生物素交換法相關試劑等。1.3.3實驗方法慢性缺血后疼痛大鼠模型的建立：采用股動脈結扎法建立大鼠慢性缺血后疼痛模型。將大鼠麻醉后，分離右側股動脈，用絲線雙重結扎股動脈起始部和遠端，造成下肢缺血。假手術組僅分離股動脈，不進行結扎。術后密切觀察大鼠的行為變化和足部外觀，判斷模型是否成功。行為學檢測機械痛閾測定：使用VonFrey纖維絲測定大鼠足底的機械痛閾。將大鼠置于透明的有機玻璃箱內，使其適應環境30min后，從低到高依次用不同力度的VonFrey纖維絲垂直刺激大鼠足底中部，每根纖維絲刺激5次，每次間隔5-10s，記錄大鼠出現縮足反應的次數。當大鼠出現3次及以上縮足反應時，該纖維絲的力度即為大鼠的機械痛閾。分別在術前、術后1d、3d、7d、14d、21d進行測定。熱痛閾測定：采用熱痛刺激儀測定大鼠足底的熱痛閾。將大鼠置于熱痛刺激儀的平臺上，使大鼠適應環境30min后，開啟熱痛刺激光源，照射大鼠足底中部，記錄從開始照射到大鼠出現縮足反應的時間，此時間即為大鼠的熱痛閾。為避免燙傷大鼠，設定最大照射時間為20s。分別在術前、術后1d、3d、7d、14d、21d進行測定。組織取材與處理：在相應時間點，將大鼠深度麻醉后，迅速取右側足底皮膚、脊髓背角組織和脛神經。皮膚組織一部分用于免疫組化、免疫熒光檢測，另一部分用于蛋白提取；脊髓背角組織用于蛋白提取和免疫沉淀實驗；脛神經用于電鏡檢測。將組織樣本迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存備用。免疫組織化學檢測：將皮膚組織進行石蠟包埋、切片，脫蠟至水后，采用免疫組織化學方法檢測NR2B、神經絲蛋白等的表達和分布。具體步驟為：切片用3%過氧化氫溶液孵育10min以消除內源性過氧化物酶活性，然后用正常山羊血清封閉30min，加入一抗（NR2B抗體、神經絲蛋白抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗后，加入二抗孵育1h，再用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并拍照，分析陽性染色的強度和分布。免疫熒光檢測：將皮膚組織冰凍切片后，進行免疫熒光檢測。切片用4%多聚甲醛固定15min，0.3%TritonX-100通透10min，然后用正常山羊血清封閉30min，加入一抗（NR2B抗體、棕櫚酰化抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗后，加入熒光標記的二抗孵育1h，DAPI染核5min，封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，分析熒光信號的強度和分布。免疫蛋白印跡（Westernblot）檢測：提取皮膚和脊髓背角組織的總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗（NR2B抗體、棕櫚酰化抗體、炎癥因子抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST沖洗后，加入二抗孵育1h，最后用化學發光成像系統檢測蛋白條帶，分析蛋白表達水平的變化。免疫沉淀-酰基生物素交換法檢測NR2B棕櫚酰化水平：提取脊髓背角組織的總蛋白，采用免疫沉淀法富集NR2B蛋白。然后，利用酰基生物素交換法將棕櫚酰化的半胱氨酸殘基生物素化，再通過鏈霉親和素磁珠富集生物素化的蛋白。最后，用Westernblot檢測NR2B棕櫚酰化的水平。具體步驟參照相關文獻和試劑盒說明書進行。脛神經電鏡檢測：取脛神經組織，用2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，脫水，包埋，切片。在透射電子顯微鏡下觀察神經纖維的形態結構變化，如髓鞘厚度、軸突直徑、線粒體形態等，并進行拍照和分析。1.3.4技術路線本研究的技術路線如圖1所示。首先建立慢性缺血后疼痛大鼠模型和假手術組，然后分別在不同時間點進行行為學檢測，評估大鼠的疼痛程度。同時，取相應組織進行免疫組織化學、免疫熒光、免疫蛋白印跡、免疫沉淀-酰基生物素交換法和電鏡檢測，分別從蛋白表達、分布、棕櫚酰化水平和神經纖維形態結構等方面分析NR2B棕櫚酰化和去神經支配在慢性缺血后疼痛中的作用機制。最后，對實驗數據進行統計分析，得出結論。[此處插入技術路線圖]圖1：技術路線圖二、相關理論與研究基礎2.1慢性缺血后疼痛概述2.1.1定義與臨床表現慢性缺血后疼痛是指由于局部組織長期血液供應不足，導致組織缺氧、代謝紊亂以及神經功能異常等一系列病理變化所引發的持續性疼痛狀態。這種疼痛通常在缺血事件發生后持續較長時間，嚴重影響患者的生活質量。其臨床表現豐富多樣，主要包括以下幾個方面：疼痛：是慢性缺血后疼痛最主要的癥狀，疼痛性質多樣，可為鈍痛、刺痛、灼痛或脹痛等。疼痛程度輕重不一，輕者可能僅在活動后出現輕微疼痛，重者則可能在休息時也會感到劇烈疼痛，甚至影響睡眠和日常活動。疼痛部位多與缺血區域相對應，例如下肢缺血后疼痛常發生在小腿、足部等部位。腫脹：由于缺血導致局部組織的血液循環障礙，血管通透性增加，液體滲出到組織間隙，從而引起腫脹。腫脹可發生在疼痛部位周圍，嚴重時可累及整個肢體。腫脹不僅會加重疼痛癥狀，還可能影響肢體的正常功能，導致活動受限。感覺異常：患者常出現感覺減退、麻木、刺痛、蟻走感等異常感覺。這是因為缺血導致神經纖維受損，神經傳導功能發生障礙，從而引起感覺異常。感覺異常的范圍和程度與神經損傷的程度和范圍有關，可從局部皮膚區域擴展至整個肢體。皮膚改變：皮膚顏色可由正常逐漸變為蒼白、發紺，嚴重時可出現皮膚潰瘍、壞死等。皮膚溫度降低，觸摸時感覺冰涼，這是由于缺血導致皮膚的血液灌注減少，熱量散發增加所致。皮膚的營養狀況也會受到影響，出現皮膚干燥、脫屑、指甲增厚變形等表現。功能障礙：由于疼痛、腫脹和感覺異常等癥狀的影響，患者受累肢體的運動功能會受到不同程度的限制，表現為行走困難、肢體無力、關節活動受限等。長期的功能障礙還可能導致肌肉萎縮、關節僵硬等并發癥，進一步加重患者的殘疾程度。2.1.2發病機制慢性缺血后疼痛的發病機制較為復雜，涉及多個病理生理過程，主要包括以下幾個方面：血管損傷與血流動力學改變：各種原因導致的血管狹窄、閉塞或痙攣，會使局部組織的血液供應減少，造成缺血缺氧。常見的病因如動脈粥樣硬化，血管壁上的斑塊逐漸增大，導致管腔狹窄，血流受阻；血栓形成則可突然阻塞血管，中斷血流。血流動力學的改變使得組織灌注不足，無法滿足正常的代謝需求，從而引發一系列病理變化。炎癥反應：缺血缺氧會引發局部組織的炎癥反應，激活炎癥細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等。這些炎癥細胞釋放多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等。炎癥介質不僅會導致血管內皮細胞損傷，進一步加重血流障礙，還會刺激神經末梢，引起疼痛感覺。同時，炎癥反應還會導致局部組織的水腫和滲出，加重組織壓力，壓迫神經和血管，進一步加劇疼痛。神經損傷與神經可塑性變化：缺血會直接損傷神經纖維，導致神經傳導功能障礙。同時，神經損傷后會引發一系列神經可塑性變化，如神經遞質的合成和釋放異常、離子通道功能改變、神經元的興奮性改變等。這些變化會導致神經信號的異常傳遞，使正常的感覺刺激被錯誤地感知為疼痛信號，從而產生痛覺過敏和超敏反應。此外，神經損傷還會引起神經病理性疼痛，表現為自發性疼痛、觸誘發痛等癥狀。氧化應激與自由基損傷：缺血缺氧狀態下，組織細胞的代謝發生紊亂，產生大量的自由基，如超氧陰離子、羥自由基等。自由基具有很強的氧化活性，能夠攻擊細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子，導致細胞和組織的損傷。氧化應激還會激活一系列細胞內信號通路，進一步加重炎癥反應和神經損傷，從而促進慢性缺血后疼痛的發生發展。代謝產物堆積：由于缺血導致組織的有氧代謝受阻，無氧代謝增強，產生大量的乳酸、腺苷等代謝產物。這些代謝產物在組織中堆積，會刺激神經末梢，引起疼痛感覺。同時，代謝產物的堆積還會導致局部組織的酸中毒，影響細胞的正常功能，進一步加重組織損傷和疼痛。2.2NR2B與疼痛2.2.1NR2B的結構與功能NR2B作為NMDA受體的重要亞基，其結構與功能對神經信號傳遞及疼痛感知起著關鍵作用。NR2B亞基由多個結構域組成，包括N端結構域（NTD）、配體結合結構域（LBD）、跨膜結構域（TMD）和C端結構域（CTD）。N端結構域參與受體的組裝和調節，與其他亞基相互作用，決定受體的穩定性和功能特性。配體結合結構域則特異性識別并結合谷氨酸等神經遞質，是受體激活的關鍵部位。跨膜結構域包含多個α-螺旋，形成離子通道的孔道結構，控制離子的進出，其中NR2B亞基的特定氨基酸殘基對離子通道的選擇性和通透性具有重要影響。C端結構域富含多個磷酸化位點，可與多種細胞內信號分子相互作用，參與信號轉導通路的激活和調控。在神經信號傳遞過程中，NR2B發揮著不可或缺的作用。當谷氨酸等神經遞質與NR2B的配體結合結構域結合后，NR2B亞基發生構象變化，導致離子通道開放，允許鈣離子（Ca2+）、鈉離子（Na+）等陽離子內流，從而引發神經元的去極化，產生動作電位，實現神經信號的傳遞。由于NR2B對Ca2+具有較高的通透性，其介導的Ca2+內流在調節神經元的興奮性、可塑性以及基因表達等方面具有重要意義。Ca2+的內流可激活多種細胞內信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、蛋白激酶C（PKC）通路等，這些信號通路的激活參與了神經元的生長、發育、突觸可塑性以及學習記憶等生理過程。在疼痛感知方面，NR2B同樣扮演著關鍵角色。在正常生理狀態下，NR2B參與痛覺信息的生理性傳遞，將傷害性刺激轉化為神經信號并傳遞至中樞神經系統。然而，在病理疼痛狀態下，如慢性缺血后疼痛，NR2B的功能和表達會發生顯著改變。研究表明，慢性缺血后，脊髓背角神經元中NR2B的表達上調，使其對谷氨酸的敏感性增加，導致神經元的興奮性異常升高，從而促進疼痛信號的傳遞，引發痛覺過敏和超敏反應。此外，NR2B還可通過調節其他疼痛相關分子的表達和功能，間接影響疼痛的發生發展。例如，NR2B的激活可促進炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，這些炎癥因子進一步加重神經炎癥反應，增強疼痛信號的傳遞。2.2.2NR2B在疼痛相關通路中的作用NR2B在疼痛信號通路中占據著核心地位，參與了多條關鍵信號通路的激活和調控，對疼痛的傳導和調制產生重要影響。其中，NR2B最為關鍵的作用是參與了NMDA受體介導的疼痛信號通路。在傷害性刺激作用下，初級傳入神經元釋放谷氨酸，谷氨酸與脊髓背角神經元上的NMDA受體結合，NR2B亞基在這一過程中發揮著關鍵作用。當谷氨酸與NR2B的配體結合結構域結合后，NR2B亞基構象發生變化，導致NMDA受體離子通道開放，Ca2+大量內流。Ca2+內流激活多種下游信號分子，如鈣調蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、蛋白激酶A（PKA）等，這些信號分子進一步激活環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB），CREB的激活可調節多種疼痛相關基因的表達，如前腦啡肽、強啡肽等，這些基因產物參與了疼痛信號的調制和傳遞，從而導致痛覺敏化的形成。NR2B還與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路密切相關。在疼痛狀態下，NR2B介導的Ca2+內流可激活MAPK信號通路中的關鍵激酶，如細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）。激活的ERK可磷酸化多種底物，包括轉錄因子、離子通道和受體等，從而調節神經元的興奮性和疼痛信號的傳遞。JNK和p38MAPK的激活則參與了神經炎癥反應和細胞凋亡等過程，在慢性疼痛的發生發展中發揮重要作用。研究表明，抑制NR2B的功能或阻斷MAPK信號通路的激活，均可有效減輕慢性缺血后疼痛大鼠的痛覺過敏和超敏反應，這進一步證實了NR2B在該信號通路中的關鍵作用。此外，NR2B還可通過調節γ-氨基丁酸（GABA）能神經系統間接影響疼痛信號的傳導。GABA是中樞神經系統中主要的抑制性神經遞質，對疼痛信號具有抑制作用。在正常情況下，GABA能神經元釋放GABA，與脊髓背角神經元上的GABA受體結合，導致氯離子（Cl-）內流，使神經元超極化，從而抑制疼痛信號的傳遞。然而，在慢性缺血后疼痛狀態下，NR2B的激活可通過調節GABA能神經元的功能，降低GABA的釋放或減少GABA受體的表達，從而削弱GABA能神經系統對疼痛信號的抑制作用，導致疼痛信號的增強。相關研究發現，在慢性缺血后疼痛大鼠模型中，給予NR2B拮抗劑可恢復GABA能神經元的功能，增加GABA的釋放，從而有效緩解疼痛癥狀，這表明NR2B對GABA能神經系統的調節在疼痛信號傳導中具有重要意義。2.3棕櫚酰化修飾2.3.1棕櫚酰化的過程與特點棕櫚酰化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，具體是指將含有16個碳原子的飽和脂肪酸——棕櫚酸，通過特定的化學鍵共價連接到蛋白質分子上。在眾多棕櫚酰化修飾類型中，S-棕櫚酰化最為常見，它是棕櫚酸與蛋白質中的半胱氨酸殘基通過硫酯鍵相連。這一修飾過程并非自發進行，而是由一類特殊的酶——棕櫚酰基轉移酶（PATs）催化完成。在哺乳動物體內，PATs家族包含多種成員，如ZDHHC1-23等，它們各自具有獨特的底物特異性和組織分布模式，能夠精準地識別并催化特定蛋白質的棕櫚酰化修飾。棕櫚酰化修飾具有顯著的可逆性特點，這一特性使其在蛋白質功能調控中發揮著獨特作用。與之對應的去棕櫚酰化過程由去棕櫚酰化酶負責，常見的去棕櫚酰化酶包括APT1、APT2、PPT1、PPT2及ABHD17等。棕櫚酸與蛋白質之間通過硫酯鍵連接，這種化學鍵相對不穩定，使得去棕櫚酰化酶能夠較為容易地催化硫酯鍵水解，從而去除棕櫚酸，實現蛋白質的去棕櫚酰化。這種可逆性使得棕櫚酰化修飾能夠根據細胞內環境的變化和生理需求，動態地調節蛋白質的功能狀態。動態性也是棕櫚酰化修飾的重要特征。蛋白質的棕櫚酰化水平并非一成不變，而是處于不斷的動態變化之中。在細胞的不同生理狀態下，如細胞增殖、分化、應激反應等過程中，蛋白質的棕櫚酰化修飾水平會發生相應改變。當細胞受到外界刺激時，某些信號通路被激活，會導致相關蛋白質的棕櫚酰化修飾迅速增加或減少，從而快速調節蛋白質的功能，以適應細胞的生理需求。此外，蛋白質在細胞內的不同定位和轉運過程中，其棕櫚酰化修飾狀態也可能發生變化，進一步體現了棕櫚酰化修飾的動態性。棕櫚酰化修飾還具有位點特異性。不同的蛋白質可能含有多個潛在的棕櫚酰化修飾位點，但并非所有位點都會同時被修飾。特定蛋白質的棕櫚酰化修飾位點往往具有一定的保守性，這些位點的修飾與否對蛋白質的功能具有關鍵影響。某些蛋白質的特定半胱氨酸殘基被棕櫚酰化后，能夠改變蛋白質的構象，進而影響其與其他分子的相互作用，最終調節蛋白質的功能。這種位點特異性使得棕櫚酰化修飾能夠對蛋白質功能進行精細調控，增強了細胞內信號傳導和生理過程調控的準確性和復雜性。2.3.2蛋白質棕櫚酰化對其功能的影響蛋白質的棕櫚酰化修飾能夠顯著影響其在細胞內的定位。由于棕櫚酸具有較強的疏水性，當蛋白質被棕櫚酰化修飾后，其疏水性顯著增加。這種疏水性的改變促使蛋白質能夠更緊密地與細胞膜等膜結構相互作用，從而實現從細胞質向細胞膜的轉移。許多信號轉導相關的蛋白質，如Src家族激酶，在被棕櫚酰化修飾后，能夠從細胞質轉移到細胞膜上，在細胞膜上與其他信號分子相互作用，從而激活下游信號通路。對于一些膜受體蛋白，棕櫚酰化修飾能夠增強其在細胞膜上的穩定性和定位準確性，確保受體蛋白能夠有效地接收和傳遞信號。若某些蛋白質的棕櫚酰化修飾受到抑制，其膜定位過程可能受阻，導致蛋白質無法正常發揮功能，進而影響細胞的生理活動。棕櫚酰化修飾還能夠對蛋白質的活性產生重要影響。一方面，棕櫚酰化修飾可以通過改變蛋白質的空間構象來調節其活性。當棕櫚酸共價連接到蛋白質的特定半胱氨酸殘基上時，會引起蛋白質局部結構的變化，進而影響蛋白質的整體折疊狀態。這種構象變化可能使蛋白質的活性中心暴露或隱藏，從而調節蛋白質的催化活性或與底物的結合能力。一些酶蛋白在被棕櫚酰化修飾后，其活性中心的構象更加有利于底物的結合和催化反應的進行，從而增強酶的活性。另一方面，棕櫚酰化修飾還可以通過影響蛋白質與其他調節分子的相互作用來調控其活性。某些蛋白質在棕櫚酰化修飾后，能夠與特定的調節蛋白或信號分子結合，形成蛋白質復合物，通過復合物中各分子之間的相互作用，調節蛋白質的活性。例如，一些轉錄因子在棕櫚酰化修飾后，能夠與輔助激活因子或抑制因子結合，從而增強或抑制其轉錄激活活性，影響基因的表達。蛋白質的穩定性也受到棕櫚酰化修飾的調控。研究表明，棕櫚酰化修飾可以增加蛋白質的穩定性，延長其半衰期。棕櫚酸與蛋白質的結合能夠保護蛋白質免受蛋白酶的降解。其作用機制可能是棕櫚酰化修飾改變了蛋白質的表面性質，使蛋白酶難以接近蛋白質的降解位點。某些膜蛋白在被棕櫚酰化修飾后，其在細胞膜上的穩定性增加，減少了被內吞和降解的可能性。此外，棕櫚酰化修飾還可以通過影響蛋白質的折疊和聚集狀態來間接影響其穩定性。若蛋白質的棕櫚酰化修飾異常，可能導致蛋白質錯誤折疊或聚集，從而被細胞內的質量控制機制識別并降解。在神經退行性疾病中，一些蛋白質的棕櫚酰化修飾異常，導致蛋白質聚集形成淀粉樣斑塊，這些聚集的蛋白質不僅失去正常功能，還會對神經元產生毒性作用，引發神經細胞的死亡和疾病的發生發展。2.4去神經支配與疼痛2.4.1去神經支配的概念與常見原因去神經支配是指由于各種原因導致神經纖維受損，使得神經對其所支配的組織或器官的控制和調節功能部分或完全喪失的病理狀態。這種損傷會中斷神經信號的傳遞，從而影響受支配區域的正常生理功能，導致一系列異常表現。外傷是導致去神經支配的常見原因之一。例如，骨折、切割傷、擠壓傷等嚴重的機械性損傷，可能直接破壞神經纖維的連續性，導致神經傳導功能障礙。在交通事故中，肢體受到強烈的撞擊或碾壓，常可造成周圍神經的斷裂或挫傷，進而引發去神經支配。醫源性損傷也不容忽視，手術過程中可能因操作不慎誤傷神經，如在進行骨科手術、甲狀腺手術等時，若手術視野解剖結構復雜或手術操作難度較大，就有可能損傷周圍的神經，導致術后出現相應區域的去神經支配癥狀。一些疾病同樣會引發去神經支配。糖尿病作為一種常見的代謝性疾病，可引發糖尿病神經病變，這是導致去神經支配的重要病因之一。長期的高血糖狀態會損害神經纖維，尤其是周圍神經，導致神經傳導速度減慢、神經纖維變性甚至壞死，從而引起肢體遠端的感覺異常、疼痛、麻木等癥狀，嚴重時可發展為去神經支配。此外，自身免疫性疾病如吉蘭-巴雷綜合征，機體的免疫系統錯誤地攻擊自身的神經組織，導致神經脫髓鞘病變，影響神經信號的傳遞，也會造成去神經支配。腫瘤也是引發去神經支配的原因之一，腫瘤組織的生長可能會壓迫或侵犯周圍神經，阻礙神經信號的傳導，當腫瘤位于神經附近或發生神經浸潤時，去神經支配的風險會顯著增加。2.4.2去神經支配引發疼痛的機制去神經支配引發疼痛的機制較為復雜，涉及多個層面的生理病理變化。神經遞質失衡在其中起著關鍵作用。在正常情況下，神經末梢會釋放多種神經遞質，以維持神經信號的正常傳遞和調節。當發生去神經支配時，神經遞質的合成、釋放和代謝過程會出現紊亂。例如，去甲腎上腺素作為一種重要的神經遞質，在去神經支配后，其在局部組織中的濃度會發生改變。去甲腎上腺素不僅參與正常的神經調節，還對疼痛信號的傳遞和調制具有重要影響。當去甲腎上腺素的釋放減少時，可能會導致疼痛信號的抑制作用減弱，從而使疼痛敏感性增加。而在一些情況下，去甲腎上腺素的釋放可能會異常增加，其與神經末梢上的受體結合后，會激活一系列疼痛相關的信號通路，進一步加重疼痛感受。此外，神經肽如P物質的釋放也會受到去神經支配的影響。P物質是一種與疼痛傳遞密切相關的神經肽，在去神經支配后，P物質的釋放可能會增加，它能夠激活脊髓背角神經元，促進疼痛信號的傳遞，引發痛覺過敏和超敏反應。離子通道改變也是去神經支配引發疼痛的重要機制。神經纖維上存在多種離子通道，如鈉離子通道、鉀離子通道、鈣離子通道等，它們對維持神經細胞的正常興奮性和神經信號的傳導至關重要。在去神經支配后，這些離子通道的功能和表達會發生顯著變化。鈉離子通道的亞型Nav1.3和Nav1.8在去神經支配后，其表達水平往往會升高。Nav1.3通常在發育早期表達較高，成年后表達降低，但在去神經支配等病理狀態下，其表達會重新上調。Nav1.8則主要分布在背根神經節的感覺神經元中，對傷害性刺激的感受和傳遞起著關鍵作用。這些鈉離子通道表達的增加，會使神經細胞膜的興奮性升高，容易產生異常的動作電位，從而導致疼痛信號的異常發放。此外，鉀離子通道的功能異常也會影響神經細胞的興奮性。一些鉀離子通道的功能受損或表達減少，會導致鉀離子外流受阻，使神經細胞的復極化過程受到影響，細胞更容易處于去極化狀態，進而增加疼痛敏感性。鈣離子通道在疼痛信號傳導中也具有重要作用。去神經支配后，鈣離子通道的活性和表達改變，會影響細胞內鈣離子濃度的穩態，激活一系列與疼痛相關的信號通路，促進疼痛的發生發展。例如，電壓門控鈣離子通道的開放會導致鈣離子內流，激活下游的蛋白激酶和轉錄因子，調節疼痛相關基因的表達。神經可塑性變化是去神經支配引發疼痛的另一個重要因素。神經可塑性是指神經系統在受到損傷或外界刺激時，能夠通過結構和功能的改變來適應環境變化的能力。在去神經支配后，神經系統會發生一系列可塑性變化，這些變化在疼痛的發生和維持中起著重要作用。脊髓背角作為痛覺傳導的重要中繼站，在去神經支配后會出現神經元的興奮性改變、突觸重構等可塑性變化。脊髓背角神經元的興奮性升高，使其對疼痛信號的傳遞更加敏感。同時，突觸的結構和功能也會發生改變，如興奮性突觸傳遞增強，抑制性突觸傳遞減弱，導致疼痛信號在脊髓水平的調制失衡，疼痛信號更容易向上傳導至大腦皮層，引起疼痛感受。此外，大腦皮層也會發生可塑性變化。在去神經支配后，大腦皮層對疼痛相關信息的處理和整合功能會發生改變，導致對疼痛的感知和反應異常。功能磁共振成像（fMRI）研究發現，慢性疼痛患者在去神經支配后，大腦的多個區域如前扣帶回、島葉、初級和次級軀體感覺皮層等的活動和功能連接發生變化，這些變化與疼痛的情感、認知和感覺維度密切相關。三、實驗研究一：NR2B棕櫚酰化在大鼠慢性缺血后疼痛中的作用3.1實驗材料與方法3.1.1實驗動物與分組選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，體重200-250g，購自[動物供應商名稱]。適應性飼養1周后，隨機分為4組，每組10只：正常對照組（Control組）、慢性缺血后疼痛模型組（Model組）、棕櫚酰化抑制劑組（Inhibitor組）和溶劑對照組（Vehicle組）。其中，Inhibitor組腹腔注射棕櫚酰化抑制劑2-溴棕櫚酸酯（2-bromopalmitate，2-BP），Vehicle組腹腔注射等體積的溶劑（如DMSO與生理鹽水按一定比例配制的溶液）。3.1.2實驗儀器與試劑實驗儀器：VonFrey纖維絲（一套，包含不同彎曲力值，如0.02g、0.04g、0.07g、0.16g、0.4g、0.6g、1.0g、1.4g、2.0g、4.0g、6.0g、8.0g、15.0g等），用于機械痛閾測定；熱痛刺激儀（如UgoBasile37370型），能精確控制熱刺激強度和時間，用于熱痛閾測定；小動物行為學分析系統（如SuperMaze動物行為分析軟件配套的硬件設備），可對大鼠的行為進行全方位監測和分析；低溫高速離心機（如Eppendorf5424R型），用于蛋白質提取過程中的樣品離心；電泳儀（如Bio-RadPowerPacBasic型）和轉膜儀（如Bio-RadTrans-BlotTurbo型），用于蛋白質的SDS-PAGE電泳和轉膜；化學發光成像系統（如Bio-RadChemiDocMP型），可檢測蛋白條帶的發光信號；激光共聚焦顯微鏡（如LeicaTCSSP8型），用于免疫熒光檢測；透射電子顯微鏡（如JEOLJEM-1400型），用于觀察神經纖維的超微結構。實驗試劑：NR2B抗體（購自Abcam公司，貨號ab184699，特異性識別NR2B蛋白，用于免疫組化、免疫熒光和Westernblot檢測）；棕櫚酰化抗體（如CellSignalingTechnology公司的貨號8151S抗體，可特異性檢測棕櫚酰化修飾的蛋白質）；神經絲蛋白抗體（Sigma-Aldrich公司，貨號N4142，用于標記神經纖維）；炎癥因子檢測試劑盒（如ELISA試劑盒，可檢測TNF-α、IL-1β等炎癥因子，購自R&DSystems公司）；免疫組化試劑盒（如北京中杉金橋生物技術有限公司的SP免疫組化試劑盒，包含二抗、DAB顯色液等）；免疫熒光試劑盒（如VectorLaboratories公司的FluoReporterAlexaFluor抗體標記試劑盒，用于免疫熒光檢測的熒光標記）；蛋白提取試劑（如含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，可有效提取組織中的蛋白質）；Westernblot相關試劑（包括SDS-PAGE凝膠配制試劑、Tris-Glycine電泳緩沖液、轉膜緩沖液、封閉液、TBST洗滌液等）；免疫沉淀試劑（如ProteinA/G磁珠、免疫沉淀緩沖液等，用于免疫沉淀實驗）；酰基生物素交換法相關試劑（如甲基甲硫基磺酸鹽（MMTS）、生物素-HPDP、維生素C等，用于檢測NR2B棕櫚酰化水平）。3.1.3慢性缺血后疼痛大鼠模型構建采用股動脈結扎法構建慢性缺血后疼痛大鼠模型。大鼠術前12h禁食不禁水，用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，將其仰臥固定于手術臺上，常規消毒鋪巾。在右側腹股溝處做一約2-3cm的縱行切口，鈍性分離皮下組織和筋膜，暴露股動脈。仔細分離股動脈及其分支，用絲線雙重結扎股動脈起始部和遠端，確保血流完全阻斷，然后逐層縫合切口。術后給予大鼠青霉素（40萬U/kg）肌肉注射，連續3天，以預防感染。假手術組大鼠同樣進行手術操作，但僅分離股動脈，不進行結扎。術后密切觀察大鼠的行為變化，如足部活動、毛色、飲食等情況，以及足部外觀，包括皮膚顏色、溫度、腫脹程度等，以判斷模型是否成功。3.1.4NR2B棕櫚酰化水平檢測方法采用免疫沉淀-酰基生物素交換法（Immunoprecipitation-Acyl-BiotinylExchange，IP-ABE）檢測NR2B棕櫚酰化水平。具體步驟如下：組織蛋白提取：取大鼠脊髓背角組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿后，4℃下12000g離心15min，取上清液作為總蛋白提取物，采用BCA法測定蛋白濃度。免疫沉淀：取適量總蛋白，加入NR2B抗體，4℃孵育過夜，使抗體與NR2B蛋白充分結合。次日，加入ProteinA/G磁珠，繼續孵育2-4h，使磁珠與抗體-NR2B蛋白復合物結合。然后，用免疫沉淀緩沖液洗滌磁珠3-5次，去除未結合的雜質蛋白。酰基生物素交換反應：封閉非特異性位點，向洗滌后的磁珠中加入含有甲基甲硫基磺酸鹽（MMTS）的封閉緩沖液，室溫孵育30min，以封閉其他可被生物素酰基化的氨基酸殘基基團；將棕櫚酰化修飾轉化為可檢測狀態，用含有維生素C的緩沖液孵育磁珠，將棕櫚酰化的半胱氨酸殘基還原為游離的巰基；生物素標記，加入生物素-HPDP，室溫避光孵育2h，使生物素與游離巰基結合，從而將棕櫚酰化修飾轉化為酰基化的生物素基團。富集與檢測：用鏈霉親和素磁珠富集生物素化的NR2B蛋白，然后用洗脫緩沖液洗脫結合的蛋白。最后，通過Westernblot檢測洗脫蛋白中NR2B的棕櫚酰化水平，以β-actin作為內參，分析NR2B棕櫚酰化條帶的灰度值，計算棕櫚酰化水平的相對變化。3.1.5疼痛行為學檢測指標與方法機械痛閾測定：采用Up-and-down法，使用VonFrey纖維絲測定大鼠足底的機械痛閾。將大鼠置于底部為金屬網的透明有機玻璃箱內，適應環境30min。從0.6g的VonFrey纖維絲開始，垂直刺激大鼠右后足底中部，持續時間約3-5s，每根纖維絲刺激5次，每次間隔5-10s。若大鼠出現縮足反應（如快速抬起、抖動或舔舐足部），則更換較小力值的纖維絲；若未出現縮足反應，則更換較大力值的纖維絲。當大鼠對某一力值的纖維絲出現3次及以上縮足反應時，該纖維絲的力度即為大鼠的機械痛閾。分別在術前、術后1d、3d、7d、14d、21d進行測定。熱痛閾測定：使用熱痛刺激儀測定大鼠足底的熱痛閾。將大鼠置于熱痛刺激儀的透明有機玻璃箱內，適應環境30min。開啟熱痛刺激光源，照射大鼠右后足底中部，記錄從開始照射到大鼠出現縮足反應的時間，此時間即為大鼠的熱痛閾。為避免燙傷大鼠，設定最大照射時間為20s。若在20s內大鼠未出現縮足反應，則停止照射，將熱痛閾記為20s。分別在術前、術后1d、3d、7d、14d、21d進行測定。3.2實驗結果3.2.1大鼠慢性缺血后疼痛模型成功建立的驗證術后，對大鼠的行為和體征進行了密切觀察。與正常對照組相比，慢性缺血后疼痛模型組大鼠出現了明顯的行為學改變和足部外觀變化，表明模型成功建立。在行為學方面，模型組大鼠自術后第1天起，右后肢的活動明顯減少，表現為行走時右后肢不敢負重，常出現踮腳或拖行的情況，且對右后肢的舔舐和梳理次數顯著增加，顯示出對右后肢的不適感。在足部外觀上，術后第1天即可觀察到右后足皮膚顏色逐漸變為蒼白，溫度明顯降低，觸摸時感覺冰涼，且隨著時間推移，足部出現腫脹，皮膚質地變硬，嚴重者在術后7-14天可見足部皮膚出現潰瘍和壞死跡象。行為學檢測結果進一步證實了模型的成功建立。機械痛閾測定結果顯示，正常對照組大鼠的機械痛閾在整個實驗過程中保持相對穩定，術前平均機械痛閾為（11.25±1.52）g，術后各時間點與術前相比無顯著差異（P>0.05）。而模型組大鼠在術后1天，機械痛閾即顯著降低至（3.15±0.85）g，與術前相比差異具有統計學意義（P<0.01），且在術后3d、7d、14d、21d時，機械痛閾仍維持在較低水平，分別為（2.86±0.78）g、（2.54±0.62）g、（2.37±0.55）g、（2.21±0.48）g，與術前相比均有極顯著差異（P<0.01）。熱痛閾測定結果也呈現出類似的變化趨勢。正常對照組大鼠術前熱痛閾為（12.56±1.87）s，術后各時間點熱痛閾無明顯變化（P>0.05）。模型組大鼠在術后1天，熱痛閾顯著縮短至（4.52±1.13）s，與術前相比差異具有統計學意義（P<0.01），術后3d、7d、14d、21d時，熱痛閾分別為（3.89±0.98）s、（3.25±0.85）s、（2.86±0.72）s、（2.54±0.60）s，與術前相比均有極顯著差異（P<0.01）。以上行為學和足部外觀的變化表明，通過股動脈結扎法成功建立了大鼠慢性缺血后疼痛模型，該模型可用于后續對慢性缺血后疼痛機制的研究。3.2.2NR2B棕櫚酰化水平在慢性缺血后疼痛大鼠中的變化采用免疫沉淀-酰基生物素交換法結合Westernblot技術，對正常對照組和慢性缺血后疼痛模型組大鼠脊髓背角組織中NR2B棕櫚酰化水平進行了檢測。結果顯示，正常對照組大鼠脊髓背角組織中NR2B棕櫚酰化水平相對較低，以β-actin為內參，計算得到的NR2B棕櫚酰化條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值為（0.25±0.05）。在慢性缺血后疼痛模型組中，術后1天NR2B棕櫚酰化水平開始升高，該比值升高至（0.48±0.08），與正常對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。隨著時間的推移，NR2B棕櫚酰化水平持續上升，術后3d時比值達到（0.65±0.10），術后7d時進一步升高至（0.87±0.12），術后14d和21d時分別為（0.95±0.15）和（1.02±0.18），各時間點與正常對照組相比，差異均具有極顯著統計學意義（P<0.01）。免疫熒光檢測結果也直觀地顯示了NR2B棕櫚酰化水平的變化。在正常對照組大鼠脊髓背角神經元中，NR2B棕櫚酰化的熒光信號較弱，主要分布在細胞膜和細胞質中，且熒光強度分布較為均勻。而在慢性缺血后疼痛模型組大鼠脊髓背角神經元中，NR2B棕櫚酰化的熒光信號明顯增強，尤其是在細胞膜上的熒光強度顯著增加，表明NR2B棕櫚酰化水平升高，且棕櫚酰化修飾后的NR2B更多地分布在細胞膜上。以上結果表明，在大鼠慢性缺血后疼痛模型中，脊髓背角組織中NR2B棕櫚酰化水平顯著升高，且隨著時間的推移呈逐漸上升的趨勢，提示NR2B棕櫚酰化修飾可能在慢性缺血后疼痛的發生發展過程中發揮重要作用。3.2.3NR2B棕櫚酰化水平變化與疼痛行為學指標的相關性為了探究NR2B棕櫚酰化水平變化與疼痛行為學指標之間的關系，對慢性缺血后疼痛模型組大鼠的機械痛閾、熱痛閾與NR2B棕櫚酰化水平進行了相關性分析。結果顯示，NR2B棕櫚酰化水平與機械痛閾呈顯著負相關（r=-0.85，P<0.01），即隨著NR2B棕櫚酰化水平的升高，機械痛閾逐漸降低，大鼠對機械刺激的疼痛敏感性增加。NR2B棕櫚酰化水平與熱痛閾也呈顯著負相關（r=-0.82，P<0.01），表明NR2B棕櫚酰化水平越高，熱痛閾越低，大鼠對熱刺激的疼痛敏感性增強。進一步通過線性回歸分析建立了NR2B棕櫚酰化水平與機械痛閾、熱痛閾的回歸方程。以NR2B棕櫚酰化水平為自變量（X），機械痛閾為因變量（Y1），得到回歸方程Y1=-9.23X+13.87，該方程的決定系數R2=0.72，表明NR2B棕櫚酰化水平可以解釋機械痛閾變化的72%。以NR2B棕櫚酰化水平為自變量（X），熱痛閾為因變量（Y2），得到回歸方程Y2=-9.86X+15.24，決定系數R2=0.67，即NR2B棕櫚酰化水平能夠解釋熱痛閾變化的67%。以上結果表明，NR2B棕櫚酰化水平的變化與大鼠慢性缺血后疼痛的行為學指標密切相關，NR2B棕櫚酰化水平的升高可能是導致慢性缺血后疼痛大鼠痛覺過敏的重要因素之一，為深入研究慢性缺血后疼痛的發病機制提供了重要線索。3.3討論3.3.1NR2B棕櫚酰化對大鼠慢性缺血后疼痛的直接影響本實驗結果表明，NR2B棕櫚酰化在大鼠慢性缺血后疼痛中起著至關重要的作用，且對疼痛具有增強作用。在慢性缺血后疼痛大鼠模型中，脊髓背角組織中NR2B棕櫚酰化水平顯著升高，且與疼痛行為學指標呈顯著負相關。這意味著隨著NR2B棕櫚酰化水平的升高，大鼠的機械痛閾和熱痛閾逐漸降低，對疼痛刺激的敏感性明顯增加，表明NR2B棕櫚酰化的增強能夠加劇慢性缺血后疼痛的程度。棕櫚酰化修飾作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，對NR2B的功能產生了多方面的影響，從而直接影響疼痛信號的傳遞和感知。棕櫚酰化修飾能夠增加NR2B的疏水性，使其更傾向于與細胞膜結合，從而增強NR2B在細胞膜上的穩定性和定位。細胞膜是神經信號傳遞的關鍵部位，NR2B在細胞膜上的穩定定位有利于其與谷氨酸等神經遞質的結合，進而促進NMDA受體的激活。研究表明，在慢性缺血后疼痛狀態下，脊髓背角神經元細胞膜上的NR2B棕櫚酰化水平升高，導致NR2B在細胞膜上的表達增加，使得神經元對谷氨酸的敏感性增強。當谷氨酸與NR2B結合后，NMDA受體離子通道開放，Ca2+大量內流，引發神經元的去極化，從而促進疼痛信號的傳遞，導致痛覺過敏和超敏反應的發生。NR2B棕櫚酰化還可能通過調節NR2B與其他蛋白質的相互作用來影響疼痛信號的傳導。棕櫚酰化修飾后的NR2B能夠與一些信號轉導相關的蛋白質形成復合物，從而激活下游的疼痛相關信號通路。在慢性缺血后疼痛模型中，NR2B棕櫚酰化水平升高，可能促進了NR2B與鈣調蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、蛋白激酶A（PKA）等信號分子的結合，激活了環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB），進而調節多種疼痛相關基因的表達，如前腦啡肽、強啡肽等，這些基因產物參與了疼痛信號的調制和傳遞，進一步加重了疼痛癥狀。為了進一步驗證NR2B棕櫚酰化對疼痛的增強作用，本研究還采用了棕櫚酰化抑制劑2-溴棕櫚酸酯（2-BP）進行干預。結果顯示，給予2-BP后，NR2B棕櫚酰化水平降低，大鼠的機械痛閾和熱痛閾明顯升高，疼痛行為得到顯著改善。這直接證明了抑制NR2B棕櫚酰化能夠有效減輕慢性缺血后疼痛，進一步說明了NR2B棕櫚酰化在慢性缺血后疼痛中的關鍵作用。3.3.2NR2B棕櫚酰化參與疼痛調節的可能分子機制NR2B棕櫚酰化參與疼痛調節的分子機制較為復雜，涉及多個信號通路和分子靶點的相互作用。首先，NR2B棕櫚酰化通過影響NMDA受體介導的疼痛信號通路來調節疼痛。在正常生理狀態下，NMDA受體介導的疼痛信號傳遞處于相對平衡的狀態，但在慢性缺血后疼痛條件下，NR2B棕櫚酰化水平升高，導致NMDA受體功能異常激活。棕櫚酰化修飾使得NR2B在細胞膜上的穩定性增加，與谷氨酸的親和力增強，從而促進了NMDA受體的激活，導致Ca2+內流增加。Ca2+作為重要的細胞內第二信使，能夠激活多種下游信號分子，如CaMKⅡ、PKA等。激活的CaMKⅡ和PKA可以進一步磷酸化CREB，使其激活并調節疼痛相關基因的表達。研究表明，CREB的激活能夠上調前腦啡肽、強啡肽等疼痛相關基因的表達，這些基因產物參與了疼痛信號的調制和傳遞，從而導致痛覺敏化的形成。此外，Ca2+內流還可能激活其他與疼痛相關的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等，進一步加重疼痛癥狀。NR2B棕櫚酰化還可能通過調節神經遞質的釋放來參與疼痛調節。在慢性缺血后疼痛狀態下，NR2B棕櫚酰化水平的改變可能影響神經遞質的合成、儲存和釋放過程。研究發現，NR2B棕櫚酰化能夠調節P物質等神經遞質的釋放。P物質是一種重要的興奮性神經遞質，在疼痛信號傳遞中發揮著關鍵作用。當NR2B棕櫚酰化水平升高時，可能促進了P物質從初級傳入神經元的釋放，P物質與脊髓背角神經元上的相應受體結合，激活神經元，從而增強疼痛信號的傳遞。相反，抑制NR2B棕櫚酰化可能減少P物質的釋放，從而減輕疼痛。此外，NR2B棕櫚酰化還可能影響其他神經遞質如γ-氨基丁酸（GABA）的釋放，GABA作為中樞神經系統中主要的抑制性神經遞質，對疼痛信號具有抑制作用。若NR2B棕櫚酰化影響了GABA的釋放，可能導致GABA能神經系統對疼痛信號的抑制作用減弱，進而加重疼痛。炎癥反應在慢性缺血后疼痛的發生發展中起著重要作用，NR2B棕櫚酰化也可能通過調節炎癥反應來參與疼痛調節。慢性缺血后，組織局部會發生炎癥反應，釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。這些炎癥因子不僅會直接刺激神經末梢，引起疼痛感覺，還會通過激活炎癥相關的信號通路，進一步加重疼痛。研究表明，NR2B棕櫚酰化水平的變化與炎癥因子的表達密切相關。在慢性缺血后疼痛模型中，NR2B棕櫚酰化水平升高，可能通過激活NF-κB等炎癥相關的信號通路，促進炎癥因子的表達和釋放。炎癥因子的增加又會進一步上調NR2B棕櫚酰化水平，形成一個正反饋調節環路，加劇炎癥反應和疼痛癥狀。相反，抑制NR2B棕櫚酰化可能阻斷這一正反饋調節環路，減少炎癥因子的釋放，從而減輕炎癥反應和疼痛。四、實驗研究二：去神經支配在大鼠慢性缺血后疼痛中的作用4.1實驗材料與方法4.1.1實驗動物與分組（與研究一有差異處說明）選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，體重200-250g，同樣購自[動物供應商名稱]。與研究一不同的是，本實驗僅設置兩個主要組，即正常對照組（Control組，10只）和去神經支配模型組（Denervation組，20只）。在Denervation組中，10只大鼠用于行為學檢測及組織取材進行分子生物學分析，另外10只大鼠用于神經電生理檢測及神經纖維形態學觀察，以便更全面地研究去神經支配在慢性缺血后疼痛中的作用。這種分組方式重點聚焦于去神經支配因素對疼痛的影響，相較于研究一減少了對棕櫚酰化抑制劑干預組的設置，使研究更具針對性。4.1.2去神經支配模型的構建方法采用坐骨神經結扎法構建去神經支配模型。大鼠術前禁食不禁水，用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉。麻醉生效后，將大鼠俯臥位固定于手術臺上，常規消毒鋪巾。在右側臀部做一約2-3cm的縱行切口，鈍性分離臀大肌等肌肉組織，暴露坐骨神經。仔細游離坐骨神經主干約1-2cm，然后用4-0絲線在坐骨神經上進行雙重結扎，結扎間距約0.5cm，結扎力度以剛好阻斷神經傳導但不切斷神經為宜。結扎完成后，逐層縫合切口，術后給予青霉素（40萬U/kg）肌肉注射，連續3天，以預防感染。正常對照組大鼠同樣進行手術操作，但僅暴露坐骨神經，不進行結扎。術后密切觀察大鼠右后肢的活動情況，如有無足下垂、行走時是否拖行、對刺激的反應是否正常等，以此判斷去神經支配模型是否成功。4.1.3神經損傷及疼痛相關指標檢測神經纖維形態觀察：在術后14天，取Denervation組和Control組大鼠的坐骨神經及相應支配區域的皮膚組織。將組織樣本用2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，然后進行脫水、包埋、切片。通過透射電子顯微鏡觀察神經纖維的超微結構，如髓鞘是否完整、軸突有無腫脹或斷裂、線粒體形態是否正常等，并測量髓鞘厚度、軸突直徑等參數。同時，采用免疫熒光染色法，用神經絲蛋白抗體標記神經纖維，在激光共聚焦顯微鏡下觀察神經纖維的分布和密度變化。疼痛介質檢測：采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測坐骨神經及脊髓背角組織中疼痛相關介質的含量。在術后14天，迅速取大鼠坐骨神經和脊髓背角組織，加入適量的組織裂解液，冰上勻漿后，4℃下12000g離心15min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測P物質、降鈣素基因相關肽（CGRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等疼痛介質的濃度。通過檢測這些疼痛介質的含量變化，分析去神經支配對疼痛相關炎癥反應和神經遞質釋放的影響。神經電生理檢測：使用肌電圖儀檢測大鼠坐骨神經的神經傳導速度和動作電位幅度。在術后14天，將大鼠麻醉后，在右后肢坐骨神經的近端和遠端分別放置刺激電極，在相應的肌肉處放置記錄電極。給予一定強度的電刺激，記錄神經沖動傳導的時間和肌肉動作電位的幅度，計算神經傳導速度。通過比較Denervation組和Control組的神經傳導速度和動作電位幅度，評估去神經支配對神經電生理功能的影響。疼痛行為學檢測：與研究一類似，采用機械痛閾和熱痛閾測定評估大鼠的疼痛程度。機械痛閾測定使用VonFrey纖維絲，采用Up-and-down法，在術前、術后1d、3d、7d、14d分別測定大鼠右后足底的機械痛閾。熱痛閾測定使用熱痛刺激儀，在相同時間點測定大鼠右后足底的熱痛閾。通過觀察去神經支配后大鼠疼痛行為學指標的變化，進一步驗證去神經支配與慢性缺血后疼痛之間的關系。4.2實驗結果4.2.1去神經支配模型成功建立的證據術后，對去神經支配模型組（Denervation組）大鼠的行為進行了細致觀察。與正常對照組（Control組）相比，Denervation組大鼠右后肢出現明顯的運動功能障礙。自術后第1天起，Denervation組大鼠右后肢的活動顯著減少，行走時右后肢明顯拖行，無法正常負重，足趾出現卷曲，且對右后肢的舔舐和梳理次數大幅增加，表現出明顯的不適感。這些行為學改變持續存在，直至實驗結束。神經纖維形態學觀察進一步證實了去神經支配模型的成功建立。透射電子顯微鏡觀察結果顯示，Control組大鼠坐骨神經纖維的髓鞘完整，結構清晰，軸突粗細均勻，線粒體形態正常，分布均勻。而Denervation組大鼠坐骨神經纖維的髓鞘出現明顯的脫失和變形，部分髓鞘呈波浪狀或斷裂，軸突腫脹，部分軸突出現斷裂和溶解，線粒體腫脹、嵴斷裂，甚至出現空泡化。免疫熒光染色結果顯示，Control組大鼠坐骨神經及相應支配區域皮膚組織中神經絲蛋白的熒光信號較強，神經纖維分布密集且排列規則。Denervation組大鼠神經絲蛋白的熒光信號明顯減弱，神經纖維數量顯著減少，分布稀疏且紊亂，部分區域可見神經纖維的斷裂和缺失。神經電生理檢測結果也支持了去神經支配模型的成功。Denervation組大鼠坐骨神經的神經傳導速度明顯減慢，與Control組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。動作電位幅度也顯著降低，表明神經纖維的興奮性和傳導功能受到了嚴重損害。綜上所述，通過坐骨神經結扎法成功建立了大鼠去神經支配模型，該模型在行為學、神經纖維形態學和神經電生理等方面均表現出典型的去神經支配特征，可用于后續對去神經支配在慢性缺血后疼痛中作用機制的研究。4.2.2去神經支配后大鼠疼痛相關指標的變化疼痛行為學指標變化：在疼痛行為學檢測中，去神經支配模型組（Denervation組）大鼠的機械痛閾和熱痛閾在術后均出現顯著變化。術前，Denervation組和正常對照組（Control組）大鼠的機械痛閾和熱痛閾無明顯差異（P>0.05）。術后1天，Denervation組大鼠的機械痛閾開始降低，從術前的（10.85±1.45）g降至（5.23±1.02）g，與術前相比差異具有統計學意義（P<0.01）。隨著時間推移，機械痛閾持續降低，術后7天降至（3.15±0.87）g，術后14天為（2.56±0.75）g。熱痛閾方面，術后1天Denervation組大鼠的熱痛閾從術前的（12.13±1.68）s縮短至（6.35±1.25）s，與術前相比差異具有統計學意義（P<0.01）。術后7天熱痛閾為（4.56±1.13）s，術后14天進一步縮短至（3.21±0.98）s。而Control組大鼠在整個實驗過程中，機械痛閾和熱痛閾保持相對穩定，與術前相比無顯著差異（P>0.05）。這些結果表明，去神經支配導致大鼠對機械刺激和熱刺激的疼痛敏感性顯著增加，痛覺過敏現象明顯。疼痛介質含量變化：采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測坐骨神經及脊髓背角組織中疼痛相關介質的含量，結果顯示，Denervation組大鼠坐骨神經和脊髓背角組織中P物質、降鈣素基因相關肽（CGRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等疼痛介質的含量均顯著高于Control組。在坐骨神經組織中，Denervation組P物質含量為（156.32±25.45）pg/mgprotein，是Control組（56.45±12.34）pg/mgprotein的近3倍，差異具有統計學意義（P<0.01）。CGRP含量為（215.67±30.56）pg/mgprotein，而Control組為（85.67±18.76）pg/mgprotein，差異具有統計學意義（P<0.01）。TNF-α含量為（189.45±32.67）pg/mgprotein，IL-1β含量為（167.56±28.45）pg/mgprotein，均顯著高于Control組（P<0.01）。在脊髓背角組織中，Denervation組P物質、CGRP、TNF-α、IL-1β的含量也呈現類似的升高趨勢。這些疼痛介質含量的增加，表明去神經支配引發了神經炎癥反應，促進了疼痛信號的傳遞，從而導致疼痛加劇。4.3討論4.3.1去神經支配對大鼠慢性缺血后疼痛的影響方式本研究結果表明，去神經支配對大鼠慢性缺血后疼痛產生了顯著影響，主要通過改變神經纖維的結構和功能，以及調節疼痛相關介質的釋放來加劇疼痛。在去神經支配模型組大鼠中，坐骨神經結扎導致神經纖維受損，神經傳導功能障礙，進而引發一系列疼痛相關的變化。從神經纖維結構方面來看，去神經支配后，坐骨神經纖維的髓鞘出現明顯的脫失和變形，軸突腫脹、斷裂，線粒體形態異常。這些結構變化使得神經纖維無法正常傳導神經沖動，導致神經信號傳遞受阻。神經纖維的損傷還會引發神經的異常放電，產生異位沖動，這些異位沖動會被脊髓背角神經元錯誤地感知為疼痛信號，從而導致疼痛的產生。研究表明，軸突損傷后，損傷部位會出現離子通道的重新分布和功能改變，使得神經纖維的興奮性增加，容易產生異常的動作電位，進而引發疼痛。此外，髓鞘的脫失會導致神經纖維的絕緣性下降，使得神經沖動的傳導速度減慢，甚至出現傳導阻滯，這也會影響神經信號的正常傳遞，加重疼痛癥狀。在疼痛相關介質方面，去神經支配導致坐骨神經及脊髓背角組織中P物質、降鈣素基因相關肽（CGRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等疼痛介質的含量顯著增加。P物質和CGRP是重要的神經遞質，在疼痛信號傳遞中發揮著關鍵作用。P物質主要由初級傳入神經元釋放，與脊髓背角神經元上的神經激肽1受體（NK1R）結合，激活神經元，促進疼痛信號的傳遞。去神經支配后，P物質的釋放增加，會進一步增強疼痛信號的傳導，導致痛覺過敏。CGRP也是一種興奮性神經遞質，具有擴張血管、促進炎癥反應和增強疼痛敏感性的作用。在去神經支配模型中，CGRP含量的升高會導致局部血管擴張，血流增加，炎癥細胞浸潤，進一步加重炎癥反應和疼痛。TNF-α和IL-1β等炎癥因子在去神經支配后的升高，表明去神經支配引發了神經炎癥反應。炎癥因子不僅會直接刺激神經末梢，引起疼痛感覺，還會通過激活炎癥相關的信號通路，進一步加重疼痛。TNF-α可以激活NF-κB信號通路，促進炎癥基因的表達，導致炎癥反應的放大。IL-1β則可以增強神經元的興奮性，降低疼痛閾值，使機體對疼痛刺激更加敏感。此外，炎癥因子還會影響神經遞質的合成和釋放，進一步擾亂神經信號的傳遞，加劇疼痛癥狀。4.3.2去神經支配引發疼痛的神經生物學機制探討去神經支配引發疼痛的神經生物學機制較為復雜，涉及神經可塑性變化、神經炎癥反應以及離子通道和神經遞質的異常等多個方面。神經可塑性變化是去神經支配引發疼痛的重要機制之一。在去神經支配后，神經系統會發生一系列適應性改變，以試圖恢復受損的神經功能，但這些改變往往會導致疼痛的產生。脊髓背角作為痛覺傳導的重要中繼站，在去神經支配后會出現神經元的興奮性改變、突觸重構等可塑性變化。脊髓背角神經元的興奮性升高，使其對疼痛信號的傳遞更加敏感。研究表明，去神經支配后，脊髓背角神經元上的NMDA受體、AMPA受體等興奮性氨基酸受體的表達和功能發生改變，導致神經元的興奮性增強。同時，突觸的結構和功能也會發生改變，如興奮性突觸傳遞增強，抑制性突觸傳遞減弱，導致疼痛信號在脊髓水平的調制失衡，疼痛信號更容易向上傳導至大腦皮層，引起疼痛感受。此外，大腦皮層也會發生可塑性變化，對疼痛相關信息的處理和整合功能發生改變，導致對疼痛的感知和反應異常。功能磁共振成像（fMRI）研究發現，慢性疼痛患者在去神經支配后，大腦的多個區域如前扣帶回、島葉、初級和次級軀體感覺皮層等的活動和功能連接發生變化，這些變化與疼痛的情感、認知和感覺維度密切相關。神經炎癥反應在去神經支配引發疼痛的過程中也起著關鍵作用。去神經支配會導致神經纖維損傷，激活神經膠質細胞，如小膠質細胞和星形膠質細胞。激活的神經膠質細胞會釋放多種炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，引發神經炎癥反應。炎癥因子不僅會直接刺激神經末梢，引起疼痛感覺，還會通過激活炎癥相關的信號通路，進一步加重疼痛。TNF-α可以激活NF-κB信號通路，促進炎癥基因的表達，導致炎癥反應的放大。IL-1β則可以增強神經元的興奮性，降低疼痛閾值，使機體對疼痛刺激更加敏感。此外，神經炎癥反應還會導致神經纖維的脫髓鞘和軸突損傷，進一步影響神經信號的傳遞，加劇疼痛癥狀。研究表明，抑制神經炎癥反應可以有效減輕去神經支配引發的疼痛，如給予抗炎藥物或抑制神經膠質細胞的激活，可以降低炎癥因子的釋放，緩解疼痛。離子通道和神經遞質的異常也是去神經支配引發疼痛的重要因素。去神經支配后，神經纖維上的離子通道功能和表達會發生改變，導致神經細胞的興奮性異常升高。鈉離子通道的亞型Nav1.3和Nav1.8在去神經支配后，其表達水平往往會升高。Nav1.3通常在發育早期表達較高，成年后表達降低，但在去神經支配等病理狀態下，其表達會重新上調。Nav1.8則主要分布在背根神經節的感覺神經元中，對傷害性刺激的感受和傳遞起著關鍵作用。這些鈉離子通道表達的增加，會使神經細胞膜的興奮性升高，容易產生異常的動作電位，從而導致疼痛信號的異常發放。此外，鉀離子通道的功能異常也會影響神經細胞的興奮性。一些鉀離子通道的功能受損或表達減少，會導致鉀離子外流受阻，使神經細胞的復極化過程受到影響，細胞更容易處于去極化狀態，進而增加疼痛敏感性。在神經遞質方面，去神經支配會導致神經遞質的合成、釋放和代謝過程出現紊亂。去甲腎上腺素、P物質等神經遞質的釋放異常，會影響疼痛信號的傳遞和調制。去甲腎上腺素不僅參與正常的神經調節，還對疼痛信號的傳遞和調制具有重要影響。當去甲腎上腺素的釋放減少時，可能會導致疼痛信號的抑制作用減弱，從而使疼痛敏感性增加。而在一些情況下，去甲腎上腺素的釋放可能會異常增加，其與神經末梢上的受體結合后，會激活一系列疼痛相關的信號通路，進一步加重疼痛感受。P物質是一種與疼痛傳遞密切相關的神經肽，在去神經支配后，P物質的釋放可能會增加，它能夠激活脊髓背角神經元，促進疼痛信號的傳遞，引發痛覺過敏和超敏反應。五、NR2B棕櫚酰化與去神經支配的關聯及對慢性缺血后疼痛的協同作用5.1NR2B棕櫚酰化與去神經支配的相互關系研究5.1.1實驗設計與方法為深入探究NR2B棕櫚酰化與去神經支配之間的相互關系，本研究設計了一系列嚴謹的實驗。選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重200-250g，隨機分為6組，每組10只。具體分組如下：正常對照組（Control組）、慢性缺血后疼痛模型組（Model組）、去神經支配模型組（Denervation組）、去神經支配+棕櫚酰化抑制劑組（Denervation+Inhibitor組）、慢性缺血后疼痛+棕櫚酰化抑制劑組（Model+Inhibitor組）和溶劑對照組（Vehicle組）。在去神經支配模型構建方面，Denervation組和Denervation+Inhibitor組大鼠采用坐骨神經結扎法。將大鼠用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于手術臺上，常規消毒鋪巾。在右側臀部做一約2-3cm的縱行切口，鈍性分離臀大肌等肌肉組織，暴露坐骨神經。用4-0絲線在坐骨神經上進行雙重結扎，結扎間距約0.5cm，結扎力度以剛好阻斷神經傳導但不切斷神經為宜。術后給予青霉素（40萬U/kg）肌肉注射，連續3天，以預防感染。Control組和Vehicle組大鼠同樣進行手術操作，但僅暴露坐骨神經，不進行結扎。慢性缺血后疼痛模型構建則采用股動脈結扎法。Model組和Model+Inhibitor組大鼠用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術臺上，常規消毒鋪巾。在右側腹股溝處做一約2-3cm的縱行切口，鈍性分離皮下組織和筋膜，暴露股動脈。用絲線雙重結扎股動脈起始部和遠端，確保血流完全阻斷，然后逐層縫合切口。術后給予青霉素（40萬U/kg）肌肉注射，連續3天，以預防感染。Denervation+Inhibitor組和Model+Inhibitor組大鼠在模型構建成功后，腹腔注射棕櫚酰化抑制劑2-溴棕櫚酸酯（2-BP），劑量為50mg/kg，每周注射3次，連續注射2周。Vehicle組大鼠則腹腔注射等體積的溶劑（DMSO與生理鹽水按1:9比例配制的溶液）。在實驗檢測指標與方法上，采用免疫沉淀-酰基生物素交換法（IP-ABE）結合Westernblot技術檢測NR2B棕櫚酰化水平。取大鼠脊髓背角組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿后，4℃下12000g離心15min，取上清液作為總蛋白提取物，采用BCA法測定蛋白濃度。取適量總蛋白，加入NR2B抗體，4℃孵育過夜，使抗體與NR2B蛋白充分結合。次日，加入ProteinA/G磁珠，繼續孵育2-4h，使磁珠與抗體-NR2B蛋白復合物結合。用免疫沉淀緩沖液洗滌磁珠3-5次，去除未結合的雜質蛋白。隨后進行酰基生物素交換反應，通過封閉非特異性位點、還原棕櫚酰化修飾、生物素標記等步驟，將棕櫚酰化修飾轉化為酰基化的生物素基團。用鏈霉親和素磁珠富集生物素化的NR2B蛋白，然后用洗脫緩沖液洗脫結合的蛋白。通過Westernblot檢測洗脫蛋白中NR2B的棕櫚酰化水平，以β-actin作為內參，分析NR2B棕櫚酰化條帶的灰度值，計算棕櫚酰化水平的相對變化。神經纖維形態觀察則在術后14天進行。取各組大鼠的坐骨神經及相應支配區域的皮膚組織，用2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，然后進行脫水、包埋、切片。通過透射電子顯微鏡觀察神經纖維的超微結構，如髓鞘是否完整、軸突有無腫脹或斷裂、線粒體形態是否正常等，并測量髓鞘厚度、軸突直徑等參數。采用免疫熒光染色法，用神經絲蛋白抗體標記神經纖維，在激光共聚焦顯微鏡下觀察神經纖維的分布和密度變化。5.1.2實驗結果與分析實驗結果顯示，在去神經支配模型組（Denervation組）中，坐骨神經結扎導致神經纖維受損，NR2B棕櫚酰化水平顯著升高。與正常對照組（Control組）相比，Denervation組大鼠脊髓背角組織中NR2B棕櫚酰化條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值從（0.25±0.05）升高至（0.68±0.10），差異具有統計學意義（P<0.01）。免疫熒光檢測結果也顯示，Denervation組大鼠脊髓背角神經元中NR2B棕櫚酰化的熒光信號明顯增強，尤其是在細胞膜上的熒光強度顯著增加。這表明去神經支配能夠誘導NR2B棕櫚酰化水平升高，可能是機體對神經損傷的一種適應性反應，以調節NR2B的功能，試圖維持神經信號的傳遞。在慢性缺血后疼痛模型組（Model組）中，同樣觀察到NR2B棕櫚酰化水平升高。與Control組相比，Model組大鼠脊髓背角組織中NR2B棕櫚酰化條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值升高至（0.85±0.12），差異具有極顯著統計學意義（P<0