NOD2與NF-κB在結(jié)核分枝桿菌感染中的交互作用及機(jī)制解析一、引言1.1研究背景結(jié)核病作為一種古老且嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，至今仍然對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅。世界衛(wèi)生組織2024年發(fā)布的《全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，2023年全球新增結(jié)核病確診病例達(dá)850萬(wàn)例，創(chuàng)下自1995年啟動(dòng)全球結(jié)核病監(jiān)測(cè)以來(lái)的新高，結(jié)核病再度成為全球頭號(hào)傳染病，全球每天仍有近3萬(wàn)人發(fā)病、3500人死亡。在中國(guó)，盡管結(jié)核病疫情呈穩(wěn)步下降趨勢(shì)，發(fā)病率下降速度是全球平均水平的2倍，成功治療率保持在90%以上，死亡率維持在較低水平，但由于人口基數(shù)龐大，結(jié)核病患者的絕對(duì)數(shù)量仍然不容忽視。結(jié)核分枝桿菌是引發(fā)結(jié)核病的病原菌，其感染人體的過(guò)程復(fù)雜且精妙。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌通過(guò)呼吸道進(jìn)入人體后，首先會(huì)遭遇肺泡巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的抵抗。巨噬細(xì)胞可通過(guò)吞噬作用攝取結(jié)核分枝桿菌，但結(jié)核分枝桿菌進(jìn)化出了一系列逃逸機(jī)制，能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活甚至繁殖，如抑制吞噬體與溶酶體的融合，避免被溶酶體中的水解酶降解；利用自身分泌的蛋白干擾人體的免疫信號(hào)通路等。此外，結(jié)核分枝桿菌還能通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制因子，削弱機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，一旦機(jī)體免疫力下降，就可能引發(fā)活動(dòng)性結(jié)核病。在宿主應(yīng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)中，天然免疫發(fā)揮著至關(guān)重要的第一道防線作用。天然免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），進(jìn)而啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2（NOD2）作為一種重要的胞內(nèi)PRR，在識(shí)別結(jié)核分枝桿菌感染中扮演著關(guān)鍵角色。NOD2能夠識(shí)別結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的成分——胞壁酰二肽（MDP），激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子對(duì)于招募免疫細(xì)胞、增強(qiáng)免疫反應(yīng)具有重要意義。同時(shí)，NOD2還可參與自噬調(diào)節(jié)，通過(guò)自噬清除胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。核因子-κB（NF-κB）是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，NOD2激活后可通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終激活NF-κB。NF-κB入核后，結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控炎性細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等多種免疫相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步放大免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抵抗能力。然而，過(guò)度激活的NF-κB信號(hào)通路也可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，引發(fā)組織損傷和免疫病理?yè)p害。NOD2與NF-κB在結(jié)核分枝桿菌感染免疫中的作用機(jī)制尚未完全明確，深入研究它們之間的相互關(guān)系以及在感染過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，不僅有助于揭示結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，還可能為結(jié)核病的診斷、治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)和策略。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探討NOD2與NF-κB在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中的作用機(jī)制及其相互關(guān)系，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，揭示它們?cè)诟腥静煌A段的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為闡明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。具體而言，本研究將通過(guò)干擾NOD2基因表達(dá)，觀察其對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的影響，包括細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存活數(shù)量、炎癥因子分泌水平以及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化等；同時(shí)，研究NF-κB信號(hào)通路在NOD2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的調(diào)控作用，以及兩者協(xié)同作用對(duì)機(jī)體免疫防御和病理?yè)p傷的影響。結(jié)核病作為全球重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，盡管現(xiàn)有的抗結(jié)核治療方案在一定程度上控制了疫情，但耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)、結(jié)核病與其他疾病（如艾滋病、糖尿病等）的共感染，使得結(jié)核病的防治面臨新的挑戰(zhàn)。深入了解結(jié)核分枝桿菌感染的免疫機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型診斷方法、治療策略和預(yù)防措施具有至關(guān)重要的意義。NOD2與NF-κB作為天然免疫信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，在結(jié)核分枝桿菌感染免疫中發(fā)揮著核心作用。研究它們的作用機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)靶向NOD2或NF-κB信號(hào)通路的藥物，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御能力，減少炎癥損傷，提高結(jié)核病的治療效果；也可能為結(jié)核病的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)NOD2和NF-κB相關(guān)分子的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病的早期預(yù)警和精準(zhǔn)診斷，從而推動(dòng)結(jié)核病防治工作取得新的突破。二、NOD2與NF-κB的生物學(xué)特性2.1NOD2的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1NOD2的分子結(jié)構(gòu)NOD2，全稱核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2，屬于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（NLR）家族中的重要成員。其基因定位于人類染色體16q12.1，編碼的蛋白質(zhì)由1040個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為115kDa。NOD2的分子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出模塊化的特點(diǎn)，主要由以下幾個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域組成：N端的半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）：該結(jié)構(gòu)域由約90個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，含有兩個(gè)串聯(lián)排列的CARD基序。CARD結(jié)構(gòu)域在NOD2信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它能夠通過(guò)與下游接頭蛋白R(shí)IP2（受體相互作用蛋白2）的CARD結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異性同源相互作用，從而招募RIP2，啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。RIP2被招募后，會(huì)發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而激活下游的信號(hào)分子，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）等，引發(fā)一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。中央的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）：此結(jié)構(gòu)域包含多個(gè)保守的基序，如P-loop（磷酸結(jié)合環(huán)）、WalkerB基序和亮氨酸拉鏈（LZ）結(jié)構(gòu)等。NOD結(jié)構(gòu)域具有ATP酶活性，能夠結(jié)合和水解ATP。在靜息狀態(tài)下，NOD2處于一種自我抑制的構(gòu)象，NOD結(jié)構(gòu)域與CARD結(jié)構(gòu)域以及C端的富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）結(jié)構(gòu)域相互作用，維持NOD2的非活性狀態(tài)。當(dāng)NOD2識(shí)別到配體后，NOD結(jié)構(gòu)域結(jié)合ATP并發(fā)生構(gòu)象變化，解除自我抑制狀態(tài)，暴露出CARD結(jié)構(gòu)域，使其能夠與RIP2結(jié)合，啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)。C端的富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）：LRR結(jié)構(gòu)域由約20個(gè)串聯(lián)的LRR基序組成，每個(gè)基序包含20-29個(gè)氨基酸殘基。LRR結(jié)構(gòu)域具有高度的多態(tài)性，其主要功能是識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）。對(duì)于NOD2而言，LRR結(jié)構(gòu)域能夠特異性識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁的成分——胞壁酰二肽（MDP），MDP是所有細(xì)菌肽聚糖的最小生物活性單位。當(dāng)LRR結(jié)構(gòu)域識(shí)別到MDP后，會(huì)誘導(dǎo)NOD2發(fā)生構(gòu)象改變，從而激活NOD2的信號(hào)傳導(dǎo)功能。此外，LRR結(jié)構(gòu)域還參與調(diào)節(jié)NOD2的活性，通過(guò)與NOD結(jié)構(gòu)域的相互作用，維持NOD2在靜息狀態(tài)下的穩(wěn)定性和非活性狀態(tài)。2.1.2NOD2在免疫反應(yīng)中的功能概述NOD2作為一種重要的模式識(shí)別受體（PRR），在機(jī)體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵功能，是連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁，對(duì)于維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)和抵御病原體感染具有不可或缺的作用。免疫識(shí)別功能：NOD2能夠精準(zhǔn)識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中的PAMPs，特別是MDP。MDP作為一種保守的細(xì)菌成分，廣泛存在于革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中。NOD2通過(guò)其LRR結(jié)構(gòu)域與MDP特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌感染的識(shí)別。這種識(shí)別能力使得機(jī)體能夠及時(shí)感知到細(xì)菌的入侵，為后續(xù)啟動(dòng)免疫應(yīng)答提供了關(guān)鍵的信號(hào)觸發(fā)。例如，在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中，NOD2可以識(shí)別結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中的MDP，從而激活下游免疫信號(hào)通路，引發(fā)機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御反應(yīng)。激活免疫細(xì)胞：一旦NOD2識(shí)別到MDP并被激活，它會(huì)通過(guò)CARD-CARD相互作用招募RIP2，進(jìn)而激活下游的NF-κB和MAPK信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，被激活后會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控一系列炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等免疫相關(guān)基因的表達(dá)。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠吸引和激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，使其聚集到感染部位，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。比如，NF-κB可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，IL-6能夠促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性；IL-8是一種趨化因子，能夠吸引中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞向感染部位遷移；TNF-α則具有直接殺傷病原體和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能的作用。誘導(dǎo)免疫反應(yīng)：NOD2激活后誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子不僅能夠激活免疫細(xì)胞，還能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和類型。一方面，這些細(xì)胞因子可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌能力，促進(jìn)其對(duì)病原體的清除；另一方面，它們可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化方向，促使初始T細(xì)胞向Th1、Th17等不同亞型分化，從而引發(fā)不同類型的免疫反應(yīng)。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體的抵抗能力；Th17細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17）等細(xì)胞因子，參與固有免疫和炎癥反應(yīng)，在防御細(xì)胞外病原體感染和維持黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。此外，NOD2還可以通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能，影響其對(duì)T細(xì)胞的激活和抗原呈遞，進(jìn)一步調(diào)控適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和發(fā)展。調(diào)節(jié)自噬：自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的自我降解過(guò)程，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、清除病原體和受損細(xì)胞器等具有重要意義。NOD2在調(diào)節(jié)自噬方面發(fā)揮著重要作用，它可以通過(guò)與自噬相關(guān)蛋白相互作用，誘導(dǎo)自噬體的形成。在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，NOD2激活后可以招募自噬相關(guān)蛋白LC3等，促使自噬體包裹胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，然后與溶酶體融合，將結(jié)核分枝桿菌降解，從而限制結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的存活和繁殖，減少病原體對(duì)細(xì)胞的損害。2.2NF-κB的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1NF-κB的分子結(jié)構(gòu)核因子-κB（NF-κB）是一個(gè)蛋白質(zhì)家族，在哺乳動(dòng)物中主要包括RelA（p65）、RelB、c-Rel、p50和p52這5種成員。這些成員的N端都含有一個(gè)高度保守的Rel同源區(qū)（RHR），RHR由N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（CTD）連接而成。在CTD上存在一個(gè)核定位序列（NLS），其主要負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合、二聚體化以及核易位等關(guān)鍵過(guò)程。其中，RelA（p65）、c-Rel和RelB的C端還擁有反式激活結(jié)構(gòu)域（TD），這個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诩せ钅繕?biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起著至關(guān)重要的作用。p50和p52這兩個(gè)亞基比較特殊，它們僅含有RHR結(jié)構(gòu)域，而缺乏TD結(jié)構(gòu)域。這就導(dǎo)致p50和p52形成的同源二聚體無(wú)法直接激活基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞內(nèi)通常扮演抑制分子的角色。在細(xì)胞中，p50和p52一般分別以其前體p105和p100的形式存在，p105和p100在經(jīng)過(guò)一系列蛋白酶的加工處理后，才會(huì)生成具有功能的p50和p52。在眾多的NF-κB二聚體形式中，由RelA（p65）與p50組成的異源二聚體是最為常見(jiàn)的。當(dāng)NF-κB處于非激活狀態(tài)時(shí)，它與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合物，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。IκB家族成員包括IκBα、IκBβ、IκBε、p100、p105、IκBζ、Bcl-3和IκBNS等。IκB通過(guò)其C末端特定的錨蛋白重復(fù)序列（ARD）與NF-κB緊密結(jié)合，并且覆蓋住NF-κB的NLS，從而阻止NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，使其無(wú)法發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，IKK會(huì)將IκB亞基調(diào)節(jié)位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化，使得IκB被泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解。此時(shí)，NF-κB二聚體得以釋放，暴露其NLS，隨后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。2.2.2NF-κB在免疫調(diào)節(jié)中的核心作用NF-κB在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中處于核心地位，發(fā)揮著多方面不可或缺的關(guān)鍵作用，對(duì)維持機(jī)體的免疫平衡和抵御病原體入侵起著至關(guān)重要的作用。調(diào)控炎癥因子表達(dá)：當(dāng)機(jī)體受到病原體感染或其他外界刺激時(shí)，NF-κB信號(hào)通路被迅速激活。激活后的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與一系列炎癥相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。例如，NF-κB可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-1β能夠激活T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性；IL-6不僅可以促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖與分化，還能參與急性期反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度；IL-8作為一種趨化因子，能夠吸引中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，增強(qiáng)局部免疫防御能力；TNF-α則具有直接殺傷病原體、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能等多種作用。通過(guò)調(diào)控這些炎癥因子的表達(dá)，NF-κB能夠快速啟動(dòng)和放大炎癥反應(yīng)，抵御病原體的入侵。參與免疫相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控：除了炎癥因子，NF-κB還參與調(diào)控眾多其他免疫相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因涉及免疫細(xì)胞的活化、增殖、分化以及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)等多個(gè)方面。例如，NF-κB可以調(diào)節(jié)趨化因子的表達(dá)，趨化因子能夠引導(dǎo)免疫細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和定位，使免疫細(xì)胞能夠準(zhǔn)確地到達(dá)感染或炎癥部位，參與免疫防御。此外，NF-κB還能調(diào)控黏附分子的表達(dá)，黏附分子對(duì)于免疫細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附以及免疫細(xì)胞在組織中的浸潤(rùn)具有重要作用，有助于免疫細(xì)胞在炎癥部位的聚集和發(fā)揮功能。NF-κB還參與調(diào)節(jié)免疫球蛋白基因的表達(dá)，影響B(tài)細(xì)胞的分化和抗體的產(chǎn)生，在體液免疫中發(fā)揮重要作用。免疫細(xì)胞發(fā)育與分化的調(diào)節(jié)：NF-κB在免疫細(xì)胞的發(fā)育和分化過(guò)程中也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在T細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，NF-κB參與調(diào)控T細(xì)胞從胸腺祖細(xì)胞到成熟T細(xì)胞的各個(gè)階段的分化。例如，NF-κB信號(hào)通路的激活對(duì)于T細(xì)胞受體（TCR）介導(dǎo)的T細(xì)胞活化和增殖是必需的，它能夠促進(jìn)T細(xì)胞向不同亞型（如Th1、Th2、Th17和Treg等）分化。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體的抵抗能力；Th2細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）等細(xì)胞因子，參與體液免疫，在抵御寄生蟲(chóng)感染和過(guò)敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；Th17細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17）等細(xì)胞因子，參與固有免疫和炎癥反應(yīng)，在防御細(xì)胞外病原體感染和維持黏膜免疫中發(fā)揮重要作用；Treg細(xì)胞則具有免疫抑制功能，能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，防止過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。在B細(xì)胞的發(fā)育和分化過(guò)程中，NF-κB同樣發(fā)揮著重要作用，它參與調(diào)控B細(xì)胞的活化、增殖以及抗體類別轉(zhuǎn)換等過(guò)程，影響體液免疫應(yīng)答的質(zhì)量和效果。三、NOD2在結(jié)核分枝桿菌感染中的作用機(jī)制3.1NOD2對(duì)結(jié)核分枝桿菌的識(shí)別機(jī)制3.1.1NOD2識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的模式NOD2作為一種重要的模式識(shí)別受體（PRR），在識(shí)別結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其識(shí)別結(jié)核分枝桿菌主要依賴于對(duì)病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）的識(shí)別，特別是對(duì)結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁成分胞壁酰二肽（MDP）的特異性識(shí)別。MDP是所有細(xì)菌肽聚糖的最小生物活性單位，廣泛存在于革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中，結(jié)核分枝桿菌也不例外。NOD2通過(guò)其C端富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）結(jié)構(gòu)域與MDP特異性結(jié)合。LRR結(jié)構(gòu)域具有高度的多態(tài)性，其氨基酸序列的差異決定了對(duì)不同PAMPs的識(shí)別特異性。對(duì)于NOD2而言，其LRR結(jié)構(gòu)域能夠精準(zhǔn)識(shí)別MDP的特定結(jié)構(gòu)特征，這種識(shí)別是基于分子間的相互作用，包括氫鍵、范德華力等非共價(jià)鍵的作用。一旦NOD2的LRR結(jié)構(gòu)域與MDP結(jié)合，就會(huì)誘導(dǎo)NOD2發(fā)生構(gòu)象改變，從而激活NOD2的信號(hào)傳導(dǎo)功能，啟動(dòng)后續(xù)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究表明，NOD2對(duì)MDP的識(shí)別具有高度的敏感性和特異性。即使在極低濃度的MDP存在下，NOD2也能夠有效識(shí)別并激活下游信號(hào)通路。這種高度的識(shí)別能力使得機(jī)體能夠及時(shí)感知到結(jié)核分枝桿菌的入侵，為早期免疫防御提供了重要保障。NOD2對(duì)MDP的識(shí)別還具有一定的冗余性，即除了NOD2外，其他一些模式識(shí)別受體可能也參與了對(duì)MDP的識(shí)別，但NOD2在其中發(fā)揮著不可或缺的核心作用。3.1.2識(shí)別后的信號(hào)傳導(dǎo)初始步驟當(dāng)NOD2的LRR結(jié)構(gòu)域識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的MDP后，會(huì)引發(fā)一系列信號(hào)傳導(dǎo)的初始步驟，這些步驟是啟動(dòng)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。識(shí)別MDP后，NOD2的構(gòu)象發(fā)生改變，解除了自身的抑制狀態(tài)。在靜息狀態(tài)下，NOD2的NOD結(jié)構(gòu)域與CARD結(jié)構(gòu)域以及LRR結(jié)構(gòu)域相互作用，維持NOD2的非活性狀態(tài)。當(dāng)LRR結(jié)構(gòu)域結(jié)合MDP后，誘導(dǎo)NOD2的NOD結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，使其能夠結(jié)合ATP。NOD結(jié)構(gòu)域具有ATP酶活性，結(jié)合ATP后會(huì)發(fā)生水解，這一過(guò)程伴隨著能量的釋放，為后續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)提供動(dòng)力。ATP水解導(dǎo)致NOD2的構(gòu)象進(jìn)一步改變，暴露出CARD結(jié)構(gòu)域。暴露的CARD結(jié)構(gòu)域通過(guò)CARD-CARD相互作用招募受體相互作用蛋白2（RIP2）。RIP2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，含有CARD結(jié)構(gòu)域。NOD2的CARD結(jié)構(gòu)域與RIP2的CARD結(jié)構(gòu)域能夠特異性地相互結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這種相互作用是基于CARD結(jié)構(gòu)域之間的同源性，通過(guò)精確的分子對(duì)接實(shí)現(xiàn)。招募RIP2后，RIP2發(fā)生自身磷酸化，激活其激酶活性。RIP2的磷酸化位點(diǎn)主要位于其激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的特定氨基酸殘基上，這些位點(diǎn)的磷酸化會(huì)改變RIP2的構(gòu)象，使其能夠與下游信號(hào)分子相互作用，從而啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。RIP2激活后，會(huì)進(jìn)一步招募和激活一系列下游信號(hào)分子，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路的相關(guān)蛋白。在MAPK信號(hào)通路中，RIP2可以激活MAPK激酶激酶（MAP3K），如TAK1等。TAK1被激活后，會(huì)依次磷酸化并激活MAPK激酶（MAP2K）和MAPK，如JNK、ERK和p38等。這些被激活的MAPK會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、Elk-1等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。在NF-κB信號(hào)通路中，RIP2會(huì)激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物。IKK復(fù)合物由IKKα、IKKβ和IKKγ組成，RIP2通過(guò)與IKKγ相互作用，促使IKKα和IKKβ磷酸化IκBα。IκBα是NF-κB的抑制蛋白，磷酸化后的IκBα?xí)环核鼗揎棧M(jìn)而被蛋白酶體降解。此時(shí)，NF-κB二聚體得以釋放，暴露其核定位序列（NLS），隨后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，調(diào)控炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等免疫相關(guān)基因的表達(dá)。3.2NOD2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)3.2.1炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)當(dāng)NOD2識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的MDP并激活后，會(huì)迅速啟動(dòng)一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，NOD2通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域招募RIP2，形成NOD2-RIP2復(fù)合物。RIP2作為一種關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，被招募后會(huì)發(fā)生自身磷酸化，激活其激酶活性。激活的RIP2進(jìn)一步激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。在MAPK信號(hào)通路中，RIP2可以激活MAPK激酶激酶（MAP3K），如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β激活激酶1（TAK1）。TAK1被激活后，會(huì)依次磷酸化并激活MAPK激酶（MAP2K）和MAPK。其中，MAP2K包括MKK4和MKK7，它們可激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）；MKK3和MKK6則可激活p38MAPK。被激活的JNK和p38MAPK會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。例如，JNK可以磷酸化c-Jun，使其與激活蛋白-1（AP-1）家族的其他成員形成異源二聚體，結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。p38MAPK可以磷酸化ATF2、Elk-1等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的過(guò)程中，抑制p38MAPK的活性，可顯著降低IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)水平，說(shuō)明p38MAPK在NOD2介導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。在NF-κB信號(hào)通路中，RIP2激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物。IKK復(fù)合物由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基IKKγ（也稱為NEMO）組成。RIP2與IKKγ相互作用，促使IKKα和IKKβ磷酸化IκBα。IκBα是NF-κB的抑制蛋白，通常與NF-κB二聚體結(jié)合，使其處于非活性狀態(tài)并滯留于細(xì)胞質(zhì)中。磷酸化后的IκBα?xí)环核鼗揎棧M(jìn)而被蛋白酶體降解。此時(shí)，NF-κB二聚體（如p65/p50）得以釋放，暴露其核定位序列（NLS），隨后迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，NF-κB與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。眾多炎性細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域都含有κB位點(diǎn)，因此NF-κB的激活可促進(jìn)這些基因的表達(dá)。例如，NF-κB可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-6具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，它可以促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性；IL-8是一種強(qiáng)效的趨化因子，能夠吸引中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，增強(qiáng)局部免疫防御能力；TNF-α則具有直接殺傷病原體、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能等多種作用。研究發(fā)現(xiàn)，在NOD2基因敲除的巨噬細(xì)胞中，結(jié)核分枝桿菌感染后NF-κB的激活受到顯著抑制，IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)水平明顯降低，表明NOD2通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，在誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。3.2.2自噬調(diào)控作用自噬是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)降解過(guò)程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、清除病原體以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中，NOD2對(duì)自噬具有重要的調(diào)控作用，這對(duì)于限制結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的存活和繁殖、促進(jìn)細(xì)菌的清除具有關(guān)鍵意義。當(dāng)NOD2識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的MDP并被激活后，可通過(guò)多條途徑誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。NOD2可以直接與自噬相關(guān)蛋白相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，NOD2能夠與微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）相互作用。LC3是自噬體形成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，在自噬誘導(dǎo)時(shí)，胞漿型LC3（LC3-I）會(huì)被Atg4切割，暴露其C端甘氨酸殘基，然后在Atg7和Atg3等酶的作用下，與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，形成脂結(jié)合型LC3（LC3-II），LC3-II定位于自噬體膜上，參與自噬體的形成。NOD2與LC3的相互作用可以促進(jìn)LC3的脂化修飾，增加LC3-II的表達(dá)水平，從而促進(jìn)自噬體的形成。NOD2還可以通過(guò)激活下游信號(hào)通路來(lái)調(diào)控自噬。如前所述，NOD2激活后可通過(guò)RIP2激活NF-κB信號(hào)通路。NF-κB被激活后，除了調(diào)控炎性細(xì)胞因子的表達(dá)外，還可以調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，NF-κB可以誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)。Beclin1是自噬起始復(fù)合物的重要組成部分，它與Vps34、Vps15等蛋白組成復(fù)合物，參與自噬體的起始形成過(guò)程。NF-κB通過(guò)上調(diào)Beclin1的表達(dá)，促進(jìn)自噬體的形成，增強(qiáng)細(xì)胞的自噬能力。NOD2激活的MAPK信號(hào)通路也參與自噬的調(diào)控。p38MAPK被激活后，可以磷酸化一些自噬相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)自噬體的形成和成熟過(guò)程。例如，p38MAPK可以磷酸化Atg13，增強(qiáng)Atg13與Atg1的相互作用，促進(jìn)自噬起始復(fù)合物的組裝，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。NOD2調(diào)控的自噬對(duì)清除結(jié)核分枝桿菌具有重要影響。自噬體形成后，會(huì)包裹胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，然后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。在自噬溶酶體中，結(jié)核分枝桿菌會(huì)受到溶酶體中的多種水解酶的作用，被降解和清除。研究表明，在NOD2表達(dá)正常的巨噬細(xì)胞中，結(jié)核分枝桿菌感染后自噬水平明顯升高，細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存活數(shù)量顯著減少。而當(dāng)NOD2基因被敲除或其功能被抑制時(shí)，巨噬細(xì)胞的自噬水平降低，細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存活數(shù)量明顯增加，說(shuō)明NOD2通過(guò)調(diào)控自噬，在限制結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的存活和促進(jìn)細(xì)菌清除方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。3.2.3抗菌肽的產(chǎn)生與作用抗菌肽是一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，在機(jī)體的固有免疫防御中發(fā)揮著重要作用。在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，NOD2可以誘導(dǎo)抗菌肽的產(chǎn)生，這些抗菌肽對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有直接的殺傷作用，是機(jī)體抵御結(jié)核分枝桿菌感染的重要防線之一。NOD2誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生的機(jī)制主要與激活下游信號(hào)通路有關(guān)。當(dāng)NOD2識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的MDP并激活后，通過(guò)RIP2激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路。在NF-κB信號(hào)通路中，激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與抗菌肽基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄。以防御素4B為例，其基因啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)κB位點(diǎn)，NF-κB的結(jié)合可以促進(jìn)防御素4B基因的表達(dá)。研究表明，在巨噬細(xì)胞中，用結(jié)核分枝桿菌感染或MDP刺激后，NF-κB被激活，防御素4B的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。當(dāng)抑制NF-κB的活性時(shí)，防御素4B的表達(dá)明顯降低，說(shuō)明NF-κB在NOD2誘導(dǎo)防御素4B產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用。MAPK信號(hào)通路也參與NOD2誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生的過(guò)程。如p38MAPK被激活后，可磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄。p38MAPK可以磷酸化ATF2，磷酸化的ATF2與抗菌肽基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，使用p38MAPK抑制劑處理巨噬細(xì)胞后，結(jié)核分枝桿菌感染誘導(dǎo)的防御素4B表達(dá)水平明顯降低，表明p38MAPK在NOD2誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生中具有重要作用。抗菌肽對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有多種作用方式。防御素4B等抗菌肽可以通過(guò)破壞結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，從而達(dá)到殺菌的目的。抗菌肽還可以干擾結(jié)核分枝桿菌的代謝過(guò)程，抑制其蛋白質(zhì)合成、核酸復(fù)制等關(guān)鍵生理活動(dòng)。研究表明，防御素4B能夠與結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)合，改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，破壞細(xì)胞的完整性。防御素4B還可以進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，干擾其正常的代謝和生理功能，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。3.3相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析3.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本研究選用人巨噬細(xì)胞U937作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型，因其具有典型的巨噬細(xì)胞特性，在免疫研究中應(yīng)用廣泛。實(shí)驗(yàn)共分為以下三組：正常對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)U937細(xì)胞，不做任何處理，作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于對(duì)比其他處理組細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)變化。結(jié)核分枝桿菌感染組：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株，以感染復(fù)數(shù)（MOI）為10:1的比例加入到培養(yǎng)的U937細(xì)胞中。具體操作如下，首先用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基將結(jié)核分枝桿菌H37Rv株稀釋至所需濃度，然后加入到培養(yǎng)有U937細(xì)胞的6孔板中，每孔細(xì)胞密度為5×10^5個(gè)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。之后用PBS輕柔洗滌細(xì)胞3次，以去除未被細(xì)胞吞噬的結(jié)核分枝桿菌，再加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。NOD2干擾+結(jié)核分枝桿菌感染組：采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)U937細(xì)胞中NOD2的表達(dá)。首先，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)NOD2基因的小干擾RNA（siRNA）序列，其序列為：sense：5'-CCUACGCCACCUUCUUCUUTT-3'，antisense：5'-AAGAAGAAGGUGGCGUAGGTT-3'。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000將siRNA轉(zhuǎn)染至U937細(xì)胞中。具體轉(zhuǎn)染步驟如下，將U937細(xì)胞以每孔3×10^5個(gè)的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%。按照Lipofectamine3000試劑說(shuō)明書(shū)，將適量的siRNA與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育20分鐘，形成siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有U937細(xì)胞的孔中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)后，用上述相同方法將結(jié)核分枝桿菌H37Rv株以MOI為10:1的比例感染轉(zhuǎn)染后的U937細(xì)胞。3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及對(duì)結(jié)論的支持在菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬及殺傷能力實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌感染組U937細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌菌落形成單位（CFU）數(shù)量在感染后24小時(shí)明顯高于正常對(duì)照組，這表明U937細(xì)胞能夠吞噬結(jié)核分枝桿菌，且結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)能夠存活和繁殖。NOD2干擾+結(jié)核分枝桿菌感染組細(xì)胞內(nèi)的CFU數(shù)量顯著高于結(jié)核分枝桿菌感染組，這說(shuō)明干擾NOD2表達(dá)后，U937細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬和殺傷能力明顯下降。這一結(jié)果支持了NOD2在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用的結(jié)論，即NOD2的正常表達(dá)有助于巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)U937細(xì)胞中NOD2mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染組U937細(xì)胞中NOD2mRNA的表達(dá)水平在感染后6小時(shí)開(kāi)始顯著上調(diào)，12小時(shí)達(dá)到峰值，之后略有下降，但仍高于正常對(duì)照組。這表明結(jié)核分枝桿菌感染能夠誘導(dǎo)U937細(xì)胞中NOD2基因的表達(dá)。在NOD2干擾+結(jié)核分枝桿菌感染組中，NOD2mRNA的表達(dá)水平明顯低于結(jié)核分枝桿菌感染組，說(shuō)明siRNA干擾有效降低了NOD2的表達(dá)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)中對(duì)NOD2表達(dá)調(diào)控的有效性，為后續(xù)分析NOD2功能提供了基礎(chǔ)。采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α的水平，結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌感染組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平在感染后12小時(shí)顯著升高，且在24小時(shí)維持在較高水平。這表明結(jié)核分枝桿菌感染能夠刺激U937細(xì)胞分泌炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。NOD2干擾+結(jié)核分枝桿菌感染組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平顯著低于結(jié)核分枝桿菌感染組，說(shuō)明干擾NOD2表達(dá)后，炎癥因子的分泌受到抑制。這支持了NOD2在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的結(jié)論，即NOD2通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和分泌，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。運(yùn)用Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白p62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）的表達(dá)，結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌感染組U937細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值在感染后12小時(shí)顯著升高，p62蛋白的表達(dá)水平下降。這表明結(jié)核分枝桿菌感染能夠誘導(dǎo)U937細(xì)胞發(fā)生自噬，自噬過(guò)程中LC3-I會(huì)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II，定位于自噬體膜上，而p62蛋白會(huì)被自噬降解。NOD2干擾+結(jié)核分枝桿菌感染組細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值顯著低于結(jié)核分枝桿菌感染組，p62蛋白的表達(dá)水平升高。這說(shuō)明干擾NOD2表達(dá)后，U937細(xì)胞的自噬水平降低，自噬對(duì)p62蛋白的降解減少。這支持了NOD2在調(diào)控自噬中發(fā)揮重要作用的結(jié)論，即NOD2能夠通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除。四、NF-κB在結(jié)核分枝桿菌感染中的作用機(jī)制4.1NF-κB信號(hào)通路的激活過(guò)程4.1.1經(jīng)典激活途徑在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中，NF-κB經(jīng)典激活途徑發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其信號(hào)傳導(dǎo)步驟涉及多個(gè)關(guān)鍵蛋白和復(fù)雜的分子相互作用。當(dāng)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞受到結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，結(jié)核分枝桿菌的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如細(xì)胞壁成分脂多糖（LPS）、肽聚糖、脂蛋白等，可被細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別。Toll樣受體（TLRs）家族中的TLR2和TLR4等在識(shí)別結(jié)核分枝桿菌PAMPs中發(fā)揮重要作用。以TLR2為例，當(dāng)它識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的脂蛋白等成分后，會(huì)招募接頭蛋白髓樣分化因子88（MyD88）。MyD88通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域與TLR2的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，形成TLR2-MyD88復(fù)合物。MyD88招募IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員，包括IRAK1、IRAK4等。IRAK4首先被招募到TLR2-MyD88復(fù)合物中，然后磷酸化IRAK1，使其激活。激活的IRAK1會(huì)進(jìn)一步招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6是一種E3泛素連接酶，它會(huì)發(fā)生自身泛素化修飾，形成多聚泛素鏈。這些多聚泛素鏈作為信號(hào)平臺(tái)，招募并激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β激活激酶1（TAK1）及其結(jié)合蛋白TAB1、TAB2和TAB3組成的復(fù)合物。TAK1被激活后，主要通過(guò)磷酸化激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物。IKK復(fù)合物由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基IKKγ（也稱為NEMO）組成。TAK1磷酸化IKKβ的Ser177和Ser181位點(diǎn)，使其激活。激活的IKKβ會(huì)磷酸化IκBα的Ser32和Ser36位點(diǎn)。IκBα是NF-κB的抑制蛋白，通常與NF-κB二聚體（如p65/p50）結(jié)合，使其處于非活性狀態(tài)并滯留于細(xì)胞質(zhì)中。IκBα磷酸化后，會(huì)被E3泛素連接酶β-TrCP識(shí)別，β-TrCP將IκBα進(jìn)行多聚泛素化修飾。多聚泛素化的IκBα被26S蛋白酶體識(shí)別并降解。IκBα降解后，NF-κB二聚體（如p65/p50）得以釋放，暴露其核定位序列（NLS）。在細(xì)胞核輸入蛋白的協(xié)助下，NF-κB二聚體迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，NF-κB與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。眾多炎性細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域都含有κB位點(diǎn)，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。NF-κB的結(jié)合促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)相應(yīng)的mRNA，進(jìn)而翻譯出炎性細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御能力。4.1.2非經(jīng)典激活途徑NF-κB的非經(jīng)典激活途徑具有獨(dú)特的特點(diǎn)和激活條件，在結(jié)核分枝桿菌感染中也發(fā)揮著一定的作用，盡管其作用機(jī)制相對(duì)經(jīng)典途徑研究較少，但近年來(lái)逐漸受到關(guān)注。非經(jīng)典激活途徑主要涉及NF-κB2（p100/p52）和RelB等成員。與經(jīng)典途徑不同，非經(jīng)典途徑的激活通常依賴于特定的刺激和受體，如CD40、淋巴毒素-β受體（LT-βR）、B細(xì)胞活化因子受體（BAFF-R）等，這些受體大多屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中，雖然非經(jīng)典途徑的激活機(jī)制尚未完全明確，但有研究表明，結(jié)核分枝桿菌的某些成分或感染引發(fā)的免疫微環(huán)境變化可能會(huì)激活非經(jīng)典途徑。以CD40為例，當(dāng)CD40與相應(yīng)的配體CD40L結(jié)合后，會(huì)招募TRAF2、TRAF3和TRAF5等接頭蛋白。在正常情況下，TRAF3與NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK）結(jié)合，抑制NIK的活性。當(dāng)CD40被激活后，TRAF3會(huì)從NIK上解離，使得NIK得以激活。激活的NIK磷酸化IKKα的Ser176和Ser180位點(diǎn)，使其激活。與經(jīng)典途徑中IKKβ起主要作用不同，非經(jīng)典途徑中IKKα是關(guān)鍵的激酶。激活的IKKα?xí)姿峄疦F-κB2（p100）。p100是p52的前體形式，含有一個(gè)C末端的錨蛋白重復(fù)序列（ARD），這個(gè)序列可以抑制p100的活性并使其滯留于細(xì)胞質(zhì)中。IKKα磷酸化p100后，p100會(huì)被泛素化修飾，然后被蛋白酶體部分降解，去除其C末端的ARD序列，生成具有活性的p52。p52與RelB結(jié)合形成異源二聚體，暴露其核定位序列（NLS），隨后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，p52/RelB二聚體與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這些靶基因主要參與淋巴細(xì)胞的發(fā)育、存活、成熟和粘附等過(guò)程，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和類型方面發(fā)揮作用。在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，非經(jīng)典途徑激活后調(diào)控的基因可能影響T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能，從而影響機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答。4.2NF-κB對(duì)免疫相關(guān)基因的調(diào)控4.2.1炎癥因子基因的調(diào)控在結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的免疫反應(yīng)中，NF-κB對(duì)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮著核心作用，其調(diào)控機(jī)制復(fù)雜且精細(xì)，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和分子間的相互作用。當(dāng)NF-κB信號(hào)通路被激活后，p65/p50等NF-κB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，與炎癥因子基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)特異性結(jié)合。以腫瘤壞死因子-α（TNF-α）基因啟動(dòng)子為例，其含有多個(gè)κB位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的核苷酸序列具有特定的結(jié)構(gòu)特征，能夠與NF-κB二聚體的Rel同源區(qū)（RHR）精確結(jié)合。NF-κB二聚體與κB位點(diǎn)結(jié)合后，招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，包括RNA聚合酶Ⅱ、通用轉(zhuǎn)錄因子等。這些轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物在NF-κB的作用下，組裝到炎癥因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。研究表明，在巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌后，NF-κB與TNF-α基因啟動(dòng)子的結(jié)合活性顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平升高，進(jìn)而使TNF-α的表達(dá)和分泌增加。NF-κB還可以通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。NF-κB可以與激活蛋白-1（AP-1）家族成員如c-Jun、c-Fos等相互作用。AP-1也是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的表達(dá)調(diào)控。在炎癥因子基因啟動(dòng)子區(qū)域，除了κB位點(diǎn)外，還存在AP-1結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)NF-κB和AP-1同時(shí)被激活時(shí)，它們可以分別結(jié)合到各自的位點(diǎn)上，通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合物，協(xié)同促進(jìn)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核分枝桿菌感染的細(xì)胞中，抑制AP-1的活性會(huì)降低NF-κB對(duì)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，說(shuō)明NF-κB與AP-1的協(xié)同作用在炎癥因子基因調(diào)控中具有重要意義。NF-κB對(duì)炎癥因子基因的調(diào)控還受到多種信號(hào)通路的影響。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在NF-κB調(diào)控炎癥因子基因表達(dá)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。如前所述，在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中，MAPK信號(hào)通路中的p38MAPK和JNK等成員被激活。激活的p38MAPK和JNK可以磷酸化NF-κB的p65亞基，使其轉(zhuǎn)錄激活活性增強(qiáng)。p38MAPK可以磷酸化p65的Ser536位點(diǎn)，JNK可以磷酸化p65的Ser276位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的磷酸化修飾會(huì)改變p65的構(gòu)象，增強(qiáng)其與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力，以及與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子的相互作用，從而促進(jìn)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，使用p38MAPK抑制劑或JNK抑制劑處理感染結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞，會(huì)降低NF-κB對(duì)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，導(dǎo)致炎癥因子的表達(dá)水平下降。4.2.2免疫細(xì)胞分化與功能相關(guān)基因的調(diào)控NF-κB在免疫細(xì)胞的分化、成熟和功能維持過(guò)程中，對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控起著關(guān)鍵作用，它參與了從造血干細(xì)胞向各種成熟免疫細(xì)胞分化的多個(gè)階段，以及免疫細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的功能調(diào)節(jié)。在T細(xì)胞分化過(guò)程中，NF-κB參與調(diào)控T細(xì)胞向不同亞型分化的相關(guān)基因表達(dá)。初始T細(xì)胞在受到抗原刺激和細(xì)胞因子的作用下，會(huì)分化為不同的T細(xì)胞亞型，如Th1、Th2、Th17和Treg等，每種亞型都具有獨(dú)特的功能和分泌特定的細(xì)胞因子。NF-κB通過(guò)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響T細(xì)胞的分化方向。在Th1細(xì)胞分化過(guò)程中，NF-κB可以促進(jìn)T-bet基因的表達(dá)。T-bet是Th1細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠結(jié)合到干擾素-γ（IFN-γ）基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、激活巨噬細(xì)胞等功能，在機(jī)體抵御結(jié)核分枝桿菌等細(xì)胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮重要作用。研究表明，在NF-κB信號(hào)通路被抑制的情況下，T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化受到阻礙，IFN-γ的分泌減少，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御能力下降。在B細(xì)胞分化和抗體產(chǎn)生過(guò)程中，NF-κB同樣發(fā)揮著不可或缺的作用。B細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中，需要經(jīng)歷多個(gè)階段，從骨髓中的祖B細(xì)胞逐漸分化為成熟的B細(xì)胞，并在抗原刺激下進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體。NF-κB參與調(diào)控B細(xì)胞分化過(guò)程中的多個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)。在B細(xì)胞活化階段，NF-κB可以促進(jìn)B細(xì)胞活化相關(guān)基因的表達(dá)，如CD40、CD86等。CD40和CD86是B細(xì)胞表面的重要共刺激分子，它們與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，提供B細(xì)胞活化所需的第二信號(hào)，促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化。在抗體類別轉(zhuǎn)換過(guò)程中，NF-κB可以調(diào)控免疫球蛋白重鏈基因的表達(dá)。免疫球蛋白重鏈基因存在多個(gè)恒定區(qū)基因，不同的恒定區(qū)基因決定了抗體的類別。NF-κB通過(guò)結(jié)合到免疫球蛋白重鏈基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響抗體的類別轉(zhuǎn)換，使B細(xì)胞能夠產(chǎn)生不同類型的抗體，如IgM、IgG、IgA等，以適應(yīng)不同的免疫需求。研究發(fā)現(xiàn)，在NF-κB信號(hào)通路缺陷的B細(xì)胞中，B細(xì)胞的活化、增殖和抗體產(chǎn)生均受到顯著影響，無(wú)法有效地參與體液免疫應(yīng)答。4.3NF-κB在結(jié)核分枝桿菌感染中的免疫調(diào)節(jié)作用4.3.1對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響巨噬細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫的重要組成部分，在抵御結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而NF-κB對(duì)巨噬細(xì)胞的多種功能具有顯著的調(diào)節(jié)作用。在吞噬功能方面，NF-κB的激活能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬能力。研究表明，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到結(jié)核分枝桿菌感染后，NF-κB信號(hào)通路被激活，促進(jìn)了巨噬細(xì)胞表面多種吞噬相關(guān)受體的表達(dá)，如甘露糖受體、清道夫受體等。甘露糖受體能夠識(shí)別結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁上的甘露糖殘基，清道夫受體則可以識(shí)別結(jié)核分枝桿菌表面的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等成分。這些受體表達(dá)的增加，使得巨噬細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)了吞噬作用的發(fā)生。通過(guò)基因敲除或抑制劑處理等方法抑制NF-κB的活性，巨噬細(xì)胞表面吞噬相關(guān)受體的表達(dá)會(huì)顯著降低，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬能力也隨之減弱。NF-κB還參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺傷作用。激活的NF-κB可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）和抗菌肽等。NO是巨噬細(xì)胞殺傷結(jié)核分枝桿菌的重要效應(yīng)分子之一，它可以通過(guò)與結(jié)核分枝桿菌的關(guān)鍵酶結(jié)合，抑制其代謝活動(dòng)，從而達(dá)到殺菌的目的。NF-κB激活后，會(huì)促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）基因的表達(dá)，iNOS催化L-精氨酸生成NO。研究發(fā)現(xiàn)，在NF-κB信號(hào)通路被抑制的巨噬細(xì)胞中，iNOS的表達(dá)水平明顯降低，NO的產(chǎn)生量減少，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺傷能力顯著下降。ROS也是巨噬細(xì)胞殺傷結(jié)核分枝桿菌的重要武器，它可以通過(guò)氧化損傷結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。NF-κB激活后，會(huì)調(diào)節(jié)NADPH氧化酶等相關(guān)酶的表達(dá)，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。抗菌肽則具有直接殺傷結(jié)核分枝桿菌的作用，NF-κB通過(guò)調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)，增加抗菌肽的合成和分泌，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌能力。在抗原呈遞功能方面，NF-κB對(duì)巨噬細(xì)胞也具有重要的調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞攝取結(jié)核分枝桿菌后，會(huì)對(duì)其進(jìn)行加工處理，并將抗原肽呈遞給T細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。NF-κB激活后，會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）分子和共刺激分子的表達(dá)。MHCⅡ分子負(fù)責(zé)將抗原肽呈遞給CD4+T細(xì)胞，共刺激分子如CD80、CD86等則為T細(xì)胞的活化提供第二信號(hào)。這些分子表達(dá)的增加，有助于提高巨噬細(xì)胞的抗原呈遞效率，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。研究表明，抑制NF-κB的活性會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ分子和共刺激分子的表達(dá)降低，抗原呈遞功能受損，T細(xì)胞的活化受到抑制，從而影響機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。4.3.2對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)T細(xì)胞在機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著核心作用，而NF-κB在T細(xì)胞的活化、增殖和分化等過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在T細(xì)胞活化過(guò)程中，NF-κB是不可或缺的信號(hào)分子。當(dāng)T細(xì)胞受到抗原刺激時(shí)，T細(xì)胞受體（TCR）與抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合，啟動(dòng)T細(xì)胞活化的信號(hào)傳導(dǎo)。這一過(guò)程中，NF-κB信號(hào)通路被激活。TCR信號(hào)通過(guò)一系列接頭蛋白和激酶的作用，激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物。IKK復(fù)合物磷酸化IκBα，使其降解，從而釋放NF-κB二聚體，如p65/p50。釋放的NF-κB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列與T細(xì)胞活化相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB可以促進(jìn)白細(xì)胞介素-2（IL-2）基因的表達(dá)，IL-2是T細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子。NF-κB還可以調(diào)節(jié)CD25（IL-2受體α鏈）的表達(dá)，CD25與IL-2結(jié)合后，形成高親和力的IL-2受體，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。研究表明，在NF-κB信號(hào)通路缺陷的T細(xì)胞中，T細(xì)胞受到抗原刺激后，IL-2的分泌減少，CD25的表達(dá)降低，T細(xì)胞的活化和增殖受到顯著抑制。NF-κB對(duì)T細(xì)胞的分化方向也具有重要的調(diào)節(jié)作用。初始T細(xì)胞在受到抗原刺激和細(xì)胞因子的作用下，會(huì)分化為不同的T細(xì)胞亞型，如Th1、Th2、Th17和Treg等。NF-κB通過(guò)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響T細(xì)胞的分化。在Th1細(xì)胞分化過(guò)程中，NF-κB可以促進(jìn)T-bet基因的表達(dá)。T-bet是Th1細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠結(jié)合到干擾素-γ（IFN-γ）基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、激活巨噬細(xì)胞等功能，在機(jī)體抵御結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在NF-κB信號(hào)通路被抑制的情況下，T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化受到阻礙，IFN-γ的分泌減少，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御能力下降。在Th17細(xì)胞分化過(guò)程中，NF-κB可以促進(jìn)RORγt基因的表達(dá)。RORγt是Th17細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)控Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-17（IL-17）等的表達(dá)。IL-17具有招募中性粒細(xì)胞、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等功能，在抵御細(xì)胞外病原體感染中發(fā)揮重要作用。在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。NF-κB對(duì)Treg細(xì)胞的分化和功能也有一定的調(diào)節(jié)作用。Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，防止過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。NF-κB通過(guò)調(diào)控Foxp3基因的表達(dá)，影響Treg細(xì)胞的分化和功能。Foxp3是Treg細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能維持至關(guān)重要。4.3.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及結(jié)果分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB在體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌感染免疫中的作用，本研究進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。選用6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠，體重為18-22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)分為以下3組，每組10只小鼠：正常對(duì)照組：小鼠不進(jìn)行任何處理，作為基礎(chǔ)對(duì)照。結(jié)核分枝桿菌感染組：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株，用無(wú)菌PBS稀釋至濃度為1×10^7CFU/mL。小鼠經(jīng)滴鼻感染，每只小鼠滴鼻接種100μL菌液，使結(jié)核分枝桿菌感染小鼠肺部。NF-κB抑制劑處理+結(jié)核分枝桿菌感染組：在結(jié)核分枝桿菌感染前1小時(shí)，小鼠腹腔注射NF-κB抑制劑PDTC（吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽），劑量為50mg/kg。PDTC能夠抑制IκB激酶（IKK）的活性，從而阻斷NF-κB信號(hào)通路的激活。注射PDTC后1小時(shí)，按照上述方法對(duì)小鼠進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌滴鼻感染。感染后第7天和第14天，每組隨機(jī)選取5只小鼠，處死并收集肺組織和脾組織。肺組織用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的菌落形成單位（CFU）數(shù)量，以評(píng)估細(xì)菌在肺部的存活和繁殖情況。具體方法為，將肺組織勻漿，梯度稀釋后涂布于7H11瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)2-3周，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。脾組織用于檢測(cè)T細(xì)胞亞群的比例和細(xì)胞因子的表達(dá)水平。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例，以及Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞亞群的比例。采用ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)核分枝桿菌感染組中，小鼠肺組織的CFU數(shù)量在感染后第7天和第14天均顯著高于正常對(duì)照組，表明結(jié)核分枝桿菌在小鼠肺部能夠存活和繁殖。NF-κB抑制劑處理+結(jié)核分枝桿菌感染組小鼠肺組織的CFU數(shù)量在感染后第7天和第14天均顯著高于結(jié)核分枝桿菌感染組，說(shuō)明抑制NF-κB信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致小鼠肺部結(jié)核分枝桿菌的存活和繁殖增加，機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除能力下降。在T細(xì)胞亞群比例方面，結(jié)核分枝桿菌感染組小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例在感染后第7天和第14天均顯著高于正常對(duì)照組，說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌感染能夠激活小鼠的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)核分枝桿菌感染組小鼠脾細(xì)胞中Th1和Th17細(xì)胞亞群的比例在感染后第7天和第14天均顯著高于正常對(duì)照組，Th2和Treg細(xì)胞亞群的比例在感染后第7天和第14天與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。NF-κB抑制劑處理+結(jié)核分枝桿菌感染組小鼠脾細(xì)胞中Th1和Th17細(xì)胞亞群的比例在感染后第7天和第14天均顯著低于結(jié)核分枝桿菌感染組，Th2和Treg細(xì)胞亞群的比例在感染后第7天和第14天與結(jié)核分枝桿菌感染組相比無(wú)明顯變化。這表明抑制NF-κB信號(hào)通路會(huì)阻礙T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞亞群的分化，影響機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在細(xì)胞因子表達(dá)水平方面，結(jié)核分枝桿菌感染組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-17的水平在感染后第7天和第14天均顯著高于正常對(duì)照組，IL-4和IL-10的水平在感染后第7天和第14天與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。NF-κB抑制劑處理+結(jié)核分枝桿菌感染組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-17的水平在感染后第7天和第14天均顯著低于結(jié)核分枝桿菌感染組，IL-4和IL-10的水平在感染后第7天和第14天與結(jié)核分枝桿菌感染組相比無(wú)明顯變化。這進(jìn)一步說(shuō)明抑制NF-κB信號(hào)通路會(huì)降低Th1和Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平，削弱機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御能力。五、NOD2與NF-κB在結(jié)核分枝桿菌感染中的相互關(guān)系5.1信號(hào)通路的交互作用5.1.1NOD2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響當(dāng)NOD2識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的MDP后，會(huì)通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件對(duì)NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生顯著影響。NOD2通過(guò)其C端的LRR結(jié)構(gòu)域識(shí)別MDP后，發(fā)生構(gòu)象改變，暴露NOD結(jié)構(gòu)域，使其能夠結(jié)合ATP并水解。這一過(guò)程伴隨著NOD2的進(jìn)一步構(gòu)象變化，從而暴露出N端的CARD結(jié)構(gòu)域。CARD結(jié)構(gòu)域通過(guò)CARD-CARD相互作用招募受體相互作用蛋白2（RIP2），形成NOD2-RIP2復(fù)合物。RIP2被招募后，其激酶活性被激活，發(fā)生自身磷酸化。激活的RIP2會(huì)進(jìn)一步招募和激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物。IKK復(fù)合物由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基IKKγ（也稱為NEMO）組成。RIP2通過(guò)與IKKγ相互作用，促使IKKα和IKKβ磷酸化IκBα。IκBα是NF-κB的抑制蛋白，通常與NF-κB二聚體（如p65/p50）結(jié)合，使其處于非活性狀態(tài)并滯留于細(xì)胞質(zhì)中。IκBα磷酸化后，會(huì)被E3泛素連接酶β-TrCP識(shí)別，β-TrCP將IκBα進(jìn)行多聚泛素化修飾。多聚泛素化的IκBα被26S蛋白酶體識(shí)別并降解。IκBα降解后，NF-κB二聚體得以釋放，暴露其核定位序列（NLS）。在細(xì)胞核輸入蛋白的協(xié)助下，NF-κB二聚體迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，NF-κB與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。眾多炎性細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域都含有κB位點(diǎn)，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。NF-κB的結(jié)合促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)相應(yīng)的mRNA，進(jìn)而翻譯出炎性細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。研究表明，在巨噬細(xì)胞中，用MDP刺激后，NOD2被激活，NF-κB的活性顯著增強(qiáng)，IL-6、IL-8和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平明顯升高。當(dāng)抑制NOD2的表達(dá)或功能時(shí)，NF-κB的激活受到抑制，炎性細(xì)胞因子的表達(dá)也隨之降低，這充分說(shuō)明了NOD2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活具有重要的促進(jìn)作用。5.1.2NF-κB對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)的反饋調(diào)節(jié)NF-κB被激活后，也會(huì)對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用，這種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于維持免疫反應(yīng)的平衡和穩(wěn)定至關(guān)重要。NF-κB激活后，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列基因的表達(dá)，其中包括一些對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)具有調(diào)節(jié)作用的基因。NF-κB可以誘導(dǎo)A20（也稱為TNFAIP3）基因的表達(dá)。A20是一種具有雙重泛素編輯活性的蛋白，它在NF-κB信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。A20可以通過(guò)其N端的泛素編輯結(jié)構(gòu)域去除RIP2上的K63連接的泛素鏈，從而抑制RIP2的活性。由于RIP2是NOD2信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，RIP2活性的抑制會(huì)阻斷NOD2信號(hào)的進(jìn)一步傳導(dǎo)。研究表明，在巨噬細(xì)胞中，用TNF-α刺激激活NF-κB后，A20的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)NOD2介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制，IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)也相應(yīng)降低。當(dāng)敲低A20的表達(dá)時(shí)，NF-κB對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用減弱，說(shuō)明A20在NF-κB對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)的反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的中介作用。NF-κB還可以通過(guò)調(diào)控其他基因的表達(dá)來(lái)影響NOD2信號(hào)傳導(dǎo)。NF-κB可以調(diào)節(jié)一些microRNA（miRNA）的表達(dá)。miRNA是一類非編碼RNA，它們可以通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促進(jìn)其降解，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB激活后可以上調(diào)miR-146a的表達(dá)。miR-146a可以靶向結(jié)合TRAF6和IRAK1的mRNA，抑制它們的表達(dá)。TRAF6和IRAK1是TLR信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，同時(shí)也參與NOD2信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。它們的表達(dá)受到抑制會(huì)影響NOD2信號(hào)通路的激活，從而對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用。在巨噬細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-146a可以抑制NOD2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平；而敲低miR-146a的表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證明了NF-κB通過(guò)調(diào)節(jié)miR-146a對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)的反饋調(diào)節(jié)作用。五、NOD2與NF-κB在結(jié)核分枝桿菌感染中的相互關(guān)系5.2協(xié)同調(diào)控免疫反應(yīng)5.2.1炎癥反應(yīng)的協(xié)同調(diào)控在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中，NOD2與NF-κB在炎癥反應(yīng)的調(diào)控中發(fā)揮著協(xié)同作用，其協(xié)同機(jī)制涉及多個(gè)層面和信號(hào)通路的交互。當(dāng)NOD2識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的MDP后，通過(guò)CARD-CARD相互作用招募RIP2，激活下游的NF-κB信號(hào)通路。這一過(guò)程中，NOD2為NF-κB的激活提供了關(guān)鍵的上游信號(hào)。RIP2激活I(lǐng)KK復(fù)合物，使IκBα磷酸化、泛素化并被蛋白酶體降解，從而釋放NF-κB二聚體，如p65/p50。釋放的NF-κB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，與炎性細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。眾多炎性細(xì)胞因子基因，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，其啟動(dòng)子區(qū)域都含有κB位點(diǎn)。NF-κB的結(jié)合促進(jìn)這些基因的表達(dá)，使細(xì)胞合成并分泌相應(yīng)的炎性細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。研究表明，在巨噬細(xì)胞中，用MDP刺激激活NOD2后，NF-κB的活性顯著增強(qiáng)，IL-6、IL-8和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平明顯升高。當(dāng)抑制NOD2的表達(dá)或功能時(shí)，NF-κB的激活受到抑制，炎性細(xì)胞因子的表達(dá)也隨之降低，這充分說(shuō)明了NOD2對(duì)NF-κB激活炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的促進(jìn)作用。NF-κB被激活后，會(huì)對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)，這種反饋調(diào)節(jié)對(duì)于維持炎癥反應(yīng)的平衡至關(guān)重要。NF-κB可以誘導(dǎo)A20基因的表達(dá)。A20是一種具有雙重泛素編輯活性的蛋白，它可以去除RIP2上的K63連接的泛素鏈，從而抑制RIP2的活性。由于RIP2是NOD2信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，RIP2活性的抑制會(huì)阻斷NOD2信號(hào)的進(jìn)一步傳導(dǎo)。在巨噬細(xì)胞中，用TNF-α刺激激活NF-κB后，A20的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)NOD2介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制，IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)也相應(yīng)降低。當(dāng)敲低A20的表達(dá)時(shí)，NF-κB對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用減弱，說(shuō)明A20在NF-κB對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)的反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的中介作用。NF-κB還可以通過(guò)調(diào)控miR-146a等microRNA的表達(dá)來(lái)影響NOD2信號(hào)傳導(dǎo)。miR-146a可以靶向結(jié)合TRAF6和IRAK1的mRNA，抑制它們的表達(dá)。TRAF6和IRAK1是TLR信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，同時(shí)也參與NOD2信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。它們的表達(dá)受到抑制會(huì)影響NOD2信號(hào)通路的激活，從而對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用。在巨噬細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-146a可以抑制NOD2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平；而敲低miR-146a的表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證明了NF-κB通過(guò)調(diào)節(jié)miR-146a對(duì)NOD2信號(hào)傳導(dǎo)的反饋調(diào)節(jié)作用。通過(guò)這種正反饋激活和負(fù)反饋調(diào)節(jié)的協(xié)同作用，NOD2與NF-κB共同維持著炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，使其既能有效抵御結(jié)核分枝桿菌的感染，又能避免過(guò)度炎癥對(duì)機(jī)體造成損傷。5.2.2免疫細(xì)胞功能的協(xié)同調(diào)節(jié)在結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的免疫反應(yīng)中，NOD2與NF-κB對(duì)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能具有協(xié)同調(diào)節(jié)作用，這種協(xié)同作用對(duì)于增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力、維持免疫平衡至關(guān)重要。在巨噬細(xì)胞方面，NOD2與NF-κB協(xié)同調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬、殺傷和抗原呈遞功能。NOD2識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的MDP后，激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面多種吞噬相關(guān)受體的表達(dá)，如甘露糖受體、清道夫受體等。這些受體表達(dá)的增加，使得巨噬細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)了吞噬作用的發(fā)生。NF-κB還可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）和抗菌肽等，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺傷能力。在抗原呈遞功能方面，NOD2與NF-κB協(xié)同促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）分子和共刺激分子的表達(dá)。MHCⅡ分子負(fù)責(zé)將抗原肽呈遞給CD4+T細(xì)胞，共刺激分子如CD80、CD86等則為T細(xì)胞的活化提供第二信號(hào)。這些分子表達(dá)的增加，有助于提高巨噬細(xì)胞的抗原呈遞效率，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。研究表明，在NOD2基因敲除的巨噬細(xì)胞中，NF-κB的激活受到抑制，巨噬細(xì)胞的吞噬、殺傷和抗原呈遞功能均受損；而在NF-κB信號(hào)通路被抑制的情況下，NOD2對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用也明顯減弱，說(shuō)明NOD2與NF-κB在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能中具有協(xié)同作用。在T細(xì)胞方面，NOD2與NF-κB協(xié)同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化、增殖和分化。在T細(xì)胞活化過(guò)程中，NOD2激活的信號(hào)通路與T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)通路相互作用，共同激活NF-κB。TCR與抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合后，啟動(dòng)T細(xì)胞活化的信號(hào)傳導(dǎo)，這一過(guò)程中NF-κB信號(hào)通路被激活。NOD2識(shí)別結(jié)核分枝桿菌后激活的NF-κB信號(hào)，進(jìn)一步增強(qiáng)了T細(xì)胞活化相關(guān)基因的表達(dá)，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）和CD25等。IL-2是T細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子，CD25與IL-2結(jié)合后，形成高親和力的IL-2受體，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。在T細(xì)胞分化過(guò)程中，NOD2與NF-κB協(xié)同調(diào)控T細(xì)胞向不同亞型分化。NF-κB可以促進(jìn)T-bet、RORγt等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響T細(xì)胞向Th1、Th17等亞型分化。NOD2激活的信號(hào)通路也參與調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而協(xié)同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化方向。研究發(fā)現(xiàn)，在NOD2和NF-κB信號(hào)通路均正常的情況下，T細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答更為有效；而當(dāng)其中一條信號(hào)通路受損時(shí)，T細(xì)胞的免疫功能會(huì)受到顯著影響，說(shuō)明NOD2與NF-κB在調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能中具有協(xié)同作用。5.3臨床樣本分析及相關(guān)性研究5.3.1臨床樣本的收集與檢測(cè)指標(biāo)本研究在[醫(yī)院名稱]倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下，遵循赫爾辛基宣言的原則，收集了[具體時(shí)間段]內(nèi)的臨床樣本。共納入[X]例結(jié)核病患者，其中男