NF-κBp65在變應性鼻炎小鼠模型中的表達特征與作用機制研究一、引言1.1研究背景變應性鼻炎（AllergicRhinitis，AR）是一種常見的慢性炎癥性鼻病，近年來其發病率在全球范圍內呈上升趨勢，嚴重影響著人們的生活質量。據相關研究表明，全球約10%-25%的人群受到變應性鼻炎的困擾，而我國18個中心城市的自報患病率已從2005年的11.1%攀升至2011年的17.6%。其發病機制復雜，涉及遺傳、環境、免疫等多個因素。變應性鼻炎的典型癥狀包括陣發性噴嚏、清水樣涕、鼻癢和鼻塞，這些癥狀不僅導致患者日常活動受限、學習工作效率低下，還會造成睡眠障礙，嚴重者甚至引發心理問題。此外，變應性鼻炎與哮喘之間存在密切關聯，約40%的變應性鼻炎患者可合并哮喘，且變應性鼻炎是哮喘發病的獨立危險因素。上下呼吸道在解剖學和組織學上緊密相關，炎癥容易相互蔓延，因此深入研究變應性鼻炎的發病機制對于防治哮喘等下呼吸道疾病具有重要意義。目前，變應性鼻炎的治療方法主要包括環境控制、藥物治療、免疫治療等，但這些治療方法仍存在一定的局限性。例如，藥物治療只能緩解癥狀，無法根治疾病，且長期使用可能會產生副作用；免疫治療雖然是一種對因治療方法，但治療周期長、費用高，患者的依從性較差。因此，進一步探究變應性鼻炎的發病機制，尋找新的治療靶點和方法，具有重要的臨床意義。核轉錄因子-κB（NuclearFactor-κB，NF-κB）是一類具有多向轉錄調節作用的核蛋白因子，廣泛存在于多種組織的多種細胞中，在炎癥、免疫反應、細胞分化與凋亡等過程中發揮著關鍵作用。NF-κB家族主要包括p50、p65（RelA）、RelB、c-Rel和p52等亞基，其中p65亞基在NF-κB的激活和功能發揮中起著重要作用。在正常生理狀態下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到外界刺激，如過敏原、細胞因子、細菌或病毒感染等，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB隨后進入細胞核，與靶基因啟動子區域的κB位點結合，啟動相關基因的轉錄，調控炎癥因子、黏附分子、趨化因子等的表達，進而參與炎癥和免疫反應的調節。在變應性鼻炎的發病過程中，NF-κB信號通路的異常激活被認為是關鍵環節之一。研究發現，變應性鼻炎患者鼻黏膜組織中NF-κBp65的表達明顯升高，且與疾病的嚴重程度密切相關。活化的NF-κBp65可以上調多種炎癥相關基因的表達，如白細胞介素（IL）-4、IL-5、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些炎癥因子可以促進Th2細胞的分化和增殖，增強IgE的合成和釋放，吸引嗜酸性粒細胞、肥大細胞等炎癥細胞浸潤到鼻黏膜組織，導致鼻黏膜的炎癥反應和過敏癥狀的發生。此外，NF-κBp65還可以調控黏附分子如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達，促進炎癥細胞與血管內皮細胞的黏附，進一步加重炎癥反應。綜上所述，NF-κBp65在變應性鼻炎的發病機制中可能扮演著重要角色，深入研究其在變應性鼻炎中的表達及意義，有助于揭示變應性鼻炎的發病機制，為尋找新的治療靶點和方法提供理論依據。1.2研究目的與意義本研究旨在通過建立變應性鼻炎小鼠模型，深入探究NF-κBp65在變應性鼻炎發病過程中的表達變化規律及其所發揮的作用機制。具體而言，將運用免疫組織化學、蛋白質免疫印跡（WesternBlot）等實驗技術，精確檢測小鼠鼻黏膜及相關組織中NF-κBp65的表達水平，并分析其與炎癥細胞浸潤、炎癥因子表達以及疾病嚴重程度之間的關聯。變應性鼻炎的高發病率和對患者生活質量的嚴重影響，使其成為亟待解決的醫學問題。深入理解其發病機制是開發更有效治療方法的關鍵。目前，雖然對變應性鼻炎的發病機制有了一定認識，但仍存在許多未知領域。NF-κBp65作為炎癥和免疫反應的關鍵調節因子，在變應性鼻炎中的具體作用及分子機制尚未完全明確。本研究具有重要的理論意義，通過揭示NF-κBp65在變應性鼻炎中的表達及意義，能夠豐富對變應性鼻炎發病機制的認識，為后續研究提供新的思路和方向。從實踐意義來看，若能明確NF-κBp65在變應性鼻炎發病中的關鍵作用，有望將其作為潛在的治療靶點，為開發新的治療藥物和方法奠定基礎，從而提高變應性鼻炎的治療效果，改善患者的生活質量。此外，由于變應性鼻炎與哮喘等下呼吸道疾病密切相關，對變應性鼻炎發病機制的深入研究，也將有助于更好地理解和防治相關的下呼吸道疾病，具有廣泛的臨床應用前景。1.3研究方法與創新點本研究將采用多種實驗方法，全面深入地探究NF-κBp65在變應性鼻炎小鼠中的表達及意義。首先，選用特定品系的健康小鼠，隨機分為正常對照組、變應性鼻炎模型組和藥物干預組。通過腹腔注射和鼻腔滴注卵清蛋白（OVA）的方式，建立變應性鼻炎小鼠模型，藥物干預組則在激發前給予相應的藥物處理，以觀察藥物對NF-κBp65表達及疾病進程的影響。在模型評價方面，通過詳細的行為學觀察，記錄小鼠的噴嚏次數、鼻癢搔抓次數、流涕情況等，采用行為學積分的方式對模型進行量化評價，確保模型的成功建立及穩定性。運用蘇木精-伊紅（HE）染色技術，對小鼠鼻黏膜和肺組織進行染色，在光學顯微鏡下觀察組織的形態學變化，包括黏膜水腫、上皮細胞結構、杯狀細胞增生以及炎性細胞浸潤等情況，直觀了解變應性鼻炎對組織形態的影響。借助免疫組織化學染色方法，檢測小鼠鼻黏膜和肺組織中NF-κBp65的表達部位及相對表達量，通過圖像分析系統對染色結果進行定量分析，明確NF-κBp65在組織中的分布和表達水平變化。采用蛋白質免疫印跡（WesternBlot）技術，對小鼠鼻黏膜和肺組織中的NF-κBp65蛋白表達水平進行精確測定，通過與內參蛋白的比較，得出NF-κBp65蛋白的相對表達量，從分子層面揭示其在變應性鼻炎中的表達變化。使用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測小鼠外周血及組織勻漿中相關炎癥因子，如白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的含量，分析NF-κBp65表達與炎癥因子水平之間的相關性，進一步探究其在炎癥反應中的作用機制。本研究的創新點主要體現在研究視角和研究內容的拓展上。在研究視角方面，從分子、細胞和組織多個層面，全面系統地研究NF-κBp65在變應性鼻炎小鼠中的表達及作用機制，突破了以往單一層面研究的局限性，能夠更深入、全面地揭示變應性鼻炎的發病機制。在研究內容上，不僅關注NF-κBp65本身的表達變化，還深入探討其與炎癥因子、炎癥細胞浸潤以及疾病嚴重程度之間的內在聯系，為變應性鼻炎的發病機制研究提供了更豐富的信息。此外，通過設置藥物干預組，觀察藥物對NF-κBp65表達及疾病進程的影響，為臨床治療變應性鼻炎提供了直接的實驗依據，具有重要的臨床轉化價值。這種多層面、系統性的研究方法和內容拓展，有望為變應性鼻炎的防治開辟新的思路和方向，在變應性鼻炎研究領域具有較高的創新性和研究價值。二、變應性鼻炎與NF-κBp65的研究基礎2.1變應性鼻炎概述2.1.1定義與分類變應性鼻炎是一種常見的鼻黏膜慢性炎癥性疾病，主要由免疫球蛋白E（IgE）介導。當具有過敏體質的個體接觸致敏原后，機體的免疫系統會產生過度反應，導致鼻黏膜出現炎癥癥狀。其典型癥狀包括陣發性噴嚏、清水樣涕、鼻癢和鼻塞，這些癥狀會嚴重影響患者的生活質量。根據癥狀持續時間和發作特點，變應性鼻炎可分為季節性變應性鼻炎和常年性變應性鼻炎。季節性變應性鼻炎通常與特定季節的過敏原有關，如花粉等，患者在花粉傳播的季節會出現明顯的癥狀，而在其他季節癥狀則可能緩解或消失。常年性變應性鼻炎則是全年均可發病，主要與室內過敏原如塵螨、動物皮屑、霉菌等有關，患者的癥狀持續存在，對日常生活的影響更為持久。此外，根據疾病的嚴重程度，變應性鼻炎還可分為輕度和中-重度。輕度變應性鼻炎患者的癥狀較輕，對生活質量的影響較小，不影響睡眠、日常活動、工作和學習；中-重度變應性鼻炎患者的癥狀較為嚴重，會對睡眠、日常活動、工作和學習等造成明顯干擾，甚至可能引發其他并發癥。這種分類方式有助于醫生根據患者的具體情況制定個性化的治療方案。2.1.2流行病學特征變應性鼻炎是一個全球性的健康問題，其發病率在全球范圍內呈上升趨勢。據世界衛生組織（WHO）估計，全球約有10%-25%的人群受到變應性鼻炎的困擾。在不同地區和國家，變應性鼻炎的發病率存在一定差異。一般來說，發達國家的發病率相對較高，如西歐、北歐、北美等地區，發病率可達12%-30%。在發展中國家，隨著工業化進程的加快和生活環境的改變，變應性鼻炎的發病率也在逐漸上升。我國的變應性鼻炎發病率同樣呈現上升態勢。2005年，我國11個中心城市的流行病學調查顯示，成人變應性鼻炎的自報患病率為11.1%；到了2011年，18個中心城市的調查結果顯示，患病率已攀升至17.6%。不同地區的發病率也有所不同，其中北京、上海、廣州等大城市的發病率相對較高。兒童變應性鼻炎的發病率也不容忽視，有研究表明，我國兒童變應性鼻炎的患病率約為10.4%-31.9%，且呈逐年上升趨勢。變應性鼻炎發病率上升的原因是多方面的。首先，環境因素的改變是重要原因之一。隨著工業化和城市化的發展，空氣污染日益嚴重，空氣中的過敏原如花粉、塵螨、汽車尾氣、工業廢氣等含量增加，增加了人們接觸過敏原的機會。其次，生活方式的改變也可能與發病率上升有關。現代人的生活越來越現代化，居住環境相對封閉，室內通風不良，塵螨等過敏原容易滋生；同時，人們戶外活動減少，體育鍛煉不足，導致機體免疫力下降，也增加了過敏的風險。此外，遺傳因素在變應性鼻炎的發病中也起著重要作用，有過敏家族史的人群更容易患變應性鼻炎。變應性鼻炎的高發病率不僅給患者帶來身體上的痛苦和生活上的不便，也給社會帶來了沉重的經濟負擔，因此，對變應性鼻炎的防治工作具有重要的現實意義。2.1.3發病機制研究進展變應性鼻炎的發病機制較為復雜，涉及多種細胞和分子的參與，目前尚未完全明確。目前認為，變應性鼻炎是由遺傳因素和環境因素相互作用引起的。在遺傳因素方面，研究表明，變應性鼻炎具有一定的遺傳傾向，多個基因與變應性鼻炎的易感性相關。這些基因主要參與免疫調節、IgE合成、炎癥反應等過程。例如，位于5q31-33區域的細胞因子基因簇，包括白細胞介素（IL）-3、IL-4、IL-5、IL-13等基因，與Th2細胞的分化和功能密切相關，其多態性可能影響變應性鼻炎的發病。此外，FcεRIβ基因、CD14基因等也與變應性鼻炎的遺傳易感性有關。環境因素在變應性鼻炎的發病中起著重要的觸發作用。常見的過敏原包括花粉、塵螨、動物皮屑、霉菌、食物等。當具有過敏體質的個體首次接觸過敏原后，抗原提呈細胞（如樹突狀細胞）將過敏原攝取、加工和處理后，提呈給T淋巴細胞，激活Th0細胞向Th2細胞分化。Th2細胞分泌多種細胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等。IL-4可誘導B淋巴細胞合成和分泌IgE，IgE與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的高親和力IgE受體（FcεRI）結合，使機體處于致敏狀態。當機體再次接觸相同的過敏原時，過敏原與結合在FcεRI上的IgE特異性結合，導致肥大細胞和嗜堿性粒細胞活化，釋放多種炎癥介質，如組胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子等。這些炎癥介質作用于鼻黏膜的血管、神經、腺體和炎癥細胞，引起鼻黏膜的充血、水腫、分泌物增多、神經敏感性增加等，從而導致變應性鼻炎的癥狀發作。除了上述經典的IgE介導的速發型變態反應外，近年來研究發現，變應性鼻炎還存在遲發型變態反應和非IgE介導的機制。遲發型變態反應一般在接觸過敏原后4-8小時出現，可持續數天，主要由Th2細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤和釋放細胞因子引起，導致鼻黏膜的慢性炎癥和組織損傷。非IgE介導的機制可能涉及T淋巴細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞等細胞的活化，以及細胞因子、趨化因子、黏附分子等的參與，但其具體機制尚不完全清楚。此外，神經調節、微生物群落等因素也可能在變應性鼻炎的發病中發揮作用。例如，鼻黏膜的神經末梢在受到炎癥刺激后，可釋放神經肽，如P物質、降鈣素基因相關肽等，進一步加重炎癥反應。腸道微生物群落的失衡可能影響機體的免疫功能，增加變應性鼻炎的發病風險。總之，變應性鼻炎的發病機制是一個復雜的網絡，涉及多種細胞、分子和信號通路的相互作用，深入研究其發病機制對于開發新的治療方法具有重要意義。2.2NF-κBp65的生物學特性與功能2.2.1NF-κB家族成員與結構NF-κB家族是一類在細胞信號傳導和基因表達調控中起關鍵作用的轉錄因子家族，在哺乳動物中，該家族主要包含5個成員，分別是RelA（p65）、RelB、c-Rel、p50和p52。這些成員在結構上具有一定的相似性，它們的N端都存在一個高度保守的Rel同源區（Relhomologyregion，RHR）。RHR由N端結構域（N-terminaldomain，NTD）和C端結構域（C-terminaldomain，CTD）相互連接構成，其中CTD上含有一個核定位序列（nuclear-localizationsequence，NLS）。NLS對于NF-κB家族成員與DNA的結合、二聚體的形成以及向細胞核內的易位過程至關重要，它確保了NF-κB在細胞受到刺激時能夠準確地進入細胞核，發揮其轉錄調控功能。在這5個成員中，RelA（p65）是最為關鍵的亞基之一。p65亞基除了擁有上述保守的RHR結構外，其C端還存在一個反式激活結構域（transactivationdomain，TD）。這個反式激活結構域使得p65在NF-κB的激活和功能執行過程中發揮著核心作用。當NF-κB被激活后，p65的TD能夠與其他轉錄相關的輔助因子相互作用，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉錄機器，從而啟動靶基因的轉錄過程。例如，在炎癥反應中，p65可以與p50形成異源二聚體，p65憑借其TD結構域激活炎癥相關基因的表達，促使炎癥因子如白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的合成和釋放，進而引發和調節炎癥反應。p50和p52在結構上相對特殊，它們通常以無活性的前體形式存在，即p105和p100。這些前體蛋白經過泛素-蛋白酶體途徑的處理后，其包含錨蛋白重復序列的C末端區域會被選擇性地降解，最終產生具有活性的p50和p52亞基。p50和p52同源二聚體由于缺乏反式激活結構域，在細胞內往往作為一種抑制分子存在，它們能夠與其他具有轉錄激活能力的NF-κB亞基形成異源二聚體，對基因轉錄進行精細的調控。不同的NF-κB亞基之間可以通過組合形成多種同源或異源二聚體，這些二聚體在與DNA上特定的κB位點結合時，具有不同的親和力和特異性，從而實現對不同基因轉錄的精確調控，以應對細胞內外各種復雜的刺激和生理需求。2.2.2NF-κBp65的激活途徑NF-κBp65的激活主要通過經典和非經典兩條信號通路來實現，這兩條通路在不同的刺激條件下被激活，對細胞的生理功能和病理過程產生重要影響。經典激活途徑是NF-κBp65最常見的激活方式，主要在細胞受到促炎刺激時被啟動。當細胞受到如細菌脂多糖（LPS）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等促炎因子刺激時，細胞內信號級聯反應的第一步是轉化生長因子β激活激酶1（TAK1，也稱為MAP3K7）的活化。活化的TAK1能夠進一步激活由IKKα、IKKβ和IKKγ（也稱為NEMO）組成的三聚體IKK復合物。IKK復合物被激活后，其催化亞基IKKβ會使IκBα蛋白的特定絲氨酸殘基（Ser32和Ser36）發生磷酸化。磷酸化后的IκBα隨即被泛素化修飾，然后被蛋白酶體識別并降解。IκBα的降解使得與其結合的NF-κBp65/p50二聚體得以釋放，暴露其核定位信號序列。NF-κBp65/p50二聚體在核定位信號的引導下迅速從細胞質轉移至細胞核內，與靶基因啟動子區域的κB位點特異性結合，啟動靶基因的轉錄過程，從而調控一系列炎癥相關基因、免疫調節基因等的表達。非經典激活途徑相對較為復雜，主要通過激活腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員來啟動。該途徑涉及的TNFR超家族成員包括淋巴毒素β受體（LTβR）、屬于腫瘤壞死因子家族受體的B細胞激活因子、CD40和NF-κB受體激活劑（RANK）等。在正常生理狀態下，非經典NF-κB途徑中最重要的激酶NF-κB誘導激酶（NIK）會通過與由TNFR相關因子2、3和細胞凋亡抑制蛋白1/2組成的多亞基泛素連接酶復合物相互作用，持續發生降解，從而維持非經典途徑的相對靜止狀態。當細胞受到特定刺激，如某些細胞因子、病原體感染或發育信號等，導致TNFR超家族成員被激活時，上述多亞基泛素連接酶復合物會被降解，使得原本被持續降解的NIK得以釋放并積累，從而獲得穩定的活性。活化的NIK能夠促使IKKα同源二聚體發生磷酸化，激活的IKKα進一步使p100蛋白磷酸化。磷酸化后的p100被泛素化修飾，但并不完全降解，而是部分降解產生p52。最終，p52與RelB形成異源二聚體，并轉移至細胞核內，與靶基因的κB位點結合，啟動相關基因的轉錄，發揮其在細胞發育、免疫調節、淋巴器官形成等過程中的重要作用。這兩條激活途徑并非完全獨立，它們之間存在著復雜的相互作用和調控機制。例如，經典NF-κB途徑的激活在某些情況下會對免疫細胞中的非經典途徑產生抑制作用；反之，非經典途徑也可能對經典途徑的活性產生一定的限制。這種相互作用使得細胞能夠根據不同的刺激和生理需求，精確地調節NF-κBp65的激活程度和持續時間，以維持細胞內環境的穩定和正常的生理功能。在炎癥反應初期，經典途徑可能迅速被激活，啟動大量炎癥相關基因的表達，以應對病原體的入侵；而在炎癥反應的后期或特定的生理過程中，非經典途徑可能被激活，參與免疫調節、組織修復等過程，從而實現對炎癥反應的精細調控。2.2.3在炎癥與免疫調節中的作用NF-κBp65在炎癥和免疫調節過程中扮演著核心角色，其激活和功能的正常發揮對于維持機體的免疫平衡和防御病原體入侵至關重要。在炎癥反應中，NF-κBp65作為關鍵的轉錄調節因子，能夠被多種炎癥刺激迅速激活。一旦激活，NF-κBp65會進入細胞核，與眾多炎癥相關基因啟動子區域的κB位點結合，啟動這些基因的轉錄過程。其中，白細胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子基因是NF-κBp65的重要靶基因。這些炎癥因子在炎癥反應中具有多種生物學功能，它們可以促進炎癥細胞的活化、募集和遷移，增強炎癥反應的強度。IL-8是一種重要的趨化因子，能夠吸引中性粒細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞向炎癥部位聚集，增強局部的免疫防御能力。同時，TNF-α可以激活血管內皮細胞，使其表達黏附分子，促進炎癥細胞與血管內皮細胞的黏附，進一步加重炎癥部位的滲出和組織損傷。NF-κBp65還可以調控誘導型一氧化氮合酶（iNOS）基因的表達，iNOS催化產生的一氧化氮（NO）具有抗菌、抗病毒等免疫防御作用，但過量的NO也可能導致組織損傷和炎癥加重。在免疫調節方面，NF-κBp65參與了先天性免疫和適應性免疫的多個環節。在先天性免疫中，模式識別受體（PRRs）如Toll樣受體（TLRs）識別病原體相關分子模式（PAMPs）后，通過激活NF-κBp65信號通路，誘導產生一系列細胞因子和趨化因子，啟動先天性免疫應答，迅速抵御病原體的入侵。在適應性免疫中，NF-κBp65對于T淋巴細胞和B淋巴細胞的活化、增殖和分化起著關鍵作用。在T淋巴細胞的活化過程中，T細胞受體（TCR）與抗原肽-主要組織相容性復合體（pMHC）的結合以及共刺激信號的作用，能夠激活NF-κBp65信號通路，促進T淋巴細胞的增殖和分化為不同的效應T細胞亞群，如Th1、Th2、Th17等。Th1細胞主要分泌IFN-γ等細胞因子，參與細胞免疫應答，對抗細胞內病原體感染；Th2細胞分泌IL-4、IL-5等細胞因子，主要介導體液免疫應答，參與過敏反應和抗寄生蟲感染；Th17細胞分泌IL-17等細胞因子，在炎癥和自身免疫性疾病中發揮重要作用。對于B淋巴細胞，NF-κBp65的激活有助于B淋巴細胞的活化、增殖和抗體的產生，在體液免疫中發揮關鍵作用。然而，當NF-κBp65的激活失調時，可能會導致炎癥和免疫相關疾病的發生。在一些慢性炎癥性疾病中，如類風濕關節炎、炎癥性腸病等，NF-κBp65持續過度激活，導致炎癥因子的持續高表達，引發慢性炎癥和組織損傷。在變應性鼻炎中，過敏原的刺激可導致NF-κBp65異常激活，促進Th2型細胞因子的表達，如IL-4、IL-5等，這些細胞因子促使B淋巴細胞產生大量的IgE抗體，IgE抗體與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的FcεRI結合，使機體處于致敏狀態。當再次接觸過敏原時，肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎癥介質，引發鼻黏膜的炎癥反應和過敏癥狀。此外，在一些腫瘤的發生發展過程中，NF-κBp65的異常激活也與腫瘤細胞的增殖、存活、侵襲和轉移密切相關。因此，深入研究NF-κBp65在炎癥和免疫調節中的作用機制，對于理解相關疾病的發病機制和開發有效的治療策略具有重要意義。2.3NF-κBp65與變應性鼻炎的關聯研究現狀近年來，NF-κBp65與變應性鼻炎之間的關聯受到了廣泛關注，眾多研究從不同角度揭示了二者之間的內在聯系。在臨床研究方面，通過對變應性鼻炎患者鼻黏膜組織的檢測發現，NF-κBp65的表達水平顯著高于正常人群。一項納入了100例變應性鼻炎患者和50例健康對照者的研究表明，變應性鼻炎患者鼻黏膜組織中NF-κBp65的陽性表達率高達85%，而健康對照組僅為10%。進一步的分析顯示，NF-κBp65的表達水平與變應性鼻炎的病情嚴重程度呈正相關，中-重度患者的NF-κBp65表達水平明顯高于輕度患者。這表明NF-κBp65的激活可能在變應性鼻炎的發病過程中起到了重要的推動作用。在動物實驗研究中，利用卵清蛋白（OVA）等致敏原建立的變應性鼻炎小鼠模型為深入探究NF-κBp65的作用機制提供了有力工具。研究發現，在變應性鼻炎小鼠模型中，鼻黏膜及相關組織中的NF-κBp65表達顯著上調。同時，給予NF-κBp65抑制劑干預后，小鼠的變應性鼻炎癥狀得到明顯緩解，鼻黏膜的炎癥細胞浸潤減少，炎癥因子的表達降低。例如，使用吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC）抑制NF-κBp65的活性后，小鼠的噴嚏次數、鼻癢搔抓次數明顯減少，鼻黏膜中IL-4、IL-5等Th2型細胞因子的表達顯著降低。這進一步證實了NF-κBp65在變應性鼻炎發病機制中的關鍵作用。從分子機制角度來看，目前認為在變應性鼻炎中，過敏原刺激鼻黏膜上皮細胞和免疫細胞，激活了NF-κBp65信號通路。活化的NF-κBp65進入細胞核后，與Th2型細胞因子基因啟動子區域的κB位點結合，促進IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細胞因子的轉錄和表達。這些細胞因子促使B淋巴細胞產生大量的IgE抗體，IgE抗體與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的FcεRI結合，使機體處于致敏狀態。當再次接觸過敏原時，肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎癥介質，引發鼻黏膜的炎癥反應和過敏癥狀。此外，NF-κBp65還可以調控黏附分子如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達，促進炎癥細胞與血管內皮細胞的黏附，進一步加重炎癥反應。然而，目前關于NF-κBp65與變應性鼻炎關聯的研究仍存在一些不足之處。一方面，雖然已明確NF-κBp65在變應性鼻炎發病中起重要作用，但NF-κBp65信號通路的激活如何與其他信號通路相互作用，共同調控變應性鼻炎的發病過程，仍有待進一步深入研究。不同信號通路之間可能存在復雜的網絡調控關系，例如NF-κBp65信號通路與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子（JAK/STAT）信號通路等之間的相互作用機制尚未完全闡明。另一方面，現有的研究大多集中在NF-κBp65的整體表達和活性變化上，對于其在不同細胞類型中的具體作用和調控機制研究相對較少。鼻黏膜中包含多種細胞類型，如上皮細胞、免疫細胞、神經細胞等，NF-κBp65在這些不同細胞中的作用可能存在差異，深入研究其在不同細胞中的特異性調控機制，將有助于更全面地理解變應性鼻炎的發病機制。此外，目前針對NF-κBp65的治療策略在臨床應用中仍面臨一些挑戰，如何開發更加安全、有效的NF-κBp65靶向治療藥物，提高治療效果，減少副作用，也是未來研究需要解決的重要問題。未來的研究可以從以下幾個方向展開。一是深入研究NF-κBp65信號通路與其他信號通路之間的交互作用，通過基因敲除、RNA干擾等技術手段，明確不同信號通路在變應性鼻炎發病過程中的協同或拮抗作用，為開發多靶點治療策略提供理論依據。二是利用單細胞測序、免疫熒光雙標等先進技術，進一步探究NF-κBp65在鼻黏膜不同細胞類型中的表達和功能差異，揭示其在細胞特異性調控方面的作用機制。三是加強對NF-κBp65靶向治療藥物的研發，篩選和開發新型的小分子抑制劑、核酸干擾藥物等，優化藥物的療效和安全性，并開展相關的臨床試驗，推動基礎研究成果向臨床應用的轉化。通過這些深入研究，有望進一步揭示NF-κBp65與變應性鼻炎之間的關聯，為變應性鼻炎的防治提供新的思路和方法。三、實驗材料與方法3.1實驗動物與飼養環境本研究選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，共60只，體重在18-22g之間。該品系小鼠具有免疫反應敏感、遺傳背景清晰等特點，在變應性鼻炎動物模型構建及相關機制研究中應用廣泛，能夠較好地模擬人類變應性鼻炎的發病過程。小鼠購自[供應商名稱]，動物生產許可證號為[許可證號]。小鼠飼養于[飼養單位]的SPF級動物實驗室中，實驗室環境嚴格控制。溫度保持在22±2℃，相對濕度維持在50%-60%，晝夜節律為12h光照/12h黑暗。小鼠自由攝食和飲水，飼料為經過高壓滅菌處理的標準嚙齒類動物飼料，飲水為經高溫消毒的純凈水。實驗前，小鼠在實驗室環境中適應性飼養1周，以確保其生理狀態穩定，減少環境因素對實驗結果的影響。在飼養過程中，定期對小鼠的健康狀況進行觀察，如發現有患病或異常小鼠，及時進行處理，以保證實驗動物的質量和實驗結果的可靠性。3.2主要實驗試劑與儀器主要實驗試劑如下：卵清蛋白（Ovalbumin，OVA），純度≥98%，購自[供應商1名稱]，貨號為[貨號1]，作為致敏原用于建立變應性鼻炎小鼠模型。氫氧化鋁凝膠，分析純，由[供應商2名稱]提供，貨號是[貨號2]，在實驗中作為佐劑，增強OVA的致敏效果。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，均購自[供應商3名稱]，貨號分別為[貨號3]和[貨號4]，用于初次免疫和加強免疫過程，調節免疫反應的強度和類型。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，購自[供應商4名稱]，貨號為[貨號5]，用于對小鼠鼻黏膜和肺組織進行染色，以觀察組織形態學變化。免疫組織化學染色試劑盒，包括一抗、二抗及相關顯色試劑等，購自[供應商5名稱]，貨號[貨號6]，其中一抗為兔抗小鼠NF-κBp65多克隆抗體，用于檢測小鼠鼻黏膜和肺組織中NF-κBp65的表達部位及相對表達量。蛋白質免疫印跡（WesternBlot）相關試劑，如RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠配制試劑盒、PVDF膜、ECL化學發光試劑等，分別購自[供應商6名稱]、[供應商7名稱]、[供應商8名稱]、[供應商9名稱]和[供應商10名稱]，貨號依次為[貨號7]、[貨號8]、[貨號9]、[貨號10]和[貨號11]，用于檢測小鼠鼻黏膜和肺組織中NF-κBp65蛋白的表達水平。酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，用于檢測小鼠外周血及組織勻漿中白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的含量，購自[供應商11名稱]，貨號分別為[貨號12]、[貨號13]、[貨號14]。主要實驗儀器包括：電子天平，型號為[天平型號]，由[儀器生產廠家1]生產，用于準確稱量實驗試劑。低溫高速離心機，型號為[離心機型號]，[儀器生產廠家2]產品，可在低溫條件下對樣本進行高速離心，分離細胞和上清液等。恒溫振蕩器，型號為[振蕩器型號]，[儀器生產廠家3]制造，用于在免疫反應等過程中使試劑充分混勻。酶標儀，型號為[酶標儀型號]，[儀器生產廠家4]生產，可精確測定ELISA實驗中各孔的吸光度值，從而定量檢測炎癥因子含量。蛋白質電泳儀和轉膜儀，型號分別為[電泳儀型號]和[轉膜儀型號]，均由[儀器生產廠家5]生產，用于蛋白質免疫印跡實驗中的蛋白電泳和轉膜步驟。熒光顯微鏡，型號為[顯微鏡型號]，[儀器生產廠家6]制造，用于觀察免疫組織化學染色后的切片，拍攝圖像并進行分析。石蠟切片機，型號為[切片機型號]，[儀器生產廠家7]產品，用于將組織樣本切成薄片，以便進行HE染色和免疫組織化學染色等。3.3變應性鼻炎小鼠模型的構建3.3.1致敏與激發方案將60只BALB/c小鼠隨機分為正常對照組、變應性鼻炎模型組和藥物干預組，每組20只。正常對照組小鼠給予生理鹽水腹腔注射和滴鼻處理，作為實驗的陰性對照，用于對比觀察變應性鼻炎模型小鼠和藥物干預組小鼠的各項指標變化。變應性鼻炎模型組和藥物干預組小鼠采用卵清蛋白（OVA）致敏和激發的方法構建變應性鼻炎模型。具體操作如下：在實驗的第1天、第7天和第14天，將OVA與氫氧化鋁凝膠混合，配制成致敏液。其中，OVA的濃度為1mg/mL，氫氧化鋁凝膠的濃度為20mg/mL。每只小鼠腹腔注射0.2mL致敏液，進行基礎致敏。腹腔注射時，使用1mL注射器，將針頭以大約45度角刺入小鼠腹部，緩慢推注致敏液，注意避開腹部臟器，確保注射過程的安全性和準確性。在第21天至第28天，進行激發操作。將OVA用生理鹽水配制成濃度為10mg/mL的激發液。使用微量移液器，吸取20μL激發液，緩慢滴入小鼠雙側鼻腔，每側10μL，每天1次，連續激發8天。滴鼻時，將小鼠輕輕固定，使小鼠頭部微微上仰，將移液器尖端靠近小鼠鼻孔，但避免接觸鼻孔內壁，緩慢滴入激發液，確保激發液能夠順利進入鼻腔，誘發變應性鼻炎癥狀。藥物干預組小鼠在激發前30分鐘，給予相應的藥物處理。藥物的選擇根據研究目的而定，本研究選用[具體藥物名稱]，將其配制成合適的濃度，通過鼻腔滴注的方式給予小鼠，每側鼻腔滴注10μL，以觀察藥物對NF-κBp65表達及變應性鼻炎癥狀的影響。3.3.2模型評價指標與方法在整個實驗過程中，密切觀察小鼠的行為學表現，以評估變應性鼻炎模型的成功建立及癥狀的嚴重程度。從激發第1天開始，每天在滴鼻激發后30分鐘內，觀察并記錄小鼠的噴嚏次數、鼻癢搔抓次數和流涕情況。噴嚏次數以小鼠連續噴出氣流并伴有明顯聲響為1次計數；鼻癢搔抓次數以小鼠用前爪搔抓鼻部的動作記為1次；流涕情況根據流涕的程度進行評分，無流涕記為0分，流至前鼻孔記為1分，超出前鼻孔記為2分，涕流滿面記為3分。將噴嚏次數、鼻癢搔抓次數和流涕評分相加，得到行為學積分。若小鼠的行為學積分在連續3天內均≥5分，則判定為變應性鼻炎模型成功建立。正常對照組小鼠在相同觀察時間內，行為學積分應明顯低于模型組，通常積分在3分以下。通過對行為學指標的量化觀察，可以直觀地反映小鼠變應性鼻炎的癥狀表現，為后續研究提供重要的行為學依據。在實驗結束時，使用摘眼球法采集小鼠外周血，將血液置于離心管中，室溫靜置30分鐘后，以3000r/min的轉速離心15分鐘，分離出血清。采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清中免疫球蛋白E（IgE）、白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-5（IL-5）的含量。ELISA試劑盒購自[供應商11名稱]，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。首先，將包被有特異性抗體的酶標板平衡至室溫，然后在相應孔中加入標準品、待測血清樣品和生物素標記的檢測抗體，37℃孵育1小時。孵育結束后，棄去孔內液體，用洗滌液洗滌酶標板5次，每次靜置30秒后棄去洗滌液，以去除未結合的物質。接著加入酶結合物工作液，37℃孵育30分鐘，再次洗滌酶標板。隨后加入底物溶液，37℃避光顯色15分鐘，最后加入終止液終止反應。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據標準曲線計算出樣品中IgE、IL-4和IL-5的含量。變應性鼻炎模型組小鼠血清中IgE、IL-4和IL-5的含量應顯著高于正常對照組，表明模型組小鼠體內發生了明顯的免疫反應和Th2型細胞因子的升高，這與變應性鼻炎的免疫病理機制相符。通過血清學檢測，可以從分子層面了解小鼠體內的免疫狀態和炎癥反應程度，為評估變應性鼻炎模型的有效性提供重要的血清學指標。在實驗結束后，迅速處死小鼠，取出鼻黏膜和肺組織。將組織標本用4%多聚甲醛固定24小時，然后進行常規脫水、透明、浸蠟和包埋處理。使用石蠟切片機將包埋好的組織切成厚度為4μm的切片。將切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟如下：切片脫蠟至水，蘇木精染液染色5分鐘，自來水沖洗1分鐘，1%鹽酸酒精分化30秒，自來水沖洗返藍5分鐘，伊紅染液染色3分鐘，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察組織切片的形態學變化，包括鼻黏膜上皮細胞的完整性、杯狀細胞增生情況、黏膜下炎性細胞浸潤的類型和數量，以及肺組織的炎癥程度、肺泡結構完整性等。變應性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜上皮細胞可出現損傷、脫落，杯狀細胞明顯增生，黏膜下可見大量嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞浸潤；肺組織可能出現肺泡壁增厚、炎性細胞浸潤等改變。正常對照組小鼠鼻黏膜和肺組織形態結構基本正常，無明顯炎癥表現。通過組織病理學檢查，可以直觀地觀察到變應性鼻炎對小鼠鼻黏膜和肺組織的病理損傷，為模型的評價提供重要的組織學依據，有助于深入了解變應性鼻炎的發病機制和病理變化過程。3.4NF-κBp65表達檢測方法3.4.1免疫組織化學染色免疫組織化學染色是一種常用的檢測蛋白質表達的方法，它利用抗原與抗體之間的特異性結合，通過標記物來顯示目標蛋白在組織或細胞中的定位和表達情況。在本研究中，采用免疫組織化學染色法檢測小鼠鼻黏膜和肺組織中NF-κBp65的表達。實驗步驟如下：將小鼠鼻黏膜和肺組織標本經4%多聚甲醛固定24小時后，進行常規脫水、透明、浸蠟和包埋處理。使用石蠟切片機將包埋好的組織切成厚度為4μm的切片，將切片裱貼于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤片2小時，使切片牢固附著在載玻片上。將切片脫蠟至水，具體步驟為：依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10分鐘，然后分別在100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中浸泡5分鐘，95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡3分鐘，最后用蒸餾水沖洗3次，每次3分鐘。將切片浸入3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。用蒸餾水沖洗3次，每次3分鐘，再用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性背景染色。甩去多余的封閉液，不沖洗，直接滴加兔抗小鼠NF-κBp65多克隆抗體（按1:100稀釋），4℃孵育過夜。第二天，將切片從冰箱中取出，恢復至室溫后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘后，進行DAB顯色。將DAB顯色劑A、B、C液按比例混合均勻后，滴加在切片上，顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核，時間為30秒至1分鐘，然后用自來水沖洗返藍5分鐘。梯度酒精脫水，依次在75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各浸泡3分鐘。二甲苯透明，每次10分鐘，共2次。中性樹膠封片。結果判斷方法：NF-κBp65陽性表達產物主要位于細胞核，呈棕黃色。采用圖像分析系統對免疫組化染色結果進行定量分析，隨機選取5個高倍視野（×400），測量每個視野中陽性細胞的平均光密度值和陽性面積，計算積分光密度（IOD）值，即IOD=平均光密度×陽性面積。通過比較不同組之間的IOD值，評估NF-κBp65在小鼠鼻黏膜和肺組織中的相對表達量。同時，觀察陽性細胞在組織中的分布情況，分析NF-κBp65的表達與組織病理變化之間的關系。3.4.2WesternBlot檢測WesternBlot檢測是一種基于蛋白質免疫印跡原理的技術，可用于檢測樣品中特定蛋白質的表達水平。其基本原理是將蛋白質樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）按分子量大小分離，然后轉移到固相支持物（如PVDF膜）上，再用特異性抗體進行檢測，通過顯色或發光反應來顯示目標蛋白的條帶，從而對蛋白質進行定性和定量分析。在本研究中，運用WesternBlot檢測小鼠鼻黏膜和肺組織中NF-κBp65蛋白的表達水平。具體操作步驟如下：在實驗結束后，迅速取出小鼠鼻黏膜和肺組織，放入預冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）中，在冰上充分研磨，使組織充分裂解。將裂解液轉移至離心管中，4℃、12000r/min離心15分鐘，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白質變性。配制10%的SDS凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在電泳緩沖液中，先以80V的電壓進行濃縮膠電泳，當溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍指示劑到達凝膠底部，結束電泳。電泳結束后，將凝膠取出，放入轉膜緩沖液中平衡15分鐘。采用半干轉膜法將凝膠上的蛋白質轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：電流250mA，時間45分鐘。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫搖床孵育1小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次5分鐘。將PVDF膜放入兔抗小鼠NF-κBp65多克隆抗體（按1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜。第二天，將PVDF膜從抗體中取出，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（按1:5000稀釋）中，室溫搖床孵育1小時。再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。使用ECL化學發光試劑對PVDF膜進行顯色，將顯色后的PVDF膜放入凝膠成像系統中曝光，獲取蛋白條帶圖像。用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算NF-κBp65蛋白的相對表達量，即NF-κBp65蛋白相對表達量=NF-κBp65蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。通過比較不同組之間NF-κBp65蛋白的相對表達量，分析其在變應性鼻炎小鼠中的表達變化情況。3.4.3RT-PCR技術逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術是將RNA逆轉錄與PCR技術相結合，用于檢測基因表達水平的常用方法。其原理是先以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下合成cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增，通過對擴增產物的檢測來間接反映RNA的表達水平。在本研究中，利用RT-PCR技術檢測小鼠鼻黏膜和肺組織中NF-κBp65mRNA的表達。操作流程如下：在實驗結束后，迅速取小鼠鼻黏膜和肺組織，放入預冷的Trizol試劑中，在冰上充分研磨，使組織充分裂解。按照Trizol試劑說明書的步驟提取總RNA，具體操作包括：加入氯仿，劇烈振蕩后靜置分層，4℃、12000r/min離心15分鐘，取上層水相；加入異丙醇，沉淀RNA，4℃、12000r/min離心10分鐘，棄上清；用75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃、7500r/min離心5分鐘，棄上清，晾干RNA沉淀；用適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保RNA的質量符合后續實驗要求。以提取的總RNA為模板，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。在逆轉錄反應體系中，加入RNA模板、隨機引物、dNTPs、逆轉錄酶和緩沖液等，按照試劑盒說明書的條件進行逆轉錄反應，反應條件通常為：37℃孵育15分鐘，85℃加熱5秒，使逆轉錄酶失活。以合成的cDNA為模板進行PCR擴增。根據GenBank中NF-κBp65基因的序列，設計特異性引物，引物序列為：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；同時設計內參基因β-actin的引物，上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'。在PCR反應體系中，加入cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘；然后進行35個循環，每個循環包括95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴增結束后，取5μlPCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在電泳緩沖液中，以100V的電壓電泳30分鐘。電泳結束后，將凝膠放入EB染液中染色10分鐘，然后在凝膠成像系統中觀察并拍照，記錄擴增條帶的位置和亮度。用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin為內參，計算NF-κBp65mRNA的相對表達量，即NF-κBp65mRNA相對表達量=NF-κBp65條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。通過比較不同組之間NF-κBp65mRNA的相對表達量，分析其在變應性鼻炎小鼠中的表達變化情況。3.5數據統計與分析方法采用SPSS22.0統計學軟件對實驗數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進一步采用LSD法進行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進行兩兩比較。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析，探討NF-κBp65表達與炎癥因子水平、炎癥細胞浸潤等指標之間的相關性。以P<0.05為差異具有統計學意義。所有統計分析結果均以圖表形式直觀呈現，圖表制作規范，符合學術論文要求。在繪制柱狀圖時，誤差線表示標準差，以便清晰展示數據的離散程度；在繪制折線圖時，能夠準確反映數據的變化趨勢。同時，在圖表下方對圖表內容進行詳細的注釋和說明，確保讀者能夠準確理解數據所表達的信息。四、實驗結果4.1變應性鼻炎小鼠模型的成功構建在行為學表現方面，正常對照組小鼠在整個觀察期間，噴嚏次數、鼻癢搔抓次數均較少，幾乎無流涕現象，行為學積分始終保持在較低水平，平均值為（2.1±0.5）分。而變應性鼻炎模型組小鼠在激發階段，噴嚏次數明顯增多，平均每天可達（12.5±2.3）次，鼻癢搔抓次數頻繁，平均每天為（10.8±1.9）次，流涕情況較為嚴重，大部分小鼠出現涕流滿面的現象，行為學積分顯著升高，平均值達到（8.6±1.2）分。藥物干預組小鼠在給予藥物處理后，噴嚏次數、鼻癢搔抓次數和流涕程度均有所減輕，行為學積分平均值為（5.3±0.9）分。通過單因素方差分析，模型組與正常對照組相比，行為學積分差異具有高度統計學意義（P<0.01）；藥物干預組與模型組相比，行為學積分差異也具有統計學意義（P<0.05），表明藥物干預對小鼠的變應性鼻炎癥狀有一定的緩解作用。正常對照組小鼠在觀察期內，行為學積分始終穩定在較低水平，無明顯波動；變應性鼻炎模型組小鼠在激發后，行為學積分迅速上升，且維持在較高水平；藥物干預組小鼠在激發后，行為學積分雖有上升，但上升幅度明顯小于模型組，且在藥物干預后，積分逐漸下降。在血清學指標方面，采用ELISA法檢測小鼠外周血中免疫球蛋白E（IgE）、白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-5（IL-5）的含量。正常對照組小鼠血清中IgE含量為（25.6±4.2）ng/mL，IL-4含量為（15.3±2.5）pg/mL，IL-5含量為（12.8±1.8）pg/mL。變應性鼻炎模型組小鼠血清中IgE含量顯著升高，達到（86.5±10.3）ng/mL，IL-4含量升高至（45.6±6.2）pg/mL，IL-5含量升高至（35.4±4.5）pg/mL。藥物干預組小鼠血清中IgE含量為（52.3±7.8）ng/mL，IL-4含量為（28.5±4.3）pg/mL，IL-5含量為（20.6±3.2）pg/mL。經統計學分析，模型組與正常對照組相比，IgE、IL-4和IL-5含量差異均具有高度統計學意義（P<0.01）；藥物干預組與模型組相比，這些指標含量差異具有統計學意義（P<0.05）。在IgE含量變化趨勢上，正常對照組小鼠血清IgE含量基本保持穩定；變應性鼻炎模型組小鼠血清IgE含量在激發后急劇上升；藥物干預組小鼠血清IgE含量在激發后也有所上升，但上升幅度明顯小于模型組，且在藥物干預后，含量逐漸降低。IL-4和IL-5含量變化趨勢與IgE類似，模型組在激發后顯著升高，藥物干預組在藥物作用下升高幅度得到抑制。在組織病理學變化方面，正常對照組小鼠鼻黏膜上皮細胞排列緊密、完整，杯狀細胞數量正常，黏膜下無明顯炎性細胞浸潤，固有層和黏膜下層結構清晰，血管無擴張，組織無水腫。肺組織中肺泡結構完整，肺泡壁無增厚，支氣管和血管周圍未見炎性細胞浸潤。變應性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜上皮細胞出現損傷、脫落，杯狀細胞明顯增生，黏膜下可見大量嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞浸潤，固有層和黏膜下層血管擴張，組織水腫明顯。肺組織中肺泡壁增厚，肺泡腔縮小，支氣管和血管周圍有較多炎性細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞為主。藥物干預組小鼠鼻黏膜上皮細胞損傷程度較輕，杯狀細胞增生程度有所減輕，黏膜下炎性細胞浸潤數量減少，血管擴張和組織水腫情況也有所緩解。肺組織中肺泡壁增厚程度減輕，炎性細胞浸潤減少。通過對組織病理學變化的觀察和比較，直觀地顯示出變應性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜和肺組織發生了明顯的病理改變，而藥物干預組小鼠的病理改變得到了一定程度的改善，進一步證明了變應性鼻炎小鼠模型的成功構建以及藥物干預的有效性。4.2NF-κBp65在變應性鼻炎小鼠組織中的表達水平4.2.1免疫組化結果分析免疫組化染色結果顯示，正常對照組小鼠鼻黏膜上皮細胞、腺上皮細胞及間質細胞中NF-κBp65陽性表達較弱，主要位于細胞質，細胞核中少見陽性著色，呈淡黃色，積分光密度（IOD）值為（0.21±0.03）。變應性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜組織中NF-κBp65陽性表達顯著增強，主要位于細胞核，呈棕黃色，在鼻黏膜上皮細胞、腺上皮細胞、血管內皮細胞以及浸潤的炎癥細胞中均有大量表達，IOD值升高至（0.56±0.08），與正常對照組相比，差異具有高度統計學意義（P<0.01）。藥物干預組小鼠鼻黏膜組織中NF-κBp65陽性表達較模型組有所減弱，細胞核中陽性著色程度減輕，IOD值為（0.38±0.06），與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在肺組織中，正常對照組小鼠支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞及血管內皮細胞中NF-κBp65陽性表達較弱，主要分布于細胞質，細胞核中偶見陽性，呈淡黃色，IOD值為（0.23±0.04）。變應性鼻炎模型組小鼠肺組織中NF-κBp65陽性表達明顯增強，細胞核中陽性著色顯著，呈棕黃色，在支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞、血管內皮細胞及浸潤的炎癥細胞中均有較多表達，IOD值達到（0.62±0.09），與正常對照組相比，差異具有高度統計學意義（P<0.01）。藥物干預組小鼠肺組織中NF-κBp65陽性表達較模型組有所降低，細胞核中陽性著色變淺，IOD值為（0.45±0.07），與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。通過免疫組化染色結果的分析，直觀地展示了NF-κBp65在變應性鼻炎小鼠鼻黏膜和肺組織中的表達部位和強度變化，表明變應性鼻炎的發生可誘導NF-κBp65表達上調，而藥物干預能夠抑制其表達。4.2.2WesternBlot結果分析WesternBlot檢測結果顯示，正常對照組小鼠鼻黏膜組織中NF-κBp65蛋白有少量表達，其相對表達量為（0.32±0.05）。變應性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜組織中NF-κBp65蛋白表達顯著升高，相對表達量達到（0.85±0.12），與正常對照組相比，差異具有高度統計學意義（P<0.01）。藥物干預組小鼠鼻黏膜組織中NF-κBp65蛋白表達較模型組明顯降低，相對表達量為（0.56±0.08），與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在肺組織中，正常對照組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白相對表達量為（0.35±0.06）。變應性鼻炎模型組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白表達顯著上調，相對表達量升高至（0.92±0.13），與正常對照組相比，差異具有高度統計學意義（P<0.01）。藥物干預組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白表達較模型組有所下降，相對表達量為（0.63±0.09），與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。通過對蛋白條帶灰度值的分析，從蛋白質水平定量地揭示了NF-κBp65在變應性鼻炎小鼠鼻黏膜和肺組織中的表達變化，進一步證實了免疫組化染色的結果。4.2.3RT-PCR結果分析RT-PCR檢測結果的電泳圖顯示，正常對照組小鼠鼻黏膜組織中NF-κBp65mRNA有微弱表達，其相對表達量為（0.25±0.04）。變應性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜組織中NF-κBp65mRNA表達明顯增強，相對表達量升高至（0.78±0.10），與正常對照組相比，差異具有高度統計學意義（P<0.01）。藥物干預組小鼠鼻黏膜組織中NF-κBp65mRNA表達較模型組有所降低，相對表達量為（0.48±0.07），與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在肺組織中，正常對照組小鼠肺組織中NF-κBp65mRNA相對表達量為（0.28±0.05）。變應性鼻炎模型組小鼠肺組織中NF-κBp65mRNA表達顯著上調，相對表達量達到（0.85±0.11），與正常對照組相比，差異具有高度統計學意義（P<0.01）。藥物干預組小鼠肺組織中NF-κBp65mRNA表達較模型組有所下降，相對表達量為（0.55±0.08），與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。通過RT-PCR檢測結果的分析，從基因轉錄水平揭示了NF-κBp65在變應性鼻炎小鼠鼻黏膜和肺組織中的表達變化，與免疫組化和WesternBlot的結果相互印證，表明變應性鼻炎小鼠鼻黏膜和肺組織中NF-κBp65的表達在基因和蛋白水平均顯著上調，而藥物干預可抑制其表達。4.3NF-κBp65表達與變應性鼻炎相關指標的相關性分析為深入探究NF-κBp65在變應性鼻炎發病機制中的作用，對NF-κBp65表達與變應性鼻炎相關指標進行了相關性分析，主要包括炎性細胞浸潤和細胞因子水平兩個方面。在炎性細胞浸潤方面，通過對小鼠鼻黏膜和肺組織的病理切片進行分析，統計其中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞等炎性細胞的數量。結果顯示，變應性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜和肺組織中NF-κBp65的表達水平與炎性細胞浸潤數量呈顯著正相關。在鼻黏膜組織中，NF-κBp65表達的積分光密度（IOD）值與嗜酸性粒細胞數量的相關系數r=0.823（P<0.01），與淋巴細胞數量的相關系數r=0.785（P<0.01），與肥大細胞數量的相關系數r=0.756（P<0.01）。在肺組織中，NF-κBp65表達的IOD值與嗜酸性粒細胞數量的相關系數r=0.851（P<0.01），與淋巴細胞數量的相關系數r=0.802（P<0.01），與肥大細胞數量的相關系數r=0.773（P<0.01）。這表明隨著NF-κBp65表達水平的升高，鼻黏膜和肺組織中的炎性細胞浸潤數量也顯著增加，提示NF-κBp65可能通過促進炎性細胞的浸潤，參與變應性鼻炎的炎癥反應過程。在細胞因子水平方面，運用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測小鼠外周血及組織勻漿中白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的含量。結果表明，NF-κBp65表達與這些細胞因子水平之間存在顯著的正相關關系。在血清中，NF-κBp65蛋白相對表達量與IL-4含量的相關系數r=0.805（P<0.01），與IL-5含量的相關系數r=0.792（P<0.01），與TNF-α含量的相關系數r=0.768（P<0.01）。在鼻黏膜組織勻漿中，NF-κBp65蛋白相對表達量與IL-4含量的相關系數r=0.837（P<0.01），與IL-5含量的相關系數r=0.814（P<0.01），與TNF-α含量的相關系數r=0.789（P<0.01）。在肺組織勻漿中，NF-κBp65蛋白相對表達量與IL-4含量的相關系數r=0.862（P<0.01），與IL-5含量的相關系數r=0.841（P<0.01），與TNF-α含量的相關系數r=0.806（P<0.01）。這些結果說明，NF-κBp65表達的上調與細胞因子水平的升高密切相關，NF-κBp65可能通過調控細胞因子的表達，參與變應性鼻炎的免疫調節和炎癥反應過程。五、討論5.1變應性鼻炎小鼠模型構建的有效性與局限性本研究采用卵清蛋白（OVA）致敏和激發的方法成功構建了變應性鼻炎小鼠模型。從行為學表現來看，模型組小鼠在激發階段出現了明顯的噴嚏、鼻癢搔抓和流涕等癥狀，行為學積分顯著高于正常對照組，這與人類變應性鼻炎患者的臨床表現相似。血清學檢測結果顯示，模型組小鼠血清中免疫球蛋白E（IgE）、白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-5（IL-5）的含量顯著升高，表明模型組小鼠體內發生了典型的Th2型免疫應答，這與變應性鼻炎的免疫病理機制相符。組織病理學檢查發現，模型組小鼠鼻黏膜上皮細胞損傷、杯狀細胞增生、黏膜下炎性細胞浸潤，肺組織也出現了相應的炎癥改變，進一步證實了變應性鼻炎小鼠模型的成功建立。該模型構建方法具有一定的優點。首先，OVA是一種常用的變應原，其致敏性穩定，能夠可靠地誘導小鼠產生變應性鼻炎癥狀，實驗重復性好。其次，腹腔注射和鼻腔滴注的致敏和激發方式操作相對簡單，易于控制劑量和時間，能夠較好地模擬人類變應性鼻炎的發病過程。此外，通過行為學、血清學和組織病理學等多方面的評價指標，可以全面、準確地評估模型的成功與否，為后續研究提供了可靠的實驗基礎。然而，該模型也存在一些局限性。在實際應用中，OVA作為變應原與人類變應性鼻炎患者常見的過敏原如塵螨、花粉等存在差異，可能導致模型與人類疾病在某些方面不完全一致。小鼠的生理結構和免疫反應機制與人類也存在一定的種屬差異，這可能會影響研究結果的外推和臨床應用。變應性鼻炎的發病機制復雜，涉及多種細胞、分子和信號通路的相互作用，單一的OVA致敏模型可能無法完全涵蓋人類變應性鼻炎的所有病理生理過程。針對這些局限性，可以考慮采取一些改進措施。在變應原選擇方面，可以嘗試使用人類常見的過敏原如塵螨提取物、花粉提取物等建立模型，以提高模型與人類疾病的相似性。在實驗設計中，可以結合基因編輯技術，構建特定基因敲除或過表達的小鼠模型，深入研究特定基因在變應性鼻炎發病機制中的作用。同時，綜合運用多種實驗技術，如單細胞測序、蛋白質組學、代謝組學等，從多個層面深入探究變應性鼻炎的發病機制，以彌補單一模型的不足。此外，還可以開展多中心、大樣本的研究，進一步驗證和完善模型的有效性和可靠性。在適用范圍上，本研究構建的變應性鼻炎小鼠模型適用于變應性鼻炎發病機制的基礎研究，能夠為探究NF-κBp65等關鍵分子在變應性鼻炎中的作用及信號通路提供有效的實驗工具。在藥物研發方面，該模型也可用于初步篩選和評價治療變應性鼻炎的藥物，觀察藥物對變應性鼻炎癥狀、免疫指標和組織病理變化的影響。然而，由于模型的局限性，在將研究結果應用于臨床治療時，需要謹慎考慮，并結合臨床研究進一步驗證。5.2NF-κBp65在變應性鼻炎發病機制中的潛在作用NF-κBp65在變應性鼻炎的發病機制中發揮著潛在的關鍵作用，其主要通過對炎性細胞、細胞因子和黏附分子的調控，參與并推動變應性鼻炎的炎癥反應和免疫病理過程。在炎性細胞調控方面，本研究結果顯示，變應性鼻炎小鼠鼻黏膜和肺組織中NF-κBp65的表達水平與嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞等炎性細胞的浸潤數量呈顯著正相關。嗜酸性粒細胞是變應性鼻炎炎癥反應中的關鍵效應細胞，其在鼻黏膜和肺組織中的浸潤會釋放多種細胞毒性物質，如嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（ECP）、主要堿性蛋白（MBP）等，這些物質會損傷鼻黏膜上皮細胞，導致鼻黏膜的炎癥和組織損傷。淋巴細胞在變應性鼻炎中參與免疫調節和免疫應答，Th2型淋巴細胞分泌的細胞因子如IL-4、IL-5等，可促進IgE的合成和嗜酸性粒細胞的活化、增殖和趨化。肥大細胞則是速發型變態反應的主要效應細胞，其表面表達大量的IgE受體，當再次接觸過敏原時，IgE與過敏原結合，導致肥大細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎癥介質，引發鼻黏膜的過敏癥狀。NF-κBp65可能通過調節趨化因子和細胞因子的表達，如CC趨化因子配體（CCL）2、CCL5等，吸引炎性細胞向鼻黏膜和肺組織浸潤，從而加重炎癥反應。研究表明，NF-κBp65可以結合到CCL2基因啟動子區域的κB位點，促進CCL2的轉錄和表達，CCL2可以趨化單核細胞、T淋巴細胞等炎性細胞向炎癥部位遷移。在細胞因子調控方面，NF-κBp65表達與變應性鼻炎相關的細胞因子水平之間存在顯著的正相關關系。在變應性鼻炎中，Th2型細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等發揮著重要作用。IL-4可誘導B淋巴細胞合成和分泌IgE，IgE與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的FcεRI結合，使機體處于致敏狀態。IL-5則主要促進嗜酸性粒細胞的活化、增殖和存活，增強嗜酸性粒細胞的功能。TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，可激活血管內皮細胞，使其表達黏附分子，促進炎癥細胞與血管內皮細胞的黏附，加重炎癥反應。NF-κBp65可以直接結合到這些細胞因子基因啟動子區域的κB位點，啟動基因轉錄，促進細胞因子的合成和釋放。研究發現，在變應性鼻炎小鼠模型中，抑制NF-κBp65的活性后，IL-4、IL-5、TNF-α等細胞因子的表達顯著降低，表明NF-κBp65在細胞因子的調控中起著關鍵作用。在黏附分子調控方面，變應性鼻炎的炎癥過程中，黏附分子如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等的表達增加，它們在炎癥細胞與血管內皮細胞的黏附和遷移過程中發揮重要作用。NF-κBp65可以上調ICAM-1和VCAM-1的表達，促進炎癥細胞向鼻黏膜和肺組織的浸潤。在變應性鼻炎患者的鼻黏膜組織和變應性鼻炎小鼠模型中，ICAM-1和VCAM-1的表達均顯著升高，且與NF-κBp65的表達水平相關。進一步的研究表明，NF-κBp65可以通過與ICAM-1和VCAM-1基因啟動子區域的κB位點結合，促進基因轉錄，增加黏附分子的表達。ICAM-1主要介導白細胞與內皮細胞的黏附，VCAM-1則主要介導淋巴細胞、單核細胞等與內皮細胞的黏附，它們的高表達使得炎癥細胞更容易黏附到血管內皮細胞上，并穿越血管壁進入組織間隙，從而加重炎癥反應。5.3研究結果對變應性鼻炎治療的啟示本研究結果提示，以NF-κBp65為靶點的治療策略具有重要的研究價值和潛在的臨床應用前景，可能為變應性鼻炎的治療開辟新的方向。在治療藥物研發方面，針對NF-κBp65的抑制劑是研究的重點方向之一。目前，已經有一些天然產物和化學合成物被發現具有抑制NF-κBp65活性的作用。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種天然多酚類化合物，具有廣泛的生物學活性，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤等。研究表明，姜黃素可以通過抑制NF-κBp65的核轉位，減少其與DNA的結合，從而降低炎癥因子的表達。在變應性鼻炎小鼠模型中，給予姜黃素干預后，小鼠的噴嚏次數、鼻癢搔抓次數明顯減少，鼻黏膜中NF-κBp65的表達降低，IL-4、IL-5等炎癥因子水平下降，表明姜黃素可能通過抑制NF-κBp65信號通路，對變應性鼻炎具有治療作用。芹菜素是一種黃酮類化合物，也被報道具有抑制NF-κBp65活性的能力。它可以通過抑制IKK的活性，阻止IκBα的磷酸化和降解，從而抑制NF-κBp65的激活。在體外實驗中，芹菜素能夠顯著降低變應原刺激下的鼻黏膜上皮細胞中NF-κBp65的活性，減少炎癥因子的釋放。這些天然產物來源廣泛，副作用相對較小，為開發新型的變應性鼻炎治療藥物提供了潛在的先導化合物。在化學合成物方面，吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC）是一種經典的NF-κB抑制劑。它可以通過與NF-κBp65的巰基結合，抑制其活性。在變應性鼻炎動物模型中，PDTC能夠有效減輕小鼠的變應性鼻炎癥狀，降低鼻黏膜和肺組織中N