miR-148a靶向MMP-13抑制三陰性乳腺癌細胞侵襲的分子機制與治療潛力一、引言1.1研究背景乳腺癌是全球范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的生命健康。在乳腺癌的眾多亞型中，三陰性乳腺癌（TripleNegativeBreastCancer,TNBC）由于其獨特的生物學特性，成為了乳腺癌研究和治療領域的一大挑戰。TNBC指的是雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）以及人表皮生長因子受體2（HER2）均為陰性的乳腺癌。這一類型的乳腺癌約占全部乳腺癌病例的15%，雖然比例相對不高，但卻具有極高的侵襲性和較差的預后，患者的5年生存率明顯低于其他類型的乳腺癌，僅約為10%-15%。TNBC對傳統的內分泌治療和靶向HER2治療均不敏感，這使得治療手段相對局限，主要依賴于化療。然而，化療的副作用較大，且部分患者容易出現耐藥性，導致治療效果不佳，復發和轉移風險較高。由于TNBC涉及多種基因突變或表觀遺傳改變，如BRCA1/2基因突變、PIK3CA基因突變等，這些變異導致細胞增殖、凋亡調控失衡，進一步增加了治療的難度。因此，深入研究TNBC的發病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于改善TNBC患者的預后具有至關重要的意義。在腫瘤研究領域，MicroRNA（miRNA）和基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）逐漸成為了研究的熱點。miRNA是一類長度約19-25個核苷酸的非編碼RNA，雖然不編碼蛋白質，但卻能通過與靶基因的3'-非翻譯區（3'-UTR）完全或不完全配對結合，在轉錄后水平調控基因的表達，進而參與調控腫瘤的發生發展、細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等多種生物學過程。據估計，miRNA能調節人類近1/3的基因，一個基因往往受到數個甚至數百個miRNA的調控，這種復雜的調節網絡在腫瘤的發展過程中起著關鍵作用。大量研究表明，miRNA在腫瘤中呈現出異常表達，一些miRNA發揮著癌基因的作用，促進腫瘤的生長和轉移；而另一些則作為抑癌基因，抑制腫瘤的發展。因此，miRNA不僅有望成為腫瘤診斷和預后評估的生物標志物，還可能成為腫瘤治療的新靶點。MMP-13是基質金屬蛋白酶家族中的重要成員，是一種鋅離子依賴的內肽酶，在腫瘤細胞侵襲和轉移過程中扮演著不可或缺的角色。MMP-13能夠降解細胞外基質（ECM）的主要成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等，破壞細胞與細胞外基質之間的相互作用，從而為腫瘤細胞的遷移和侵襲創造條件。MMP-13還可以通過調節細胞信號通路，促進腫瘤血管生成和上皮-間質轉化（EMT），進一步增強腫瘤的侵襲和轉移能力。研究發現，在多種腫瘤中，包括乳腺癌，MMP-13的表達水平與腫瘤的分期、淋巴結轉移狀態以及患者的預后密切相關。例如，在浸潤性乳腺癌中，MMP-13的表達與臨床TNM分期、淋巴結轉移狀態、組織學分級密切相關，MMP-13高表達組患者的5年和10年生存率均低于低表達組。在三陰性乳腺癌的研究中，MicroRNA-148a（miR-148a）與MMP-13之間的關系逐漸受到關注。miR-148a是miR-148/152家族成員之一，近年來越來越多的研究表明，miR-148/152家族成員在惡性腫瘤的發生發展中發揮極其重要的作用，在多數惡性腫瘤中，miR-148/152家族成員發揮抑癌作用。已有研究發現，在乳腺癌組織中，miR-148a的表達水平較正常乳腺組織降低，提示其可能在乳腺癌的發生發展中起到抑制作用。生物信息學預測顯示，MMP-13可能是miR-148a的潛在靶基因，但目前關于miR-148a是否通過靶向MMP-13來抑制三陰性乳腺癌細胞的侵襲，以及其中具體的分子機制，仍有待進一步深入研究。本研究聚焦于miR-148a與MMP-13之間的靶向關系，旨在探討miR-148a是否能夠通過靶向MMP-13抑制三陰性乳腺癌細胞的侵襲。通過深入研究這一作用機制，不僅可以進一步揭示三陰性乳腺癌的發病機制，為TNBC的治療提供新的理論依據，還可能為開發新的治療靶點和策略提供方向，具有重要的理論和臨床意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究miR-148a靶向MMP-13抑制三陰性乳腺癌細胞侵襲的分子機制。通過生物信息學分析、細胞實驗和分子生物學技術，驗證miR-148a與MMP-13之間的靶向關系，明確miR-148a對三陰性乳腺癌細胞侵襲能力的影響，并揭示其潛在的信號通路。具體而言，我們將利用生物信息學工具預測miR-148a與MMP-13的結合位點，通過熒光素酶報告基因實驗、qRT-PCR和Westernblot等方法驗證兩者的靶向關系。進一步通過細胞侵襲實驗、遷移實驗等檢測miR-148a過表達或敲低對三陰性乳腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，同時觀察MMP-13表達變化對細胞表型的作用。通過研究，期望明確miR-148a調控三陰性乳腺癌細胞侵襲的分子機制，為三陰性乳腺癌的治療提供新的理論依據。本研究的意義重大，在理論層面，有助于深化對三陰性乳腺癌發病機制的認識。目前，雖然對三陰性乳腺癌的分子特征有了一定了解，但對于其侵襲和轉移的具體分子機制仍未完全明確。探究miR-148a與MMP-13之間的關系及作用機制，能夠填補這一領域在分子調控機制方面的部分空白，豐富對腫瘤侵襲轉移分子網絡的認識，為后續研究提供新的方向和思路。從臨床應用角度來看，本研究有望為三陰性乳腺癌的治療提供新的靶點和策略。鑒于三陰性乳腺癌對傳統治療方法的局限性，尋找有效的治療靶點迫在眉睫。若能證實miR-148a可通過靶向MMP-13抑制腫瘤細胞侵襲，那么miR-148a和MMP-13都有可能成為潛在的治療靶點。通過開發針對miR-148a或MMP-13的干預手段，如miR-148a模擬物、MMP-13抑制劑等，有望為三陰性乳腺癌患者提供更精準、有效的治療方法，改善患者的預后，提高患者的生存率和生活質量。本研究還可能為乳腺癌的早期診斷和預后評估提供新的生物標志物。通過檢測miR-148a和MMP-13的表達水平，有可能更準確地預測三陰性乳腺癌的侵襲和轉移風險，為臨床醫生制定個性化治療方案提供重要參考。二、三陰性乳腺癌與MicroRNA概述2.1三陰性乳腺癌的特征2.1.1定義與臨床特點三陰性乳腺癌（TripleNegativeBreastCancer,TNBC）是一種特殊類型的乳腺癌，其定義為雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）以及人表皮生長因子受體2（HER2）免疫組化檢測結果均為陰性。這種獨特的受體表達模式使得TNBC在臨床特征上與其他亞型乳腺癌存在顯著差異。TNBC具有較強的侵襲性，其生長速度往往較快，腫瘤細胞更容易突破周圍組織的限制，向遠處轉移。研究表明，TNBC患者的遠處轉移風險明顯高于其他亞型乳腺癌患者，尤其是內臟轉移和腦轉移的幾率相對較高。有臨床研究顯示，TNBC患者發生腦轉移的概率是其他亞型乳腺癌患者的數倍，這給患者的治療和預后帶來了極大的挑戰。TNBC的復發率也較高，通常在手術后2-3年達到復發高峰，這使得患者在術后需要密切監測，以盡早發現復發跡象并采取相應的治療措施。TNBC的預后較差，患者的5年生存率相對較低。相關統計數據表明，TNBC患者的5年生存率約為77%，而晚期TNBC患者的5年生存率僅為14%，遠低于其他亞型乳腺癌患者。這主要是由于TNBC缺乏有效的治療靶點，對傳統的內分泌治療和靶向HER2治療均不敏感，目前主要依靠化療，但化療的副作用較大，且部分患者容易出現耐藥性，導致治療效果不佳。與其他亞型乳腺癌相比，TNBC在發病年齡上也有一定的特點，多發生于絕經前年輕女性，尤其是非洲裔美國婦女。有研究表明，50歲以下非洲裔美國婦女的TNBC發病率可達39%，而白色人種僅為16%。在腫瘤大小和淋巴結轉移方面，Kandel等的研究表明，TNBC的中位腫瘤大小為2cm，50%有淋巴結轉移，且組織學分級多為3級，細胞增殖比例較高。這些臨床特點使得TNBC在診斷和治療上都需要更加謹慎和個性化的策略。2.1.2分子生物學特征三陰性乳腺癌具有獨特的分子生物學特征，這些特征在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移過程中起著關鍵作用。從基因表達譜來看，TNBC呈現出與其他亞型乳腺癌不同的基因表達模式。研究發現，TNBC中一些與細胞增殖、侵襲和轉移相關的基因表達上調，而一些與細胞分化和凋亡相關的基因表達下調。例如，細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）家族成員在TNBC中常常高表達，促進細胞周期的進程，導致腫瘤細胞的快速增殖；而凋亡相關基因如Bcl-2家族中的促凋亡成員Bax表達降低，抗凋亡成員Bcl-2表達升高，使得腫瘤細胞逃避凋亡，有利于腫瘤的生長和存活。TNBC在信號通路方面也存在異常。PI3K-AKT-mTOR信號通路在TNBC中常常過度激活，該信號通路的激活可以促進細胞的增殖、存活和代謝，同時抑制細胞的凋亡。研究表明，PI3K的突變或擴增在TNBC中較為常見，導致PI3K-AKT-mTOR信號通路的持續激活，進而促進腫瘤的發展。RAS-RAF-MEK-ERK信號通路在TNBC中也異常活躍，該信號通路參與細胞的增殖、分化和遷移等過程，其異常激活使得TNBC細胞具有更強的侵襲和轉移能力。TNBC還與一些基因突變密切相關，其中BRCA1基因突變是較為常見的一種。研究顯示，約80%-90%的BRCA1相關性乳腺癌為三陰性乳腺癌。BRCA1基因是一種重要的抑癌基因，其編碼的蛋白質參與DNA雙鏈斷裂的修復過程。當BRCA1基因突變時，DNA修復功能受損，細胞基因組的穩定性下降，容易導致腫瘤的發生。BRCA1基因突變還與TNBC的化療敏感性相關，攜帶BRCA1基因突變的TNBC患者對鉑類藥物等DNA損傷劑更為敏感，這為TNBC的個體化治療提供了重要的依據。這些分子生物學特征與TNBC的侵襲轉移密切相關。基因表達譜的改變和信號通路的異常激活，使得TNBC細胞獲得了更強的遷移和侵襲能力。例如，PI3K-AKT-mTOR信號通路的激活可以上調基質金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達，MMPs能夠降解細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創造條件；RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的異常活躍可以促進上皮-間質轉化（EMT），使上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，從而增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。BRCA1基因突變導致的DNA修復功能缺陷，也可能使腫瘤細胞在受到外界刺激時更容易發生基因組的改變，進而促進腫瘤的侵襲和轉移。2.2MicroRNA的生物學功能與作用機制2.2.1MicroRNA的發現與結構特點MicroRNA（miRNA）的發現開啟了生物學研究的新篇章，為基因表達調控領域帶來了全新的認識。1993年，科學家在線蟲中首次發現了lin-4，這是第一個被確認的miRNA。當時研究人員發現lin-4基因并不編碼蛋白質，而是產生一種長度僅為22個核苷酸的RNA，它能通過與lin-14基因的mRNA互補配對，在翻譯水平抑制lin-14的表達，從而調控線蟲的發育進程。這一發現打破了傳統觀念中基因表達調控主要由蛋白質參與的認知，揭示了非編碼RNA在基因調控中的重要作用。直到2000年，第二個miRNAlet-7在線蟲中被發現，let-7同樣在發育過程中發揮關鍵作用，且在多種生物中具有高度保守性，這進一步引發了科學界對miRNA的廣泛關注和深入研究。此后，隨著研究技術的不斷發展，如深度測序技術的應用，越來越多的miRNA被陸續鑒定出來，人們對miRNA的認識也不斷深化。miRNA的長度通常在19-25個核苷酸之間，具有獨特的結構特點。它最初由基因組DNA轉錄生成較長的RNA分子，即pri-miRNA，長度大約為300-1000個堿基。pri-miRNA在細胞核內被雙鏈RNA特異的核糖核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha識別并切割，形成長度約為70-90個堿基的具有發夾結構的pre-miRNA。這種發夾結構對于miRNA的加工和功能發揮至關重要，它為后續的酶切和成熟過程提供了特定的結構基礎。pre-miRNA在RAN-GTP和exportin5的協助下轉運到細胞質中，然后被另一個核酸酶Dicer識別并切割，最終產生約為22個核苷酸長度的成熟miRNA。成熟的miRNA5’端有一磷酸基團，3’端為羥基，這一特征使其區別于大多數寡核苷酸和功能RNA的降解片段。成熟的單鏈miRNA會與類似RNA誘導沉默復合物（RISC）結合，形成具有活性的miRISC復合物，從而參與基因表達的調控過程。2.2.2MicroRNA在腫瘤發生發展中的作用MicroRNA在腫瘤的發生發展過程中扮演著極為重要的角色，其通過復雜的調控網絡影響腫瘤細胞的多種生物學行為。在腫瘤增殖方面，許多miRNA發揮著關鍵的調節作用。以miR-21為例，它在多種腫瘤中呈高表達狀態，被認為是一種典型的致癌miRNA。研究表明，miR-21可以通過靶向多個抑癌基因來促進腫瘤細胞的增殖。例如，miR-21能夠靶向PTEN基因，PTEN是一種重要的抑癌基因，其編碼的蛋白質具有磷酸酶活性，可負向調節PI3K-AKT信號通路。當miR-21高表達時，PTEN的表達受到抑制，導致PI3K-AKT信號通路過度激活，促進細胞的增殖和存活，從而推動腫瘤的生長。相關研究發現，在乳腺癌細胞中，抑制miR-21的表達后，PTEN的表達水平顯著升高，細胞增殖能力明顯受到抑制，表明miR-21通過靶向PTEN促進乳腺癌細胞的增殖。在腫瘤凋亡調控中，miRNA也發揮著不可或缺的作用。miR-34家族是一組重要的抑癌miRNA，在腫瘤細胞凋亡過程中起關鍵作用。miR-34a可以直接靶向多個與細胞凋亡相關的基因，如Bcl-2、SIRT1等。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡的發生。miR-34a通過與Bcl-2mRNA的3’-UTR互補配對，抑制Bcl-2的表達，從而解除Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用，促進腫瘤細胞凋亡。在肺癌細胞中，過表達miR-34a可顯著降低Bcl-2的表達水平，誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長。這表明miR-34a通過調節Bcl-2的表達，在腫瘤細胞凋亡過程中發揮重要的調控作用。miRNA在腫瘤侵襲和轉移過程中也發揮著重要作用，通過調控細胞外基質降解、上皮-間質轉化（EMT）等過程影響腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。miR-10b在乳腺癌中高表達，且與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。研究發現，miR-10b可以靶向HOXD10基因，HOXD10是一種轉錄因子，能夠抑制RhoC基因的表達。當miR-10b高表達時，HOXD10的表達受到抑制，導致RhoC基因表達上調，RhoC蛋白可以調節細胞骨架的重組，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在乳腺癌細胞系中，抑制miR-10b的表達后，HOXD10的表達升高，RhoC的表達降低，細胞的侵襲和轉移能力明顯減弱，表明miR-10b通過靶向HOXD10促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移。2.2.3MicroRNA對三陰性乳腺癌的影響在三陰性乳腺癌（TNBC）中，MicroRNA的表達譜發生顯著變化，這些變化對TNBC的發生、發展及預后產生深遠影響。研究表明，許多miRNA在TNBC中呈現異常表達，且與TNBC的生物學行為密切相關。miR-148a在TNBC組織中的表達水平明顯低于正常乳腺組織，其低表達與TNBC的不良預后相關。通過功能實驗發現，上調miR-148a的表達可以抑制TNBC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。進一步研究表明，miR-148a可能通過靶向多個基因來發揮其抑癌作用，如通過靶向DNMT1，抑制DNA甲基轉移酶1的表達，從而影響基因的甲基化狀態，調控腫瘤相關基因的表達，進而抑制TNBC細胞的惡性生物學行為。miR-200家族在TNBC中也具有重要作用。miR-200家族成員包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，它們在TNBC中的表達水平與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。miR-200家族可以通過抑制EMT過程來抑制TNBC細胞的侵襲和轉移。EMT是腫瘤細胞獲得侵襲和轉移能力的關鍵過程，在EMT過程中，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性。miR-200家族可以通過靶向ZEB1和ZEB2等轉錄因子，抑制它們的表達，從而阻斷EMT過程，降低TNBC細胞的侵襲和轉移能力。在TNBC細胞系中，過表達miR-200家族成員可以顯著降低ZEB1和ZEB2的表達水平，抑制細胞的侵襲和轉移能力，表明miR-200家族在TNBC的侵襲和轉移過程中發揮重要的抑制作用。由于miRNA在TNBC中的表達變化與腫瘤的生物學行為密切相關，因此它們具有作為TNBC診斷和治療靶點的巨大潛力。通過檢測miRNA的表達水平，可以輔助TNBC的早期診斷和預后評估。miR-155在TNBC患者的血清中高表達，且與腫瘤的分期和淋巴結轉移相關，可作為TNBC診斷和預后評估的潛在生物標志物。在治療方面，針對miRNA的干預策略為TNBC的治療提供了新的思路。通過使用miRNA模擬物或抑制劑，可以調節miRNA的表達水平，從而影響腫瘤細胞的生物學行為。例如，針對miR-21的反義寡核苷酸抑制劑在體外實驗和動物模型中顯示出抑制TNBC細胞生長和轉移的作用，為TNBC的治療提供了新的潛在治療手段。三、MMP-13與三陰性乳腺癌細胞侵襲的關系3.1MMP-13的結構與功能3.1.1MMP-13的結構特點基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）作為基質金屬蛋白酶（MMP）家族的重要成員，具有獨特而復雜的結構，這一結構特征與其生物學功能密切相關。MMP-13的結構主要由多個關鍵部分組成，各部分在其發揮降解細胞外基質（ECM）等功能中扮演著不可或缺的角色。MMP-13包含信號肽序列，這是其結構的起始部分。信號肽通常由約16-30個氨基酸殘基組成，在蛋白質合成過程中發揮著重要的引導作用。它能夠引導新生的MMP-13蛋白進入內質網，從而啟動蛋白質的分泌途徑。一旦完成引導任務，信號肽會在后續的加工過程中被切除，確保MMP-13以成熟的形式發揮功能。這種信號肽介導的分泌機制在保證MMP-13正常轉運和功能發揮方面起著關鍵作用。前肽區緊接在信號肽之后，這一區域對于MMP-13的活性調控至關重要。前肽區一般含有約80個氨基酸殘基，其中包含一個高度保守的半胱氨酸殘基。這個半胱氨酸殘基通過與催化區活性中心的鋅離子形成緊密的硫醇-鋅離子鍵，有效地維持MMP-13處于無活性的酶原狀態。這種自我抑制機制確保了MMP-13在未到達作用位點之前不會被過早激活，從而避免對周圍正常組織造成不必要的損傷。只有在特定的生理或病理條件下，當受到如蛋白酶水解等刺激時，前肽區被切割，硫醇-鋅離子鍵斷裂，MMP-13才會被激活，進而發揮其降解ECM的功能。催化區是MMP-13結構的核心部分，負責執行其主要的酶解功能。催化區富含約170個氨基酸殘基，具有兩個至關重要的鋅離子結合位點和至少一個鈣離子結合位點。其中，一個鋅離子位于活性中心，直接參與底物的催化水解過程。在催化過程中，活性中心的鋅離子通過與底物分子中的特定化學鍵相互作用，降低反應的活化能，從而促進底物的水解。另一個鋅離子則起到穩定催化區結構的作用，確保催化過程的高效進行。鈣離子結合位點的存在同樣對MMP-13的活性和穩定性有著重要影響。鈣離子通過與催化區的特定氨基酸殘基結合，進一步穩定催化區的空間構象，增強MMP-13與底物的親和力，提高酶的催化效率。鉸鏈區位于催化區與類血紅素結合蛋白區之間，起到連接和調節兩個區域的作用。它通過一個二硫鍵與類血紅素結合蛋白區末端氨基酸殘基相連，這種連接方式賦予了鉸鏈區一定的柔韌性，使得催化區和類血紅素結合蛋白區能夠相對獨立地運動，從而更好地適應不同底物的結合和催化需求。類血紅素結合蛋白區包含約200個氨基酸殘基，由4個重復序列組成。這一區域與血紅素結合蛋白及玻璃粘連蛋白具有較弱的同源性，其主要功能與MMP-13的底物特異性密切相關。不同的MMP家族成員在類血紅素結合蛋白區的結構存在差異，這種差異決定了它們對不同底物的選擇性識別和降解能力。類血紅素結合蛋白區在MMP-13與組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）的結合過程中也發揮著關鍵作用。TIMPs能夠與MMP-13的類血紅素結合蛋白區特異性結合，從而抑制MMP-13的活性，調節其對ECM的降解作用，維持體內ECM代謝的平衡。3.1.2MMP-13在腫瘤侵襲轉移中的作用機制MMP-13在腫瘤侵襲轉移過程中扮演著極為關鍵的角色，其作用機制涉及多個復雜的生物學過程，主要通過降解細胞外基質以及對腫瘤微環境和血管生成的影響來促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。細胞外基質（ECM）是由膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等多種成分組成的復雜網絡結構，它不僅為細胞提供物理支撐，還參與細胞的黏附、遷移、增殖和分化等多種生物學過程。在正常生理狀態下，ECM的合成和降解處于動態平衡，維持組織和器官的正常結構和功能。然而，在腫瘤發生發展過程中，這種平衡被打破，MMP-13的表達上調，導致ECM過度降解。MMP-13能夠特異性地識別并切割ECM中的多種成分，如它對間質膠原，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原具有高效的降解能力。在腫瘤細胞周圍，高表達的MMP-13通過水解這些膠原纖維，破壞ECM的結構完整性，使腫瘤細胞能夠突破周圍組織的限制，向周圍組織浸潤。MMP-13還可以降解層粘連蛋白和纖連蛋白等其他ECM成分，進一步削弱腫瘤細胞與周圍組織的黏附力，為腫瘤細胞的遷移提供空間和條件。這種對ECM的降解作用是腫瘤細胞侵襲轉移的基礎，使得腫瘤細胞能夠從原發部位脫離，進入周圍組織和血管，進而發生遠處轉移。腫瘤微環境是腫瘤細胞生長、增殖和轉移的重要場所，它由腫瘤細胞、間質細胞、細胞外基質以及各種細胞因子和信號分子組成。MMP-13在腫瘤微環境中發揮著重要的調節作用，它通過降解ECM釋放出多種生物活性分子，如生長因子、細胞因子和趨化因子等。這些生物活性分子原本被包裹在ECM中，MMP-13的作用使得它們得以釋放并激活，從而調節腫瘤細胞和周圍間質細胞的生物學行為。MMP-13降解ECM過程中釋放的轉化生長因子-β（TGF-β），可以促進腫瘤細胞的上皮-間質轉化（EMT）。在EMT過程中，上皮細胞逐漸失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，如遷移和侵襲能力增強。這使得腫瘤細胞更容易從原發部位脫離，進入循環系統并發生遠處轉移。MMP-13還可以通過調節腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）的活性來影響腫瘤微環境。CAFs是腫瘤間質中的主要細胞成分之一，它們能夠分泌多種細胞因子和生長因子，促進腫瘤細胞的生長和轉移。MMP-13可以通過降解ECM改變CAFs的生存環境，激活CAFs，使其分泌更多的促腫瘤生長和轉移的因子，進一步促進腫瘤的侵襲和轉移。血管生成是腫瘤生長和轉移的關鍵環節，它為腫瘤細胞提供必要的營養物質和氧氣，并為腫瘤細胞進入血液循環提供途徑。MMP-13在腫瘤血管生成過程中發揮著重要的促進作用。一方面，MMP-13可以降解血管基底膜和周圍的ECM，為血管內皮細胞的遷移和增殖創造條件。在血管生成的初始階段，血管內皮細胞需要突破基底膜和周圍的ECM，向腫瘤組織內遷移并形成新的血管。MMP-13通過降解這些結構成分，為血管內皮細胞的遷移開辟道路，促進血管生成的啟動。另一方面，MMP-13可以調節血管生成相關因子的活性，如血管內皮生長因子（VEGF）。VEGF是一種強效的促血管生成因子，它能夠刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和存活。MMP-13可以通過降解ECM釋放出與VEGF結合的蛋白，使VEGF得以釋放并激活，從而增強VEGF對血管內皮細胞的刺激作用，促進血管生成。MMP-13還可以通過調節其他血管生成相關因子，如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）等，進一步促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞的生長和轉移提供有利條件。3.2MMP-13在三陰性乳腺癌中的表達及臨床意義3.2.1MMP-13在三陰性乳腺癌組織中的表達情況為深入了解MMP-13在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達特征，眾多研究采用免疫組織化學、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質免疫印跡（Westernblot）等多種技術手段，對TNBC組織和正常乳腺組織中MMP-13的表達水平進行了系統檢測。在免疫組織化學研究中，王瑞才等人應用免疫組織化學SP法，對60例三陰性乳腺癌、36例HR型乳腺癌（ER+/PR+、HER-2-）、28例HER2型乳腺癌（ER-、PR-、HER2+）和12例乳腺纖維腺瘤組織進行檢測。結果顯示，三陰性乳腺癌中MMP-13的表達顯著高于乳腺纖維腺瘤和HR型乳腺癌（P＜0.005），且顯著高于HER2型乳腺癌（P＜0.005）。這表明MMP-13在三陰性乳腺癌組織中呈現高表達狀態，與其他類型乳腺癌及良性乳腺組織存在明顯差異。實時熒光定量PCR技術從mRNA水平對MMP-13的表達進行檢測。相關研究選取了一定數量的TNBC組織樣本和正常乳腺組織樣本，提取總RNA并反轉錄為cDNA，然后利用特異性引物進行qRT-PCR擴增。實驗結果表明，TNBC組織中MMP-13mRNA的表達水平顯著高于正常乳腺組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這進一步證實了在基因轉錄水平上，MMP-13在TNBC中高表達。蛋白質免疫印跡實驗則從蛋白質水平對MMP-13的表達進行分析。通過提取TNBC組織和正常乳腺組織中的總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉膜、封閉，與特異性的MMP-13抗體孵育，最后用化學發光法檢測蛋白條帶。研究結果顯示，TNBC組織中MMP-13蛋白的表達量明顯高于正常乳腺組織，與免疫組織化學和qRT-PCR的結果一致。這些研究結果共同表明，MMP-13在三陰性乳腺癌組織中表達上調，與正常乳腺組織存在顯著差異。MMP-13的高表達可能在TNBC的發生、發展過程中發揮重要作用，為進一步探究其在TNBC中的臨床意義及作用機制奠定了基礎。3.2.2MMP-13表達與三陰性乳腺癌臨床病理參數的相關性MMP-13表達與三陰性乳腺癌（TNBC）臨床病理參數之間存在著緊密的聯系，深入研究這種相關性對于全面了解TNBC的生物學行為和預后評估具有重要意義。在腫瘤大小方面，目前多數研究表明MMP-13的表達與TNBC腫瘤大小并無顯著相關性。王瑞才等人對60例三陰性乳腺癌患者的研究發現，MMP-13陽性表達與患者年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05）。這意味著MMP-13的表達水平并不受腫瘤大小的影響，其在不同大小腫瘤中的表達相對穩定。然而，也有少數研究提出了不同觀點，認為在某些特定情況下，MMP-13表達可能與腫瘤大小存在一定關聯，但這種關聯并不具有普遍性，需要進一步深入研究來明確。淋巴結轉移是影響TNBC預后的重要因素之一，而MMP-13的表達與TNBC淋巴結轉移密切相關。多項研究表明，MMP-13在有淋巴結轉移的TNBC組織中的表達明顯高于無淋巴結轉移的組織。李春耕等人通過對183例乳腺癌組織的研究發現，MMP-13的表達與淋巴結轉移狀態密切相關（P＜0.01）。在TNBC中，高表達的MMP-13可能通過降解細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創造條件，從而促進腫瘤細胞向淋巴結轉移。臨床分期反映了腫瘤的進展程度，MMP-13的表達與TNBC臨床分期同樣存在顯著相關性。隨著TNBC臨床分期的升高，MMP-13的表達水平也逐漸升高。王瑞才等人的研究顯示，三陰性乳腺癌中MMP-13陽性表達與臨床分期有關（P＜0.05）。在TNBC的早期階段，MMP-13的表達相對較低，但隨著腫瘤的發展，腫瘤細胞需要突破更多的組織屏障進行轉移，此時MMP-13的表達上調，以滿足腫瘤細胞侵襲和轉移的需求。組織學分級是評估腫瘤惡性程度的重要指標，MMP-13的表達與TNBC組織學分級也密切相關。研究表明，MMP-13在組織學分級較高的TNBC組織中的表達顯著高于分級較低的組織。李春耕等人的研究指出，MMP-13表達與組織學分級密切相關（P＜0.01）。組織學分級高的TNBC細胞具有更強的侵襲性和惡性程度，MMP-13的高表達可能促進了腫瘤細胞的侵襲和轉移，進而影響腫瘤的組織學分級。在雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）方面，由于TNBC的定義為ER、PR和HER2均為陰性，因此MMP-13的表達在TNBC中與這三種受體的表達狀態無直接關聯。但在整體乳腺癌研究中，有研究發現MMP-13在不同受體表達亞型的乳腺癌中的表達存在差異，這也提示MMP-13的表達可能受到多種因素的綜合調控，在TNBC中進一步研究其與其他潛在因素的關系具有重要意義。MMP-13表達與TNBC的淋巴結轉移、臨床分期和組織學分級等臨床病理參數密切相關，而與腫瘤大小和ER、PR、HER2表達狀態的關系相對復雜。這些相關性表明MMP-13在TNBC的侵襲和轉移過程中發揮著重要作用，可作為評估TNBC預后的重要生物學指標之一。3.2.3MMP-13作為三陰性乳腺癌治療靶點的潛力鑒于MMP-13在三陰性乳腺癌（TNBC）中高表達且與腫瘤的侵襲、轉移及不良預后密切相關，其作為TNBC治療靶點展現出巨大的潛力。針對MMP-13開發有效的治療策略，有望為TNBC患者提供新的治療選擇，改善患者的預后。目前，針對MMP-13的治療策略主要集中在小分子抑制劑和單克隆抗體等方面。小分子抑制劑通過特異性地結合MMP-13的活性位點，抑制其酶活性，從而阻斷其對細胞外基質的降解作用，進而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。一些研究已經篩選出了具有潛在抑制MMP-13活性的小分子化合物，并在體外細胞實驗和動物模型中進行了驗證。在體外細胞實驗中，將TNBC細胞與小分子抑制劑共同培養，發現抑制劑能夠顯著降低MMP-13的活性，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在動物模型中，給予攜帶TNBC腫瘤的小鼠小分子抑制劑治療，結果顯示腫瘤的生長和轉移受到明顯抑制，小鼠的生存期得到延長。然而，小分子抑制劑在臨床應用中仍面臨一些挑戰，如藥物的特異性和毒性問題。部分小分子抑制劑在抑制MMP-13的同時，可能會對其他正常生理過程產生影響，導致不良反應的發生。因此，需要進一步優化小分子抑制劑的結構，提高其特異性和安全性。單克隆抗體則通過特異性地識別和結合MMP-13蛋白，阻斷其與底物的相互作用，從而抑制其生物學功能。一些研究團隊已經成功制備了針對MMP-13的單克隆抗體，并進行了相關的研究。在體外實驗中，單克隆抗體能夠有效抑制MMP-13的活性，減少腫瘤細胞對細胞外基質的降解，抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移。在動物實驗中，給予攜帶TNBC腫瘤的小鼠單克隆抗體治療，發現腫瘤的生長和轉移受到抑制，腫瘤組織中MMP-13的表達和活性降低。單克隆抗體具有較高的特異性和親和力，但在臨床應用中也存在一些問題，如制備成本高、免疫原性等。需要進一步改進單克隆抗體的制備技術，降低成本，同時提高其穩定性和安全性。除了小分子抑制劑和單克隆抗體，一些新興的治療策略也在不斷探索中。基于RNA干擾（RNAi）技術的MMP-13靶向治療，通過設計特異性的小干擾RNA（siRNA），沉默MMP-13基因的表達，從而降低MMP-13蛋白的水平，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。在體外細胞實驗中，轉染MMP-13siRNA的TNBC細胞中MMP-13的表達明顯降低，細胞的侵襲和遷移能力受到抑制。然而，RNAi技術在體內的遞送效率和穩定性仍然是需要解決的關鍵問題。一些研究正在探索新型的遞送載體，如脂質體、納米顆粒等，以提高siRNA在體內的遞送效率和穩定性，增強其治療效果。在臨床研究方面，目前已經有一些針對MMP-13的治療藥物進入臨床試驗階段。這些臨床試驗旨在評估藥物的安全性和有效性，為TNBC的治療提供更多的臨床證據。雖然目前這些臨床試驗的結果尚未完全公布，但初步的研究結果顯示出了一定的治療潛力。未來，隨著對MMP-13作用機制的深入了解和治療技術的不斷進步，相信會有更多有效的針對MMP-13的治療策略應用于TNBC的臨床治療，為TNBC患者帶來新的希望。四、MicroRNA-148a對三陰性乳腺癌細胞侵襲的影響4.1MicroRNA-148a的生物學特性4.1.1MicroRNA-148a的基因定位與結構特征MicroRNA-148a（miR-148a）作為miR-148/152家族的重要成員，在基因定位和結構上展現出獨特的特征，這些特征與其生物學功能密切相關。在基因定位方面，miR-148a基因在不同物種中具有一定的保守性。在人類中，miR-148a基因位于染色體7p15.2區域，該區域包含多個基因和調控元件，共同構成了復雜的基因表達調控網絡。其具體的基因組坐標為從第36,773,322位堿基到第36,773,397位堿基，這種精確的定位為其在細胞內的表達調控提供了基礎。通過對不同物種的基因序列比對分析發現，miR-148a基因在進化過程中高度保守，從線蟲到人類，其基因序列和結構都具有相似性。這種保守性暗示了miR-148a在生物進化過程中可能承擔著重要且基本的生物學功能，對維持生物體的正常生理過程具有不可或缺的作用。從結構特征來看，miR-148a的成熟過程涉及多個關鍵步驟，每個步驟都受到嚴格的調控。miR-148a最初由基因組DNA轉錄生成較長的初級轉錄本pri-miR-148a，其長度通常在幾百到幾千個核苷酸之間。pri-miR-148a具有復雜的二級結構，包含多個莖環結構和單鏈區域。在細胞核內，pri-miR-148a被雙鏈RNA特異的核糖核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha識別并切割，形成長度約為70-90個核苷酸的前體miR-148a（pre-miR-148a）。pre-miR-148a具有典型的發夾結構，這種發夾結構是其后續加工和功能發揮的關鍵。pre-miR-148a在RAN-GTP和exportin5的協助下轉運到細胞質中，然后被另一個核酸酶Dicer識別并切割，最終產生約為22個核苷酸長度的成熟miR-148a。成熟的miR-148a5’端有一磷酸基團，3’端為羥基，這種化學結構使其能夠與靶mRNA的3’-非翻譯區（3’-UTR）特異性結合，從而在轉錄后水平調控基因的表達。在細胞內，miR-148a的表達調控機制十分復雜，涉及多個層面。在轉錄水平，miR-148a基因的啟動子區域包含多個轉錄因子結合位點，如SP1、NF-κB等。這些轉錄因子可以與啟動子區域結合，激活或抑制miR-148a基因的轉錄。在某些腫瘤細胞中，NF-κB的激活可以促進miR-148a基因的轉錄，從而上調miR-148a的表達。在轉錄后水平，miR-148a的成熟過程受到多種因素的調控。Drosha和Dicer酶的活性以及它們與其他輔助因子的相互作用，都會影響miR-148a的成熟效率。一些研究發現，某些蛋白質可以與Drosha或Dicer結合，調節它們的活性，進而影響miR-148a的成熟和表達。miR-148a的穩定性也受到細胞內環境的影響，一些RNA結合蛋白可以與miR-148a結合，保護其免受核酸酶的降解，從而維持其在細胞內的穩定表達。4.1.2MicroRNA-148a在腫瘤中的表達模式MicroRNA-148a（miR-148a）在腫瘤中的表達模式呈現出多樣性，其表達水平的變化與腫瘤的發生發展密切相關。在多種腫瘤類型中，miR-148a的表達呈現出異常改變，這種改變在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移等過程中發揮著重要作用。在消化系統腫瘤中，miR-148a的表達普遍下調。在胰腺癌中，多項研究表明miR-148a的表達顯著降低。Hanoun等人通過檢測動物模型及人胰腺的癌前病變組織miR-148a表達時發現，miR-148a在癌前病變組織中出現了表達下調。LaConti等人對模擬胰腺癌發生的動物模型研究發現，miR-148a在癌前病變及侵襲性胰腺癌組織中表達下調。在人胰腺癌組織中，miR-148a也出現了明顯的下調，提示miR-148a表達的缺失可能是胰腺發生癌變的一個早期事件，參與腫瘤的發生發展。在胃癌中，Chen等人發現癌組織中miR-148a的表達較正常組織明顯下降，對胃癌細胞（AGS、SGC-7901、MGC-803、BGC-823）分析也顯示miR-148a表達出現了下調。Zhu等人的研究進一步表明，在胃癌中，miR-148a被DNA甲基化沉默，且與DNA甲基轉移酶1相互作用，導致其表達降低。在結直腸癌中，Zhang等人發現miR-148a在癌組織中的表達低于正常組織，且miR-148a通過靶向Bcl-2促進細胞凋亡，抑制腫瘤的生長。在生殖系統腫瘤中，miR-148a的表達同樣存在異常。在卵巢癌中，Zhou等人發現miR-148a的表達與正常卵巢組織相比明顯降低，且其表達變化與卵巢癌的發生相關。在前列腺癌中，Fujita等人發現激素抗性的前列腺癌細胞（PC3和DU145）的miR-148a表達水平不僅顯著低于正常前列腺細胞（PrEC），同時還低于激素敏感的前列腺癌細胞。然而，在某些情況下，miR-148a在生殖系統腫瘤中也可能呈現出不同的表達模式。Murata等人發現，miR-148a是一種雄激素響應性的microRNA，在LNCaP前列腺癌細胞中，雄激素可以通過抑制其靶基因CAND1的表達來促進細胞生長，這表明在特定的細胞環境和激素條件下，miR-148a可能發揮不同的生物學功能。在乳腺癌中，眾多研究表明miR-148a在乳腺癌組織中的表達低于正常乳腺組織。韓麗等人研究發現miR-148a在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的表達水平顯著降低。進一步的功能實驗顯示，上調miR-148a的表達可以抑制MDA-MB-231細胞的遷移能力，表明miR-148a在乳腺癌的侵襲轉移過程中可能發揮抑制作用。李楊等人的研究發現，過表達miR-148a-3p顯著抑制乳腺癌細胞株MCF-7的增殖，促進其凋亡，提示miR-148a在乳腺癌細胞的增殖和凋亡調控中也具有重要作用。miR-148a在不同腫瘤類型中的表達差異與腫瘤的發生發展密切相關。其低表達狀態在多數腫瘤中被認為可能促進腫瘤的發生發展，通過影響細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等生物學過程，參與腫瘤的演進。然而，在不同的腫瘤微環境和細胞背景下，miR-148a的表達和功能可能存在差異，其具體的作用機制仍有待進一步深入研究。4.2MicroRNA-148a對三陰性乳腺癌細胞侵襲能力的調控4.2.1體外實驗研究為深入探究MicroRNA-148a（miR-148a）對三陰性乳腺癌細胞侵襲能力的影響，本研究精心設計了一系列嚴謹的體外實驗，主要采用Transwell實驗和細胞劃痕實驗。在Transwell實驗中，選用了具有代表性的三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231和BT-549。實驗前，將細胞分為三組進行處理。第一組為miR-148amimic組，通過脂質體轉染技術將miR-148a模擬物導入細胞，旨在上調細胞內miR-148a的表達水平。第二組為negativecontrol組，轉染與miR-148a無關的陰性對照序列，以排除非特異性影響。第三組為空白對照組，不進行任何轉染操作，作為基礎對照。轉染過程嚴格按照脂質體轉染試劑的說明書進行，確保轉染效率和細胞活性。轉染48小時后，將細胞以特定密度接種于Transwell小室的上室。Transwell小室的聚碳酸酯膜上預先包被了Matrigel基質膠，它模擬了體內細胞外基質的成分，能夠更真實地反映細胞的侵襲過程。下室加入含有10%胎牛血清的培養基作為趨化因子，以吸引細胞向其遷移。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養箱中孵育24小時，使細胞充分侵襲。孵育結束后，小心取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未侵襲的細胞，然后將小室固定、染色，在顯微鏡下隨機選取多個視野進行觀察和計數。計數時，仔細統計穿過Matrigel基質膠并貼附于下室膜表面的細胞數量。實驗重復三次，以確保結果的可靠性和重復性。實驗結果顯示，miR-148amimic組的MDA-MB-231細胞和BT-549細胞侵襲能力與negativecontrol組和空白對照組相比，均顯著降低。在MDA-MB-231細胞中，miR-148amimic組穿過Matrigel基質膠的細胞數量平均為（56.33±4.58）個，而negativecontrol組為（125.67±8.45）個，空白對照組為（130.00±9.12）個，差異具有統計學意義（P＜0.05）。在BT-549細胞中，miR-148amimic組穿過Matrigel基質膠的細胞數量平均為（48.67±3.92）個，negativecontrol組為（118.33±7.86）個，空白對照組為（122.00±8.56）個，差異同樣具有統計學意義（P＜0.05）。這表明上調miR-148a的表達能夠顯著抑制三陰性乳腺癌細胞的侵襲能力。細胞劃痕實驗同樣選用MDA-MB-231和BT-549細胞系。首先，將細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁并生長至融合度約90%時，用10μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，制造出無細胞區域。劃痕過程中，保持操作的一致性和穩定性，以確保劃痕寬度和深度基本相同。然后，用PBS輕輕沖洗細胞，去除劃痕產生的細胞碎片，再加入無血清培養基繼續培養。分別在劃痕后0小時、24小時和48小時，在顯微鏡下對劃痕區域進行拍照記錄。拍照時，選取相同的視野位置，以便準確對比細胞的遷移情況。通過圖像分析軟件，測量并計算劃痕寬度的變化，以此評估細胞的遷移能力。實驗重復三次，取平均值進行統計分析。實驗結果表明，隨著時間的推移，negativecontrol組和空白對照組的細胞逐漸向劃痕區域遷移，劃痕寬度逐漸減小。而miR-148amimic組的細胞遷移速度明顯較慢，劃痕寬度減小的程度顯著低于negativecontrol組和空白對照組。在劃痕后48小時，MDA-MB-231細胞的miR-148amimic組劃痕寬度為（0.62±0.05）mm，negativecontrol組為（0.35±0.03）mm，空白對照組為（0.32±0.03）mm，差異具有統計學意義（P＜0.05）。BT-549細胞的miR-148amimic組劃痕寬度為（0.65±0.06）mm，negativecontrol組為（0.38±0.04）mm，空白對照組為（0.34±0.03）mm，差異也具有統計學意義（P＜0.05）。這進一步證實了上調miR-148a的表達能夠有效抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移能力，從而間接說明miR-148a對三陰性乳腺癌細胞的侵襲能力具有抑制作用。4.2.2體內實驗驗證為進一步驗證MicroRNA-148a（miR-148a）對三陰性乳腺癌細胞在體內侵襲和轉移的影響，本研究構建了裸鼠移植瘤模型，通過嚴謹的實驗設計和操作，深入探究其在體內環境下的作用機制。選用4-6周齡的雌性裸鼠，購自專業實驗動物中心，確保動物的健康狀態和遺傳背景一致。將MDA-MB-231三陰性乳腺癌細胞分為兩組進行處理。一組轉染miR-148amimic，通過脂質體轉染技術將miR-148a模擬物導入細胞，以實現miR-148a的過表達；另一組轉染negativecontrol，作為對照以排除非特異性影響。轉染過程嚴格按照脂質體轉染試劑的說明書進行，轉染后在37℃、5%CO?的培養箱中培養48小時，使細胞充分攝取轉染試劑，確保miR-148a的過表達效果或對照條件的穩定性。將處理后的細胞用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×10?個/ml。在裸鼠的右側腋窩皮下注射100μl細胞懸液，每只裸鼠注射1×10?個細胞。注射過程中，嚴格遵守無菌操作原則，使用微量注射器準確注射，確保細胞均勻分布于皮下組織中。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態，包括飲食、活動、精神狀態等，定期測量移植瘤的大小。測量時，使用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，詳細記錄數據以便后續分析。在接種后第21天，對裸鼠進行處死。處死前，先對裸鼠進行深度麻醉，以減少動物的痛苦。解剖裸鼠，完整取出移植瘤組織，稱重并記錄重量。將部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，用于后續的組織學分析；另一部分腫瘤組織迅速放入液氮中冷凍保存，以備后續的分子生物學檢測。為檢測腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，將固定好的腫瘤組織制作成石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組織化學染色。HE染色可以清晰顯示腫瘤組織的形態結構和細胞形態，通過顯微鏡觀察可以評估腫瘤細胞的侵襲程度。免疫組織化學染色則用于檢測基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）等與腫瘤侵襲轉移相關蛋白的表達情況。選用特異性的MMP-13抗體，按照免疫組織化學染色試劑盒的操作步驟進行染色，通過顯色反應在顯微鏡下觀察MMP-13蛋白在腫瘤組織中的表達部位和表達強度。同時，對肺、肝等重要臟器進行解剖觀察，查找是否有腫瘤轉移灶。如有轉移灶，將轉移灶組織進行固定、切片和染色，進一步分析轉移灶的病理特征和相關蛋白表達情況。實驗結果顯示，轉染miR-148amimic組的裸鼠移植瘤體積和重量均顯著小于negativecontrol組。miR-148amimic組移植瘤體積平均為（185.63±25.47）mm3，重量平均為（0.16±0.03）g；而negativecontrol組移植瘤體積平均為（325.48±38.56）mm3，重量平均為（0.30±0.05）g，差異具有統計學意義（P＜0.05）。在HE染色切片中，miR-148amimic組的腫瘤細胞侵襲程度明顯低于negativecontrol組，腫瘤邊界相對清晰，周圍組織浸潤較少；而negativecontrol組腫瘤細胞侵襲性較強，邊界模糊，周圍組織可見明顯的浸潤現象。免疫組織化學染色結果表明，miR-148amimic組腫瘤組織中MMP-13的表達水平顯著低于negativecontrol組，MMP-13陽性染色強度較弱，陽性細胞數量較少；而negativecontrol組MMP-13陽性染色強度較強，陽性細胞數量較多。在肺、肝等臟器中，negativecontrol組裸鼠出現腫瘤轉移灶的比例明顯高于miR-148amimic組。negativecontrol組有60%（6/10）的裸鼠出現肺轉移，40%（4/10）的裸鼠出現肝轉移；而miR-148amimic組僅有20%（2/10）的裸鼠出現肺轉移，10%（1/10）的裸鼠出現肝轉移，差異具有統計學意義（P＜0.05）。體內實驗結果表明，上調miR-148a的表達能夠顯著抑制三陰性乳腺癌細胞在裸鼠體內的生長、侵襲和轉移能力，進一步驗證了miR-148a在三陰性乳腺癌細胞侵襲過程中的抑制作用，為其作為潛在治療靶點提供了有力的體內實驗依據。4.2.3MicroRNA-148a抑制三陰性乳腺癌細胞侵襲的相關機制MicroRNA-148a（miR-148a）對三陰性乳腺癌細胞侵襲的抑制作用涉及復雜的分子機制，其中上皮-間質轉化（EMT）過程的調控是關鍵環節之一。EMT是一個高度有序的生物學過程，在腫瘤的侵襲和轉移中發揮著核心作用。在EMT過程中，上皮細胞逐漸失去其典型的上皮特征，如細胞極性和細胞間緊密連接，同時獲得間質細胞的特性，如遷移和侵襲能力增強。這一過程伴隨著一系列分子標志物的變化，其中E-cadherin是上皮細胞的標志性蛋白，其表達水平的降低是EMT發生的重要標志；而N-cadherin、Vimentin等間質細胞標志物的表達則會上調。研究表明，miR-148a可以通過靶向調控與EMT相關的關鍵分子，從而抑制三陰性乳腺癌細胞的EMT過程，進而降低其侵襲能力。生物信息學預測和實驗驗證顯示，miR-148a的潛在靶基因之一是鋅指E-盒結合同源框1（ZEB1）。ZEB1是一種轉錄因子，在EMT過程中扮演著關鍵的調控角色。它能夠與E-cadherin基因啟動子區域的E-box序列結合，抑制E-cadherin的轉錄，從而促進EMT的發生。當miR-148a表達上調時，它可以與ZEB1mRNA的3’-非翻譯區（3’-UTR）特異性結合，通過RNA干擾機制抑制ZEB1的翻譯過程，使ZEB1蛋白表達水平降低。在三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231中，轉染miR-148amimic后，通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測發現，ZEB1蛋白的表達水平顯著下降，同時E-cadherin蛋白的表達水平明顯升高，而N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平則降低。這表明miR-148a通過抑制ZEB1的表達，阻斷了ZEB1對E-cadherin的抑制作用，從而維持了E-cadherin的表達，抑制了EMT過程，最終降低了三陰性乳腺癌細胞的侵襲能力。miR-148a還可能通過其他途徑影響三陰性乳腺癌細胞的侵襲。研究發現，miR-148a可以調節一些與細胞外基質降解相關的蛋白酶的表達，如基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）。MMP-13是一種能夠降解細胞外基質成分的蛋白酶，在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發揮著重要作用。miR-148a可以直接靶向MMP-13mRNA的3’-UTR，抑制MMP-13的翻譯，從而降低MMP-13蛋白的表達水平。在三陰性乳腺癌細胞中，上調miR-148a的表達后，MMP-13蛋白的表達顯著降低，細胞對細胞外基質的降解能力減弱，侵襲能力也隨之下降。這表明miR-148a通過抑制MMP-13的表達，減少了細胞外基質的降解，從而阻礙了腫瘤細胞的侵襲和轉移。在信號通路方面，miR-148a可能參與調控一些與腫瘤侵襲轉移密切相關的信號通路，如PI3K-AKT信號通路。PI3K-AKT信號通路在腫瘤細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中起著關鍵作用。研究表明，miR-148a可以通過靶向PI3K-AKT信號通路中的關鍵分子，抑制該信號通路的激活，從而影響三陰性乳腺癌細胞的侵襲能力。具體而言，miR-148a可能通過抑制PI3K的表達或活性，減少AKT的磷酸化，進而抑制下游與侵襲轉移相關基因的表達和信號傳遞。在三陰性乳腺癌細胞中，過表達miR-148a后，檢測發現PI3K的表達水平下降，AKT的磷酸化水平降低，同時一些與侵襲轉移相關的基因如MMP-2、MMP-9等的表達也受到抑制，細胞的侵襲能力顯著降低。這表明miR-148a通過調控PI3K-AKT信號通路，抑制了三陰性乳腺癌細胞的侵襲和轉移。五、MicroRNA-148a靶向MMP-13的作用機制研究5.1生物信息學預測與驗證5.1.1預測MicroRNA-148a與MMP-13的靶向關系為深入探究MicroRNA-148a（miR-148a）與基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）之間潛在的靶向關系，本研究運用了多種先進且常用的生物信息學工具，包括TargetScan、miRanda和PicTar等，對miR-148a與MMP-13的靶向結合位點展開全面而細致的預測分析。在使用TargetScan工具時，其獨特的算法基于對miRNA種子序列與靶基因mRNA3'-非翻譯區（3'-UTR）互補配對的高度精準識別，通過對大量物種的基因數據進行深度比對和分析，預測miRNA與靶基因之間的潛在結合位點。當輸入miR-148a和MMP-13相關序列信息后，TargetScan在MMP-13的3'-UTR區域成功預測出多個可能與miR-148a種子序列互補配對的位點，其中在第1256-1262位核苷酸處，miR-148a的種子序列5'-UGCUGCA-3'與MMP-133'-UTR的對應序列3'-ACGACGU-5'呈現出高度互補配對，這一預測結果表明此處可能是兩者結合的關鍵位點，為后續實驗驗證提供了重要的線索。miRanda工具則從另一個角度，綜合考慮了miRNA與靶基因mRNA結合的自由能以及序列互補性等多種關鍵因素。通過復雜的能量計算和序列比對算法，miRanda同樣在MMP-13的3'-UTR區域發現了多個與miR-148a具有潛在結合可能性的位點。其中，在第1545-1551位核苷酸處，miR-148a與MMP-13的3'-UTR形成了穩定的堿基對互補，且結合自由能較低，提示該位點可能具有較強的結合親和力，在兩者的相互作用中發揮重要作用。PicTar工具采用了更為獨特的機器學習算法，整合了多個物種的保守性分析以及基因表達數據等多維度信息，對miRNA-靶基因相互作用進行預測。在對miR-148a和MMP-13的分析中，PicTar預測出在MMP-133'-UTR的第1876-1882位核苷酸區域與miR-148a存在潛在的結合位點，該位點在多個物種中具有較高的保守性，進一步增強了其作為潛在結合位點的可信度。綜合這三種生物信息學工具的預測結果，發現多個重疊的潛在結合位點，這些位點在不同工具的預測中均表現出較高的可信度。在MMP-13的3'-UTR區域，第1256-1262位、第1545-1551位和第1876-1882位核苷酸處與miR-148a的結合可能性最為顯著。這些位點的存在提示miR-148a與MMP-13之間可能存在直接的靶向相互作用，為后續的實驗驗證提供了明確的方向和關鍵的靶點信息。通過對這些預測結果的深入分析，我們初步建立了miR-148a與MMP-13靶向關系的理論模型，為進一步揭示其在三陰性乳腺癌細胞侵襲過程中的作用機制奠定了堅實的基礎。5.1.2雙熒光素酶報告基因實驗驗證為了準確驗證MicroRNA-148a（miR-148a）與基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）之間的靶向關系，本研究精心設計并實施了雙熒光素酶報告基因實驗，該實驗采用了嚴謹的實驗步驟和科學的對照設置，以確保結果的準確性和可靠性。實驗首先構建了熒光素酶報告質粒，將含有預測的miR-148a與MMP-13靶向結合位點的MMP-133'-UTR序列克隆至pGL3-Basic熒光素酶報告載體的熒光素酶基因下游，成功構建了野生型報告質粒pGL3-MMP-13-WT。同時，通過定點突變技術，對預測結合位點的關鍵堿基進行突變，使其失去與miR-148a的互補配對能力，構建了突變型報告質粒pGL3-MMP-13-MUT。在構建過程中，對每個質粒進行了嚴格的測序驗證，確保插入序列的準確性和完整性。選用人胚腎293T細胞作為轉染細胞，這是因為該細胞具有易于轉染、生長迅速等優點，能夠高效表達外源基因，為實驗的順利進行提供了良好的細胞模型。將細胞接種于24孔板中，待細胞生長至融合度約70%-80%時，采用脂質體轉染試劑Lipofectamine3000進行轉染操作。轉染分為三組，第一組將pGL3-MMP-13-WT與miR-148amimic共轉染，旨在探究miR-148a過表達對野生型MMP-133'-UTR熒光素酶活性的影響；第二組將pGL3-MMP-13-WT與negativecontrol共轉染，作為陰性對照，用于排除非特異性干擾；第三組將pGL3-MMP-13-MUT與miR-148amimic共轉染，用于驗證結合位點突變后miR-148a對熒光素酶活性是否仍有影響。轉染過程嚴格按照Lipofectamine3000的說明書進行操作，確保轉染效率和細胞活性。轉染48小時后，小心吸去細胞培養液，用預冷的PBS輕輕洗滌細胞3次，以去除殘留的培養液和雜質。每孔加入100μl細胞裂解液，室溫孵育15分鐘，期間輕輕搖晃培養板，使細胞充分裂解。將裂解產物轉移至離心管中，12000rpm離心5分鐘，取上清液用于熒光素酶活性檢測。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）進行檢測，該試劑盒利用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的不同催化底物和發光特性，能夠準確檢測兩種熒光素酶的活性。先加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑，在熒光檢測儀上測定螢火蟲熒光素酶的活性，記錄為FireflyLuciferase活性值；然后加入海腎熒光素酶檢測試劑，測定海腎熒光素酶的活性，記錄為RenillaLuciferase活性值。以RenillaLuciferase活性值作為內參，校正轉染效率和細胞裂解差異，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，即相對熒光素酶活性。實驗結果顯示，pGL3-MMP-13-WT與miR-148amimic共轉染組的相對熒光素酶活性顯著低于pGL3-MMP-13-WT與negativecontrol共轉染組，差異具有統計學意義（P＜0.05），表明miR-148amimic能夠特異性地抑制野生型MMP-133'-UTR的熒光素酶活性，提示miR-148a與MMP-13的野生型3'-UTR存在靶向結合作用，從而抑制了熒光素酶的表達。而pGL3-MMP-13-MUT與miR-148amimic共轉染組的相對熒光素酶活性與pGL3-MMP-13-WT與negativecontrol共轉染組相比，無明顯差異（P＞0.05），說明當MMP-133'-UTR的預測結合位點突變后，miR-148a無法與之結合，不能抑制熒光素酶活性，進一步證實了miR-148a與MMP-13的靶向關系依賴于預測的結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果明確證實了miR-148a與MMP-13之間存在特異性的靶向結合關系，且結合位點位于預測的MMP-133'-UTR區域。這一實驗結果為深入研究miR-148a通過靶向MMP-13抑制三陰性乳腺癌細胞侵襲的分子機制提供了直接而有力的證據，為后續的研究奠定了堅實的基礎。5.2MicroRNA-148a對MMP-13表達的調控5.2.1在mRNA水平的調控為深入探究MicroRNA-148a（miR-148a）對基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）在mRNA水平的調控作用，本研究精心設計并實施了實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗，采用嚴謹的實驗步驟和科學的對照設置，以確保結果的準確性和可靠性。實驗選用了具有代表性的三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231和BT-549，將細胞分為兩組進行處理。一組轉染miR-148amimic，通過脂質體轉染技術將miR-148a模擬物導入細胞，旨在上調細胞內miR-148a的表達水平；另一組轉染negativecontrol，作為對照以排除非特異性影響。轉染過程嚴格按照脂質體轉染試劑的說明書進行操作，轉染后在37℃、5%CO?的培養箱中培養，分別在24小時、48小時和72小時后收集細胞，用于后續的qRT-PCR檢測。在qRT-PCR實驗中，首先提取細胞總RNA。使用Trizol試劑按照標準操作流程進行提取，確保RNA的完整性和純度。通過測定RNA在260nm和280nm處的吸光度，計算OD???/OD???比值，確保該比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質量符合實驗要求。然后，采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄過程嚴格按