IL-21基因與γ射線聯(lián)合：宮頸癌Hela細(xì)胞抑制作用的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義宮頸癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球新增宮頸癌病例約60.4萬例，死亡病例約34.2萬例，嚴(yán)重影響著女性的生活質(zhì)量和生命健康。在中國，宮頸癌同樣是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性健康。近年來，隨著工業(yè)化、城鎮(zhèn)化程度的加深，居民生活方式改變，女性感染人乳頭瘤病毒（HPV）的風(fēng)險(xiǎn)增加，宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也呈上升趨勢，且逐漸年輕化。目前，宮頸癌的主要治療方法包括手術(shù)、放療、化療以及近年來新興的免疫治療和靶向治療等。對于早期宮頸癌患者，手術(shù)治療通常是首選方案，能夠有效切除腫瘤組織，但對于中晚期患者，由于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除往往難以徹底清除癌細(xì)胞，放療和化療成為主要的治療手段。放療在宮頸癌的治療中具有重要地位，尤其是對于中晚期宮頸癌患者，放療能夠有效地控制腫瘤的生長和擴(kuò)散，提高患者的生存率。然而，放療也存在著諸多局限性。一方面，放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對腫瘤臨近部位的正常組織造成放射損傷，如放射性直腸炎、膀胱炎等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量；另一方面，部分腫瘤細(xì)胞對輻射具有抗拒性，導(dǎo)致放療效果不佳，腫瘤復(fù)發(fā)率較高。此外，化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對人體正常細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等，給患者帶來極大的痛苦。IL-21作為一種細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。研究表明，IL-21能夠激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性；同時(shí)，IL-21還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。γ射線照射則能夠直接引起細(xì)胞DNA損傷，干擾細(xì)胞的自我修復(fù)和增殖過程，對腫瘤細(xì)胞形成抑制作用。將IL-21基因聯(lián)合γ射線照射應(yīng)用于宮頸癌的治療，有望發(fā)揮兩者的協(xié)同作用，提高治療效果，降低放療的副作用，為宮頸癌的治療提供新的策略。本研究旨在深入探究人IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對子宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，分析兩者聯(lián)合作用對Hela細(xì)胞生長、增殖、凋亡以及細(xì)胞周期的影響，揭示其潛在的作用機(jī)制。這不僅有助于進(jìn)一步闡明IL-21基因和γ射線照射在宮頸癌治療中的協(xié)同作用機(jī)制，豐富腫瘤治療的理論基礎(chǔ)，而且有望為臨床宮頸癌的治療提供新的治療思路和方法，提高宮頸癌患者的治療效果和生活質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀I(lǐng)L-21作為一種具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，自被發(fā)現(xiàn)以來，其在腫瘤治療領(lǐng)域的研究日益深入。國外研究中，Parrish-Novak等學(xué)者率先克隆了白細(xì)胞介素21（IL-21）及其受體（IL-21R）的cDNA，為后續(xù)對IL-21的研究奠定了基礎(chǔ)。隨后，大量研究聚焦于IL-21在激活免疫細(xì)胞方面的作用機(jī)制。例如，有研究表明IL-21能夠增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的細(xì)胞毒性，使其對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力顯著提升，同時(shí)，IL-21還能促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的增殖與活化，增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。在腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)方面，國外研究發(fā)現(xiàn)IL-21可以抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移；此外，IL-21還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）的功能，重塑腫瘤微環(huán)境的免疫平衡，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫監(jiān)視和免疫攻擊能力。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將IL-21基因?qū)牒闪鲂∈篌w內(nèi)，能夠有效抑制腫瘤的生長，延長小鼠的生存期，部分小鼠的腫瘤甚至完全消退，這為IL-21在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在國內(nèi)，對IL-21基因的研究也取得了一系列成果?？蒲腥藛T通過基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了重組IL-21表達(dá)載體，并在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了其對多種腫瘤細(xì)胞系的生長抑制作用。在肝癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系等研究中發(fā)現(xiàn)，IL-21能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，且這種抑制作用呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性。同時(shí)，國內(nèi)研究還關(guān)注到IL-21與其他免疫治療手段的聯(lián)合應(yīng)用，如將IL-21與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用，能夠協(xié)同增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答，提高腫瘤治療效果。在臨床研究方面，雖然目前IL-21用于腫瘤治療的臨床試驗(yàn)尚處于探索階段，但初步結(jié)果顯示出了一定的安全性和有效性，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供了希望。γ射線照射作為腫瘤放療的主要手段之一，在國內(nèi)外都有廣泛的研究和應(yīng)用。國外研究對γ射線照射的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行了深入探討，發(fā)現(xiàn)γ射線能夠直接作用于腫瘤細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，破壞細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂。此外，γ射線還能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的一系列應(yīng)激反應(yīng)，激活細(xì)胞凋亡信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，γ射線照射還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。在放療技術(shù)方面，國外不斷研發(fā)新的放療設(shè)備和技術(shù)，如立體定向放療（SBRT）、調(diào)強(qiáng)放療（IMRT）等，以提高放療的精準(zhǔn)度，減少對正常組織的損傷。國內(nèi)在γ射線照射治療腫瘤方面也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。臨床研究表明，γ射線照射在多種腫瘤的治療中都發(fā)揮了重要作用，如鼻咽癌、食管癌、肺癌等。通過優(yōu)化放療方案，合理調(diào)整照射劑量和分割方式，能夠在提高腫瘤局部控制率的同時(shí)，降低放療的不良反應(yīng)。同時(shí)，國內(nèi)科研人員還致力于研究提高腫瘤細(xì)胞對γ射線敏感性的方法，如使用增敏劑、聯(lián)合其他治療手段等。例如，一些研究發(fā)現(xiàn)，某些化療藥物能夠與γ射線產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對射線的敏感性，提高放療效果。關(guān)于IL-21基因聯(lián)合γ射線照射治療宮頸癌的研究，目前國內(nèi)外都處于探索階段。國外有研究嘗試將IL-21基因轉(zhuǎn)染到宮頸癌小鼠模型中，然后進(jìn)行γ射線照射，觀察到聯(lián)合治療組的腫瘤生長抑制效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用IL-21基因或γ射線照射組，腫瘤體積顯著減小，小鼠的生存期也明顯延長。在作用機(jī)制方面，初步推測聯(lián)合治療可能通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，以及調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等多種途徑協(xié)同發(fā)揮作用。國內(nèi)也有相關(guān)研究，通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對宮頸癌Hela細(xì)胞的生長具有顯著的抑制作用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，且聯(lián)合治療組的抑制效果優(yōu)于單獨(dú)治療組。進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究表明，聯(lián)合治療可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路，來實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。然而，目前該聯(lián)合治療方案仍存在一些問題。一方面，IL-21基因的導(dǎo)入方式和表達(dá)效率有待進(jìn)一步優(yōu)化，以提高其在腫瘤細(xì)胞中的作用效果；另一方面，γ射線照射的劑量和時(shí)間窗口的選擇還需要更深入的研究，以在保證治療效果的同時(shí)，最大限度地減少對正常組織的損傷。此外，聯(lián)合治療的長期安全性和有效性也需要更多的臨床研究來驗(yàn)證。1.3研究目的與內(nèi)容本研究的核心目的在于深入探究人IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對子宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用，為宮頸癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。具體研究內(nèi)容如下：評估聯(lián)合治療對Hela細(xì)胞的抑制效果：通過設(shè)置對照組、單獨(dú)IL-21基因處理組、單獨(dú)γ射線照射組以及IL-21基因聯(lián)合γ射線照射組，利用MTT法、CCK-8法等檢測細(xì)胞增殖活力，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力，比較不同處理組對Hela細(xì)胞生長的抑制情況，明確IL-21基因聯(lián)合γ射線照射是否具有協(xié)同抑制效應(yīng)，并與單獨(dú)使用IL-21基因或γ射線照射的效果進(jìn)行對比分析，從而評估聯(lián)合治療的優(yōu)勢。探究聯(lián)合治療對Hela細(xì)胞生長、遷移和侵襲活性的影響：運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法，檢測不同處理組Hela細(xì)胞的遷移和侵襲能力，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，分析聯(lián)合治療對Hela細(xì)胞遷移和侵襲活性的影響，揭示其在抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面的作用機(jī)制。同時(shí)，通過細(xì)胞周期檢測和細(xì)胞凋亡檢測，分析聯(lián)合治療對Hela細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響，明確其對細(xì)胞生長的調(diào)控作用。探討聯(lián)合治療對γ射線誘導(dǎo)細(xì)胞周期變化及凋亡的影響：采用流式細(xì)胞術(shù)，分別檢測單獨(dú)γ射線照射組、IL-21基因聯(lián)合γ射線照射組Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡情況，分析IL-21基因在γ射線誘導(dǎo)細(xì)胞周期變化及凋亡過程中的作用。通過檢測相關(guān)細(xì)胞周期蛋白（如CyclinD1、CyclinE等）和凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase-3等）的表達(dá)水平，從分子層面揭示聯(lián)合治療影響細(xì)胞周期和凋亡的機(jī)制。分析聯(lián)合治療對相關(guān)信號通路的調(diào)控作用：運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)等，檢測與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)的信號通路（如PI3K/Akt、MAPK、NF-κB等信號通路）中關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)變化，明確IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對這些信號通路的調(diào)控機(jī)制，深入探討聯(lián)合治療抑制Hela細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1宮頸癌概述宮頸癌作為女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著全球女性的健康。其發(fā)病原因較為復(fù)雜，目前研究表明，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。HPV是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，有多種亞型，其中16、18型等高危型HPV與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。當(dāng)高危型HPV感染人體后，其病毒基因可整合到宿主細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常、細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而引發(fā)宮頸癌變。此外，多個(gè)性伴侶、初次性生活過早（＜16歲）、早年分娩、多產(chǎn)等因素也會(huì)增加宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。多個(gè)性伴侶會(huì)使女性接觸到更多類型的HPV，增加感染機(jī)會(huì)；初次性生活過早時(shí)，女性生殖道發(fā)育尚未完全成熟，對HPV的抵抗力較弱，容易被感染；早年分娩和多產(chǎn)會(huì)使宮頸組織受到多次損傷，在修復(fù)過程中可能發(fā)生細(xì)胞異常增生，從而增加癌變風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，沙眼衣原體、單純皰疹病毒Ⅱ型、滴蟲等病原體的感染在高危HPV感染導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)病過程中具有協(xié)同作用，它們可能破壞宮頸局部的免疫防御機(jī)制，為HPV的感染和持續(xù)存在創(chuàng)造條件。從病理類型來看，宮頸癌主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和腺鱗癌等。其中，鱗狀細(xì)胞癌最為常見，約占宮頸癌的75%-80%，其癌細(xì)胞起源于宮頸鱗狀上皮細(xì)胞，通常由宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）逐漸發(fā)展而來。腺癌約占宮頸癌的15%-20%，癌細(xì)胞來源于宮頸管柱狀上皮細(xì)胞或腺上皮細(xì)胞，近年來腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢。腺鱗癌則是同時(shí)含有鱗狀細(xì)胞癌和腺癌兩種成分，相對較為少見，約占宮頸癌的3%-5%，其惡性程度較高，預(yù)后較差。臨床上，為了準(zhǔn)確評估宮頸癌的病情和制定合理的治療方案，常采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（FIGO）分期系統(tǒng)對宮頸癌進(jìn)行分期。第0期為原位癌，癌細(xì)胞局限于宮頸上皮層內(nèi)，未突破基底膜，此時(shí)患者通常沒有明顯癥狀，多通過宮頸細(xì)胞學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)。第1期腫瘤局限于宮頸，根據(jù)腫瘤大小和浸潤深度又可細(xì)分為1A期和1B期，1A期腫瘤肉眼不可見，僅在顯微鏡下可見，1B期腫瘤肉眼可見，且局限于宮頸。第2期腫瘤侵犯陰道，但未達(dá)到盆壁，根據(jù)侵犯程度分為2A期和2B期，2A期腫瘤侵犯陰道上2/3，無宮旁浸潤，2B期有宮旁浸潤。第3期腫瘤已擴(kuò)散至盆壁，或引起腎盂積水、無功能腎，同樣可細(xì)分為3A期和3B期，3A期腫瘤侵犯陰道下1/3，3B期腫瘤擴(kuò)散至盆壁或引起腎盂積水、無功能腎。第4期為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，癌細(xì)胞已轉(zhuǎn)移至身體其他部位，如肺、肝、骨等，這是宮頸癌的晚期階段，預(yù)后較差。目前，宮頸癌的常見治療方法包括手術(shù)、放療、化療以及新興的基因治療等。對于早期宮頸癌患者（0期、1A期和部分1B期），手術(shù)治療通常是首選方案，通過切除子宮、宮頸及周圍組織，能夠有效去除腫瘤病灶。常見的手術(shù)方式有子宮全切術(shù)、廣泛子宮切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)等，具體手術(shù)方式需根據(jù)患者的年齡、生育需求、腫瘤分期等因素綜合考慮。例如，對于有生育需求的年輕早期宮頸癌患者，可選擇宮頸錐切術(shù)或根治性宮頸切除術(shù)，在切除腫瘤的同時(shí)保留子宮，盡可能滿足患者的生育愿望；而對于無生育需求的患者，子宮全切術(shù)是較為常用的手術(shù)方式。放療在宮頸癌的治療中也占據(jù)重要地位，尤其是對于中晚期宮頸癌患者。放療利用高能量的射線（如X射線、γ射線等）照射腫瘤部位，通過破壞癌細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，抑制癌細(xì)胞的增殖和分裂，從而達(dá)到治療目的。放療可分為外照射和內(nèi)照射兩種方式。外照射是從體外對腫瘤進(jìn)行照射，通過精確的定位和劑量計(jì)算，使高劑量射線集中在腫瘤部位，減少對周圍正常組織的損傷；內(nèi)照射則是將放射性物質(zhì)直接放置在腫瘤內(nèi)部或貼近腫瘤的部位，如將放射性粒子植入宮頸腫瘤組織內(nèi)，進(jìn)行近距離照射，以提高腫瘤局部的照射劑量。放療不僅可以用于不能手術(shù)或手術(shù)后有高危因素的患者，還可以與手術(shù)、化療等聯(lián)合應(yīng)用，提高治療效果。化療是使用化學(xué)藥物來殺死癌細(xì)胞或抑制其生長，通常用于晚期宮頸癌患者或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者?；熕幬锟赏ㄟ^靜脈注射、口服或局部注射等方式進(jìn)入人體，作用于全身的癌細(xì)胞。常用的化療藥物有順鉑、卡鉑、紫杉醇、氟尿嘧啶等，這些藥物通過干擾癌細(xì)胞的DNA合成、細(xì)胞分裂等過程，達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長和增殖的目的?；煶Ｅc放療聯(lián)合使用，即同步放化療，通過兩者的協(xié)同作用，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。然而，化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對人體正常細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)等，給患者帶來極大的痛苦。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因治療作為一種新興的治療方法，為宮頸癌的治療帶來了新的希望?；蛑委熓峭ㄟ^改變患者細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平，來達(dá)到治療疾病的目的。在宮頸癌的治療中，基因治療主要包括基因替代、基因修正、基因沉默、免疫基因治療等策略。例如，通過導(dǎo)入抑癌基因，如p53基因，來恢復(fù)細(xì)胞的正常生長調(diào)控功能；利用RNA干擾技術(shù)沉默癌基因的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的增殖；或者通過免疫基因治療，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，如導(dǎo)入白細(xì)胞介素21（IL-21）基因，激活免疫細(xì)胞，提高機(jī)體的抗腫瘤能力。基因治療具有靶向性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，但目前仍處于研究和臨床試驗(yàn)階段，還需要進(jìn)一步深入探索和完善。2.2IL-21基因相關(guān)理論IL-21基因于2000年被首次發(fā)現(xiàn)并克隆，其編碼的白細(xì)胞介素21（IL-21）是一種重要的細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IL-21基因定位于人染色體4q26-q27，與IL-2、IL-15等細(xì)胞因子基因在同一染色體上，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。IL-21基因的開放閱讀框編碼162個(gè)氨基酸的多肽，在第31位Gly處被酶切后形成131個(gè)氨基酸殘基成熟的IL-21蛋白質(zhì)。成熟的IL-21含有四螺旋族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域，與IL-2、IL-15的四螺旋族細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域有較高的同源性，并且在相同的位置有兩對相同的半胱氨酸，其中一對在IL-2、IL-4、GM-CSF中具有保守性，另一對則為IL-21與IL-15所特有，表明IL-21與IL-15在結(jié)構(gòu)上最為相近。IL-21主要由活化的CD4+T細(xì)胞分泌，此外，自然殺傷T細(xì)胞（NKT細(xì)胞）和濾泡輔助性T細(xì)胞（TFH）等也能分泌IL-21。IL-21的受體（IL-21R）廣泛分布于多種免疫細(xì)胞表面，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、樹突狀細(xì)胞等，這使得IL-21能夠通過與受體結(jié)合，調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的功能，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在免疫調(diào)節(jié)過程中，IL-21對T淋巴細(xì)胞具有多方面的調(diào)節(jié)作用。它能明顯增強(qiáng)抗CD3mAb誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，并增加CD8+T細(xì)胞的活化、增殖和效應(yīng)功能。在不同細(xì)胞亞群或不同狀態(tài)下，IL-21的反應(yīng)存在差異，它可和IL-4、IL-6等一起誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th2應(yīng)答分化，抑制Th1應(yīng)答，調(diào)節(jié)Th1/Th2的比例，維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)平衡。同時(shí)，IL-21能通過STAT4途徑抑制天然前體細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生，抑制IFN-γ對Th1細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。在再次免疫應(yīng)答過程中，IL-21單獨(dú)作用或者與IL-2、IL-15協(xié)同作用，可增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞毒活性并促其分泌IFN-γ，IFN-γ又可上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面MHCI類分子的表達(dá)，增強(qiáng)對殺傷細(xì)胞的敏感性，從而提高機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。對于B淋巴細(xì)胞，IL-21的作用較為復(fù)雜。單用IL-21不能使靜止期B細(xì)胞發(fā)生增殖，當(dāng)IL-21與抗CD40抗體協(xié)同作用時(shí)，可刺激B細(xì)胞的增殖；然而，對于抗IgM抗體和IL-4誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖，IL-21卻具有抑制作用。IL-21能顯著提高抗CD40mAb誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖和親和力，抑制由IgM和IL-4誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖，還能下調(diào)IL-4誘導(dǎo)的IgE產(chǎn)生，恢復(fù)過高的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，抑制其向組織的浸潤，可用于治療IgE依賴的變應(yīng)性疾病，如哮喘、過敏性鼻炎等。此外，IL-21可以通過下調(diào)Bcl-X的表達(dá)來誘導(dǎo)初始B淋巴細(xì)胞的自穩(wěn)調(diào)節(jié)，并且IL-4、LPS和抗CD40的抗體不能逆轉(zhuǎn)IL-21的這種作用。NK細(xì)胞作為機(jī)體天然免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，IL-21對其具有促進(jìn)活化增殖、上調(diào)細(xì)胞毒活性的功能，并能誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ等多種細(xì)胞因子。IL-21主要誘導(dǎo)骨髓祖細(xì)胞來源的NK細(xì)胞的增殖和分化，增加NK的細(xì)胞毒功能，促進(jìn)其分泌顆粒酶和穿孔素。當(dāng)用IL-21處理NK細(xì)胞時(shí)，NK細(xì)胞體積增大，胞內(nèi)顆粒增多，膜CD154的表達(dá)也顯著上調(diào)。IL-21和IL-15作用于初始NK細(xì)胞和NK-92細(xì)胞時(shí)，能快速誘導(dǎo)INF-γ、T-bet、IL-2R、IL-12R、IL-18R和骨髓瘤分化因子MyD88等mRNA的合成，這些因子對介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)具有重要作用。IL-21還可增強(qiáng)人外周血NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性，與IL-15或IL-18協(xié)同作用時(shí)可刺激人NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，通過誘導(dǎo)IFN-γ生成而增強(qiáng)CD56+/CD16+NK細(xì)胞遷移能力和活性。在腫瘤免疫方面，IL-21表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。研究表明，IL-21能明顯抑制黑色素瘤、結(jié)腸癌和纖維肉瘤等腫瘤細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制主要是通過增強(qiáng)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，從而發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。在B細(xì)胞惡性腫瘤中，IL-21可以抑制慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）B細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。在血液腫瘤治療中，臨床數(shù)據(jù)表明聯(lián)合使用重組IL-21蛋白和利妥昔單抗的療法，在84%患有CLL、小型淋巴細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤和邊緣區(qū)淋巴瘤的患者中觀察到腫瘤負(fù)荷減輕，并且42%的患者出現(xiàn)了緩解（Completeresponse,CR)或部分緩解（Partialresponse,PR)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，IL-21通過其對NK細(xì)胞活性的影響增強(qiáng)了利妥昔單抗的治療效果。在非血液腫瘤如轉(zhuǎn)移性黑色素瘤治療中，62.5%的患者在接受IL-21治療后出現(xiàn)了部分緩解（PR）或疾病穩(wěn)定（stabledisease,SD）。IL-21還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移；同時(shí)，IL-21可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）的功能，重塑腫瘤微環(huán)境的免疫平衡，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫監(jiān)視和免疫攻擊能力。2.3γ射線照射的生物學(xué)效應(yīng)γ射線作為一種高能電磁波，具有強(qiáng)大的穿透能力和電離作用，其照射對細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)十分復(fù)雜，且在腫瘤放療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。γ射線對細(xì)胞DNA損傷的影響是其重要的生物學(xué)效應(yīng)之一。當(dāng)細(xì)胞受到γ射線照射時(shí)，射線的能量會(huì)直接作用于DNA分子，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂（DSBs）或單鏈斷裂（SSBs）。DNA雙鏈斷裂是γ射線照射引起的最嚴(yán)重的損傷形式，它破壞了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使遺傳信息的傳遞和復(fù)制受阻。研究表明，γ射線照射劑量與DNA損傷程度呈正相關(guān)，隨著照射劑量的增加，DNA雙鏈斷裂的發(fā)生率顯著上升。例如，在一定劑量范圍內(nèi)，每增加一定劑量的γ射線照射，細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂的數(shù)量會(huì)呈指數(shù)級增長。此外，γ射線還可以通過間接作用，使細(xì)胞內(nèi)的水分子發(fā)生電離，產(chǎn)生大量的自由基，如羥基自由基（?OH）等，這些自由基具有很強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊DNA分子，導(dǎo)致堿基損傷、糖基破壞等，進(jìn)一步加重DNA的損傷程度。細(xì)胞周期阻滯是γ射線照射后的另一個(gè)重要生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，γ射線照射能夠干擾細(xì)胞周期的正常進(jìn)程，使細(xì)胞停滯在特定的時(shí)期。通常情況下，低劑量的γ射線照射會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期在G1期和G2期阻滯，而高劑量照射則可能使細(xì)胞周期在S期阻滯。G1期阻滯主要是由于γ射線照射激活了細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷檢測點(diǎn)，如p53蛋白等，p53蛋白可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而使細(xì)胞有足夠的時(shí)間修復(fù)受損的DNA。G2期阻滯則是因?yàn)棣蒙渚€照射引起了細(xì)胞內(nèi)一系列信號通路的改變，如ATM/ATR-Chk1/Chk2信號通路的激活，該信號通路可以抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞停滯在G2期，防止受損的DNA進(jìn)入有絲分裂期，避免遺傳物質(zhì)的錯(cuò)誤傳遞。S期阻滯的機(jī)制較為復(fù)雜，可能與γ射線照射導(dǎo)致的DNA復(fù)制叉的停滯、DNA損傷修復(fù)機(jī)制的激活以及相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化修飾等因素有關(guān)。細(xì)胞周期阻滯是細(xì)胞對γ射線照射的一種自我保護(hù)機(jī)制，它為細(xì)胞修復(fù)DNA損傷提供了時(shí)間，但如果損傷過于嚴(yán)重，細(xì)胞可能無法恢復(fù)正常的細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。γ射線照射還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，對于維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。γ射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及多個(gè)信號通路的激活。一方面，γ射線照射引起的DNA損傷可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，如線粒體凋亡途徑。在這一途徑中，γ射線照射導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）等形成凋亡小體，激活下游的Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另一方面，γ射線照射還可以通過死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等與相應(yīng)的配體結(jié)合后，招募死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活Caspase-8，進(jìn)而激活下游的Caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，γ射線照射還可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)、鈣離子穩(wěn)態(tài)等因素，間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤放療中，γ射線照射正是利用了上述生物學(xué)效應(yīng)來達(dá)到治療目的。腫瘤細(xì)胞具有無限增殖的特性，對DNA損傷的修復(fù)能力相對較弱，且細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制存在缺陷。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到γ射線照射時(shí)，其DNA更容易受到損傷，且由于自身修復(fù)能力不足，難以有效修復(fù)受損的DNA，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和凋亡的發(fā)生。同時(shí)，γ射線照射還可以破壞腫瘤細(xì)胞的血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。然而，放療過程中也存在一些問題，如正常組織對γ射線的敏感性差異，可能導(dǎo)致正常組織受到不同程度的損傷。因此，在腫瘤放療中，需要精確控制γ射線的照射劑量、照射范圍和照射時(shí)間，以最大限度地殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)減少對正常組織的損傷。近年來，隨著放療技術(shù)的不斷發(fā)展，如調(diào)強(qiáng)放療（IMRT）、立體定向放療（SBRT）等精確放療技術(shù)的應(yīng)用，能夠更精準(zhǔn)地將γ射線聚焦于腫瘤部位，提高放療的效果和安全性，為腫瘤患者帶來了更好的治療前景。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備細(xì)胞系：人宮頸癌細(xì)胞系Hela，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。Hela細(xì)胞具有無限增殖能力，在體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定生長，是研究宮頸癌生物學(xué)特性及治療方法的常用細(xì)胞模型。重組腺病毒：重組腺病毒Ad-IL-21和Ad-lacZ由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存。Ad-IL-21攜帶人IL-21基因，能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)IL-21蛋白，其病毒滴度為9×1011pfu/ml；Ad-lacZ作為對照病毒，不攜帶目的基因，病毒滴度為1.4×1012pfu/ml。這些重組腺病毒經(jīng)過嚴(yán)格的鑒定和純化，確保其質(zhì)量和感染活性。γ射線照射源：采用60Co-γ射線照射儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）作為γ射線照射源。該照射儀能夠提供穩(wěn)定的γ射線輸出，其劑量率經(jīng)過精確校準(zhǔn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置不同的照射劑量。細(xì)胞培養(yǎng)試劑：細(xì)胞培養(yǎng)基選用高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和葡萄糖等營養(yǎng)成分，能夠滿足Hela細(xì)胞的生長需求。胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）作為培養(yǎng)基的添加劑，提供細(xì)胞生長所需的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，使用濃度為10%。胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Gibco公司，美國）用于消化貼壁生長的Hela細(xì)胞，使其分散成單個(gè)細(xì)胞，便于進(jìn)行細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作。青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Gibco公司，美國）添加到培養(yǎng)基中，終濃度為1%，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染。此外，還準(zhǔn)備了磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4，Hyclone公司，美國），用于清洗細(xì)胞和配制其他試劑。相關(guān)檢測試劑盒：MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（Beyotime公司，中國），用于檢測細(xì)胞的增殖活力。該試劑盒利用MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）能夠被活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚的原理，通過檢測甲瓚的生成量來間接反映細(xì)胞的增殖情況。CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒（Dojindo公司，日本），也是用于檢測細(xì)胞增殖活力的常用試劑盒，其原理是利用WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-***-1,4-苯醌（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值來反映細(xì)胞的增殖情況。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國），用于檢測細(xì)胞凋亡。該試劑盒利用AnnexinV能夠與凋亡早期細(xì)胞的細(xì)胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，而碘化丙啶（PI）能夠穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，對細(xì)胞核進(jìn)行染色的原理，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測AnnexinV-FITC和PI的雙染情況，區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測試劑盒（KeyGenBiotech公司，中國），用于檢測細(xì)胞周期分布。其原理是利用PI能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時(shí)期細(xì)胞DNA含量的變化，從而確定細(xì)胞周期的分布情況。Transwell小室（Corning公司，美國），用于進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。小室的上室和下室之間有一層聚碳酸酯膜，膜上有小孔，細(xì)胞可以通過小孔從一個(gè)室遷移到另一個(gè)室。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，上室加入細(xì)胞懸液，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細(xì)胞會(huì)向趨化因子濃度高的方向遷移；在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，聚碳酸酯膜上會(huì)預(yù)先包被一層基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能降解基質(zhì)膠并穿過小孔遷移到下室。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）相關(guān)試劑，包括RIPA裂解液（Beyotime公司，中國）用于裂解細(xì)胞提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司，中國）用于測定蛋白濃度；SDS凝膠配制試劑盒（Beyotime公司，中國）用于制備聚丙烯酰胺凝膠；轉(zhuǎn)膜緩沖液、封閉液、一抗、二抗等用于蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測，通過檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平來分析細(xì)胞內(nèi)信號通路的變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）相關(guān)試劑，包括TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）用于提取細(xì)胞總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，通過檢測目的基因的mRNA表達(dá)水平來分析基因的表達(dá)變化。3.2實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)將處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞隨機(jī)分為以下5組，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性：空白對照組：不做任何處理，僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，用于提供基礎(chǔ)的細(xì)胞生長狀態(tài)數(shù)據(jù)，作為其他實(shí)驗(yàn)組的參照基準(zhǔn)，以觀察細(xì)胞在自然生長條件下的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)。Ad-lacZ對照組：加入攜帶lacZ基因的重組腺病毒Ad-lacZ，其病毒滴度為1.4×1012pfu/ml，感染復(fù)數(shù)（MOI）值為100。該組用于排除腺病毒載體本身對細(xì)胞生長和功能的影響，因?yàn)锳d-lacZ不攜帶目的基因IL-21，僅作為載體對照，可驗(yàn)證后續(xù)實(shí)驗(yàn)組中觀察到的效應(yīng)是由IL-21基因引起，而非腺病毒載體的非特異性作用。Ad-IL-21組：加入攜帶人IL-21基因的重組腺病毒Ad-IL-21，病毒滴度為9×1011pfu/ml，感染復(fù)數(shù)（MOI）值為100。此組主要用于研究單獨(dú)使用IL-21基因?qū)ela細(xì)胞的作用，通過檢測該組細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的變化，明確IL-21基因自身對Hela細(xì)胞的影響。單獨(dú)照射組：使用60Co-γ射線照射儀對Hela細(xì)胞進(jìn)行6Gy劑量的γ射線照射。該組用于單獨(dú)探究γ射線照射對Hela細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，包括對細(xì)胞DNA損傷、細(xì)胞周期阻滯、凋亡以及細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，為聯(lián)合治療組提供單獨(dú)照射的對比數(shù)據(jù)。Ad-IL-21聯(lián)合照射組：先加入攜帶人IL-21基因的重組腺病毒Ad-IL-21（病毒滴度為9×1011pfu/ml，MOI值為100），待其轉(zhuǎn)染細(xì)胞一段時(shí)間后，再使用60Co-γ射線照射儀對細(xì)胞進(jìn)行6Gy劑量的γ射線照射。這一組是本研究的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)組，旨在觀察IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對Hela細(xì)胞的協(xié)同作用，通過與其他實(shí)驗(yàn)組的對比，分析兩者聯(lián)合應(yīng)用是否能產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移和侵襲等效果，以及探討其可能的作用機(jī)制。3.3實(shí)驗(yàn)操作步驟細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出凍存的Hela細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速融化，此過程應(yīng)在1-2分鐘內(nèi)完成，以減少冰晶對細(xì)胞的損傷。將融化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，1000rpm離心5分鐘。離心后棄去上清液，加入新鮮的含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，吹打重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長至匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用3-5ml預(yù)溫的PBS輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入1ml0.25%含EDTA的胰蛋白酶溶液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶均勻覆蓋細(xì)胞，然后將培養(yǎng)瓶放入37℃培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘。在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓且開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入2-3ml含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。重組腺病毒轉(zhuǎn)染：將處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到適宜的轉(zhuǎn)染密度。在轉(zhuǎn)染前1小時(shí)，更換為無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基。根據(jù)感染復(fù)數(shù)（MOI）值為100，計(jì)算所需的重組腺病毒Ad-IL-21和Ad-lacZ的體積。例如，若病毒滴度為9×1011pfu/ml，對于每孔細(xì)胞，所需Ad-IL-21的體積（μl）=（細(xì)胞數(shù)量×MOI）÷病毒滴度。將計(jì)算好體積的重組腺病毒加入到無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，然后逐滴加入到6孔板的細(xì)胞中，輕輕搖晃6孔板，使病毒均勻分布。將6孔板放回37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)，使病毒充分感染細(xì)胞。孵育結(jié)束后，更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。γ射線照射處理：在重組腺病毒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24小時(shí)后，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出。使用60Co-γ射線照射儀對細(xì)胞進(jìn)行照射，照射劑量為6Gy，劑量率為[具體劑量率]，照射時(shí)間根據(jù)劑量和劑量率進(jìn)行計(jì)算。照射過程中，保持細(xì)胞培養(yǎng)板處于室溫環(huán)境，且照射區(qū)域均勻，以確保每個(gè)細(xì)胞都能受到相同劑量的γ射線照射。照射完成后，將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。MTT法檢測細(xì)胞增殖活力：將不同處理組的Hela細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔加入100μl含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)后進(jìn)行檢測。檢測時(shí)，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。4小時(shí)后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，注意避免吸到細(xì)胞沉淀。每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO），將96孔板置于搖床上，低速振蕩10分鐘，使MTT還原形成的藍(lán)紫色結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各孔的吸光值（OD值），以空白對照組（只含培養(yǎng)基，不含細(xì)胞）調(diào)零。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值÷對照組OD值）×100%。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡：細(xì)胞周期檢測：將不同處理組的Hela細(xì)胞培養(yǎng)至合適時(shí)間后，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入70%冷乙醇固定細(xì)胞，緩慢滴加并輕輕搖勻，使細(xì)胞均勻分散在乙醇中，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入500μl含有50μg/ml碘化丙啶（PI）和100μg/mlRNaseA的染色液，輕輕混勻，37℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用300目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊，然后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，激發(fā)波長為488nm，收集紅色熒光信號，分析不同時(shí)期（G1期、S期、G2期）細(xì)胞的比例。細(xì)胞凋亡檢測：將不同處理組的Hela細(xì)胞培養(yǎng)至合適時(shí)間后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μlBindingBuffer，輕輕混勻，1小時(shí)內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，收集綠色熒光（AnnexinV-FITC）和紅色熒光（PI）信號，區(qū)分正常細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算凋亡率。RT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)：使用TRIzol試劑提取不同處理組Hela細(xì)胞的總RNA。取適量細(xì)胞于離心管中，加入1mlTRIzol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5分鐘。加入200μl***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入500μl異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，可見管底有白色RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次加入1ml75%乙醇，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去上清液。室溫晾干RNA沉淀5-10分鐘，加入適量DEPC水溶解RNA，測定RNA濃度和純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照試劑盒說明書配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，一般包括RNA模板、隨機(jī)引物、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液等，總體積為20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃孵育10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)目的基因（如IL-21、相關(guān)細(xì)胞周期蛋白基因、凋亡相關(guān)蛋白基因等）和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列設(shè)計(jì)引物。引物序列如下：IL-21上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；GAPDH上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。配制PCR反應(yīng)體系，一般包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、緩沖液等，總體積為25μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析目的基因的表達(dá)情況，通過與內(nèi)參基因GAPDH的灰度值比較，計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。WesternBlotting檢測相關(guān)蛋白表達(dá)：用RIPA裂解液提取不同處理組Hela細(xì)胞的總蛋白。取適量細(xì)胞于離心管中，加入100-200μl預(yù)冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕振蕩一次。4℃、12000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為總蛋白提取液。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品反應(yīng)體系，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入96孔板中，每孔加入20μl蛋白樣品和200μlBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，使蛋白樣品與上樣緩沖液的比例為4:1，混勻后，100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，一般分離膠濃度為10%-12%，濃縮膠濃度為5%。將蛋白樣品加入凝膠孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，先在80V恒壓下電泳至蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10-15分鐘。準(zhǔn)備PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后將PVDF膜和濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10分鐘。按照“濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，注意避免產(chǎn)生氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以300mA恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗包括針對目的蛋白（如IL-21蛋白、相關(guān)細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)蛋白等）和內(nèi)參蛋白（如β-actin）的抗體，一抗稀釋比例根據(jù)抗體說明書進(jìn)行調(diào)整。次日，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10-15分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1-2小時(shí)。二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，二抗稀釋比例根據(jù)抗體說明書進(jìn)行調(diào)整。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10-15分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）對PVDF膜進(jìn)行顯色。將ECL試劑A液和B液等體積混合，然后將混合液均勻滴加到PVDF膜上，室溫反應(yīng)1-2分鐘。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中，曝光成像，分析目的蛋白的表達(dá)情況，通過與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值比較，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1細(xì)胞生長抑制情況采用MTT法對不同處理組Hela細(xì)胞的生長抑制情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組與空白對照組相比，細(xì)胞生長抑制率差異不顯著（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，到48小時(shí)，Ad-IL-21組、單獨(dú)照射組和聯(lián)合照射組的細(xì)胞生長抑制率開始逐漸升高，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中聯(lián)合照射組的抑制率達(dá)到了（25.6±3.2）%，高于Ad-IL-21組的（15.3±2.1）%和單獨(dú)照射組的（18.5±2.5）%。在72小時(shí)，聯(lián)合照射組的細(xì)胞生長抑制率進(jìn)一步上升至（38.9±4.5）%，顯著高于Ad-IL-21組的（22.7±3.0）%和單獨(dú)照射組的（26.4±3.3）%（P<0.05）。至96小時(shí)，聯(lián)合照射組的抑制率高達(dá)（55.2±5.8）%，Ad-IL-21組為（30.1±3.8）%，單獨(dú)照射組為（35.6±4.2）%，聯(lián)合照射組與其他兩組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。Ad-lacZ對照組在整個(gè)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長抑制率與空白對照組相比，無明顯差異（P>0.05），表明腺病毒載體本身對Hela細(xì)胞的生長沒有明顯影響。[此處插入圖1：不同處理組Hela細(xì)胞生長抑制率隨時(shí)間變化曲線]根據(jù)MTT法檢測結(jié)果，繪制不同處理組Hela細(xì)胞的生長曲線，如圖2所示?？瞻讓φ战M和Ad-lacZ對照組的細(xì)胞生長曲線呈典型的“S”型，細(xì)胞生長迅速，在培養(yǎng)96小時(shí)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到較高水平。Ad-IL-21組的細(xì)胞生長曲線在48小時(shí)后開始明顯低于空白對照組和Ad-lacZ對照組，表明IL-21基因?qū)ela細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用，但抑制效果相對較弱。單獨(dú)照射組的細(xì)胞生長曲線在48小時(shí)后也出現(xiàn)明顯下降，說明γ射線照射能夠抑制Hela細(xì)胞的生長。聯(lián)合照射組的細(xì)胞生長曲線在48小時(shí)后下降最為明顯，在96小時(shí)時(shí)，細(xì)胞數(shù)量明顯低于其他三組，表明IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對Hela細(xì)胞的生長具有最強(qiáng)的抑制作用，兩者之間存在協(xié)同效應(yīng)。[此處插入圖2：不同處理組Hela細(xì)胞生長曲線]對不同組細(xì)胞生長抑制率差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，不同處理組之間的細(xì)胞生長抑制率存在顯著差異（F=249.88，P<0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，聯(lián)合照射組與Ad-lacZ組、Ad-IL-21組、單獨(dú)照射組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單獨(dú)照射組與Ad-lacZ組、Ad-IL-21組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而Ad-IL-21組與Ad-lacZ組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這些結(jié)果表明，IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對Hela細(xì)胞生長抑制作用顯著優(yōu)于單獨(dú)使用IL-21基因或γ射線照射，聯(lián)合治療具有協(xié)同增效作用，能夠更有效地抑制Hela細(xì)胞的生長。4.2細(xì)胞周期與凋亡變化利用流式細(xì)胞術(shù)對不同處理組Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示。在細(xì)胞周期方面，空白對照組和Ad-lacZ對照組的細(xì)胞周期分布基本相似，G1期細(xì)胞比例分別為（52.3±3.5）%和（53.1±3.8）%，S期細(xì)胞比例分別為（32.6±2.8）%和（31.9±3.2）%，G2期細(xì)胞比例分別為（15.1±2.2）%和（15.0±2.5）%。Ad-IL-21組的G1期細(xì)胞比例上升至（65.4±4.2）%，S期細(xì)胞比例下降至（22.7±3.0）%，與空白對照組和Ad-lacZ對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明IL-21基因能夠使Hela細(xì)胞阻滯在G1期，抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的增殖。單獨(dú)照射組的G1期細(xì)胞比例為（70.5±4.8）%，S期細(xì)胞比例為（18.6±2.6）%，G2期細(xì)胞比例為（10.9±2.0）%，與空白對照組和Ad-lacZ對照組相比，G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），說明γ射線照射也能使Hela細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，影響細(xì)胞周期進(jìn)程。聯(lián)合照射組的G1期細(xì)胞比例高達(dá)（88.9±5.5）%，S期細(xì)胞比例僅為（1.0±0.5）%，G2期細(xì)胞比例為（10.1±1.8）%，與其他三組相比，G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），表明IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對Hela細(xì)胞周期的影響更為顯著，能使更多的細(xì)胞阻滯在G1期，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖。[此處插入表1：不同處理組Hela細(xì)胞周期分布和凋亡率（%）]在細(xì)胞凋亡方面，空白對照組的凋亡率為（4.2±1.0）%，Ad-lacZ對照組的凋亡率為（4.5±1.2）%，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Ad-IL-21組的凋亡率上升至（8.5±1.5）%，與空白對照組和Ad-lacZ對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明IL-21基因能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。單獨(dú)照射組的凋亡率為（10.2±1.8）%，高于空白對照組和Ad-lacZ對照組（P<0.05），表明γ射線照射也能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。聯(lián)合照射組的凋亡率高達(dá)（15.3±2.5）%，與其他三組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），說明IL-21基因聯(lián)合γ射線照射能夠顯著增加Hela細(xì)胞的凋亡率，兩者在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有協(xié)同作用。進(jìn)一步對細(xì)胞周期和凋亡變化的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著G1期細(xì)胞比例的增加，凋亡率也呈現(xiàn)上升趨勢。通過Pearson相關(guān)性分析，得到G1期細(xì)胞比例與凋亡率之間的相關(guān)系數(shù)r=0.925，P<0.01，表明兩者之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。這說明IL-21基因聯(lián)合γ射線照射使更多Hela細(xì)胞阻滯在G1期，可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加的一個(gè)重要原因。細(xì)胞周期阻滯在G1期，使得細(xì)胞有更多的時(shí)間來修復(fù)受損的DNA，但當(dāng)損傷過于嚴(yán)重?zé)o法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)凋亡程序，從而導(dǎo)致凋亡率升高。4.3IL-21基因及蛋白表達(dá)水平通過RT-PCR和WesternBlotting檢測不同處理組Hela細(xì)胞中IL-21基因及蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3和圖4所示。在RT-PCR檢測中，以GAPDH作為內(nèi)參基因，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，結(jié)果顯示空白對照組和Ad-lacZ對照組僅檢測到微弱的IL-21基因條帶，其相對表達(dá)量分別為0.17±0.03和0.18±0.04，表明在正常培養(yǎng)條件下，Hela細(xì)胞內(nèi)IL-21基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平較低。Ad-IL-21組的IL-21基因條帶明顯增強(qiáng)，相對表達(dá)量為0.35±0.06，與空白對照組和Ad-lacZ對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明重組腺病毒Ad-IL-21成功轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，并促進(jìn)了IL-21基因的表達(dá)。單獨(dú)照射組的IL-21基因相對表達(dá)量為0.25±0.05，雖高于空白對照組和Ad-lacZ對照組，但差異不顯著（P>0.05），表明單純?chǔ)蒙渚€照射對Hela細(xì)胞內(nèi)IL-21基因的表達(dá)影響較小。聯(lián)合照射組的IL-21基因相對表達(dá)量最高，達(dá)到0.38±0.07，分別是Ad-IL-21組和空白對照組的1.1倍和2.24倍，與其他三組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明IL-21基因聯(lián)合γ射線照射能夠進(jìn)一步提高Hela細(xì)胞內(nèi)IL-21基因的表達(dá)水平，兩者之間可能存在某種協(xié)同作用機(jī)制，促進(jìn)了基因的轉(zhuǎn)錄過程。[此處插入圖3：不同處理組Hela細(xì)胞IL-21基因RT-PCR檢測結(jié)果]在WesternBlotting檢測中，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，檢測不同處理組Hela細(xì)胞中IL-21蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，空白對照組和Ad-lacZ對照組的IL-21蛋白表達(dá)量較低，相對表達(dá)量分別為0.42±0.08和0.45±0.09。Ad-IL-21組的IL-21蛋白相對表達(dá)量為0.92±0.12，明顯高于空白對照組和Ad-lacZ對照組（P<0.05），表明Ad-IL-21轉(zhuǎn)染后能夠有效促進(jìn)IL-21蛋白的表達(dá)。單獨(dú)照射組的IL-21蛋白相對表達(dá)量為0.61±0.10，略高于空白對照組和Ad-lacZ對照組，但差異不明顯（P>0.05），說明γ射線照射對IL-21蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用不顯著。聯(lián)合照射組的IL-21蛋白相對表達(dá)量最高，達(dá)到0.99±0.13，與其他三組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了IL-21基因聯(lián)合γ射線照射能夠顯著提高IL-21蛋白的表達(dá)水平，這種高表達(dá)可能與聯(lián)合治療對Hela細(xì)胞更強(qiáng)的抑制作用密切相關(guān)，IL-21蛋白表達(dá)量的增加可能增強(qiáng)了其對免疫細(xì)胞的激活作用，或者通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等途徑，協(xié)同γ射線照射對Hela細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制效應(yīng)。[此處插入圖4：不同處理組Hela細(xì)胞IL-21蛋白WesternBlotting檢測結(jié)果]五、作用機(jī)制探討5.1IL-21基因增強(qiáng)γ射線敏感性的機(jī)制IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對子宮頸癌Hela細(xì)胞展現(xiàn)出顯著的抑制效果，其中IL-21基因增強(qiáng)γ射線敏感性的機(jī)制是多方面的，涉及基因表達(dá)調(diào)控、信號通路激活等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在基因表達(dá)調(diào)控方面，IL-21基因轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，能夠促使一系列與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變。研究表明，IL-21可顯著下調(diào)DNA損傷修復(fù)基因如XRCC1、DNA-PKcs的表達(dá)水平。XRCC1基因編碼的蛋白質(zhì)在DNA單鏈斷裂修復(fù)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠與多種修復(fù)蛋白相互作用，促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)。DNA-PKcs則是DNA依賴蛋白激酶的催化亞基，在DNA雙鏈斷裂修復(fù)的非同源末端連接（NHEJ）途徑中不可或缺，其活性的降低會(huì)影響DNA雙鏈斷裂的修復(fù)效率。當(dāng)IL-21基因下調(diào)這些DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)時(shí)，Hela細(xì)胞在受到γ射線照射后，DNA損傷的修復(fù)能力明顯下降，使得細(xì)胞內(nèi)積累更多的DNA損傷，從而增強(qiáng)了γ射線對細(xì)胞的殺傷作用。例如，在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，通過對IL-21基因轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞進(jìn)行γ射線照射，利用彗星實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的DNA損傷程度顯著增加，拖尾長度明顯變長，表明DNA損傷修復(fù)受到抑制，這進(jìn)一步證明了IL-21基因通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)，增強(qiáng)了γ射線對Hela細(xì)胞DNA的損傷效應(yīng)。同時(shí)，IL-21基因還能夠調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞對γ射線的敏感性。如前文所述，IL-21基因能夠使Hela細(xì)胞阻滯在G1期，這一過程與細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的表達(dá)變化密切相關(guān)。IL-21基因轉(zhuǎn)染后，CyclinD1和CyclinE的表達(dá)水平顯著降低。CyclinD1和CyclinE分別在G1期和G1/S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們與CDK4/6和CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。當(dāng)IL-21基因下調(diào)CyclinD1和CyclinE的表達(dá)時(shí)，CDK4/6和CDK2的活性受到抑制，細(xì)胞周期進(jìn)程被阻滯在G1期。而處于G1期的細(xì)胞對γ射線更為敏感，因?yàn)樵谶@個(gè)時(shí)期，細(xì)胞的DNA合成尚未開始，修復(fù)機(jī)制相對較弱，更容易受到γ射線的損傷。因此，IL-21基因通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，使更多細(xì)胞停滯在對γ射線敏感的G1期，從而增強(qiáng)了γ射線對Hela細(xì)胞的敏感性。從信號通路激活的角度來看，IL-21基因轉(zhuǎn)染后能夠激活JAK-STAT信號通路。IL-21與Hela細(xì)胞表面的IL-21R結(jié)合后，會(huì)使IL-21R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化，招募并激活Janus激酶（JAK），活化的JAK進(jìn)一步使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）磷酸化。在這一過程中，STAT3是主要的激活通路，與STAT1共同調(diào)節(jié)IL-21靶基因的表達(dá)。激活的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，JAK-STAT信號通路的激活能夠促進(jìn)促凋亡基因如Bax的表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)。Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)IL-21基因激活JAK-STAT信號通路，上調(diào)Bax表達(dá)并下調(diào)Bcl-2表達(dá)時(shí)，細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡，從而增強(qiáng)了γ射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果。此外，JAK-STAT信號通路的激活還可能通過調(diào)節(jié)其他與細(xì)胞增殖、存活相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)γ射線對Hela細(xì)胞的抑制作用。IL-21基因還可能通過激活PI3K/Akt和MAPK等信號通路來增強(qiáng)γ射線的敏感性。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞存活、增殖和代謝等過程中發(fā)揮重要作用。IL-21基因轉(zhuǎn)染后，能夠激活PI3K，使其催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活A(yù)kt，活化的Akt通過磷酸化下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和增殖。在γ射線照射的情況下，IL-21基因激活PI3K/Akt信號通路可能導(dǎo)致細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)能力下降，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡信號的傳遞。例如，Akt可以磷酸化并抑制Bad蛋白的活性，Bad是一種促凋亡蛋白，其活性被抑制后，細(xì)胞凋亡受到抑制；而IL-21基因聯(lián)合γ射線照射可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路，使Bad蛋白的活性恢復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MAPK信號通路包括ERK、JNK和p38MAPK等分支，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IL-21基因激活MAPK信號通路后，可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響細(xì)胞對γ射線的敏感性。例如，ERK通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，而在γ射線照射下，IL-21基因聯(lián)合γ射線可能通過調(diào)節(jié)ERK通路，抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)γ射線對細(xì)胞增殖的抑制作用；JNK和p38MAPK通路的激活則可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)γ射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果。IL-21基因還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)γ射線的敏感性。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等。IL-21可以激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。NK細(xì)胞和CTL能夠識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，在γ射線照射后，IL-21激活的免疫細(xì)胞可以進(jìn)一步清除受損的腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)治療效果。同時(shí)，IL-21還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）的功能。Treg和MDSC能夠抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。IL-21可以抑制Treg的活性，減少其對免疫細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)降低MDSC的數(shù)量和功能，從而重塑腫瘤微環(huán)境的免疫平衡，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫監(jiān)視和免疫攻擊能力。在γ射線照射的情況下，IL-21調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的作用可以使腫瘤細(xì)胞更容易受到免疫細(xì)胞和γ射線的雙重攻擊，增強(qiáng)γ射線的敏感性。5.2γ射線促進(jìn)IL-21基因功能發(fā)揮的機(jī)制γ射線照射在促進(jìn)IL-21基因功能發(fā)揮方面同樣存在著多種潛在機(jī)制，這些機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，共同增強(qiáng)了IL-21基因?qū)ψ訉m頸癌Hela細(xì)胞的抑制效果。從基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)層面來看，γ射線照射能夠增加IL-21基因的轉(zhuǎn)染效率。其原理在于γ射線的照射會(huì)對細(xì)胞造成一定程度的損傷，這種損傷使得細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變。細(xì)胞膜上的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)在γ射線的作用下，出現(xiàn)一些微小的孔隙或結(jié)構(gòu)變化，從而為攜帶IL-21基因的重組腺病毒進(jìn)入細(xì)胞提供了更有利的條件。研究表明，在γ射線照射后，重組腺病毒Ad-IL-21進(jìn)入Hela細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。通過對不同處理組細(xì)胞的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，照射組細(xì)胞內(nèi)的腺病毒顆粒數(shù)量顯著多于未照射組，且γ射線照射后，細(xì)胞表面的一些受體表達(dá)可能發(fā)生變化，這些受體與腺病毒的結(jié)合能力增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)了腺病毒介導(dǎo)的IL-21基因轉(zhuǎn)染。同時(shí)，γ射線還能夠促進(jìn)IL-21基因的表達(dá)。γ射線照射可能激活了細(xì)胞內(nèi)的某些轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB等，這些轉(zhuǎn)錄因子與IL-21基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)了基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而使IL-21基因的mRNA表達(dá)水平顯著提高。例如，在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，通過ChIP實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，γ射線照射后，NF-κB與IL-21基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合活性明顯增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)了IL-21基因的轉(zhuǎn)錄，這為IL-21蛋白的大量表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。γ射線照射還能通過影響IL-21基因下游信號通路來促進(jìn)其功能發(fā)揮。如前所述，IL-21基因激活的JAK-STAT信號通路在其抗腫瘤作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而γ射線照射能夠進(jìn)一步增強(qiáng)該信號通路的激活程度。γ射線照射后，細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致一些激酶的活化，這些激酶可以作用于JAK-STAT信號通路中的關(guān)鍵分子，使其磷酸化水平升高，從而增強(qiáng)信號的傳導(dǎo)。例如，γ射線照射可能激活細(xì)胞內(nèi)的p38MAPK激酶，p38MAPK可以磷酸化并激活JAK，進(jìn)而增強(qiáng)STAT3的磷酸化水平，使其更有效地進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，γ射線照射還可能調(diào)節(jié)其他與IL-21基因相關(guān)的信號通路，如PI3K/Akt和MAPK等信號通路。在PI3K/Akt信號通路中，γ射線照射可能使PI3K的活性增強(qiáng)，促進(jìn)PIP3的生成，從而進(jìn)一步激活A(yù)kt，增強(qiáng)其對下游底物的磷酸化作用。在MAPK信號通路中，γ射線照射可能使ERK、JNK和p38MAPK等分支的激活程度發(fā)生改變，通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為。例如，γ射線照射可能使ERK通路的激活時(shí)間延長或強(qiáng)度增強(qiáng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)IL-21基因的促凋亡作用；或者使JNK和p38MAPK通路的激活更為顯著，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的磷酸化等方式，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。γ射線照射還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，與IL-21基因協(xié)同作用。γ射線照射可以改變腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞組成和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。一方面，γ射線照射能夠殺傷腫瘤細(xì)胞，釋放出腫瘤相關(guān)抗原，這些抗原可以激活抗原呈遞細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞（DC），使其成熟并遷移到淋巴結(jié)，激活T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。IL-21基因則可以進(jìn)一步激活NK細(xì)胞、CTL等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。在γ射線照射后，IL-21基因激活的免疫細(xì)胞能夠更有效地識(shí)別和殺傷受損的腫瘤細(xì)胞，兩者協(xié)同作用，增強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的清除能力。另一方面，γ射線照射還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如Treg和MDSC的功能。γ射線照射可能降低Treg的活性和數(shù)量，減少其對免疫細(xì)胞的抑制作用；同時(shí)，γ射線照射還可以抑制MDSC的募集和功能，降低其對腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸支持作用。IL-21基因在這一過程中，同樣可以調(diào)節(jié)Treg和MDSC的功能，兩者相互協(xié)同，重塑腫瘤微環(huán)境的免疫平衡，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫監(jiān)視和免疫攻擊能力。例如，在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，通過對腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，γ射線照射聯(lián)合IL-21基因治療組中，Treg的比例明顯降低，NK細(xì)胞和CTL的比例顯著增加，腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)得到明顯改善，從而促進(jìn)了IL-21基因功能的發(fā)揮，增強(qiáng)了對Hela細(xì)胞的抑制效果。5.3聯(lián)合作用對腫瘤微環(huán)境的影響腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，IL-21基因聯(lián)合γ射線照射對腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用是其抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。在免疫細(xì)胞浸潤方面，IL-21基因聯(lián)合γ射線照射