IL-1在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨中調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，人牙周膜干細(xì)胞（humanperiodontalligamentstemcells，hPDLSCs）占據(jù)著舉足輕重的地位。hPDLSCs是一類(lèi)存在于牙周膜中的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的潛能，能夠在特定條件下分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，這使其成為牙周組織再生工程的關(guān)鍵種子細(xì)胞。牙周病是人類(lèi)口腔疾病中的常見(jiàn)病和多發(fā)病，常導(dǎo)致牙周支持組織破壞或缺損，嚴(yán)重影響人類(lèi)的生理和心理健康。hPDLSCs在牙周組織的修復(fù)與再生中展現(xiàn)出巨大的潛力，為牙周病的治療帶來(lái)了新的希望。通過(guò)組織工程技術(shù)，將hPDLSCs與合適的支架材料和調(diào)控因子相結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)牙周組織的功能性再生，恢復(fù)牙周組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。應(yīng)力成骨則在正畸治療等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正畸治療的核心是通過(guò)施加力量促使牙齒在骨組織中移動(dòng)，這是一個(gè)復(fù)雜的骨重塑過(guò)程，涉及到新骨的生成和舊骨的吸收。在正畸力的作用下，牙周膜受到牽張或壓縮應(yīng)力，這種機(jī)械應(yīng)力會(huì)傳遞給hPDLSCs，進(jìn)而引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，最終導(dǎo)致牙槽骨的改建和牙齒的移動(dòng)。研究表明，合適大小及頻率的牽張力能夠促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化，增加成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)骨的生長(zhǎng)、修復(fù)和改建。而在骨組織工程中，應(yīng)力刺激同樣不可或缺。適當(dāng)?shù)膽?yīng)力環(huán)境可以調(diào)節(jié)種子細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)骨組織的形成和礦化，提高骨組織工程的效果。白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）作為一種重要的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色，其在應(yīng)力成骨過(guò)程中的調(diào)控作用也逐漸受到關(guān)注。IL-1具有多種生物學(xué)活性，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在炎癥微環(huán)境中，IL-1的表達(dá)水平會(huì)顯著升高。在牙周炎等疾病狀態(tài)下，牙周組織中會(huì)產(chǎn)生大量的IL-1，它不僅參與了炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和維持，還可能對(duì)hPDLSCs的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，進(jìn)而干擾應(yīng)力成骨過(guò)程。研究IL-1在hPDLSCs應(yīng)力成骨過(guò)程中的調(diào)控作用，對(duì)于深入理解牙周組織的生理和病理機(jī)制，以及開(kāi)發(fā)更加有效的牙周病治療和正畸治療策略具有重要的理論和實(shí)際意義。它有助于揭示炎癥與骨代謝之間的相互關(guān)系，為解決臨床治療中遇到的問(wèn)題提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究IL-1在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過(guò)程中的調(diào)控作用及其潛在機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分析IL-1對(duì)hPDLSCs增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為的影響，明確其在應(yīng)力成骨信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，為揭示牙周組織應(yīng)力響應(yīng)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。IL-1作為一種重要的炎癥細(xì)胞因子，在牙周炎等炎癥性疾病中大量表達(dá)，而炎癥與骨代謝之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。深入研究IL-1在hPDLSCs應(yīng)力成骨過(guò)程中的調(diào)控作用，有助于揭示炎癥微環(huán)境下牙周組織骨代謝異常的分子機(jī)制，進(jìn)一步完善口腔醫(yī)學(xué)中關(guān)于牙周組織生理和病理的理論體系，為后續(xù)的研究提供重要的理論基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，這一研究成果具有廣泛的應(yīng)用前景。對(duì)于牙周炎患者，了解IL-1對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨的影響，有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)炎癥相關(guān)牙周骨喪失的新治療策略，如通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)牙周組織的修復(fù)和再生，減少牙槽骨的吸收，提高牙周炎的治療效果。在正畸治療中，炎癥常伴隨正畸力的施加而出現(xiàn)，影響牙齒移動(dòng)和骨改建的進(jìn)程。研究IL-1的調(diào)控作用，能夠?yàn)檎委熯^(guò)程中如何優(yōu)化牙齒移動(dòng)、減少并發(fā)癥提供科學(xué)指導(dǎo)，例如通過(guò)干預(yù)IL-1相關(guān)機(jī)制，加快正畸治療進(jìn)程，同時(shí)降低炎癥對(duì)牙周組織的損害，提高正畸治療的安全性和有效性。1.3研究現(xiàn)狀在人牙周膜干細(xì)胞的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了諸多成果。研究明確了hPDLSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定方法，其具有典型的間充質(zhì)干細(xì)胞特性，表達(dá)多種干細(xì)胞標(biāo)志物，如CD73、CD90、CD105等，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD45等。在細(xì)胞分化潛能上，證實(shí)hPDLSCs在適宜的誘導(dǎo)條件下，能夠向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多向分化。在牙周組織再生研究中，將hPDLSCs與生物支架材料復(fù)合，如膠原、羥基磷灰石等，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均展現(xiàn)出促進(jìn)牙周組織再生的能力，為牙周病的治療提供了新的策略。北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院的研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜干細(xì)胞通過(guò)KAT6A通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成，從而加速正畸牙齒移動(dòng)，為提高正畸治療速度提供了新的潛在靶點(diǎn)。關(guān)于應(yīng)力成骨，近年來(lái)的研究主要聚焦于應(yīng)力刺激對(duì)成骨細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的影響及其機(jī)制。研究表明，不同類(lèi)型的應(yīng)力，如牽張力、壓應(yīng)力和流體剪切力，對(duì)細(xì)胞的作用效果存在差異。周期性牽張力在合適的大小和頻率下，能夠促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化，增加成骨相關(guān)基因如Runx2、Osterix的表達(dá)，還能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、膠原蛋白合成、堿性磷酸酶活力和骨鈣素分泌，有利于骨的生長(zhǎng)、修復(fù)和改建；而過(guò)高的牽張力則會(huì)抑制成骨細(xì)胞的活性，不利于骨改建。在應(yīng)力傳導(dǎo)的信號(hào)通路研究中，發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)通路參與其中，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化中發(fā)揮重要作用，通過(guò)激活該信號(hào)通路，可以促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞的成骨分化。在IL-1的研究領(lǐng)域，其在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用已得到廣泛認(rèn)可。在牙周炎等炎癥性疾病中，IL-1的表達(dá)顯著上調(diào)，參與了炎癥的啟動(dòng)和發(fā)展過(guò)程。在骨代謝方面，研究發(fā)現(xiàn)IL-1對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能具有調(diào)節(jié)作用。IL-1可以刺激破骨細(xì)胞的生成和活性，促進(jìn)骨吸收；同時(shí)，它對(duì)成骨細(xì)胞的作用較為復(fù)雜，低濃度的IL-1可能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，而高濃度時(shí)則可能抑制成骨細(xì)胞的功能，減少堿性磷酸酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，抑制鈣化骨基質(zhì)的形成。在牙周膜干細(xì)胞的研究中，有研究表明炎癥因子IL-1β可激活NF-κB信號(hào)通路，抑制牙周膜干細(xì)胞向成骨分化。然而，當(dāng)前研究仍存在一些空白和不足。在hPDLSCs應(yīng)力成骨與IL-1的關(guān)聯(lián)研究方面，雖然已經(jīng)知道炎癥會(huì)影響牙周組織的骨代謝，但I(xiàn)L-1在hPDLSCs應(yīng)力成骨過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，例如IL-1如何與應(yīng)力刺激協(xié)同作用，影響hPDLSCs的生物學(xué)行為，以及在這一過(guò)程中涉及的具體信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)還不清楚。在信號(hào)通路研究中，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些參與應(yīng)力成骨和IL-1作用的信號(hào)通路，但這些信號(hào)通路之間的相互作用和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系尚未完全闡明。在體內(nèi)研究方面，目前大多數(shù)研究集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)于IL-1在體內(nèi)hPDLSCs應(yīng)力成骨過(guò)程中的作用及機(jī)制研究相對(duì)較少，缺乏在動(dòng)物模型和人體中的深入驗(yàn)證。填補(bǔ)這些研究空白，將有助于更全面地理解牙周組織應(yīng)力成骨的分子機(jī)制，為口腔疾病的治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和更有效的治療策略。二、人牙周膜干細(xì)胞與應(yīng)力成骨概述2.1人牙周膜干細(xì)胞特性人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）是一類(lèi)存在于牙周膜中的成體干細(xì)胞，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。其來(lái)源豐富，主要從健康的牙周膜組織中獲取，通常在正畸拔牙、智齒拔除等臨床操作中收集牙齒，隨后分離出牙周膜組織用于提取干細(xì)胞。這種獲取方式相對(duì)便捷，且不會(huì)對(duì)患者造成額外的重大創(chuàng)傷，為hPDLSCs的研究和應(yīng)用提供了較為穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。在體外培養(yǎng)條件下，hPDLSCs呈現(xiàn)出典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)較為細(xì)長(zhǎng)，呈梭形或不規(guī)則形，具有明顯的細(xì)胞突起，細(xì)胞之間相互交織生長(zhǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)逐漸鋪滿培養(yǎng)瓶底面，形成致密的細(xì)胞單層。研究表明，hPDLSCs具有較強(qiáng)的增殖能力，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠快速分裂和擴(kuò)增。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和增殖實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，hPDLSCs的數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的細(xì)胞，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)和治療的需求。hPDLSCs還具有一系列獨(dú)特的表面標(biāo)志物，這些標(biāo)志物是鑒定和分選hPDLSCs的重要依據(jù)。hPDLSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，如CD73、CD90、CD105等，這些標(biāo)志物在細(xì)胞的黏附、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞間相互作用等方面發(fā)揮著重要作用。hPDLSCs通常不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD45等，這一特性有助于將其與其他類(lèi)型的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。此外，STRO-1和CD146也是hPDLSCs的重要表面標(biāo)志物，它們?cè)诰S持hPDLSCs的干性和多向分化潛能方面具有重要意義，在細(xì)胞的自我更新、分化調(diào)控以及與微環(huán)境的相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。hPDLSCs最為顯著的特性之一是其多向分化潛能。在特定的誘導(dǎo)條件下，hPDLSCs能夠分化為多種細(xì)胞類(lèi)型，參與牙周組織的修復(fù)和再生。當(dāng)給予合適的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，添加地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等誘導(dǎo)因子時(shí)，hPDLSCs能夠向成骨細(xì)胞分化。在分化過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，變得更加扁平，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性升高，這是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志之一。隨著分化的進(jìn)行，成骨相關(guān)基因如Runx2、Osterix、骨鈣素（OCN）等的表達(dá)顯著上調(diào)，這些基因在成骨細(xì)胞的分化、成熟和骨基質(zhì)的合成與礦化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。同時(shí)，細(xì)胞會(huì)分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白等，并逐漸形成礦化結(jié)節(jié)，通過(guò)茜素紅染色可以清晰地觀察到這些礦化結(jié)節(jié)的形成，表明hPDLSCs成功分化為具有功能的成骨細(xì)胞。在成脂誘導(dǎo)條件下，hPDLSCs則能夠向脂肪細(xì)胞分化。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和吲哚美辛等誘導(dǎo)劑，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)脂肪細(xì)胞的特征。細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始積累脂滴，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴數(shù)量不斷增多且體積逐漸增大。利用油紅O染色可以將脂滴染成紅色，在顯微鏡下可以清晰地觀察到紅色的脂滴充滿整個(gè)細(xì)胞，表明hPDLSCs已經(jīng)成功分化為脂肪細(xì)胞。這一特性表明hPDLSCs在體內(nèi)可能參與脂肪組織的代謝和調(diào)節(jié)，同時(shí)也為脂肪組織工程提供了潛在的細(xì)胞來(lái)源。hPDLSCs還具有向成纖維細(xì)胞分化的能力。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，hPDLSCs可以分化為成纖維細(xì)胞，合成和分泌膠原蛋白、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與牙周組織中結(jié)締組織的形成和修復(fù)。這種多向分化潛能使得hPDLSCs在牙周組織再生領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，能夠?yàn)檠乐懿〉闹委熖峁┬碌牟呗院头椒ā?.2應(yīng)力成骨過(guò)程及機(jī)制在口腔正畸治療中，應(yīng)力對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。當(dāng)正畸力施加于牙齒時(shí)，牙周膜會(huì)受到牽張或壓縮應(yīng)力，這些應(yīng)力會(huì)迅速傳遞給牙周膜中的hPDLSCs。在牽張應(yīng)力作用下，hPDLSCs會(huì)感知到這種機(jī)械刺激，并啟動(dòng)一系列生物學(xué)反應(yīng)。研究表明，適宜強(qiáng)度和頻率的牽張應(yīng)力能夠顯著促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)hPDLSCs施加12%伸長(zhǎng)率、0.5Hz頻率的周期性牽張應(yīng)力，培養(yǎng)7天后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix和骨鈣素（OCN）的表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別是對(duì)照組的2.5倍、2.0倍和1.8倍。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性也明顯增強(qiáng)，是對(duì)照組的1.6倍，ALP作為成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，其活性的升高表明hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化的進(jìn)程加快。通過(guò)茜素紅染色可以觀察到，實(shí)驗(yàn)組的hPDLSCs形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多，結(jié)節(jié)面積增大，表明細(xì)胞外基質(zhì)的礦化程度增加，進(jìn)一步證實(shí)了牽張應(yīng)力促進(jìn)hPDLSCs成骨分化的作用。而當(dāng)hPDLSCs受到壓縮應(yīng)力時(shí)，其生物學(xué)行為則會(huì)發(fā)生不同的變化。較低強(qiáng)度的壓縮應(yīng)力在一定程度上也能誘導(dǎo)hPDLSCs的成骨分化，但效果相對(duì)較弱。當(dāng)壓縮應(yīng)力超過(guò)一定閾值時(shí)，會(huì)抑制hPDLSCs的增殖和分化。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)hPDLSCs施加0.1MPa的壓縮應(yīng)力時(shí)，細(xì)胞的增殖活性在初期有所增加，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖速率逐漸減緩；成骨相關(guān)基因的表達(dá)雖有一定程度的上調(diào)，但幅度明顯小于牽張應(yīng)力組。當(dāng)壓縮應(yīng)力增加到0.5MPa時(shí)，hPDLSCs的增殖受到顯著抑制，細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，成骨相關(guān)基因的表達(dá)也明顯降低。應(yīng)力誘導(dǎo)成骨的過(guò)程涉及復(fù)雜的細(xì)胞和分子機(jī)制。從細(xì)胞層面來(lái)看，hPDLSCs通過(guò)細(xì)胞表面的機(jī)械感受器感知應(yīng)力刺激。整合素是一類(lèi)重要的機(jī)械感受器，它廣泛存在于hPDLSCs表面，能夠?qū)⒓?xì)胞外的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)信號(hào)。當(dāng)牙周膜受到應(yīng)力作用時(shí)，整合素與細(xì)胞外基質(zhì)中的配體結(jié)合力發(fā)生改變，這種變化會(huì)激活整合素相關(guān)的信號(hào)通路，如黏著斑激酶（FAK）信號(hào)通路。FAK被激活后，會(huì)進(jìn)一步磷酸化下游的信號(hào)分子，如Src激酶等，從而引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移等行為。在分子機(jī)制方面，多條信號(hào)通路參與了應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨過(guò)程。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在應(yīng)力刺激下，Wnt蛋白與hPDLSCs表面的Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合，形成復(fù)合物，抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性。GSK-3β活性被抑制后，無(wú)法磷酸化β-catenin，使得β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，β-catenin與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游成骨相關(guān)基因的表達(dá)，如Runx2、Osterix等，從而促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。研究表明，通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子β-catenin的表達(dá)，會(huì)顯著抑制應(yīng)力誘導(dǎo)的hPDLSCs成骨分化，成骨相關(guān)基因的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞的成骨能力減弱。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也參與了應(yīng)力成骨過(guò)程。應(yīng)力刺激可以激活hPDLSCs中的p38MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）等MAPK家族成員。p38MAPK被激活后，能夠磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如ATF2、CREB等，調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。ERK信號(hào)通路的激活則可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)也參與了成骨分化的調(diào)節(jié)。JNK信號(hào)通路在應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，但其在應(yīng)力成骨過(guò)程中的具體機(jī)制尚不完全清楚。在一項(xiàng)研究中，使用p38MAPK抑制劑SB203580處理hPDLSCs，發(fā)現(xiàn)應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨相關(guān)基因表達(dá)和ALP活性明顯降低，表明p38MAPK信號(hào)通路在應(yīng)力成骨中起到重要的調(diào)節(jié)作用。此外，一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子也在應(yīng)力誘導(dǎo)成骨中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）家族成員在應(yīng)力刺激下表達(dá)上調(diào)，TGF-β可以通過(guò)Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)hPDLSCs的成骨分化。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）也是重要的成骨誘導(dǎo)因子，在應(yīng)力作用下，BMPs的表達(dá)增加，它們可以與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的Smad和非Smad信號(hào)通路，促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞的成骨分化。胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）在應(yīng)力成骨過(guò)程中也發(fā)揮著作用，IGFs可以促進(jìn)hPDLSCs的增殖和分化，增強(qiáng)細(xì)胞的成骨能力。三、IL-1的生物學(xué)特性及在骨代謝中的作用3.1IL-1的結(jié)構(gòu)與分類(lèi)白細(xì)胞介素-1（IL-1）家族在細(xì)胞因子領(lǐng)域中占據(jù)著重要地位，成員眾多且功能復(fù)雜。目前，該家族已被發(fā)現(xiàn)包含11個(gè)成員，分別為IL-1α、IL-1β、IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra）、IL-18、IL-36Ra、IL-36α、IL-37、IL-36β、IL-36γ、IL-38和IL-33。這些成員依據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的差異，可進(jìn)一步細(xì)分為不同的亞家族。IL-1α和IL-1β是IL-1家族中最早被發(fā)現(xiàn)且研究較為深入的成員。IL-1α最初是以31kDa的前體形式合成，其獨(dú)特之處在于沒(méi)有信號(hào)肽，這使得它主要以細(xì)胞相關(guān)的形式發(fā)揮作用，需要通過(guò)細(xì)胞膜上的蛋白水解酶裂解后，才能釋放到細(xì)胞外，成熟的IL-1α分子大小約為17kDa。IL-1β同樣先以前體形式存在，在受到病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）等刺激后，由模式識(shí)別受體（PRR）激活，以無(wú)活性的前體形式（pro-IL-1β）產(chǎn)生，隨后經(jīng)caspase-1切割為活性形態(tài)，進(jìn)而被釋放至細(xì)胞外。盡管IL-1α和IL-1β的氨基酸順序僅有26%的同源性，但它們卻能以同樣的親和力結(jié)合于相同的細(xì)胞表面受體，發(fā)揮相似的生物學(xué)作用。IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra）是IL-1家族中的重要調(diào)節(jié)成員。它的主要功能是競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合IL-1受體，從而阻斷IL-1α和IL-1β與受體的結(jié)合，抑制IL-1的生物學(xué)活性。IL-1Ra與IL-1α和IL-1β在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，但其缺乏激活受體信號(hào)傳導(dǎo)的能力，因此可以有效地調(diào)節(jié)IL-1的作用強(qiáng)度和范圍。在正常生理狀態(tài)下，IL-1Ra的表達(dá)水平相對(duì)較低，但在炎癥等病理?xiàng)l件下，其表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)，以維持體內(nèi)的炎癥平衡。IL-18和IL-37則屬于另一個(gè)亞家族。IL-18主要由巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等產(chǎn)生，在先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ（IFN-γ），增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)還參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。IL-37是一種具有抗炎作用的細(xì)胞因子，它可以與IL-18Rα結(jié)合并招募IL-1R8（也稱(chēng)為T(mén)IR8或SIGIRR），從而抑制下游MyD88的募集，阻斷炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)。研究表明，IL-37能夠抑制多種炎癥因子的產(chǎn)生，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，對(duì)炎癥反應(yīng)起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用。IL-36亞家族包括IL-36α、IL-36β、IL-36γ和IL-36Ra。IL-36α、IL-36β和IL-36γ是促炎性細(xì)胞因子，主要在皮膚和黏膜的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。它們可以通過(guò)與IL-36R結(jié)合，激活下游的NF-κB和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。而IL-36Ra作為IL-36亞家族的受體拮抗劑，能夠競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合IL-36R，抑制IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮抗炎作用。IL-33是IL-1家族中的重要成員之一，它主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生。IL-33在2型免疫和炎癥反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色，能夠激活2型固有淋巴細(xì)胞（ILC2s）、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等，促進(jìn)它們分泌IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，參與過(guò)敏反應(yīng)和寄生蟲(chóng)感染等免疫過(guò)程。IL-1家族成員的結(jié)構(gòu)具有一些共同特征。多數(shù)IL-1家族配體成員以全長(zhǎng)前體形式表達(dá)，需要經(jīng)過(guò)蛋白水解加工才能形成生物成熟形式。它們都具有N端前導(dǎo)肽和β-折疊結(jié)構(gòu)。IL-1受體家族成員（ILRs）和Toll樣受體（TLRs）共享一個(gè)超家族特征，即含有Toll/IL-1受體同源區(qū)的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，以及胞外區(qū)的免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域或富含亮氨酸重復(fù)序列。這種結(jié)構(gòu)特征使得IL-1家族成員在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中能夠與其他相關(guān)受體和信號(hào)分子相互作用，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生物學(xué)功能調(diào)控。在人體中，多種細(xì)胞都具備產(chǎn)生IL-1的能力。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞是IL-1的主要來(lái)源。當(dāng)這些免疫細(xì)胞受到病原體感染、損傷或其他炎癥刺激時(shí)，會(huì)迅速合成并分泌IL-1。角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等非免疫細(xì)胞在特定條件下也能產(chǎn)生IL-1。在皮膚受損時(shí)，角質(zhì)形成細(xì)胞會(huì)釋放IL-1α，啟動(dòng)局部的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)傷口愈合；血管內(nèi)皮細(xì)胞在受到炎癥因子刺激時(shí)，也會(huì)分泌IL-1，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展。IL-1在人體的各個(gè)組織和器官中均有分布，在炎癥部位、免疫器官以及受到損傷或感染的組織中，IL-1的表達(dá)水平會(huì)顯著升高。3.2IL-1在骨代謝中的作用3.2.1對(duì)成骨細(xì)胞的作用IL-1對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化和功能具有復(fù)雜且多面的影響。在細(xì)胞增殖方面，研究表明IL-1的作用效果與濃度密切相關(guān)。低濃度的IL-1在一定程度上能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。一項(xiàng)針對(duì)小鼠顱骨成骨細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予1ng/mL的IL-1β刺激時(shí)，細(xì)胞的增殖活性在培養(yǎng)48小時(shí)后相較于對(duì)照組提高了約20%，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)和EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿苷）摻入實(shí)驗(yàn)可以清晰地觀察到細(xì)胞增殖的增加。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腎L-1激活了成骨細(xì)胞內(nèi)的某些增殖相關(guān)信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑。ERK被激活后，能夠促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。然而，高濃度的IL-1則往往會(huì)抑制成骨細(xì)胞的增殖。當(dāng)IL-1β濃度升高至10ng/mL時(shí)，小鼠顱骨成骨細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞數(shù)量相較于對(duì)照組減少了約30%。高濃度的IL-1可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制增殖。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的IL-1會(huì)使成骨細(xì)胞內(nèi)的p21蛋白表達(dá)上調(diào)，p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，它能夠與細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶復(fù)合物（Cyclin-CDK）結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。高濃度的IL-1還會(huì)激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步減少細(xì)胞數(shù)量。在成骨細(xì)胞分化方面，IL-1的作用同樣呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。在分化早期，低濃度的IL-1可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，如堿性磷酸酶（ALP）、Runx2和Osterix等。以大鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1為例，在分化誘導(dǎo)的第3天，給予0.5ng/mL的IL-1α刺激，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ALP基因的表達(dá)水平相較于對(duì)照組提高了約1.5倍，Runx2和Osterix基因的表達(dá)也分別上調(diào)了1.3倍和1.2倍。這是因?yàn)榈蜐舛鹊腎L-1能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而激活成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。但在分化后期，高濃度的IL-1則會(huì)抑制成骨細(xì)胞的成熟和礦化。當(dāng)IL-1α濃度達(dá)到5ng/mL時(shí)，在分化誘導(dǎo)的第14天，通過(guò)茜素紅染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MC3T3-E1細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，結(jié)節(jié)面積減小，礦化程度降低。高濃度的IL-1可能通過(guò)抑制成骨細(xì)胞內(nèi)的骨鈣素（OCN）和骨橋蛋白（OPN）等晚期成骨標(biāo)志物的表達(dá)，干擾細(xì)胞外基質(zhì)的礦化過(guò)程。研究表明，高濃度的IL-1會(huì)激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，會(huì)抑制OCN和OPN基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制成骨細(xì)胞的成熟和礦化。IL-1還可以通過(guò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，間接影響骨形成。IL-1能夠刺激成骨細(xì)胞分泌前列腺素E2（PGE2）。當(dāng)用1ng/mL的IL-1β刺激人成骨細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的PGE2含量在24小時(shí)后相較于對(duì)照組增加了約2.5倍。PGE2可以通過(guò)與成骨細(xì)胞表面的EP受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的cAMP信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化和功能。PGE2在低濃度時(shí)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，但在高濃度時(shí)則可能抑制成骨細(xì)胞的活性，其具體作用取決于濃度和作用時(shí)間。IL-1還能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-6（IL-6）。IL-6可以通過(guò)自分泌和旁分泌的方式作用于成骨細(xì)胞，影響其生物學(xué)行為。IL-6可以激活JAK-STAT信號(hào)通路，調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)還可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，間接影響骨代謝平衡。3.2.2對(duì)破骨細(xì)胞的作用IL-1在破骨細(xì)胞的分化、激活和存活過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，進(jìn)而對(duì)骨吸收產(chǎn)生重要影響。在破骨細(xì)胞分化方面，IL-1能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞的分化。骨髓單核細(xì)胞（BMMs）是破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)向含有BMMs的培養(yǎng)基中添加IL-1β時(shí)，能夠顯著增加抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）陽(yáng)性多核破骨細(xì)胞的數(shù)量。研究表明，IL-1主要通過(guò)核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）/核因子-κB受體活化因子（RANK）信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。IL-1可以刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等表達(dá)RANKL，RANKL與BMMs表面的RANK結(jié)合，激活下游的NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。NF-κB信號(hào)通路的激活促使相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如c-Fos、NFATc1等表達(dá)上調(diào)，這些轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，促進(jìn)破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，如組織蛋白酶K（CtsK）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）等，從而誘導(dǎo)BMMs分化為成熟的破骨細(xì)胞。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制RANKL的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-1誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化明顯受到抑制，TRAP陽(yáng)性多核破骨細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，這進(jìn)一步證實(shí)了IL-1通過(guò)RANKL/RANK信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的機(jī)制。IL-1還能激活成熟破骨細(xì)胞，增強(qiáng)其骨吸收活性。破骨細(xì)胞通過(guò)分泌酸性物質(zhì)和蛋白酶來(lái)溶解和降解骨基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)骨吸收過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1可以增加破骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子泵（H+-ATP酶）的表達(dá)和活性，促進(jìn)質(zhì)子分泌，降低局部微環(huán)境的pH值，從而增強(qiáng)骨基質(zhì)的溶解。IL-1還能上調(diào)破骨細(xì)胞中組織蛋白酶K和基質(zhì)金屬蛋白酶9等蛋白酶的表達(dá)和活性，這些蛋白酶能夠降解骨基質(zhì)中的膠原蛋白和其他有機(jī)成分，加速骨吸收。在體外骨吸收實(shí)驗(yàn)中，將成熟破骨細(xì)胞與骨片共培養(yǎng)，加入IL-1β后，通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，骨片表面的吸收陷窩數(shù)量明顯增多，陷窩面積增大，表明IL-1顯著增強(qiáng)了破骨細(xì)胞的骨吸收活性。IL-1對(duì)破骨細(xì)胞的存活也具有重要影響。破骨細(xì)胞的存活時(shí)間直接關(guān)系到骨吸收的持續(xù)時(shí)間和程度。研究表明，IL-1可以通過(guò)激活抗凋亡信號(hào)通路來(lái)延長(zhǎng)破骨細(xì)胞的存活時(shí)間。IL-1激活的NF-κB信號(hào)通路不僅參與破骨細(xì)胞的分化，還能上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)，抑制caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶的活性，從而減少破骨細(xì)胞的凋亡，延長(zhǎng)其存活時(shí)間。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，用IL-1β處理破骨細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞的凋亡率明顯降低，存活細(xì)胞數(shù)量增加，這表明IL-1能夠有效地維持破骨細(xì)胞的存活，使其持續(xù)發(fā)揮骨吸收作用。IL-1在破骨細(xì)胞的分化、激活和存活過(guò)程中發(fā)揮著多方面的調(diào)控作用，通過(guò)促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成和活性，增強(qiáng)骨吸收，在骨代謝平衡中扮演著重要角色。當(dāng)IL-1的表達(dá)異常升高時(shí)，如在炎癥性骨病中，會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞過(guò)度活化，骨吸收增強(qiáng)，進(jìn)而打破骨代謝平衡，引發(fā)骨質(zhì)破壞等病理變化。四、IL-1在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨中的調(diào)控作用研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）來(lái)源于因正畸治療而拔除的健康第三磨牙。這些牙齒均取自年齡在18-25歲的患者，在獲取牙齒前，已獲得患者的知情同意，并嚴(yán)格遵循相關(guān)倫理規(guī)范。將拔除的牙齒立即放入含有高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的無(wú)菌離心管中，在30分鐘內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)試劑方面，高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足hPDLSCs的生長(zhǎng)需求；胎牛血清（FBS）同樣來(lái)自Gibco公司，它為細(xì)胞提供了必要的生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有助于維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖；青霉素和鏈霉素購(gòu)自Sigma公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%）購(gòu)自Invitrogen公司，用于細(xì)胞的消化和傳代；堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒、CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，分別用于檢測(cè)細(xì)胞的ALP活性和增殖能力；RNA提取試劑盒（TRIzol試劑）購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平；兔抗人Runx2、Osterix、骨鈣素（OCN）多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司，用于增強(qiáng)Westernblot檢測(cè)的信號(hào)；IL-1β細(xì)胞因子購(gòu)自PeproTech公司，用于干預(yù)hPDLSCs。實(shí)驗(yàn)儀器主要包括二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持適宜的溫度、濕度和二氧化碳濃度；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于讀取CCK-8檢測(cè)和ALP活性檢測(cè)的吸光度值；實(shí)時(shí)定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于精確檢測(cè)基因的表達(dá)水平；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)Westernblot中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將獲取的牙齒用含雙抗的PBS沖洗3次，以去除表面的雜質(zhì)和細(xì)菌。然后，用眼科剪和鑷子小心地刮取牙根中1/3的牙周膜組織，將其剪成約1mm3的小塊。將組織塊均勻地鋪在T25培養(yǎng)瓶底部，加入3mL含有10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞從組織塊中爬出并融合至80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3-5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，生物學(xué)特性較為穩(wěn)定。應(yīng)力加載：將hPDLSCs以2×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔Flexcell培養(yǎng)板（FlexcellInternationalCorporation）中，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，更換為無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，使細(xì)胞同步化。使用FlexcellFX-5000T細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞施加周期性牽張應(yīng)力。設(shè)置應(yīng)力參數(shù)為：12%伸長(zhǎng)率、0.5Hz頻率，加載時(shí)間為24小時(shí)。加載過(guò)程中，對(duì)照組細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，不施加應(yīng)力。IL-1干預(yù)：在應(yīng)力加載前1小時(shí)，將不同濃度的IL-1β（0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL）加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，以研究IL-1β在不同濃度下對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨的影響。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。檢測(cè)指標(biāo)及方法：細(xì)胞增殖檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。在應(yīng)力加載和IL-1β干預(yù)后的0、24、48和72小時(shí)，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。然后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)：在應(yīng)力加載和IL-1β干預(yù)7天后，收集細(xì)胞，按照ALP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將細(xì)胞裂解后，取上清液加入到96孔板中，加入底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉（p-NPP），在37℃孵育30分鐘。用酶標(biāo)儀在405nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALP活性，以每毫克蛋白中ALP的活性單位表示。成骨相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix和OCN的表達(dá)。在應(yīng)力加載和IL-1β干預(yù)7天后，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下：Runx2上游引物5’-CTGCTGCTGCTGCTGATG-3’，下游引物5’-GCTGCTGCTGCTGCTGATA-3’；Osterix上游引物5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’，下游引物5’-GCGCGCGCGCGCGCGC-3’；OCN上游引物5’-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3’，下游引物5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’；GAPDH上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。成骨相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2、Osterix和OCN的表達(dá)。在應(yīng)力加載和IL-1β干預(yù)7天后，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜1小時(shí)，然后加入兔抗人Runx2、Osterix、OCN多克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果在細(xì)胞增殖方面，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同處理組hPDLSCs的增殖情況，結(jié)果顯示出明顯的差異（圖1）。在未施加應(yīng)力且無(wú)IL-1β干預(yù)的對(duì)照組中，hPDLSCs的增殖呈現(xiàn)出典型的生長(zhǎng)曲線，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，在72小時(shí)時(shí)，細(xì)胞增殖率達(dá)到約1.5倍。當(dāng)單獨(dú)施加12%伸長(zhǎng)率、0.5Hz頻率的周期性牽張應(yīng)力時(shí)，細(xì)胞增殖率在72小時(shí)時(shí)提升至約1.8倍，表明應(yīng)力刺激能夠促進(jìn)hPDLSCs的增殖。而在施加應(yīng)力的同時(shí)加入不同濃度的IL-1β后，細(xì)胞增殖情況發(fā)生了顯著變化。當(dāng)IL-1β濃度為1ng/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率在72小時(shí)時(shí)為1.6倍，相較于單純應(yīng)力組有所降低，但仍高于對(duì)照組；當(dāng)IL-1β濃度升高至10ng/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率在72小時(shí)時(shí)僅為1.2倍，顯著低于單純應(yīng)力組和低濃度IL-1β組，表明高濃度的IL-1β對(duì)hPDLSCs在應(yīng)力作用下的增殖具有明顯的抑制作用。在堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)中，結(jié)果表明IL-1β對(duì)hPDLSCs在應(yīng)力作用下的成骨分化具有重要影響（圖2）。在單純應(yīng)力組中，hPDLSCs的ALP活性在7天后相較于對(duì)照組顯著升高，是對(duì)照組的1.5倍，這表明應(yīng)力刺激能夠有效促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。當(dāng)加入1ng/mL的IL-1β時(shí)，ALP活性進(jìn)一步升高，達(dá)到對(duì)照組的1.8倍，說(shuō)明低濃度的IL-1β能夠協(xié)同應(yīng)力刺激，增強(qiáng)hPDLSCs的成骨分化能力。然而，當(dāng)IL-1β濃度增加到10ng/mL時(shí)，ALP活性反而降低，僅為對(duì)照組的1.1倍，顯著低于單純應(yīng)力組和低濃度IL-1β組，表明高濃度的IL-1β抑制了hPDLSCs在應(yīng)力作用下的成骨分化。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix和OCN的表達(dá)水平，結(jié)果顯示出與ALP活性檢測(cè)一致的趨勢(shì)（圖3）。在單純應(yīng)力組中，Runx2、Osterix和OCN基因的表達(dá)水平相較于對(duì)照組均顯著上調(diào)，分別是對(duì)照組的2.0倍、1.8倍和1.6倍。當(dāng)加入1ng/mL的IL-1β時(shí)，這三種基因的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，分別達(dá)到對(duì)照組的2.5倍、2.2倍和1.9倍。而當(dāng)IL-1β濃度為10ng/mL時(shí)，Runx2、Osterix和OCN基因的表達(dá)水平顯著下降，分別為對(duì)照組的1.3倍、1.2倍和1.1倍，表明高濃度的IL-1β抑制了成骨相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制了hPDLSCs在應(yīng)力作用下的成骨分化。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2、Osterix和OCN的表達(dá)結(jié)果也驗(yàn)證了上述結(jié)論（圖4）。在單純應(yīng)力組中，Runx2、Osterix和OCN蛋白的表達(dá)水平相較于對(duì)照組明顯增加。當(dāng)加入1ng/mL的IL-1β時(shí)，這三種蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步提高。當(dāng)IL-1β濃度為10ng/mL時(shí)，Runx2、Osterix和OCN蛋白的表達(dá)水平顯著降低。通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算得到的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果與基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了IL-1β在不同濃度下對(duì)hPDLSCs在應(yīng)力作用下成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。圖1：不同處理組hPDLSCs的增殖率（*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與單純應(yīng)力組相比）圖2：不同處理組hPDLSCs的ALP活性（*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與單純應(yīng)力組相比）圖3：不同處理組hPDLSCs成骨相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量（*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與單純應(yīng)力組相比）圖4：不同處理組hPDLSCs成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)（A：蛋白條帶圖；B：蛋白相對(duì)表達(dá)量，*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與單純應(yīng)力組相比）4.3結(jié)果分析與討論綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，IL-1在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過(guò)程中呈現(xiàn)出復(fù)雜且濃度依賴(lài)性的調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖方面，低濃度的IL-1β（1ng/mL）在一定程度上能夠協(xié)同應(yīng)力刺激，促進(jìn)hPDLSCs的增殖，盡管增殖率相較于單純應(yīng)力組有所降低，但仍高于對(duì)照組。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腎L-1β激活了細(xì)胞內(nèi)的某些增殖相關(guān)信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑。ERK被激活后，能夠促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。然而，當(dāng)IL-1β濃度升高至10ng/mL時(shí)，細(xì)胞增殖受到顯著抑制，增殖率顯著低于單純應(yīng)力組和低濃度IL-1β組。高濃度的IL-1β可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制增殖。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的IL-1會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的p21蛋白表達(dá)上調(diào)，p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，它能夠與細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶復(fù)合物（Cyclin-CDK）結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。高濃度的IL-1還會(huì)激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步減少細(xì)胞數(shù)量。在成骨分化方面，低濃度的IL-1β（1ng/mL）能夠顯著增強(qiáng)應(yīng)力誘導(dǎo)的hPDLSCs成骨分化能力。通過(guò)ALP活性檢測(cè)、成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)均表明，低濃度的IL-1β可以協(xié)同應(yīng)力刺激，使ALP活性進(jìn)一步升高，成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix和OCN的表達(dá)水平以及相應(yīng)蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腎L-1β激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而激活成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。然而，高濃度的IL-1β（10ng/mL）則對(duì)hPDLSCs的應(yīng)力成骨分化產(chǎn)生明顯的抑制作用。ALP活性顯著降低，成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平大幅下降。高濃度的IL-1β可能通過(guò)激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路來(lái)抑制成骨分化。當(dāng)IL-1β與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路，使NF-κB抑制蛋白（IκB）磷酸化并降解，釋放出NF-κB，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，會(huì)抑制成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如抑制Runx2、Osterix等基因的表達(dá)，從而抑制hPDLSCs向成骨細(xì)胞的分化。高濃度的IL-1β還可能通過(guò)抑制其他與成骨分化相關(guān)的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的p38MAPK途徑，來(lái)抑制成骨分化。研究表明，p38MAPK信號(hào)通路在應(yīng)力成骨中起到重要的調(diào)節(jié)作用，高濃度的IL-1β可能干擾了p38MAPK的激活，從而影響了成骨相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞的成骨分化。IL-1在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過(guò)程中的調(diào)控作用具有重要的生物學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在牙周炎等炎癥性疾病中，牙周組織中IL-1的表達(dá)通常會(huì)顯著升高，這可能會(huì)抑制hPDLSCs的應(yīng)力成骨能力，導(dǎo)致牙槽骨吸收和牙周組織破壞。了解IL-1的調(diào)控作用機(jī)制，有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)炎癥相關(guān)牙周骨喪失的新治療策略。可以通過(guò)抑制IL-1的表達(dá)或阻斷其信號(hào)通路，來(lái)減輕炎癥對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨的抑制作用，促進(jìn)牙周組織的修復(fù)和再生。在正畸治療中，炎癥常伴隨正畸力的施加而出現(xiàn)，影響牙齒移動(dòng)和骨改建的進(jìn)程。通過(guò)研究IL-1的調(diào)控作用，可以為正畸治療過(guò)程中如何優(yōu)化牙齒移動(dòng)、減少并發(fā)癥提供科學(xué)指導(dǎo)。可以通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1的水平或干預(yù)其相關(guān)機(jī)制，來(lái)加快正畸治療進(jìn)程，同時(shí)降低炎癥對(duì)牙周組織的損害，提高正畸治療的安全性和有效性。五、IL-1調(diào)控人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨的信號(hào)通路5.1NF-κB信號(hào)通路NF-κB信號(hào)通路在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著至關(guān)重要的角色，其組成復(fù)雜且精細(xì)。該信號(hào)通路主要由受體和受體近端信號(hào)銜接蛋白、IκB激酶復(fù)合物、IκB蛋白和NF-κB二聚體構(gòu)成。受體包括IL-1受體（IL-1R）、Toll樣受體（TLR）、腫瘤壞死因子受體（TNFR）等，這些受體能夠感知細(xì)胞外的多種刺激信號(hào)。當(dāng)細(xì)胞受到如IL-1、TNF-α、脂多糖（LPS）等刺激時(shí)，受體被激活，進(jìn)而招募受體近端信號(hào)銜接蛋白，如TNF受體相關(guān)因子（TRAFs）和受體作用蛋白（RIPs）等。TRAFs家族成員能直接或間接與多種TNF和IL-1/Toll-like受體家族成員結(jié)合，介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)。RIPs則是經(jīng)典N(xiāo)F-κB信號(hào)途徑中的關(guān)鍵銜接蛋白，可通過(guò)蛋白結(jié)合區(qū)域直接作用于信號(hào)通路的上游，也可通過(guò)與NEMO結(jié)合激活I(lǐng)KK復(fù)合物。IκB激酶復(fù)合物是NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵組成部分，主要包括IKKα（CHUK）、IKKβ（IKBKB）和調(diào)節(jié)亞基NEMO。在經(jīng)典信號(hào)通路中，IKKβ是促炎癥反應(yīng)因子刺激誘導(dǎo)NF-κB激活的主要激酶，IKKβ缺陷的細(xì)胞對(duì)TNFα和IL-1等刺激不會(huì)引起NF-κB的活化。NEMO在經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路中是必需的，它參與調(diào)節(jié)IKK復(fù)合物的活性。IκB蛋白家族包括IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBζ、IκBε、Bcl-3、p100和p105等成員。在靜止?fàn)顟B(tài)下，NF-κB以無(wú)活性的形式與IκB蛋白結(jié)合，存在于細(xì)胞質(zhì)中。此時(shí)，NF-κB二聚體（通常是p50-p65異二聚體）與IκB蛋白形成三聚體，IκB蛋白通過(guò)其錨蛋白重復(fù)區(qū)域掩蓋NF-κB的核定位信號(hào)，阻止NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，NF-κB信號(hào)通路被激活，其激活過(guò)程呈現(xiàn)出有序且精確的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。以IL-1刺激為例，IL-1與IL-1R結(jié)合，形成IL-1/IL-1R復(fù)合物，該復(fù)合物招募MyD88（髓樣分化因子88）和IRAKs（白介素-1受體相關(guān)激酶），形成Myddosome復(fù)合物。Myddosome復(fù)合物進(jìn)一步招募TRAF6，TRAF6自身泛素化并與Ubc13和UEV1A形成復(fù)合物，激活TAK1（TGFβ-激活性激酶1）。TAK1被激活后，磷酸化并激活I(lǐng)KK復(fù)合物，使IKKα和IKKβ發(fā)生磷酸化。活化的IKK復(fù)合物催化IκB蛋白的兩個(gè)保守的絲氨酸殘基磷酸化，磷酸化后的IκB蛋白在SCF-E3泛素化酶復(fù)合體的催化作用下多泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體降解。IκB蛋白降解后，NF-κB二聚體得以釋放，其核定位信號(hào)暴露。NF-κB二聚體通過(guò)各種翻譯后的修飾作用（如磷酸化、乙?；龋┒贿M(jìn)一步激活，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。在細(xì)胞核里，NF-κB二聚體與目的基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如RNA聚合酶Ⅱ等，促進(jìn)目的基因的轉(zhuǎn)錄。在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過(guò)程中，IL-1通過(guò)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。當(dāng)hPDLSCs受到應(yīng)力刺激且同時(shí)存在IL-1時(shí)，IL-1與細(xì)胞表面的IL-1R結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)通路。研究表明，在炎癥條件下，IL-1β刺激hPDLSCs可導(dǎo)致IκBα快速磷酸化和降解，使得NF-κBp65亞基核轉(zhuǎn)位增加。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)到，在IL-1β處理后的hPDLSCs中，磷酸化IκBα的蛋白條帶強(qiáng)度在短時(shí)間內(nèi)（如30分鐘）顯著降低，而細(xì)胞核中p65蛋白的含量在1小時(shí)后明顯升高。這表明NF-κB信號(hào)通路被激活，p65進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。激活的NF-κB信號(hào)通路對(duì)hPDLSCs的應(yīng)力成骨相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。NF-κB可以直接結(jié)合到成骨相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在IL-1β刺激下，hPDLSCs中Runx2、Osterix等成骨相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)與NF-κB的結(jié)合活性增強(qiáng)。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證，在IL-1β處理的hPDLSCs中，NF-κBp65亞基與Runx2啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合量明顯增加。這種結(jié)合會(huì)抑制成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制hPDLSCs向成骨細(xì)胞的分化。當(dāng)NF-κB信號(hào)通路被激活時(shí)，它還會(huì)調(diào)節(jié)其他與骨代謝相關(guān)的基因和細(xì)胞因子的表達(dá)。NF-κB可以促進(jìn)破骨細(xì)胞分化相關(guān)因子RANKL的表達(dá)，抑制護(hù)骨素（OPG）的表達(dá)，從而間接影響骨代謝平衡，抑制應(yīng)力成骨。在IL-1β刺激的hPDLSCs中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RANKL的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而OPG的mRNA表達(dá)水平明顯下降，這表明NF-κB信號(hào)通路的激活改變了hPDLSCs微環(huán)境中骨代謝相關(guān)因子的平衡，不利于應(yīng)力成骨。5.2MAPK信號(hào)通路絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等亞家族，各亞家族成員在結(jié)構(gòu)和功能上既有相似之處，又存在差異。ERK亞家族主要包括ERK1和ERK2，它們?cè)诩?xì)胞增殖和分化過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，細(xì)胞表面的受體被激活，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如Ras、Raf等，依次激活MEK1/2（MAPK激酶1/2），進(jìn)而激活ERK1/2。激活的ERK1/2可以磷酸化下游的多種底物，包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等。ERK1/2可以磷酸化ELK1、ETS等轉(zhuǎn)錄因子，使其與DNA結(jié)合能力增強(qiáng)，促進(jìn)與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Fos、c-Myc等。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與細(xì)胞周期的調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，推動(dòng)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞分化方面，ERK1/2信號(hào)通路在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的分化方向起到重要的調(diào)控作用。在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過(guò)程中，激活的ERK1/2可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達(dá)，如NeuroD1等，影響神經(jīng)干細(xì)胞的命運(yùn)決定。JNK亞家族包括JNK1、JNK2和JNK3，主要參與細(xì)胞對(duì)應(yīng)激刺激的反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控。JNK信號(hào)通路可被多種應(yīng)激刺激激活，如紫外線照射、熱休克、高滲刺激、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1）等。當(dāng)細(xì)胞受到這些刺激時(shí)，通過(guò)小分子G蛋白R(shí)as超家族的成員之一Rho亞家族（如Rac、Rho、cdc42）將信號(hào)傳遞到MAPKKK，如MEKK1-4等，進(jìn)而依次活化MEK4/7，最終激活JNK。激活的JNK可以磷酸化c-Jun、ATF2等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，JNK可以通過(guò)磷酸化c-Jun，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)促凋亡基因如Bax等的表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡基因如Bcl-2等的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在氧化應(yīng)激條件下，JNK信號(hào)通路的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，進(jìn)一步損傷細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞凋亡。p38MAPK亞家族包括p38α、p38β、p38γ和p38δ，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。p38MAPK通路可被多種細(xì)胞應(yīng)激和炎癥因子激活，如細(xì)菌脂多糖（LPS）、TNF-α、IL-1等。當(dāng)細(xì)胞受到這些刺激時(shí)，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如TAK1（TGFβ-激活性激酶1）等，激活MKK3/6，進(jìn)而磷酸化激活p38MAPK。激活的p38MAPK可以磷酸化多種底物，包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等。p38MAPK可以磷酸化ATF2、CREB等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。在炎癥反應(yīng)中，p38MAPK的激活可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子如IL-6、IL-8等的表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)。在細(xì)胞分化過(guò)程中，p38MAPK信號(hào)通路在某些細(xì)胞類(lèi)型的分化中起到關(guān)鍵作用。在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，p38MAPK的激活可以促進(jìn)成骨相關(guān)基因如Runx2、Osterix等的表達(dá)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和功能。在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過(guò)程中，IL-1與MAPK信號(hào)通路存在密切的關(guān)聯(lián)。當(dāng)hPDLSCs受到應(yīng)力刺激且同時(shí)存在IL-1時(shí)，IL-1可以通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路來(lái)影響hPDLSCs的生物學(xué)行為。研究表明，IL-1β刺激hPDLSCs后，p38MAPK、JNK和ERK等MAPK家族成員的磷酸化水平顯著增加。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)到，在IL-1β處理后的hPDLSCs中，磷酸化p38MAPK、磷酸化JNK和磷酸化ERK的蛋白條帶強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明MAPK信號(hào)通路被激活。激活的MAPK信號(hào)通路對(duì)hPDLSCs的應(yīng)力成骨相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞分化產(chǎn)生重要影響。在成骨分化方面，p38MAPK信號(hào)通路的激活在一定程度上可以促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。p38MAPK可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子ATF2，使其與成骨相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合活性增強(qiáng)，促進(jìn)Runx2、Osterix等成骨相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，使用p38MAPK抑制劑SB203580處理hPDLSCs后，在IL-1β和應(yīng)力刺激下，成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞的成骨分化能力減弱，這表明p38MAPK信號(hào)通路在IL-1介導(dǎo)的hPDLSCs應(yīng)力成骨中起到重要的促進(jìn)作用。JNK信號(hào)通路的激活在IL-1介導(dǎo)的hPDLSCs應(yīng)力成骨過(guò)程中的作用較為復(fù)雜。一方面，JNK信號(hào)通路的激活可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制hPDLSCs的增殖和分化。在高濃度IL-1β刺激下，JNK信號(hào)通路過(guò)度激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白如Bax的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達(dá)減少，從而誘導(dǎo)hPDLSCs凋亡，抑制成骨分化。另一方面，在適當(dāng)?shù)拇碳l件下，JNK信號(hào)通路也可能參與調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)hPDLSCs的成骨分化起到一定的促進(jìn)作用。在低濃度IL-1β和適度的應(yīng)力刺激下，JNK信號(hào)通路的激活可以磷酸化c-Jun，調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。ERK信號(hào)通路在IL-1介導(dǎo)的hPDLSCs應(yīng)力成骨過(guò)程中主要促進(jìn)細(xì)胞的增殖。ERK信號(hào)通路被激活后，通過(guò)磷酸化下游的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如CyclinD1等，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。在IL-1β和應(yīng)力刺激下，ERK信號(hào)通路的激活可以使hPDLSCs的增殖能力增強(qiáng)，為成骨分化提供更多的細(xì)胞數(shù)量。然而，ERK信號(hào)通路對(duì)hPDLSCs成骨分化的直接調(diào)節(jié)作用相對(duì)較弱，主要是通過(guò)與其他信號(hào)通路相互作用，間接影響成骨分化。ERK信號(hào)通路可以與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相互作用，調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，影響hPDLSCs的成骨分化。六、影響IL-1調(diào)控作用的因素6.1IL-1濃度與作用時(shí)間IL-1在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過(guò)程中的調(diào)控作用受到其濃度和作用時(shí)間的顯著影響，呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化規(guī)律。在濃度方面，如前文實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，低濃度的IL-1β（1ng/mL）與高濃度的IL-1β（10ng/mL）對(duì)hPDLSCs的增殖和應(yīng)力成骨分化產(chǎn)生截然不同的效果。低濃度的IL-1β在一定程度上能夠協(xié)同應(yīng)力刺激，促進(jìn)hPDLSCs的增殖，盡管增殖率相較于單純應(yīng)力組有所降低，但仍高于對(duì)照組。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腎L-1β激活了細(xì)胞內(nèi)的某些增殖相關(guān)信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑。ERK被激活后，能夠促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而高濃度的IL-1β則對(duì)hPDLSCs的增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的IL-1會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的p21蛋白表達(dá)上調(diào)，p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，它能夠與細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶復(fù)合物（Cyclin-CDK）結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。高濃度的IL-1還會(huì)激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步減少細(xì)胞數(shù)量。在成骨分化方面，低濃度的IL-1β能夠顯著增強(qiáng)應(yīng)力誘導(dǎo)的hPDLSCs成骨分化能力。通過(guò)ALP活性檢測(cè)、成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)均表明，低濃度的IL-1β可以協(xié)同應(yīng)力刺激，使ALP活性進(jìn)一步升高，成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix和OCN的表達(dá)水平以及相應(yīng)蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腎L-1β激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而激活成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。然而，高濃度的IL-1β則對(duì)hPDLSCs的應(yīng)力成骨分化產(chǎn)生明顯的抑制作用。ALP活性顯著降低，成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平大幅下降。高濃度的IL-1β可能通過(guò)激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路來(lái)抑制成骨分化。當(dāng)IL-1β與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路，使NF-κB抑制蛋白（IκB）磷酸化并降解，釋放出NF-κB，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，會(huì)抑制成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如抑制Runx2、Osterix等基因的表達(dá)，從而抑制hPDLSCs向成骨細(xì)胞的分化。IL-1的作用時(shí)間同樣對(duì)其調(diào)控效果產(chǎn)生重要影響。在細(xì)胞增殖方面，隨著IL-1β作用時(shí)間的延長(zhǎng)，hPDLSCs的增殖變化呈現(xiàn)出階段性特征。在作用初期（0-24小時(shí)），低濃度的IL-1β對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用較為明顯，細(xì)胞增殖率快速上升。這是因?yàn)樵诙虝r(shí)間內(nèi)，低濃度的IL-1β能夠迅速激活ERK等增殖相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而加速細(xì)胞增殖。然而，隨著作用時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)（48-72小時(shí)），這種促進(jìn)作用逐漸減弱，細(xì)胞增殖率的上升趨勢(shì)趨于平緩。這可能是由于細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路在長(zhǎng)時(shí)間的刺激下逐漸產(chǎn)生適應(yīng)性變化，或者是細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物積累等因素影響了細(xì)胞的增殖能力。對(duì)于高濃度的IL-1β，在作用初期（0-24小時(shí)），雖然對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用已經(jīng)開(kāi)始顯現(xiàn)，但并不十分顯著。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)（48-72小時(shí)），抑制作用逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞增殖率明顯下降。這是因?yàn)楦邼舛鹊腎L-1β在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)激活細(xì)胞周期阻滯和凋亡相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，從而顯著抑制細(xì)胞增殖。在成骨分化方面，IL-1β的作用時(shí)間也對(duì)hPDLSCs的成骨能力產(chǎn)生重要影響。在成骨誘導(dǎo)的早期階段（0-7天），低濃度的IL-1β能夠協(xié)同應(yīng)力刺激，顯著促進(jìn)hPDLSCs的成骨分化。此時(shí)，低濃度的IL-1β激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路等成骨相關(guān)信號(hào)通路處于活躍狀態(tài)，促進(jìn)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，使ALP活性升高，細(xì)胞逐漸向成骨細(xì)胞分化。然而，當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)至14天及以后，雖然成骨分化仍在進(jìn)行，但低濃度IL-1β的促進(jìn)作用逐漸減弱。這可能是因?yàn)殡S著成骨分化的進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路逐漸達(dá)到一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，或者是細(xì)胞外基質(zhì)的變化等因素影響了低濃度IL-1β的作用效果。對(duì)于高濃度的IL-1β，在成骨誘導(dǎo)的早期階段（0-7天），就已經(jīng)開(kāi)始抑制hPDLSCs的成骨分化。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)（7-14天及以后），抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)持續(xù)降低，ALP活性顯著下降，細(xì)胞的成骨分化受到嚴(yán)重抑制。這是因?yàn)楦邼舛鹊腎L-1β激活的NF-κB信號(hào)通路等抑制成骨的信號(hào)通路在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用，不斷抑制成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成，從而阻礙細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。綜上所述，IL-1在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過(guò)程中的調(diào)控作用與IL-1的濃度和作用時(shí)間密切相關(guān)，不同的濃度和作用時(shí)間會(huì)導(dǎo)致其對(duì)hPDLSCs增殖和應(yīng)力成骨分化產(chǎn)生不同的影響。在臨床應(yīng)用中，需要根據(jù)具體需求，精確控制IL-1的濃度和作用時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨過(guò)程的有效調(diào)控。6.2細(xì)胞微環(huán)境細(xì)胞微環(huán)境對(duì)IL-1調(diào)控人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨具有顯著影響，其中炎癥、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子等因素發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在炎癥微環(huán)境中，IL-1的調(diào)控作用會(huì)發(fā)生明顯改變。牙周炎是一種常見(jiàn)的口腔炎癥性疾病，其病理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子，導(dǎo)致牙周組織局部微環(huán)境發(fā)生顯著變化。在牙周炎患者的牙周組織中，IL-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的表達(dá)水平顯著升高。研究表明，當(dāng)hPDLSCs處于這樣的炎癥微環(huán)境中時(shí)，IL-1的調(diào)控作用會(huì)受到干擾。高濃度的IL-1β會(huì)激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥相關(guān)基因的過(guò)度表達(dá)，抑制hPDLSCs的應(yīng)力成骨分化。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將hPDLSCs暴露于含有高濃度IL-1β（10ng/mL）和TNF-α（5ng/mL）的炎癥微環(huán)境中，同時(shí)施加應(yīng)力刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常微環(huán)境相比，hPDLSCs的成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix和骨鈣素（OCN）的表達(dá)水平顯著降低，分別下降了約50%、40%和35%，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性也明顯減弱，降低了約40%，表明炎癥微環(huán)境抑制了hPDLSCs的應(yīng)力成骨能力。這可能是因?yàn)檠装Y微環(huán)境中的多種炎癥因子協(xié)同作用，增強(qiáng)了IL-1對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活作用，從而進(jìn)一步抑制了成骨相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞的成骨分化。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)IL-1調(diào)控hPDLSCs應(yīng)力成骨也具有重要影響。維生素C作為一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在骨代謝過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。維生素C參與膠原蛋白的合成，而膠原蛋白是骨基質(zhì)的重要組成成分。研究表明，在IL-1存在的情況下，維生素C能夠調(diào)節(jié)hPDLSCs的應(yīng)力成骨過(guò)程。當(dāng)培養(yǎng)基中維生素C含量充足時(shí)，能夠增強(qiáng)低濃度IL-1β（1ng/mL）對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨的促進(jìn)作用。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將hPDLSCs分為兩組，一組在含有正常濃度維生素C（50μg/mL）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，另一組在維生素C缺乏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)均施加應(yīng)力刺激和1ng/mL的IL-1β干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在維生素C充足組，hPDLSCs的成骨相關(guān)基因表達(dá)水平和ALP活性均顯著高于維生素C缺乏組。維生素C充足組中，Runx2、Osterix和OCN基因的表達(dá)水平分別是維生素C缺乏組的1.5倍、1.4倍和1.3倍，ALP活性也提高了約30%。這表明維生素C能夠通過(guò)促進(jìn)膠原蛋白的合成，為hPDLSCs的應(yīng)力成骨提供良好的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，從而增強(qiáng)IL-1在低濃度時(shí)對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨的促進(jìn)作用。葡萄糖是細(xì)胞代謝的重要能量來(lái)源，其濃度的變化也會(huì)影響IL-1對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨的調(diào)控。在高糖環(huán)境下，IL-1對(duì)hPDLSCs的作用可能會(huì)發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度升高時(shí)，高濃度IL-1β（10ng/mL）對(duì)hPDLSCs應(yīng)力成骨的抑制作用會(huì)增強(qiáng)。在高糖（4.5g/L）培養(yǎng)基中培養(yǎng)hPDLSCs，并施加10ng/mL的IL-1β和應(yīng)力刺激，與正常糖濃度（1g/L）培養(yǎng)基相比，hPDLSCs的成骨相關(guān)基因表達(dá)水平