HMGB2在肝癌中的表達及臨床意義：探索肝癌診療新方向一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，其發病率和死亡率長期居高不下。據統計，2018年中國新發肝癌病例約39萬，死亡人數達36萬，分別位居新發惡性腫瘤和腫瘤致死原因的第三位。在中國，肝癌的高發與乙型肝炎的廣泛流行密切相關，盡管乙肝陽性率從曾經的10%左右降至當前的7%-8%，但龐大的人口基數使得中國的肝癌患者數量在全球范圍內仍遙遙領先。肝癌的惡性程度極高，具有易復發、轉移等特點，患者預后普遍較差，早期診斷的困難更是導致許多患者錯失最佳治療時機。傳統的治療方法，如手術切除、化療、放療等，雖在一定程度上能夠緩解病情，但整體療效仍不盡人意。近年來，靶向治療和免疫治療等新興手段雖為肝癌治療帶來了新希望，但仍面臨諸多挑戰，如耐藥性、高昂的治療費用等。因此，深入探尋肝癌的發病機制，尋找更為有效的診斷標志物和治療靶點，成為當前肝癌研究領域的緊迫任務。高遷移率族蛋白B2（HMGB2），作為一種與內質網結合的SET復合體的關鍵組成部分，在細胞生理過程中發揮著不可或缺的作用。其能夠直接與SET相互作用，并展現出優先結合單鏈DNA以及解開雙鏈DNA的能力。已有研究表明，HMGB2在多種癌癥的發生發展進程中扮演著重要角色，如在成神經管細胞瘤、惡性胃腸基質癌以及皮膚鱗狀細胞癌等疾病中，均發現HMGB2存在異常表達的現象。然而，在肝癌領域，HMGB2的研究仍相對匱乏，其與肝癌的相關性以及在肝癌發生、發展、轉移等過程中的具體作用機制，尚未得到充分的揭示。對HMGB2在肝癌中的表達情況及其臨床意義展開深入研究，具有極其重要的價值。在理論層面，有望進一步明晰肝癌的發病機制，為深入理解肝癌的生物學行為提供全新的視角和理論依據；在臨床實踐方面，若能證實HMGB2與肝癌的密切關聯，它極有可能成為一種全新的肝癌診斷標志物，有助于提高肝癌的早期診斷率，實現疾病的早發現、早治療；同時，也有望為肝癌的治療開辟新的靶點，為開發更為有效的治療策略奠定基礎，從而顯著改善肝癌患者的預后，降低死亡率，具有重要的臨床價值和社會意義。1.2國內外研究現狀在國外，HMGB2的研究起步相對較早，涉及多個領域。在癌癥研究方面，已明確HMGB2在成神經管細胞瘤、惡性胃腸基質癌以及皮膚鱗狀細胞癌等疾病中呈現異常表達。例如，在成神經管細胞瘤的研究中，通過cDNA芯片技術對成神經管細胞瘤和正常小腦樣品的基因表達水平進行比較，發現HMGB2基因在成神經管細胞瘤中表達水平顯著升高，提示其可能在該腫瘤的發生發展過程中扮演重要角色。在惡性胃腸基質癌的研究里，運用定量RT-PCR技術檢測，證實了HMGB2基因在惡性胃腸基質癌中存在過表達現象，為進一步探究其在胃腸道腫瘤中的作用機制提供了線索。對于皮膚鱗狀細胞癌，研究表明HMGB2與腫瘤變化程度密切相關，且可能對細胞分化、腫瘤生長以及轉移起到有效的刺激作用，這為皮膚鱗狀細胞癌的治療和預后評估提供了新的潛在靶點和思路。在國內，肝癌的研究一直是醫學領域的重點方向。近年來，針對HMGB2與肝癌相關性的研究逐漸增多。有研究利用TCGA和GEO公共數據庫數據，深入分析了HMGB2mRNA在肝細胞癌（HCC）組織中的表達特點。研究結果顯示，HCC組織中HMGB2mRNA的表達水平顯著高于癌旁正常組織，且在TNM分期晚、分化程度低和甲胎蛋白高表達的HCC組織中，HMGB2mRNA的表達水平更高。通過Kaplan-Meier法生存分析發現，HMGB2mRNA高表達者的總體生存期、無進展生存時間均明顯小于低表達者，這初步表明HMGB2的表達與肝癌的惡性程度及患者預后密切相關。此外，在細胞實驗層面，有研究采用Westernblot法檢測正常肝細胞LO2和HCC細胞SMMC7721、Hep3B中HMGB2蛋白的表達，結果顯示HCC細胞中HMGB2蛋白表達顯著升高。進一步用HMGB2siRNA轉染SMMC7721和Hep3B細胞后，發現細胞增殖、侵襲能力顯著降低，細胞被阻滯于G0/G1期，細胞凋亡率明顯增加，這進一步證實了HMGB2在肝癌細胞生物學活性調控中的重要作用，提示其有可能成為肝癌診斷及治療的新靶點。盡管國內外針對HMGB2與癌癥的相關性已開展了一系列研究，在肝癌領域也取得了一定成果，但仍存在諸多研究空白。一方面，HMGB2在肝癌發生、發展、轉移等過程中的具體分子機制尚未完全明確，其上下游的調控網絡以及與其他信號通路之間的相互作用關系有待進一步深入探究。例如，HMGB2是否通過與某些關鍵基因或蛋白相互作用，影響肝癌細胞的增殖、凋亡和遷移等生物學行為，目前尚不清楚。另一方面，雖然已有研究表明HMGB2與肝癌的惡性程度和預后相關，但將其作為肝癌診斷標志物和治療靶點的臨床應用研究仍處于初步階段，缺乏大規模的臨床驗證和多中心的聯合研究，距離真正應用于臨床實踐仍有較長的路要走。1.3研究方法與創新點在研究方法上，本研究將綜合運用多種實驗技術與數據分析手段。首先，收集肝癌患者的癌組織及癌旁正常組織樣本，采用免疫組織化學染色技術，直觀地檢測HMGB2蛋白在組織中的表達水平及定位情況，通過顯微鏡觀察染色結果，分析其在不同組織中的表達差異。同時，運用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術，精確測定樣本中HMGB2mRNA的相對表達量，從基因轉錄水平探究其與肝癌的相關性。此外，選取肝癌細胞系和正常肝細胞系，進行細胞培養實驗，通過Westernblot法檢測細胞中HMGB2蛋白的表達，進一步驗證其在細胞層面的表達差異。為深入研究HMGB2對肝癌細胞生物學行為的影響，將采用RNA干擾技術，構建針對HMGB2的小干擾RNA（siRNA），轉染肝癌細胞，使HMGB2基因表達沉默，然后利用細胞增殖實驗（如CCK-8法）檢測細胞增殖能力的變化，通過Transwell實驗評估細胞侵襲和遷移能力的改變，運用流式細胞術分析細胞周期分布和凋亡情況，全面揭示HMGB2在肝癌細胞生長、轉移等過程中的作用機制。在數據分析方面，對于免疫組化、qRT-PCR、Westernblot等實驗所得的數據，將采用統計學軟件進行分析，通過計算均值、標準差等指標，運用t檢驗、方差分析等方法，比較肝癌組織與癌旁組織、不同肝癌細胞系以及干擾前后細胞中HMGB2表達水平的差異，判斷其是否具有統計學意義；對于細胞實驗中涉及細胞增殖、侵襲、遷移、周期和凋亡等數據，同樣進行統計學分析，明確HMGB2對肝癌細胞生物學行為影響的顯著性。本研究的創新點主要體現在以下幾個方面。其一，研究視角創新，盡管已有研究表明HMGB2在多種癌癥中存在異常表達，但在肝癌領域，其具體作用機制和臨床意義尚未得到充分闡釋。本研究聚焦于HMGB2在肝癌中的表達及功能研究，有望為肝癌的發病機制提供新的理論依據，填補該領域在這方面研究的相對空白。其二，研究方法創新，本研究將多種實驗技術有機結合，從組織、細胞和分子多個層面，全面、系統地探究HMGB2與肝癌的相關性，相比以往單一技術的研究，能夠更深入、準確地揭示其內在聯系和作用機制，為后續研究提供更為全面和可靠的實驗數據支持。其三，潛在應用價值創新，若研究結果證實HMGB2與肝癌的密切關聯，其不僅有可能成為肝癌早期診斷的新型生物標志物，提高肝癌的早期診斷準確率，而且有望為肝癌的靶向治療提供新的靶點，為開發更為有效的治療策略奠定基礎，具有重要的臨床應用前景和潛在的社會經濟效益。二、HMGB2與肝癌的相關理論基礎2.1HMGB2的結構與功能高遷移率族蛋白B2（HMGB2），作為高遷移率族蛋白（HMG）家族中的重要成員，在細胞的生理和病理過程中發揮著關鍵作用。其編碼基因位于人類染色體4q34.1上，該基因所轉錄和翻譯形成的HMGB2蛋白，具有獨特而精細的分子結構。從整體架構來看，HMGB2主要由三個關鍵結構域構成。其中，最為顯著的是兩個HMG-box結構域，這兩個結構域與HMGB1具有高達99%的同源性，它們在HMGB2與DNA的相互作用過程中扮演著核心角色，是DNA結合的特異性結構域。HMG-box結構域呈現出一種獨特的三維空間構象，由一系列α-螺旋通過特定的連接方式組合而成，形成了一種能夠緊密契合DNA雙螺旋結構的特殊形狀。這種結構特點使得HMG-box能夠以極高的親和力和特異性識別并結合DNA分子，尤其是對單鏈DNA具有優先結合能力。當HMGB2與單鏈DNA結合時，其HMG-box結構域能夠通過與DNA鏈上的堿基和磷酸骨架之間形成多種非共價相互作用，如氫鍵、范德華力和靜電相互作用等，實現穩定的結合，從而對DNA的結構和功能產生重要影響。在DNA復制、轉錄、修復等過程中，HMGB2的HMG-box結構域可以與相關的DNA區域結合，協助招募或穩定其他參與這些過程的蛋白質和酶，促進DNA的解旋、模板暴露以及新鏈的合成等關鍵步驟的順利進行。除了兩個HMG-box結構域之外，HMGB2還包含一個C端結構域。這個結構域在介導HMGB2與其他蛋白質的相互作用方面發揮著不可或缺的作用。C端結構域富含大量帶負電荷的氨基酸殘基，這些殘基賦予了該結構域獨特的電荷性質和空間構象，使其能夠與眾多具有特定結構和功能的蛋白質分子發生特異性的相互作用。通過與不同蛋白質的結合，HMGB2可以參與到多種復雜的蛋白質-蛋白質相互作用網絡中，進而在細胞內信號傳導、基因表達調控、染色質重塑等多個重要的生理過程中發揮關鍵的調節作用。在基因轉錄調控過程中，HMGB2的C端結構域可以與轉錄因子、轉錄輔助因子等蛋白質相互作用，形成轉錄調控復合物。這些復合物能夠結合到基因的啟動子或增強子區域，通過影響轉錄起始復合物的組裝、RNA聚合酶的活性以及染色質的結構狀態等，實現對基因轉錄水平的精確調控，從而影響細胞的分化、增殖、凋亡等生物學行為。在細胞內，HMGB2發揮著廣泛而重要的正常生理功能。首先，在DNA重組與修復過程中，HMGB2扮演著至關重要的角色。當細胞受到內外界各種因素的刺激，如紫外線照射、化學物質損傷、電離輻射等，導致DNA分子出現損傷時，HMGB2能夠迅速響應并被招募到損傷位點。其HMG-box結構域優先結合到損傷部位的單鏈DNA或雙鏈DNA的斷裂末端，通過與其他DNA修復相關蛋白，如DNA聚合酶、連接酶、核酸內切酶等相互作用，協助這些酶準確地識別損傷部位，去除受損的DNA片段，并以完整的DNA鏈為模板進行修復合成，從而確保DNA分子的完整性和遺傳信息的穩定性。如果HMGB2的功能出現異常，可能會導致DNA修復過程受阻，使得細胞內積累大量的DNA損傷，進而增加細胞發生基因突變、染色體畸變等遺傳物質改變的風險，最終可能引發細胞的癌變或其他疾病的發生。其次，HMGB2在基因表達調控方面也發揮著關鍵作用。它可以通過與染色質上的特定DNA序列以及多種轉錄相關蛋白相互作用，調節染色質的結構和狀態，進而影響基因的轉錄活性。在染色質處于緊密折疊的狀態時，基因的轉錄通常受到抑制。而HMGB2能夠結合到染色質上，通過與組蛋白等染色質組成成分相互作用，促使染色質結構發生重塑，使得原本緊密纏繞的DNA鏈得以部分解開，暴露出基因的啟動子和增強子區域，為轉錄因子和RNA聚合酶等轉錄相關蛋白的結合提供了機會，從而促進基因的轉錄起始和延伸過程。此外，HMGB2還可以與一些轉錄抑制因子或激活因子相互作用，通過調節它們與DNA的結合能力或活性，間接影響基因的表達水平。在細胞分化過程中，HMGB2可以通過調控一系列與細胞分化相關基因的表達，引導細胞朝著特定的方向分化，形成具有不同形態和功能的細胞類型。HMGB2還參與了細胞周期的調控過程。細胞周期的正常進行對于細胞的增殖、分化和維持機體的正常生理功能至關重要。研究表明，HMGB2在細胞周期的不同階段發揮著不同的調節作用。在細胞周期的G1期，HMGB2可以通過與相關的細胞周期調控蛋白相互作用，促進細胞從G1期向S期的過渡，啟動DNA的復制過程。在S期，HMGB2參與維持DNA復制的準確性和穩定性，確保遺傳物質的正確傳遞。在G2/M期，HMGB2又可以通過調節紡錘體的組裝和染色體的分離等過程，保證細胞能夠順利完成有絲分裂，產生兩個遺傳物質完全相同的子代細胞。如果HMGB2在細胞周期調控過程中出現異常表達或功能失調，可能會導致細胞周期紊亂，細胞出現異常增殖或凋亡受阻等現象，這也是腫瘤發生發展的重要機制之一。2.2肝癌的發病機制與特點肝癌，作為肝臟惡性腫瘤的統稱，涵蓋了肝細胞癌（HCC）、肝內膽管癌（ICC）和混合型肝癌等多種病理類型，其中肝細胞癌在臨床上最為常見，約占原發性肝癌的75%-85%。其發病機制極為復雜，是多種因素長期相互作用的結果。從病因學角度來看，病毒性肝炎感染是肝癌發生的首要危險因素，尤其是乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）。全球范圍內，約50%-80%的肝癌病例與HBV感染密切相關，在中國，這一比例更是高達80%以上。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，其基因組可整合到宿主肝細胞的基因組中，引發一系列復雜的分子事件。一方面，病毒基因的整合可能導致宿主細胞原癌基因的激活或抑癌基因的失活，如HBVX蛋白（HBx）能夠與多種細胞內信號通路關鍵分子相互作用，干擾細胞周期調控、DNA修復以及細胞凋亡等正常生理過程，促進細胞的異常增殖和轉化。另一方面，長期的HBV感染會引發機體的免疫反應，導致肝臟慢性炎癥和持續的肝細胞損傷，肝臟在反復的損傷與修復過程中，容易發生基因突變和染色體異常，進而增加肝癌的發病風險。HCV則是一種單鏈RNA病毒，其感染主要通過直接細胞毒性作用以及誘導機體免疫反應來損傷肝臟細胞。HCV核心蛋白可以干擾細胞內的信號傳導通路，影響脂質代謝、細胞周期調控和凋亡等過程，同時，免疫細胞在清除HCV感染細胞的過程中，也會釋放大量的炎癥因子，進一步加重肝臟炎癥和纖維化，最終促使肝癌的發生。肝硬化同樣是肝癌發生的重要危險因素之一，約70%-90%的肝細胞癌患者合并有肝硬化。肝硬化是一種慢性進行性肝臟疾病，其病理特征為肝臟彌漫性纖維化、假小葉和再生結節形成。在肝硬化的發展過程中，肝臟的正常組織結構和功能遭到嚴重破壞，肝實質細胞大量減少，纖維結締組織增生，導致肝臟微循環障礙和肝細胞缺血缺氧。這種病理狀態會持續刺激肝細胞的增殖和分化異常，同時，肝硬化時肝臟的免疫監視功能下降，無法有效識別和清除發生癌變的細胞，使得癌細胞得以在肝臟內生長和擴散。此外，肝硬化患者體內的一些細胞因子和生長因子表達失調，如轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，這些因子可以促進肝星狀細胞的活化和增殖，進一步加重肝臟纖維化，同時也為肝癌細胞的生長提供了適宜的微環境。黃曲霉毒素B1（AFB1）是一種由黃曲霉和寄生曲霉產生的強致癌性真菌***，也是引發肝癌的重要環境因素之一。AFB1主要污染玉米、花生、大米等糧食作物，人類通過食用被污染的食物而攝入AFB1。AFB1進入人體后，在肝臟細胞色素P450酶系的作用下，被代謝活化成具有強反應活性的環氧化物，這些環氧化物能夠與DNA分子中的鳥嘌呤殘基結合，形成AFB1-DNA加合物。這種加合物的形成會導致DNA復制錯誤和基因突變，尤其是對腫瘤抑制基因p53的損傷最為顯著，p53基因的突變會使其失去對細胞增殖和凋亡的調控能力，從而促使肝細胞發生癌變。流行病學研究表明，在AFB1污染嚴重的地區，肝癌的發病率明顯升高，如中國的廣西、江蘇啟東等地，AFB1的暴露與肝癌的發生呈現出顯著的正相關關系。除上述主要因素外，肝癌的發生還與遺傳因素、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、酗酒、飲用水污染等多種因素有關。遺傳因素在肝癌的發病中起著一定的作用，家族聚集性現象表明某些遺傳基因的突變或多態性可能增加個體對肝癌的易感性。例如，一些研究發現，染色體1p、4q、8p等區域的雜合性缺失以及某些基因如TERT、CTNNB1、TP53等的突變，在肝癌家族中更為常見。NAFLD近年來在全球范圍內的發病率呈逐年上升趨勢，其發病與肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征密切相關。NAFLD患者肝臟內脂肪過度堆積，引發氧化應激、炎癥反應和胰島素抵抗等病理生理過程，導致肝細胞損傷和纖維化，進而增加肝癌的發病風險。長期酗酒會導致酒精性肝病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化，這些疾病狀態下，肝臟的代謝功能受損，對致癌物質的解毒能力下降，同時酒精及其代謝產物乙醛還具有直接的細胞毒性和致癌性，可誘導肝細胞發生癌變。飲用水污染，特別是水源中存在的藻類***、化學物質如亞硝胺類化合物等，也與肝癌的發生存在一定關聯。在病理特點方面，肝細胞癌的大體形態可分為巨塊型、結節型、彌漫型和小癌型。巨塊型肝癌通常為單個巨大的癌塊，直徑大于10cm，呈膨脹性生長，可伴有出血、壞死和液化，周圍可有衛星結節；結節型肝癌表現為多個大小不等的癌結節，直徑一般在3-5cm之間，散在分布于肝臟內，與周圍組織分界不清；彌漫型肝癌較為少見，癌結節較小，彌漫分布于全肝，與肝硬化結節難以區分，病情發展迅速，預后極差；小癌型肝癌則指瘤體直徑小于3cm的肝癌，多為單結節，包膜多完整，癌栓發生率較低，癌細胞分化較好，預后相對較好。在組織學上，肝細胞癌主要由肝細胞分化而來，癌細胞呈多邊形，核大而核仁明顯，排列成巢狀或索狀，在巢或索之間有豐富的血竇，無間質成分。根據癌細胞的分化程度，可分為高分化、中分化和低分化三個級別，分化程度越高，癌細胞的形態和功能越接近正常肝細胞，惡性程度相對較低；分化程度越低，癌細胞的異型性越大，惡性程度越高，預后越差。肝內膽管癌起源于肝內膽管上皮細胞，其發病率相對較低，約占原發性肝癌的10%-15%。在大體形態上，肝內膽管癌可表現為腫塊型、管周浸潤型和管內生長型。腫塊型肝內膽管癌通常為單個較大的腫塊，邊界不清，質地堅硬，常伴有肝內膽管擴張；管周浸潤型主要沿膽管壁浸潤生長，導致膽管壁增厚、管腔狹窄，可引起膽汁淤積和黃疸；管內生長型則呈息肉樣或乳頭狀生長于膽管腔內，可阻塞膽管，引起膽管炎和黃疸。組織學上，肝內膽管癌主要為腺癌，癌細胞呈立方形或柱狀，排列成腺體，纖維組織較多，血竇相對較少。肝內膽管癌的惡性程度較高，早期癥狀不明顯，發現時多已處于中晚期，手術切除率低，預后較差。混合型肝癌則同時具有肝細胞癌和肝內膽管癌兩種成分，其發生率較少，約占肝臟腫瘤的5%。混合型肝癌的病理特征較為復雜，兩種癌成分可相互混雜或分區存在，在基因表型分析上顯示分屬兩個獨立的克隆。該型肝癌具有高侵襲性，術后5年生存率較低，比單純性肝細胞癌可能更差，治療原則與肝細胞癌相似。肝癌在臨床特點方面，早期癥狀往往不典型，多數患者無明顯不適，部分患者可能出現食欲減退、腹脹、乏力、消瘦等非特異性癥狀，容易被忽視。隨著腫瘤的進展，患者可出現肝區疼痛，多為持續性鈍痛或脹痛，這是由于腫瘤迅速生長，使肝包膜張力增加所致；還可出現腹部腫塊，質地堅硬，表面不平，有壓痛；當腫瘤侵犯膽管或壓迫膽管時，可引起黃疸，表現為皮膚和鞏膜黃染、尿色加深等；此外，肝癌患者還可能出現腹水，多為漏出液，是由于肝硬化、門靜脈高壓、低蛋白血癥等因素導致的。肝癌具有易復發和轉移的特點，其轉移途徑主要包括血行轉移、淋巴轉移和直接浸潤。血行轉移最為常見，癌細胞可通過肝靜脈進入體循環，轉移至肺、骨、腦等遠處器官，其中肺轉移最為多見；淋巴轉移可轉移至肝門淋巴結、腹腔淋巴結等；直接浸潤則可侵犯周圍組織和器官，如膈肌、胃、結腸等。由于肝癌起病隱匿，早期診斷困難，大多數患者確診時已處于中晚期，失去了手術根治的機會，因此肝癌的總體預后較差，5年生存率較低。2.3HMGB2與腫瘤發生發展的潛在聯系近年來，大量研究聚焦于HMGB2在腫瘤發生發展進程中的潛在作用機制，從分子和細胞層面揭示了其與腫瘤之間千絲萬縷的聯系。在分子層面，HMGB2能夠通過多種途徑對腫瘤細胞的基因表達和信號傳導進行精準調控。研究發現，HMGB2可直接與特定的DNA序列緊密結合，進而影響基因的轉錄過程。在乳腺癌細胞中，HMGB2能夠特異性地結合到某些癌基因的啟動子區域，通過招募轉錄相關因子，形成轉錄起始復合物，促進癌基因的轉錄激活，從而增強癌細胞的增殖能力和侵襲性。此外，HMGB2還可以通過與轉錄因子相互作用，間接調控基因表達。例如，在結直腸癌中，HMGB2與轉錄因子Snail相互結合，協同促進上皮-間質轉化（EMT）相關基因的表達，誘導腫瘤細胞發生EMT過程，使其獲得更強的遷移和侵襲能力，從而促進腫瘤的轉移。HMGB2在腫瘤細胞信號傳導通路中也扮演著重要角色，參與多個關鍵信號通路的調控。在PI3K/Akt信號通路中，HMGB2可通過與PI3K的調節亞基相互作用，激活PI3K，進而使Akt蛋白磷酸化，激活下游一系列與細胞增殖、存活和代謝相關的蛋白激酶，促進腫瘤細胞的生長和存活。在肝癌細胞中，抑制HMGB2的表達能夠顯著降低PI3K/Akt信號通路的活性，導致細胞增殖受到抑制，凋亡明顯增加。在Wnt/β-catenin信號通路中，HMGB2能夠與β-catenin相互作用，穩定β-catenin蛋白，并促進其進入細胞核，與TCF/LEF家族轉錄因子結合，激活相關靶基因的表達，如c-Myc、CyclinD1等，這些基因在細胞增殖、分化和腫瘤發生過程中發揮著關鍵作用。在胃癌細胞中，HMGB2的高表達可激活Wnt/β-catenin信號通路，促進癌細胞的增殖和遷移，而沉默HMGB2則能夠抑制該信號通路，使癌細胞的生物學行為受到明顯抑制。從細胞層面來看，HMGB2對腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為產生著深遠影響。在腫瘤細胞增殖方面，眾多研究表明，HMGB2的高表達往往與腫瘤細胞的快速增殖密切相關。在骨肉瘤細胞中，過表達HMGB2能夠顯著促進細胞的增殖，縮短細胞周期，增加S期細胞的比例；相反，利用RNA干擾技術沉默HMGB2的表達后，骨肉瘤細胞的增殖速度明顯減緩，細胞周期阻滯在G0/G1期。進一步的機制研究發現，HMGB2可能通過調節細胞周期相關蛋白的表達來影響細胞增殖。HMGB2能夠促進CyclinD1、CyclinE等細胞周期蛋白的表達，同時抑制p21、p27等細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達，從而推動細胞周期進程，促進腫瘤細胞的增殖。在腫瘤細胞凋亡調控方面，HMGB2發揮著重要的抗凋亡作用。在非小細胞肺癌細胞中，HMGB2的高表達能夠抑制細胞凋亡，使癌細胞對化療藥物的敏感性降低。其抗凋亡機制可能與調節凋亡相關蛋白的表達有關。HMGB2可以上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時下調促凋亡蛋白Bax的表達，從而抑制線粒體途徑的細胞凋亡。此外，HMGB2還可以通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制caspase-3等凋亡執行蛋白的活性，進一步增強腫瘤細胞的抗凋亡能力。HMGB2對腫瘤細胞的遷移和侵襲能力也具有顯著的促進作用。在乳腺癌細胞的Transwell實驗中，過表達HMGB2的細胞穿過基底膜的數量明顯增多，表明其遷移和侵襲能力增強；而敲低HMGB2后，乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力則受到明顯抑制。在機制上，HMGB2促進腫瘤細胞遷移和侵襲的作用與EMT過程密切相關。如前文所述，HMGB2通過調控EMT相關基因的表達，誘導腫瘤細胞發生EMT，使上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，從而增強細胞的遷移和侵襲能力。此外，HMGB2還可以通過調節細胞外基質降解酶的表達，如基質金屬蛋白酶（MMPs），促進細胞外基質的降解，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創造有利條件。在卵巢癌細胞中，HMGB2能夠上調MMP-2和MMP-9的表達，增強癌細胞對細胞外基質的降解能力，進而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。三、HMGB2在肝癌組織中的表達情況研究3.1研究設計與樣本收集本研究旨在全面、系統地探究HMGB2在肝癌組織中的表達情況，通過嚴謹的實驗設計和科學的樣本收集，確保研究結果的準確性和可靠性。實驗設計思路主要圍繞對比肝癌組織與癌旁正常組織中HMGB2的表達差異展開。通過收集同一患者的肝癌組織和距離腫瘤邊緣至少2cm的癌旁正常組織樣本，在個體層面上消除了個體間差異對實驗結果的干擾，使實驗結果更能準確反映HMGB2在肝癌發生發展過程中的表達變化。同時，采用多種實驗技術，從基因轉錄水平和蛋白質表達水平兩個層面，運用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術和免疫組織化學染色技術，對HMGB2的表達進行檢測，多維度、全方位地分析其表達情況，為深入研究HMGB2與肝癌的相關性提供充足的數據支持。樣本來源為[具體醫院名稱]在[具體時間段]內收治的肝癌患者。這些患者均經過嚴格的臨床診斷、影像學檢查（如超聲、CT、MRI等）以及病理學檢查確診為原發性肝癌。納入標準為：患者簽署知情同意書，自愿參與本研究；年齡在18-75歲之間；無其他惡性腫瘤病史；未接受過術前化療、放療或其他抗腫瘤治療。排除標準為：合并有其他嚴重的系統性疾病，如心、肺、腎功能衰竭等；存在精神疾病或認知障礙，無法配合研究；標本質量不佳，無法滿足實驗檢測要求。共收集到符合條件的肝癌組織樣本[X]例，癌旁正常組織樣本[X]例。詳細記錄每例患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤分化程度、TNM分期、乙肝表面抗原（HBsAg）、丙肝抗體（抗-HCV）等指標。其中男性患者[X]例，女性患者[X]例；年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為（[平均年齡]±[標準差]）歲；腫瘤大小[最小腫瘤直徑]-[最大腫瘤直徑]cm，平均直徑為（[平均腫瘤直徑]±[標準差]）cm；腫瘤數目單發者[X]例，多發者[X]例；根據世界衛生組織（WHO）的腫瘤分類標準，腫瘤分化程度高分化者[X]例，中分化者[X]例，低分化者[X]例；TNM分期依據國際抗癌聯盟（UICC）第[具體版本]版TNM分期系統，I期患者[X]例，II期患者[X]例，III期患者[X]例，IV期患者[X]例；HBsAg陽性者[X]例，抗-HCV陽性者[X]例。通過嚴格的樣本收集和詳細的臨床病理資料記錄，為后續深入分析HMGB2表達與肝癌患者臨床病理特征之間的關系奠定了堅實基礎，有助于全面揭示HMGB2在肝癌發生發展過程中的作用機制和臨床意義。3.2檢測方法與技術路線為準確檢測HMGB2在肝癌組織中的表達情況，本研究采用了多種先進的檢測技術，涵蓋mRNA水平和蛋白水平的檢測，每種技術均遵循嚴格的實驗操作流程，以確保實驗結果的準確性和可靠性。在mRNA表達檢測方面，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術。該技術的原理基于逆轉錄反應和PCR擴增技術，能夠對特定基因的mRNA進行定量分析。具體實驗操作流程如下：首先進行樣本總RNA的提取，將收集的肝癌組織和癌旁正常組織樣本迅速放入液氮中冷凍保存，以防止RNA降解。在提取RNA時，使用Trizol試劑，按照其說明書進行操作。將組織樣本在液氮中研磨成粉末狀，加入適量的Trizol試劑，充分勻漿，使細胞裂解，釋放出RNA。然后加入氯仿進行分層，離心后RNA存在于上層水相中。將水相轉移至新的離心管中，加入異丙醇沉淀RNA，經過洗滌、干燥等步驟后，得到純凈的總RNA。使用核酸蛋白測定儀測定提取的RNA濃度和純度，確保RNA的質量符合后續實驗要求，一般要求A260/A280的比值在1.8-2.0之間。接著進行逆轉錄反應，將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。使用逆轉錄試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。在反應體系中加入適量的總RNA、逆轉錄引物、逆轉錄酶、dNTPs以及緩沖液等，在特定的溫度條件下進行逆轉錄反應，將RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應完成后，得到的cDNA可用于后續的qRT-PCR擴增。在qRT-PCR擴增階段，根據HMGB2基因的序列設計特異性引物，同時選擇內參基因（如β-actin、GAPDH等）的引物，內參基因在不同組織和細胞中的表達相對穩定，用于校正目的基因的表達水平。在反應體系中加入cDNA模板、特異性引物、SYBRGreen熒光染料、TaqDNA聚合酶、dNTPs以及緩沖液等。將反應體系置于實時熒光定量PCR儀中，按照預設的程序進行擴增反應。擴增程序一般包括預變性、變性、退火、延伸等步驟，在每個循環的延伸階段采集熒光信號。隨著PCR反應的進行，目的基因的擴增產物不斷積累，熒光信號強度也隨之增加。通過實時監測熒光信號的變化，利用儀器自帶的分析軟件，根據標準曲線法或ΔΔCt法計算出HMGB2mRNA在肝癌組織和癌旁正常組織中的相對表達量。在蛋白表達檢測方面，運用免疫組織化學染色技術。該技術利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過標記抗體來顯示細胞或組織中的抗原成分，從而對蛋白的表達水平和定位進行檢測。具體實驗操作流程如下：將收集的肝癌組織和癌旁正常組織樣本用10%中性福爾馬林固定，固定時間一般為12-24小時，以保持組織的形態和抗原性。固定后的組織樣本經過脫水、透明、浸蠟等步驟，然后進行石蠟包埋，制成石蠟切片，切片厚度一般為4-5μm。將石蠟切片進行脫蠟處理，依次將切片放入二甲苯I、二甲苯II中浸泡，以去除石蠟。然后進行水化處理，將切片依次放入不同濃度的乙醇溶液（100%、95%、90%、80%、70%）中浸泡，使組織重新恢復水分。接著進行抗原修復，由于在組織固定和包埋過程中，抗原表位可能被封閉，通過抗原修復可以暴露抗原表位，提高檢測的靈敏度。常用的抗原修復方法有高溫高壓修復法、微波修復法等，本研究采用檸檬酸鹽緩沖液進行高溫高壓抗原修復。修復后的切片用3%過氧化氫溶液浸泡，以消除內源性過氧化物酶的活性，避免非特異性染色。然后用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。接下來進行封閉處理，用5%山羊血清或牛血清白蛋白（BSA）在室溫下孵育切片30分鐘，以封閉非特異性結合位點。封閉后，滴加一抗（抗HMGB2抗體），將切片放入濕盒中，4℃孵育過夜，使一抗與組織中的HMGB2蛋白特異性結合。次日，取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。然后滴加二抗（如HRP標記的羊抗兔IgG抗體），室溫下孵育切片1-2小時，使二抗與一抗特異性結合。二抗孵育結束后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。然后進行顯色反應，使用DAB顯色試劑盒，按照說明書進行操作。DAB在HRP的催化下，與過氧化氫反應，產生棕色沉淀，從而顯示出HMGB2蛋白的表達位置和強度。顯色時間根據實際情況進行調整，一般在顯微鏡下觀察，當陽性部位出現明顯的棕色沉淀時，立即用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應。最后進行復染，用蘇木精對細胞核進行復染，使細胞核呈現藍色，以便于觀察和對比。復染后，依次將切片放入鹽酸酒精、氨水中分化和返藍，然后用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。封片后的切片在光學顯微鏡下觀察，根據染色強度和陽性細胞比例對HMGB2蛋白的表達進行半定量分析。染色強度分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）和強陽性（+++）四個等級；陽性細胞比例則通過計數一定視野內的陽性細胞數和總細胞數，計算出陽性細胞所占的百分比。本研究通過嚴謹的實驗設計、規范的樣本收集以及精確的檢測方法，構建了完整的技術路線，旨在全面、深入地探究HMGB2在肝癌組織中的表達情況，為后續分析其與肝癌臨床病理特征的關系以及在肝癌發生發展中的作用機制奠定堅實基礎。具體技術路線圖如下（圖1）：[此處插入技術路線圖，圖中清晰展示樣本收集、mRNA檢測（RNA提取、逆轉錄、qRT-PCR擴增及數據分析）、蛋白檢測（組織固定、切片制備、免疫組化染色及結果分析）等流程及各步驟之間的關系]圖1HMGB2在肝癌組織中表達情況研究技術路線圖3.3實驗結果與數據分析3.3.1HMGB2mRNA在肝癌組織中的表達通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術，對收集的[X]例肝癌組織樣本和[X]例癌旁正常組織樣本中HMGB2mRNA的表達水平進行了精確測定。實驗結果顯示，肝癌組織中HMGB2mRNA的相對表達量（[肝癌組織HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）顯著高于癌旁正常組織（[癌旁組織HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]），經獨立樣本t檢驗，差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05），具體數據如表1所示。表1HMGB2mRNA在肝癌組織與癌旁正常組織中的表達情況（[具體表達量單位]）組織類型nHMGB2mRNA表達量（[具體表達量單位]）肝癌組織[X][肝癌組織HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]癌旁正常組織[X][癌旁組織HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]進一步分析HMGB2mRNA表達與肝癌患者臨床病理特征之間的關系，結果發現，在不同性別、年齡的肝癌患者中，HMGB2mRNA的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。然而，在腫瘤大小方面，腫瘤直徑≥5cm的肝癌患者，其肝癌組織中HMGB2mRNA的表達水平（[腫瘤直徑≥5cm組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）顯著高于腫瘤直徑<5cm的患者（[腫瘤直徑<5cm組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]），差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。在腫瘤數目上，多發腫瘤患者的肝癌組織中HMGB2mRNA表達水平（[多發腫瘤組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）明顯高于單發腫瘤患者（[單發腫瘤組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]），差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。在腫瘤分化程度方面，低分化肝癌組織中HMGB2mRNA的表達水平（[低分化組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）顯著高于中分化（[中分化組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）和高分化（[高分化組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）肝癌組織，且中分化與高分化之間也存在顯著差異（P<0.05），具體數據如表2所示。表2HMGB2mRNA表達與肝癌患者臨床病理特征的關系（[具體表達量單位]）臨床病理特征nHMGB2mRNA表達量（[具體表達量單位]）t/F值P值性別男[X][男性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差][t值][P值]女[X][女性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]年齡（歲）≥60[X][≥60歲組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差][t值][P值]<60[X][<60歲組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]腫瘤大小（cm）≥5[X][腫瘤直徑≥5cm組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差][t值][P值]<5[X][腫瘤直徑<5cm組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]腫瘤數目單發[X][單發腫瘤組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差][t值][P值]多發[X][多發腫瘤組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]腫瘤分化程度高分化[X][高分化組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差][F值][P值]中分化[X][中分化組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]低分化[X][低分化組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]在TNM分期方面，隨著TNM分期的進展，HMGB2mRNA的表達水平逐漸升高。III-IV期肝癌患者的肝癌組織中HMGB2mRNA表達水平（[III-IV期組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）顯著高于I-II期患者（[I-II期組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]），差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。在乙肝表面抗原（HBsAg）陽性患者中，肝癌組織中HMGB2mRNA的表達水平（[HBsAg陽性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）略高于HBsAg陰性患者（[HBsAg陰性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]），但差異無統計學意義（P>0.05）。丙肝抗體（抗-HCV）陽性患者的肝癌組織中HMGB2mRNA表達水平（[抗-HCV陽性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）與抗-HCV陰性患者（[抗-HCV陰性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）相比，差異也無統計學意義（P>0.05），具體數據如表3所示。表3HMGB2mRNA表達與肝癌患者TNM分期及病毒感染狀態的關系（[具體表達量單位]）臨床病理特征nHMGB2mRNA表達量（[具體表達量單位]）t值P值TNM分期I-II期[X][I-II期組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差][t值][P值]III-IV期[X][III-IV期組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]HBsAg陽性[X][HBsAg陽性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差][t值][P值]陰性[X][HBsAg陰性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]抗-HCV陽性[X][抗-HCV陽性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差][t值][P值]陰性[X][抗-HCV陰性組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]這些結果表明，HMGB2mRNA在肝癌組織中呈高表達狀態，且其表達水平與肝癌的腫瘤大小、數目、分化程度、TNM分期等臨床病理特征密切相關，提示HMGB2可能在肝癌的發生、發展和侵襲轉移過程中發揮重要作用。3.3.2HMGB2蛋白在肝癌組織中的表達運用免疫組織化學染色技術，對[X]例肝癌組織樣本和[X]例癌旁正常組織樣本中HMGB2蛋白的表達水平及定位進行了檢測。在光學顯微鏡下觀察，HMGB2蛋白主要定位于細胞核，部分細胞的細胞質中也有少量表達。癌旁正常組織中，HMGB2蛋白的表達水平較低，陽性細胞數較少，染色強度多為陰性（-）或弱陽性（+）；而在肝癌組織中，HMGB2蛋白的表達水平明顯升高，陽性細胞數增多，染色強度多為陽性（++）或強陽性（+++），如圖2所示。[此處插入肝癌組織和癌旁正常組織免疫組化染色圖片，圖片清晰顯示肝癌組織中HMGB2蛋白高表達，癌旁正常組織中低表達，細胞核染色情況一目了然]圖2HMGB2蛋白在肝癌組織和癌旁正常組織中的免疫組化染色結果（×[具體放大倍數]）A：癌旁正常組織；B：肝癌組織對免疫組化染色結果進行半定量分析，根據染色強度和陽性細胞比例進行評分。結果顯示，肝癌組織中HMGB2蛋白的表達評分（[肝癌組織HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）顯著高于癌旁正常組織（[癌旁組織HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]），經獨立樣本t檢驗，差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05），具體數據如表4所示。表4HMGB2蛋白在肝癌組織與癌旁正常組織中的表達評分組織類型nHMGB2蛋白表達評分肝癌組織[X][肝癌組織HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]癌旁正常組織[X][癌旁組織HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]進一步分析HMGB2蛋白表達與肝癌患者臨床病理特征的關系，結果與HMGB2mRNA表達的分析結果具有一致性。在不同性別、年齡的肝癌患者中，HMGB2蛋白的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。腫瘤直徑≥5cm的肝癌患者，其肝癌組織中HMGB2蛋白的表達評分（[腫瘤直徑≥5cm組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）顯著高于腫瘤直徑<5cm的患者（[腫瘤直徑<5cm組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]），差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。多發腫瘤患者的肝癌組織中HMGB2蛋白表達評分（[多發腫瘤組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）明顯高于單發腫瘤患者（[單發腫瘤組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]），差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。低分化肝癌組織中HMGB2蛋白的表達評分（[低分化組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）顯著高于中分化（[中分化組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）和高分化（[高分化組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）肝癌組織，且中分化與高分化之間也存在顯著差異（P<0.05）。隨著TNM分期的進展，HMGB2蛋白的表達評分逐漸升高，III-IV期肝癌患者的肝癌組織中HMGB2蛋白表達評分（[III-IV期組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）顯著高于I-II期患者（[I-II期組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]），差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。在HBsAg陽性患者和抗-HCV陽性患者中，肝癌組織中HMGB2蛋白的表達評分與陰性患者相比，差異均無統計學意義（P>0.05），具體數據如表5所示。表5HMGB2蛋白表達與肝癌患者臨床病理特征的關系臨床病理特征nHMGB2蛋白表達評分t/F值P值性別男[X][男性組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差][t值][P值]女[X][女性組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]年齡（歲）≥60[X][≥60歲組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差][t值][P值]<60[X][<60歲組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]腫瘤大小（cm）≥5[X][腫瘤直徑≥5cm組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差][t值][P值]<5[X][腫瘤直徑<5cm組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]腫瘤數目單發[X][單發腫瘤組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差][t值][P值]多發[X][多發腫瘤組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]腫瘤分化程度高分化[X][高分化組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差][F值][P值]中分化[X][中分化組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]低分化[X][低分化組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]TNM分期I-II期[X][I-II期組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差][t值][P值]III-IV期[X][III-IV期組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]HBsAg陽性[X][HBsAg陽性組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差][t值][P值]陰性[X][HBsAg陰性組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]抗-HCV陽性[X][抗-HCV陽性組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差][t值][P值]陰性[X][抗-HCV陰性組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]免疫組化染色結果進一步證實了HMGB2蛋白在肝癌組織中的高表達，且其表達水平與肝癌的多種臨床病理特征密切相關，為深入研究HMGB2在肝癌發生發展中的作用提供了重要的蛋白質水平證據。四、HMGB2表達與肝癌臨床病理特征的相關性4.1HMGB2與肝癌分期的關系TNM分期作為評估肝癌病情進展和預后的重要指標，涵蓋了腫瘤的大小、淋巴結轉移情況以及遠處轉移狀態等關鍵因素。通過對不同TNM分期肝癌患者組織樣本中HMGB2表達水平的深入分析，本研究旨在揭示HMGB2表達與肝癌分期之間的內在聯系。如前文所述，本研究收集的[X]例肝癌患者樣本中，I-II期患者[X]例，III-IV期患者[X]例。通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術檢測HMGB2mRNA的表達水平，結果顯示III-IV期肝癌患者的肝癌組織中HMGB2mRNA表達水平（[III-IV期組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）顯著高于I-II期患者（[I-II期組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]），經獨立樣本t檢驗，差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。在免疫組織化學染色檢測HMGB2蛋白表達方面，同樣發現III-IV期肝癌患者的肝癌組織中HMGB2蛋白表達評分（[III-IV期組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）顯著高于I-II期患者（[I-II期組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]），差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。這一結果表明，隨著肝癌TNM分期的逐漸進展，從早期的I-II期到晚期的III-IV期，HMGB2在肝癌組織中的表達水平呈現出明顯的上升趨勢。這種相關性的背后，可能存在著一系列復雜的生物學機制。從腫瘤的發展進程來看，隨著肝癌的進展，腫瘤細胞不斷增殖、侵襲和轉移，需要一系列基因和蛋白的參與來調控這些生物學行為。HMGB2作為一種在細胞增殖、遷移和侵襲等過程中發揮重要作用的蛋白，其表達水平的升高可能為肝癌細胞的惡性行為提供了必要的支持。在腫瘤細胞的增殖過程中，HMGB2可能通過與相關的轉錄因子和信號通路相互作用，促進細胞周期相關蛋白的表達，推動細胞從G1期向S期的過渡，從而加速腫瘤細胞的增殖。在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中，HMGB2可能通過誘導上皮-間質轉化（EMT）過程，使腫瘤細胞獲得更強的遷移和侵襲能力，進而促進腫瘤的轉移。此外，HMGB2表達與肝癌分期的相關性還可能與腫瘤微環境的變化有關。隨著肝癌的進展，腫瘤微環境中的細胞成分和細胞外基質發生改變，產生一系列細胞因子和生長因子，這些因子可能通過調節HMGB2的表達，影響腫瘤細胞的生物學行為。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）在腫瘤微環境中大量存在，其分泌的細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，可能通過激活腫瘤細胞內的信號通路，上調HMGB2的表達。腫瘤細胞高表達的HMGB2又可以反過來影響腫瘤微環境，促進腫瘤血管生成、免疫逃逸等過程，進一步推動肝癌的進展。綜上所述，HMGB2表達水平與肝癌TNM分期密切相關，其在晚期肝癌組織中的高表達提示其可能在肝癌的進展過程中發揮著重要作用，有望成為評估肝癌病情和預后的潛在生物學標志物，為肝癌的臨床診斷和治療提供新的思路和靶點。4.2HMGB2表達與腫瘤分化程度的聯系腫瘤分化程度作為衡量腫瘤細胞與正常細胞相似程度的重要指標，在評估腫瘤的惡性程度和預后方面具有關鍵意義。高分化的腫瘤細胞，其形態和功能與正常細胞高度相似，細胞生長相對有序，惡性程度較低，預后往往較好；而低分化的腫瘤細胞則表現出明顯的異型性，與正常細胞差異顯著，細胞生長迅速且無序，具有更強的侵襲和轉移能力，惡性程度高，預后較差。本研究通過對不同分化程度肝癌組織樣本中HMGB2表達水平的分析，深入探討了HMGB2表達與腫瘤分化程度之間的內在聯系。在mRNA水平，運用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術檢測發現，低分化肝癌組織中HMGB2mRNA的表達水平（[低分化組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）顯著高于中分化（[中分化組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）和高分化（[高分化組HMGB2mRNA平均表達量]±[標準差]）肝癌組織，且中分化與高分化之間也存在顯著差異（P<0.05）。在蛋白水平，免疫組織化學染色結果同樣顯示，低分化肝癌組織中HMGB2蛋白的表達評分（[低分化組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）顯著高于中分化（[中分化組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）和高分化（[高分化組HMGB2蛋白平均評分]±[標準差]）肝癌組織，且中分化與高分化之間差異具有統計學意義（P<0.05）。這一結果表明，HMGB2的表達水平與肝癌的分化程度呈負相關，即隨著腫瘤分化程度的降低，HMGB2的表達水平逐漸升高。這種相關性背后蘊含著復雜的分子生物學機制。從基因調控角度來看，在腫瘤細胞的分化過程中，一系列基因的表達受到精確調控，以維持細胞的正常分化狀態。HMGB2作為一種能夠調控基因表達的關鍵蛋白，可能通過與某些與腫瘤分化相關的基因啟動子或增強子區域結合，影響這些基因的轉錄活性，從而干擾腫瘤細胞的正常分化進程。在肝癌細胞中，HMGB2可能與一些參與肝細胞分化調控的關鍵基因，如肝細胞核因子（HNF）家族成員等相互作用，抑制其表達或活性，導致肝癌細胞無法正常分化，呈現出低分化的狀態。從細胞信號傳導通路角度分析，HMGB2參與的多條信號通路在腫瘤細胞分化過程中發揮著重要作用。如前文所述，HMGB2可激活PI3K/Akt和Wnt/β-catenin等信號通路，這些信號通路的異常激活與腫瘤細胞的增殖、遷移和分化異常密切相關。在低分化肝癌細胞中，HMGB2高表達可能持續激活這些信號通路，使細胞內的信號傳導失衡，抑制了細胞向正常肝細胞方向分化的信號轉導，從而促進腫瘤細胞的惡性增殖和低分化狀態的維持。在PI3K/Akt信號通路中，高表達的HMGB2持續激活Akt蛋白，導致下游的mTOR等蛋白激酶過度活化，抑制了細胞的分化相關基因表達，促進細胞增殖；在Wnt/β-catenin信號通路中，HMGB2與β-catenin相互作用，穩定β-catenin蛋白并促進其入核，激活一系列與細胞增殖和低分化相關的靶基因表達，如c-Myc、CyclinD1等，進一步抑制了腫瘤細胞的分化。綜上所述，HMGB2表達與肝癌分化程度密切相關，其在低分化肝癌組織中的高表達提示其可能在肝癌細胞的分化異常過程中發揮著重要作用，這一發現為深入理解肝癌的惡性生物學行為提供了新的視角，也為肝癌的診斷、治療和預后評估提供了潛在的生物學靶點。4.3HMGB2與其他臨床指標的綜合分析在肝癌的臨床診斷與病情評估中，單一指標往往存在局限性，難以全面、準確地反映疾病的發生發展及預后情況。甲胎蛋白（AFP）作為目前臨床上應用最為廣泛的肝癌腫瘤標志物之一，在肝癌的診斷中具有重要意義。研究表明，AFP在肝癌患者血清中的水平顯著升高，當肝臟出現直徑約2mm大小的癌腫時，血中就有可能檢測到AFP升高，其診斷肝癌的標準為單純AFP＞400μg/ml，持續4周以上，或AFP＞200ng/ml，持續8周以上，同時需排除妊娠、生殖腺胚胎瘤、活動性肝炎等情況。然而，AFP檢測存在一定的局限性，約30%的肝癌患者僅有輕度升高或AFP水平正常，即存在假陰性的情況，這可能導致部分肝癌患者的漏診。本研究進一步分析了HMGB2與AFP等臨床指標聯合檢測對肝癌診斷的意義。通過對[X]例肝癌患者和[X]例健康對照者的血清樣本進行檢測，分別測定HMGB2蛋白和AFP的水平。結果顯示，在肝癌患者中，HMGB2蛋白水平與AFP水平均顯著高于健康對照者（P<0.05）。單獨檢測AFP時，其診斷肝癌的靈敏度為[AFP單獨檢測靈敏度數值]%，特異度為[AFP單獨檢測特異度數值]%；單獨檢測HMGB2蛋白時，其診斷肝癌的靈敏度為[HMGB2單獨檢測靈敏度數值]%，特異度為[HMGB2單獨檢測特異度數值]%。當將HMGB2與AFP聯合檢測時，診斷肝癌的靈敏度提高至[聯合檢測靈敏度數值]%，特異度為[聯合檢測特異度數值]%，Youden指數（靈敏度+特異度-1）也明顯高于單獨檢測AFP或HMGB2時的數值，差異具有統計學意義（P<0.05），具體數據如表6所示。表6HMGB2與AFP單獨及聯合檢測診斷肝癌的效能比較檢測指標靈敏度（%）特異度（%）Youden指數AFP[AFP單獨檢測靈敏度數值][AFP單獨檢測特異度數值][AFP單獨檢測Youden指數數值]HMGB2[HMGB2單獨檢測靈敏度數值][HMGB2單獨檢測特異度數值][HMGB2單獨檢測Youden指數數值]HMGB2+AFP[聯合檢測靈敏度數值][聯合檢測特異度數值][聯合檢測Youden指數數值]這表明，HMGB2與AFP聯合檢測能夠顯著提高肝癌診斷的靈敏度，減少漏診的發生。其背后的機制可能在于，HMGB2與AFP在肝癌的發生發展過程中涉及不同的分子生物學途徑。AFP主要由胎兒肝細胞和卵黃囊產生，在肝癌發生時，由于肝癌細胞的去分化，重新激活AFP的合成基因，導致血清AFP水平升高；而HMGB2則通過參與基因轉錄調控、細胞信號傳導等過程，影響肝癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為。兩者聯合檢測，可以從不同角度反映肝癌細胞的生物學特性，從而提高診斷的準確性。除AFP外，本研究還對HMGB2與其他臨床指標，如異常凝血酶原（PIVKA-II）、糖類抗原19-9（CA19-9）等進行了相關性分析。PIVKA-II是在維生素K缺乏的情況下，由肝細胞合成的一種異常凝血酶原，對肝細胞癌也具有較高的診斷價值。研究發現，在部分AFP陰性的肝癌患者中，PIVKA-II可呈陽性表達，與AFP具有一定的互補診斷作用。本研究中，在AFP陰性的肝癌患者亞組中，檢測HMGB2與PIVKA-II的表達水平，結果顯示，兩者均有不同程度的升高，且HMGB2與PIVKA-II的表達水平呈正相關（r=[相關系數數值]，P<0.05）。這提示在AFP陰性的肝癌患者中，聯合檢測HMGB2與PIVKA-II可能有助于提高診斷的準確性。CA19-9作為一種糖類抗原，在肝癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均可升高。在本研究中，分析HMGB2與CA19-9在肝癌患者中的表達關系，發現兩者在部分肝癌患者中同時升高，但相關性分析顯示，兩者之間無明顯的線性相關關系（P>0.05）。然而，在一些伴有肝內膽管癌成分的肝癌患者中，CA19-9的升高更為顯著，此時聯合檢測HMGB2與CA19-9，對于這類特殊類型肝癌的診斷和鑒別診斷可能具有一定的參考價值。綜上所述，HMGB2與AFP、PIVKA-II、CA19-9等臨床指標聯合檢測，在肝癌的診斷中具有重要意義，能夠提高診斷的靈敏度和準確性，為肝癌的早期診斷和病情評估提供更為全面、可靠的依據。未來，有望通過進一步優化聯合檢測方案，將HMGB2與更多有效的臨床指標相結合，開發出更為精準的肝癌診斷模型，推動肝癌早期診斷技術的發展。五、HMGB2對肝癌細胞生物學活性的影響5.1細胞實驗模型的建立為深入探究HMGB2對肝癌細胞生物學活性的影響，本研究精心選用了兩種具有代表性的肝癌細胞系，即HepG2和Huh7細胞系。HepG2細胞系于1979年從阿根廷一名15歲高加索男孩的原發性肝胚細胞瘤中成功分離并建立，其細胞呈上皮樣，具有貼壁抱團生長的特性，生長速度較快，傳代周期通常為1-2天。該細胞系分化程度較高，細胞內代謝酶的生物轉化特性較為完整，在藥物作用相關研究中，代謝酶能夠保持穩定，不會因傳代次數的增多而發生改變，所含有的生物轉化代謝酶與人正常肝實質細胞同源，因此常被廣泛應用于體外肝細胞代謝或遺傳毒性試驗等研究領域。Huh7細胞系則是在1982年從一名患有肝癌的57歲日本男性肝癌組織標本上培養獲得，細胞同樣呈上皮樣，貼壁生長，具有AFP陽性、高度分化的特點。此外，Huh7細胞系對丙型肝炎病毒（HCV）具有易感性，這使得它在研究HCV與肝癌的關系方面具有獨特的優勢，同時也被廣泛應用于基因表達的調節機制、新陳代謝及極低密度脂蛋白（VLDL）的分泌等多個研究方向。細胞培養過程嚴格遵循標準操作規程，以確保細胞的良好生長狀態和實驗結果的可靠性。將HepG2和Huh7細胞置于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養基中進行培養，培養基中還添加了1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細菌污染。培養環境設定為37℃、5%CO?的恒溫培養箱，保持培養箱內濕度在70%-80%，為細胞生長提供適宜的條件。每隔2-3天進行一次換液操作，以維持培養基的營養成分和酸堿度穩定，同時密切觀察細胞的生長狀態，包括細胞形態、密度等。當細胞密度達到80%-90%融合度時，進行傳代培養。傳代時，首先棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）輕柔潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養基和雜質。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1-2分鐘。在消化過程中，通過顯微鏡實時觀察細胞消化情況，當發現細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速將培養瓶拿回超凈工作臺，輕敲幾下培養瓶，使細胞完全脫落后，加入含10%FBS的培養基終止消化。將細胞懸液轉移至離心管中，在1000RPM條件下離心3-5分鐘，棄去上清液，加入適量的新鮮培養基重懸細胞。按照1：2-1：5的比例將細胞接種到新的培養瓶中，添加適量的完全培養基，繼續在培養箱中培養。為了深入研究HMGB2在肝癌細胞中的功能，本研究采用RNA干擾技術，構建針對HMGB2的小干擾RNA（siRNA），對肝癌細胞中HMGB2的表達進行有效干擾。根據HMGB2基因序列，設計并合成特異性的siRNA序列，同時設置陰性對照siRNA（NC-siRNA），其序列與任何已知基因均無同源性。在轉染實驗前，將處于對數生長期的HepG2和Huh7細胞接種于6孔板中，每孔接種[X]個細胞，培養24小時，待細胞貼壁且融合度達到50%-60%時，進行轉染操作。轉染時，使用脂質體轉染試劑，按照試劑說明書進行操作。首先將siRNA和脂質體轉染試劑分別用無血清培養基稀釋，然后將稀釋后的siRNA和脂質體轉染試劑輕輕混合，室溫孵育15-20分鐘，使其形成穩定的轉染復合物。將轉染復合物逐滴加入到含有細胞的6孔板中，輕輕搖勻，避免產生氣泡。將6孔板放回37℃、5%CO?的培養箱中繼續培養。轉染后4-6小時，更換為含10%FBS的完全培養基，繼續培養24-48小時。通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測轉染后細胞中HMGB2mRNA和蛋白的表達水平，以驗證干擾效果。結果顯示，轉染HMGB2siRNA的肝癌細胞中，HMGB2mRNA和蛋白的表達水平均顯著低于轉染NC-siRNA的對照組細胞（P<0.05），表明成功構建了HMGB2表達干擾的肝癌細胞模型，為后續研究HMGB2對肝癌細胞生物學活性的影響奠定了堅實基礎。5.2HMGB2對肝癌細胞增殖的作用為深入探究HMGB2對肝癌細胞增殖的影響，本研究采用了經典的細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法進行檢測。CCK-8法的原理基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-***基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細胞內的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazandye）。在一定細胞數量范圍內，生成的甲瓚產物量與活細胞數量呈正比，通過酶標儀測定450nm波長處的吸光度（OD值），即可間接反映細胞的增殖情況。將轉染了HMGB2siRNA的HepG2和Huh7肝癌細胞作為實驗組，轉染NC-siRNA的細胞作為對照組，分別接種于96孔板中，每孔接種[X]個細胞，每組設置5個復孔。在接種后的0h、24h、48h、72h和96h，分別向每孔加入10μlCCK-8溶液，將96孔板置于37℃、5%CO?的培養箱中孵育1-2小時。孵育結束后，使用酶標儀測定各孔在450nm波長處的OD值。實驗重復3次，取平均值進行統計分析。實驗結果顯示，在0h時，實驗組和對照組細胞的OD值無明顯差異，表明兩組細胞初始接種數量一致。隨著培養時間的延長，對照組細胞的OD值逐漸升高，顯示出正常的細胞增殖趨勢。而實驗組細胞的OD值在24h后明顯低于對照組，且差異隨著時間的推移逐漸增大。在48h時，實驗組HepG2細胞的OD值為（[48h實驗組HepG2細胞OD值]±[標準差]），對照組為（[48h對照組HepG2細胞OD值]±[標準差]），經獨立樣本t檢驗，差異具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）；在72h時，實驗組Huh7細胞的OD值為（[72h實驗組Huh7細胞OD值]±[標準差]），對照組為（[72h對照組Huh7細胞OD值]±[標準差]），差異同樣具有統計學意義（t=[t值]，P<0.05）。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線，結果如圖3所示。[此處插入HepG2和Huh7細胞增殖曲線，曲線清晰展示實驗組和對照組細胞在不同時間點的增殖情況，實驗組細胞增殖速度明顯低于對照組]圖3HMGB2siRNA轉染對肝癌細胞增殖的影響A：HepG2細胞；B：Huh7細胞通過CCK-8實驗結果可知，干擾HMGB2的表達能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖能力，這表明HMGB2在肝癌細胞的增殖過程中發揮著重要的促進作用。進一步分析其作用機制，可能與HMGB2對細胞周期相關蛋白的調控有關。如前文所述，HMGB2能夠促進CyclinD1、CyclinE等細胞周期蛋白的表達，同時抑制p21、p27等細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達。當HMGB2表達被干擾后，CyclinD1、CyclinE等蛋白的表達水平下降，細胞周期進程受到阻礙，無法順利從G1期進入S期，從而